CN105316392A - 一种适用于创伤弧菌现场检测的引物、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于创伤弧菌现场检测的引物、试剂盒及其应用。本发明公开的一组引物，由如下(1)-(6)所示的DNA分子组成：(1)SEQIDNo.1所示的DNA分子；(2)SEQIDNo.2所示的DNA分子；(3)SEQIDNo.3所示的DNA分子；(4)SEQIDNo.4所示的DNA分子；(5)SEQIDNo.5所示的DNA分子；(6)SEQIDNo.6所示的DNA分子。利用本发明公开的引物、试剂盒检测创伤弧菌具有灵敏度高、特异性好、适合现场以及移动环境下进行实时检测等特点。

Description

一种适用于创伤弧菌现场检测的引物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测创伤弧菌的引物、试剂盒及其应用；特别涉及一种适用于创伤弧菌现场检测的引物、试剂盒及其应用，属于分子生物学及食品安全检测领域。

背景技术

创伤弧菌是一种广泛分布于海洋与盐湖中的嗜盐性革兰氏阴性致病菌，是鱼、虾、贝类等的重要病原菌，可引起鱼类皮肤溃烂病和败血症、养殖对虾的红腿病和烂鳃病以及贝类脓疤病等，给水产养殖业带来严重的经济损失。该菌也是引起食源性疾病的主要病原之一，人通过进食生海产品经胃肠道黏膜或破损的皮肤接触海水而感染该菌，可引起原发性败血症、下肢创伤感染，出现疱性皮肤损害、皮肤淤斑坏死、蜂窝组织炎等，同时伴高热、低血压、休克，最终发展为感染性休克、多器官衰竭甚至死亡，致死率可高达70％。因创伤弧菌给海洋渔业养殖和食品安全带来巨大危害，创伤弧菌是水产养殖和食品安全重要的微生物检疫对象。

目前检测创伤弧菌主要方法有三种：

1.生化鉴定法，该法费时，操作繁锁，不能满足快速检测的需要；

2.酶联免疫吸附法(ELISA法)，该法具有敏感性高、检测快速等特点，可用于大批标本的检测，但对新鲜样品进行检测时出现的假阳性问题，在一定程度上限制着该方法的广泛应用；

3.聚合酶链式反应法(PCR法)，该法较前两种方法快速、灵敏，但需要昂贵的PCR仪，在基层及现场无法推广应用。

由于水产病害的爆发及食品被致病菌污染具有突发性、未知性、损害严重性，缩短检测时间对于海洋渔业病害的预警和病害及时防治、食品安全隐患提早发现具有重要的意义，但是因目前检测技术或检测设备的限制，样品需送到检测实验室进行检测，不能针对现场发现的可疑样品进行及时检测。为缩短检测周期，实现现场执法的透明度，为后续处理尽早提供依据，开发一种适用于创伤弧菌现场检测的试剂盒及检测方法，实现现场快速检测，同时适用于在颠簸的移动检测车上、轮船上进行检测，对海洋病害的及时预警和食品安全的实时监测具有重要意义。

环介导恒温基因扩增技术(Loop-MediatedIsothermalAmplification)是一种简便、快速、高特异的基因扩增法。恒温荧光检测设备轻便、小巧，便于携带，且可使用干电池供电，便于在基层现场使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于创伤弧菌现场检测的引物、试剂盒及其应用，利用本发明提供的引物、试剂盒检测创伤弧菌具有灵敏度高、特异性好、适合现场以及移动环境下进行实时检测等特点。

本发明提供一组引物，由如下(1)-(6)所示的DNA分子组成：

(1)SEQIDNo.1所示的DNA分子；

(2)SEQIDNo.2所示的DNA分子；

(3)SEQIDNo.3所示的DNA分子；

(4)SEQIDNo.4所示的DNA分子；

(5)SEQIDNo.5所示的DNA分子；

(6)SEQIDNo.6所示的DNA分子。

一种检测或辅助检测创伤弧菌的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述的引物。

上述试剂盒中，所述试剂盒还包含Bst2.0WarmStart^TMDNA聚合酶、SYTO-9和矿物油；

该试剂盒还包含使用说明书，说明书中记载内容如下：以待测样品的DNA为模板，以上述引物为引物，以SYTO-9为荧光核酸染料、以Bst2.0WarmStart^TMDNA聚合酶为DNA聚合酶，得到反应体系；将反应体系置于离心管中，在离心管中加入矿物油封闭，得到封闭的体系；再将封闭的体系进行环介导恒温基因扩增，实时检测荧光信号；以时间为横坐标，荧光信号对应的电压值为纵坐标作图，得到扩增曲线，扩增曲线为S型的待测样品为含有创伤弧菌的样品，扩增曲线不是S型的待测样品为不含有创伤弧菌的样品；

所述扩增曲线为S型为所述扩增曲线具有荧光信号基线期、指数增长期、平台期；

所述时间的单位为min；

所述荧光信号对应的电压值的单位为mV；

所述Bst2.0WarmStart^TMDNA聚合酶具有链置换活性；

所述矿物油的功能是对离心管剩余空间进行填充，有效固定反应体系，避免因检测环境晃动造成的反应体系不稳定，实现在移动检测环境下的实时检测，同时具有防止反应体系挥发和防止污染的功能；

所述反应体系的组成如下：1.6μM的SEQIDNo.3所示的DNA分子、1.6μM的SEQIDNo.4所示的DNA分子、0.2μM的SEQIDNo.1所示的DNA分子、0.2μM的SEQIDNo.2所示的DNA分子、0.8μM的SEQIDNo.5所示的DNA分子、0.8μM的SEQIDNo.6所示的DNA分子、1M甜菜碱、8mMMgSO₄、8UBst2.0WarmStart^TMDNA聚合酶、1.6mMdNTP、2.5μL10×PCR扩增缓冲液、2-20μMSYTO-9、2μL模板，余量为ddH₂O，总体系25μL；

所述SYTO-9的浓度具体为5μM；

所述Bst2.0WarmStart^TMDNA聚合酶购自NewEnglandBiolabs公司，产品目录号为#M0538L；

所述10×PCR扩增缓冲液的商品名称为10×ThermoPolReactionBuffer，购自NewEnglandBiolabs公司，产品目录号为#M0538L；

所述SYTO-9购自英潍捷基(上海)贸易有限公司，产品目录号为S-34854；

所述矿物油的体积为所述反应体系体积的6-10倍，具体为6倍或10倍；

所述环介导恒温基因扩增的条件为60℃-65℃恒温反应20min-60min，具体为63℃恒温反应30min。

一种检测或辅助检测待测样品中是否含有创伤弧菌的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：以待测样品的DNA为模板，以上述引物为引物，以SYTO-9为荧光核酸染料、以Bst2.0WarmStart^TMDNA聚合酶为DNA聚合酶，得到反应体系；将反应体系置于离心管中，在离心管中加入矿物油封闭，得到封闭的体系；再将封闭的体系进行环介导恒温基因扩增，实时检测荧光信号；以时间为横坐标，荧光信号对应的电压值为纵坐标作图，得到扩增曲线，扩增曲线为S型的待测样品为含有创伤弧菌的样品，扩增曲线不是S型的待测样品为不含有创伤弧菌的样品；

所述扩增曲线为S型为所述扩增曲线具有荧光信号基线期、指数增长期、平台期；

所述时间的单位为min；

所述荧光信号对应的电压值的单位为mV。

上述方法中，所述反应体系的组成如下：1.6μM的SEQIDNo.3所示的DNA分子、1.6μM的SEQIDNo.4所示的DNA分子、0.2μM的SEQIDNo.1所示的DNA分子、0.2μM的SEQIDNo.2所示的DNA分子、0.8μM的SEQIDNo.5所示的DNA分子、0.8μM的SEQIDNo.6所示的DNA分子、1M甜菜碱、8mMMgSO₄、8UBst2.0WarmStart^TMDNA聚合酶、1.6mMdNTP、2.5μL10×PCR扩增缓冲液、2-20μMSYTO-9、2μL模板，余量为ddH₂O，总体系为25μL；

所述Bst2.0WarmStart^TMDNA聚合酶购自NewEnglandBiolabs公司，产品目录号为#M0538L；

所述10×PCR扩增缓冲液的商品名称具体为10×ThermoPolReactionBuffer，购自NewEnglandBiolabs公司，产品目录号为#M0538L；

所述矿物油购自广州捷倍斯生物科技有限公司，产品目录号为J217；

所述SYTO-9购自英潍捷基(上海)贸易有限公司，产品目录号为S-34854。

上述任一所述的方法中，所述SYTO-9的浓度为5μM。

上述任一所述的方法中，所述矿物油的体积为所述反应体系体积的6-10倍，具体为6倍或10倍。

上述任一所述的方法中，所述环介导恒温基因扩增的条件为60℃-65℃恒温反应20min-60min，具体为63℃恒温反应30min。

上述任一所述的方法中，所述实时检测荧光信号所用的仪器具体为ESE-QuantTubeScanner或实时荧光定量PCR仪。

上述引物在制备检测或辅助检测创伤弧菌的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述的试剂盒在制备检测或辅助检测创伤弧菌的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明针对创伤弧菌特异性基因序列设计引物，并通过在反应体系中加入荧光染料，借助恒温荧光检测设备，实现对创伤弧菌的实时荧光检测，同时在反应管中加入矿物油，对检测管剩余空间进行填充，有效固定反应体系，避免因检测环境晃动造成的检测体系不稳定，实现在移动检测环境下的实时检测。

利用本发明提供的引物、试剂盒检测创伤弧菌具有如下优点：

一、可适宜于移动环境下进行实时检测：在检测管中加入具有粘稠度的矿物油，对检测管剩余空间进行填充，有效固定反应体系，可避免因检测环境晃动对检测体系结果的影响，实现在移动检测环境下的实时检测，尤其适用于在远海的轮船上及移动检测车上使用，为野外考察和现场检测提供一种实时检测的方法；

二、可适于基层和现场使用：采用干电池供电的ESE-QuantTubeScanner检测仪器，检测设备轻便、小巧，便于携带，便于在基层及现场使用；

三、快速高效：整个扩增只用20-60min即可完成；

四、高特异性、高灵敏度：根据创伤弧菌vvhA基因序列设计了6条特异性引物，扩增靶序列的8个区域，具有特异性强、灵敏度高等特点；

五、结果易于判读、无需专业人员：在反应体系中恒温加入SYTO-9，根据扩增曲线判断结果，无需专业人员即可进行检测。

综上所述，利用本发明提供的引物、试剂盒检测创伤弧菌具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点。

附图说明

图1为创伤弧菌灵敏度检测结果。

图2为创伤弧菌特异性检测结果。

图3为创伤弧菌实际样品检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

创伤弧菌(Vibriovulnificus)标准菌株购自ATCC，编号为ATCC27562。

Bst2.0WarmStart^TMDNA聚合酶购自NewEnglandBiolabs公司，产品目录号为#M0538L。

10×ThermoPolReactionBuffer购自NewEnglandBiolabs公司，产品目录号为#M0538L。

MineralOil(矿物油)购自广州捷倍斯生物科技有限公司，产品目录号为J217。

SYTO-9购自英潍捷基(上海)贸易有限公司，产品目录号为S-34854。

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)标准菌株购自ATCC，编号为ATCC17749。

拟态弧菌(Vibriomimicus)在文献“郑秋月,曹际娟,蒋丹,刘淑艳,赵昕,傅俊范.食品中拟态弧菌变性高效液相色谱检测技术研究[J].食品科学,2009,06:175-177.”中公开过，公众可从中国人民解放军海军总医院获得。

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)在文献“徐芊,孙晓红,赵勇,潘迎捷.副溶血弧菌LAMP检测方法的建立[J].中国生物工程杂志,2007,12:66-72.”中公开过，公众可从中国人民解放军海军总医院获得。

河流弧菌(Vibriofluvialis)在文献“徐芊,孙晓红,赵勇,潘迎捷.副溶血弧菌LAMP检测方法的建立[J].中国生物工程杂志,2007,12:66-72.”中公开过，公众可从中国人民解放军海军总医院获得。

鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)在文献“粟婉媛,侯家奎,柳婷,郭爱玲,王洪江,谢跻,马美湖.沙门氏菌属随机扩增多态性DNAPCR条件的优化[J].食品科学,2009,20:320-323.”中公开过，公众可从中国人民解放军海军总医院获得。

大肠杆菌(E.coli)标准菌株购自ATCC，编号为ATCC25922。

实施例1、创伤弧菌灵敏度检测

基于环介导恒温基因扩增技术，根据创伤弧菌vvhA基因序列设计了6条特异性引物，能特异性识别靶基因序列上的8个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎－环DNA混合物。采用上述设计的特异性引物及一种具有链置换活性的Bst2.0WarmStart^TMDNA聚合酶，在60～65℃对核酸进行扩增反应，反应只需在恒温条件下进行，在20～60min的短时间内完成检测。

对创伤弧菌标准菌株(ATCC27562)的菌悬液进行10倍梯度稀释，采用TCBS培养板，按照《GB47892-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定方法进行平板计数》对菌悬液进行菌落计数，另分别取1mL各梯度稀释液按如下方法进行检测，具体步骤如下：

一、核酸提取

(一)取1.0mL分别含有10⁴，10³,10²,10¹,10⁰CFU/ml的创伤弧菌的菌液于1.5mL离心管中，10000-12000转/分，离心2-5分钟，弃上清液；

(二)加入100-150μL灭菌双蒸水，混匀，100℃煮5-10分钟；

(三)10000-12000转/分离心2-5分钟，取上清液至一个新的1.5mL离心管中，做为模板DNA备用。

二、环介导恒温基因扩增体系

环介导恒温基因扩增反应体系(25μL)：1.6μMvvhA-FIP、1.6μMvvhA-BIP、0.2μMvvhA-F3、0.2μMvvhA-B3、0.8μMvvhA-FLP、0.8μMvvhA-BLP、1M甜菜碱、8mMMgSO₄、8UBst2.0WarmStart^TMDNA聚合酶、1.6mMdNTP、2.5μL10×ThermoPolReactionBuffer、5μMSYTO-9、2μL模板DNA，余量为ddH₂O。

同时设置以ddH₂O和含有靶基因片段的质粒为模板，分别作为阴性对照和阳性对照，进行下述的实验。

上述含有靶基因片段的质粒的制备方法如下：以步骤一得到的DNA为模板，以vvhA-F3及vvhA-B3为引物，进行PCR扩增，得到靶基因片段，将靶基因片段连接至T载体，即得含有靶基因片段的质粒。

体系中的引物如下：

vvhA-F3：5’-TCATATCATCTCCGGTAGC-3’(SEQIDNo.1)；

vvhA-B3：5’-GAGAAAGTTTAACGCTCTCT-3’(SEQIDNo.2)；

vvhA-FIP：5’-GACAGTCCTAAACCAGTGAGTTCCGTGGTGATTGATTTGA-3’(SEQIDNo.3)；

vvhA-BIP：5’-GGCGACGCCTTAGTCAATATCGTTGATTGGGTTGTC-3’(SEQIDNo.4)；

vvhA-FLP：5’-TCGTCACCAGCAATTTGA-3’(SEQIDNo.5)；

vvhA-BLP：5’-ATTGTCAGCGATGTCACC-3’(SEQIDNo.6)。

三、环介导恒温基因扩增体系的封闭

在盛有步骤二的各体系的0.2ml的离心管中加入150μL矿物油。

四、检测及结果判断

使用ESE-QuantTubeScanner(野外)或实时荧光定量PCR仪(非野外)进行检测，将步骤三得到的各体系在63℃恒温反应30min。

以时间(单位：min)为横坐标，荧光信号对应的电压值(单位：mV)为纵坐标作图，得到扩增曲线图，根据扩增曲线判断结果，有“S”型扩增曲线的为阳性，无“S”型扩增曲线的为阴性。根据菌落计数结果计算该方法的最低检出限，结果如图1所示。

上述的“S”型扩增曲线为具有荧光信号基线期、指数增长期、平台期的曲线。

图1表明，该方法的最低检测限可达100CFU/mL。

上述方法的步骤二中SYTO-9在环介导恒温基因扩增反应体系中的浓度为2μM或20μM时、步骤三中矿物油的体积为所述反应体系体积的6或10倍、步骤四中的温度为60℃恒温反应60min或65℃恒温反应20min时，实验结果一致。

实施例2、创伤弧菌特异性检测

采用实施例1的方法对表1中7种浓度为10⁵CFU/mL特异性样品进行检测，同时设置阳性对照创伤弧菌和阴性对照ddH₂O。

表1菌种样品

检测结果如图2所示。

图2表明，只有样品1，即创伤弧菌出现扩增，有“S”型扩增曲线，其余样品均未出现扩增，表明该检测方法的特异性强，与常见弧菌及其他菌无交叉反应。

采用的实施例1的步骤二中SYTO-9在环介导恒温基因扩增反应体系中的浓度为2μM或20μM时、步骤三中矿物油的体积为所述反应体系体积的6或10倍时，步骤四中的温度为60℃恒温反应60min或65℃恒温反应20min时，实验结果与上述结果一致。

实施例3、实际样品的检测

对已经验证不含创伤弧菌的扇贝碱性蛋白胨水培养液，用已知浓度的创伤弧菌进行人工污染，使污染后样品中创伤弧菌浓度分别为10⁵CFU/mL、10⁴CFU/mL、10³CFU/mL，分别制备成样品1、样品2和样品3。

在行驶速度为60km/h的移动检测车上按照实施例1的方法对3个污染后样品(样品1、样品2和样品3)和不含创伤弧菌的扇贝碱性蛋白胨水培养液(样品4、样品5和样品6)进行检测，同时设置阳性对照创伤弧菌和阴性对照ddH₂O,检测结果如表2和图3所示。

表2样品检测结果

实验结果表明，阳性对照和阴性对照检测结果正常，污染后的样品1、2、3有“S”型扩增曲线，表明含有创伤弧菌，阴性样品4、5、6无“S”型扩增曲线，表明不含有创伤弧菌，检测结果与实际样品情况一致，表明本发明方法稳定可靠，适合于在晃动的环境下如行驶的检测车、轮船等上进行创伤弧菌的检测。

采用的实施例1的步骤二中SYTO-9在环介导恒温基因扩增反应体系中的浓度为2μM或20μM时、步骤三中矿物油的体积为所述反应体系体积的6或10倍时，步骤四中的温度为60℃恒温反应60min或65℃恒温反应20min时，实验结果与上述结果一致。

Claims (10)

1.一组引物，由如下(1)-(6)所示的DNA分子组成：

(1)SEQIDNo.1所示的DNA分子；

(2)SEQIDNo.2所示的DNA分子；

(3)SEQIDNo.3所示的DNA分子；

(4)SEQIDNo.4所示的DNA分子；

(5)SEQIDNo.5所示的DNA分子；

(6)SEQIDNo.6所示的DNA分子。

2.一种检测或辅助检测创伤弧菌的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含Bst2.0WarmStart^TMDNA聚合酶、SYTO-9和矿物油；

该试剂盒还包含使用说明书，说明书中记载内容如下：以待测样品的DNA为模板，以权利要求1所述的引物为引物，以SYTO-9为荧光核酸染料、以Bst2.0WarmStart^TMDNA聚合酶为DNA聚合酶，得到反应体系；将反应体系置于离心管中，在离心管中加入矿物油封闭，得到封闭的体系；再将封闭的体系进行环介导恒温基因扩增，实时检测荧光信号；以时间为横坐标，荧光信号对应的电压值为纵坐标作图，得到扩增曲线，扩增曲线为S型的待测样品为含有创伤弧菌的样品，扩增曲线不是S型的待测样品为不含有创伤弧菌的样品；

所述扩增曲线为S型为所述扩增曲线具有荧光信号基线期、指数增长期、平台期。

4.一种检测或辅助检测待测样品中是否含有创伤弧菌的方法，包括如下步骤：以待测样品的DNA为模板，以权利要求1所述的引物为引物，以SYTO-9为荧光核酸染料、以Bst2.0WarmStart^TMDNA聚合酶为DNA聚合酶，得到反应体系；将反应体系置于离心管中，在离心管中加入矿物油封闭，得到封闭的体系；再将封闭的体系进行环介导恒温基因扩增，实时检测荧光信号；以时间为横坐标，荧光信号对应的电压值为纵坐标作图，得到扩增曲线，扩增曲线为S型的待测样品为含有创伤弧菌的样品，扩增曲线不是S型的待测样品为不含有创伤弧菌的样品；

所述扩增曲线为S型为所述扩增曲线具有荧光信号基线期、指数增长期、平台期。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述反应体系的组成如下：1.6μM的SEQIDNo.3所示的DNA分子、1.6μM的SEQIDNo.4所示的DNA分子、0.2μM的SEQIDNo.1所示的DNA分子、0.2μM的SEQIDNo.2所示的DNA分子、0.8μM的SEQIDNo.5所示的DNA分子、0.8μM的SEQIDNo.6所示的DNA分子、1M甜菜碱、8mMMgSO₄、8UBst2.0WarmStart^TMDNA聚合酶、1.6mMdNTP、2.5μL10×PCR扩增缓冲液、2-20μMSYTO-9、2μL模板，余量为ddH₂O，总体系为25μL；

所述Bst2.0WarmStart^TMDNA聚合酶购自NewEnglandBiolabs公司，产品目录号为#M0538L；

所述10×PCR扩增缓冲液的商品名称具体为10×ThermoPolReactionBuffer，购自NewEnglandBiolabs公司，产品目录号为#M0538L。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述SYTO-9的浓度为5μM。

7.根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于：所述矿物油的体积为所述反应体系体积的6-10倍，具体为6倍或10倍。

8.根据权利要求4-7任一所述的方法，其特征在于：所述环介导恒温基因扩增的条件为60℃-65℃恒温反应20min-60min，具体为63℃恒温反应30min。

9.权利要求1所述的引物在制备检测或辅助检测创伤弧菌的产品中的应用。

10.权利要求2或3所述的试剂盒在制备检测或辅助检测创伤弧菌的产品中的应用。