CN103614466A - 用于创伤弧菌的lamp-lfd检测的引物和探针序列 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于创伤弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列，特点是包括三对LAMP的引物TolC-F3、TolC-B3、TolC-FIP、TolC-BIP、TolC-LF、TolC-LB和一条探针TolC--HP步骤，其中Van-FIP为5’端生物素标记引物，探针TolC-HP为5’端异硫氰酸荧光素FITC标记探针，具体序列如序列表中SEQNO1-NO7所示，优点是具有更高的快捷性、特异性和灵敏度，仪器需求简单，有利于创伤弧菌的早期诊断和检测，可满足基层检测机构和现场疫源地检测的需要。

Description

用于创伤弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列
技术领域
本发明涉及一种创伤弧菌的引物和探针序列，尤其是涉及一种用于创伤弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列。 
背景技术
创伤弧菌(Vibrio vulnificus)为革兰氏阴性嗜盐弧菌，普遍存在于河口和海水环境中，鱼类及贝母类等为主要易感水生动物。同时，该菌是人兽共患病的重要病原，人通常是因为生食受污染的海产品，或者伤口接触受污染的海水或海洋动物而感染该细菌。细菌感染患者主要出现原发性败血症、创伤感染、急性胃肠炎和蜂窝织炎等临床症状，其中引起的败血症性休克的死亡率可高达50%。在我国，创伤弧菌感染多发生于沿海地区，被列为食品污染源中八大高危微生物之一，对于该病的诊断和鉴别具有重要的公共卫生学意义。创伤弧菌引起的最初症状并无明显特异性，在感染早期完成诊断和鉴定显得尤为重要。因此，建立一种快速、准确、操作简便而又适用于临床检测的致病菌检测方法具有极大的应用价值。 
传统创伤弧菌鉴定主要通过病原分离与生化鉴定完成，但其存在细菌培养繁琐，检测周期长，不易鉴别相近物种或亚型等缺点。随着分子生物学检测技术的发展，以溶血素基因、DNA回旋酶B亚基（gyrB）、toxR基因、RNA聚合酶σ亚基因子S（rpoS）等基因为靶标建立的常规PCR或real-time PCR技术已成功应用于创伤弧菌的实验室诊断，具有灵敏度高，检测时间短等优点，但该方法必须配备昂贵的仪器设备，需专门的操作人员。 
环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是由日本学者Notomi发明的一种新式恒温核酸扩增技术，其反应依赖于具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，通过4个特异引物，在恒温条件下（65℃左右）高效（30 min~1 h）扩增目标DNA，相比于PCR相关检测技术，具有检测时间更短，仪器依赖性小等优点，具有应用于现场疫源地检测的巨大潜力。LAMP的反应产物可通过琼脂糖凝胶的方法进行判定，但该方法存在操作过程易污染，易出现假阳性的缺点。 
LAMP检测与横向流动试纸条（Lateral flow dipstick, LFD）技术联用（LAMP-LFD）是一种新的检测方法，反应中 FITC 标记的探针与生物素标记的 LAMP 扩增产物特异性杂交，不仅可避免非特异性扩增引起的假阳性，同时还能够避免因琼脂糖凝胶电泳等检测手段引起的体系污染问题，进一步提高了反应的特异性和灵敏度。LFD 检测不需特殊设备以及EB 等有毒试剂，操作者只需将产物和试纸条浸入缓冲液即可，操作简便、安全。LAMP-LFD 结合技术的检测结果可以直接肉眼观察，LFD 试纸条上有控制带和检测带，两条带均显色表示检测结果为阳性，只有控制带显色、检测带不显色表明检测结果为阴性。LAMP-LFD结合方法安全、快捷、高效、高灵敏度且无设备及技术限制，具有其他技术所无法替代的优势。 
目前，该技术已成功运用于桃拉病毒（Taura syndrome virus，TSV）、对虾白斑症病毒（White spot syndrome virus，WSSV）、传染性肌肉坏死病毒（Infectious myonecrosis virus，IMNV）、传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）、鳗利斯顿氏菌（Listonella anguillarum），而国内对于该技术的应用于创伤弧菌的诊断和检测中未见相关报道，即使国外文献（Thanai Surasilp a, Siwaporn Longyant a, Sombat Rukpratanporn b, Pattarin Sridulyakul a，Rapid and sensitive detection of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick targeted to rpoS gene，Molecular and Cellular Probes ，2011，25：158-163）中有相关报道，但其检测灵敏度和检测速度都远不及本发明。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快，检测成本低，检测灵敏度和准确性高的用于创伤弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列。 
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为： 
一种用于创伤弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列，根据创伤弧菌外膜蛋白基因TolC（GenBank登录号：DQ296643）的编码序列设计LAMP的三对引物序列和一条探针序列，引物序列具体如下：
TolC-F3：5’-TCTTGAAGCCACTTATCGC-3’，
TolC-B3：5’-CAGCATCAACATCCAGTACA-3’，
TolC-FIP：5’ –TACCAACATCAAAGCCCGCTTttttCGTGCGTATGAGCAATCT-3’，
TolC-BIP：5’-GATGCCACTCGTCGCCTTttttGCAGTACACTCAAGATGTAGTT-3’，
TolC-LF：5’-GGTTGCTTCTAATGCTGAACG-3’，
TolC-LB: 5’-AACCTATCGAATGCACGCT-3’，
探针TolC-HP：5’-GGTACTCGTACTATTGTGGAT-3’，
其中，TolC-FIP的5’端为生物素标记；探针TolC-HP 的5’端为异硫氰酸荧光素标记。
具体检测方法步骤如下： 
1）根据创伤弧菌外膜蛋白基因TolC（GenBank登录号：DQ296643）的编码序列设计LAMP的三对引物序列和一条探针序列，序列如上所述：
2）配置LAMP反应体系：反应体系各成分的终浓度分别为：外引物TolC-F3和TolC-B3各0.2 μmol/L，内引物TolC-FIP和TolC-BIP各1.6 μmol/L，环引物TolC-LF和TolC-LB各0.4 μmol/L，dNTPs 1.4mmol/L，Tris-HCl（pH 8.8）20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgSO4 6.5mmol/L，(NH4)2SO4 10mmol/L，Triton X-100 0.1%，8U Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)和2 μL样品模版，加双蒸水使反应体系总体积为25 μl；
3）LAMP 反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为63℃，扩增反应时间为35 min；
4）探针杂交和LFD检测：扩增后将20 pmol的探针TolC-HP加入反应体系中，63℃温育5 min，进行杂交，取5 μL杂交液加入100 μL 缓冲液中混匀，然后将LFD试纸条浸入加入杂交液的缓冲液中显色，判断横向流动试纸条检测LAMP扩增的结果。
与现有技术相比，本发明的优点在于： 
1、检测灵敏度高，本方法的检测灵敏度为3.7×102 cfumL-1，相对于背景技术中所涉及的国外文献（Rapid and sensitive detection of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick targeted to rpoS gene）中的检测灵敏度1.5×103 cfumL-1，灵敏度提高了一个数量级。
2、检测时间短，扩增反应只需35 min，从样品基因组DNA的提取到完成结果判断，整个检测流程仅需80 min，比常规PCR检测技术缩短约2h，相对于背景技术中所涉及的国外文献中报道的方法，仅扩增反应就需要90min，按照文章所述，使用试剂盒提取基因组DNA，所需时间约30min，那么从样品基因组DNA的提取到完成结果判断所需时间约为130 min；而本发明涉及的方法从样品基因组DNA的提取到完成结果判断，整个检测流程仅需80 min，比背景技术中所涉及的国外文献报道的方法缩短50min，大幅度提高检测速度。 
3、特异性强，所用的特异性引物根据创伤弧菌的外膜蛋白基因中的八个不同区域设计，并且还有DNA的特异性探针，可有效避免利用琼脂糖凝胶电泳、荧光染料等方法引起的假阳性问题。从背景技术中所涉及的国外文献提供的图片来看，它存在着以下几个问题，一是，LAMP扩增反应的图片不够清晰，条带间的分离度不好；二是从琼脂糖凝胶电泳的结果来看，90min之内的扩增产物量明显不是很好，说明扩增的峰值不大，在加样孔有大量扩增，这应属于无效扩增，但在利用LFD检测的时候，这个无效扩增结果显示也可能是阳性，会影响结果判断；三是，这样的扩增结果说明，筛选的引物不是最优的，远不及本发明筛选的引物的检测效果。 
4、检测成本低。本发明提供的基因组DNA提取方法，样品费用<0.5元/次，而上述国外文献中使用试剂盒提取样品的基因组DNA，若按科研中常用的TaKaRa通用型基因组DNA提取试剂盒来计费，市场价格为350元/50次，即样品费用为7元/次；本发明采用的引物和探针的LAMP-LFD检测方法的成本仅为上述国外文献中检测方法的0.07倍，大幅度节约检测成本。 
5、仪器设备要求低，无需常规PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统等，只需一个水浴锅即可完成检测。 
6、操作简单，结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，稍具分子生物学基础的人员即可完成操作；检测结果清晰明显，肉眼观察即可判断。 
7、对人身和环境更加安全，检测过程中不涉及EB等有毒试剂。 
综上所述，使用本发明的引物和探针采用LAMP-LFD方法对创伤弧菌进行检测，具有更高的快捷性、特异性和灵敏度，仪器需求简单，有利于创伤弧菌的早期诊断和检测，可满足基层检测机构和现场疫源地检测的需要。 
附图说明
图1为LAMP特异性实验结果；M：100 bp Plus DNA ladder (Fermentas, 美国)；1：以无菌去离子水作为模板；2：以创伤弧菌ATCC 27562的基因组DNA为模板；3～11：分别以哈维氏弧菌ATCC 33866、河流弧菌ATCC 33809、副溶血弧菌ATCC 33847、轮虫弧菌DSM17186T、溶藻弧菌ATCC 17749、鳗弧菌香鱼分离株、嗜水气单胞菌（Ah0201）、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、单增李斯特菌ATCC 19115的基因组DNA为模板； 
图2为LAMP-LFD特异性实验结果；M：100 bp Plus DNA ladder (Fermentas, 美国)；1：以无菌去离子水作为模板；2：以创伤弧菌ATCC 27562的基因组DNA为模板；3～11：分别以哈维氏弧菌ATCC 33866、河流弧菌ATCC 33809、副溶血弧菌ATCC 33847、轮虫弧菌DSM17186T、溶藻弧菌ATCC 17749、鳗弧菌香鱼分离株、嗜水气单胞菌（Ah0201）、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、单增李斯特菌ATCC 19115的基因组DNA为模板；
图3为LAMP检测的灵敏度结果；M：100 bp Plus DNA ladder (Fermentas, 美国)；1：以无菌去离子水作为模板；2~10：创伤弧菌ATCC27562原始菌液（3.7×109 cfumL-1）的100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍菌液提取的基因组DNA作为模板；
图4为LAMP-LFD检测的灵敏度结果；M：100 bp Plus DNA ladder (Fermentas, 美国)；1：以无菌去离子水作为模板；2~10：创伤弧菌ATCC 27562原始菌液（3.7×109 cfumL-1）的100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍菌液提取的基因组DNA作为模板；
图5为PCR检测的灵敏度结果；M：100 bp Plus DNA ladder (Fermentas, 美国)；1：以无菌去离子水作为模板；2~10：创伤弧菌ATCC 27562原始菌液（3.7×109 cfumL-1）的100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍菌液提取的基因组DNA作为模板。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 
实施例1 
LAMP-LFD 技术检测创伤弧菌的方法的建立
1. 引物设计：根据NCBI中已经发表的创伤弧菌外膜蛋白基因TolC（GenBank登录号：DQ296643）的编码序列进行设计，其中，引物序列具体如下：
TolC-F3：5’-TCTTGAAGCCACTTATCGC-3’，
TolC-B3：5’-CAGCATCAACATCCAGTACA-3’，
TolC-FIP：5’ –TACCAACATCAAAGCCCGCTTttttCGTGCGTATGAGCAATCT-3’，
TolC-BIP：5’-GATGCCACTCGTCGCCTTttttGCAGTACACTCAAGATGTAGTT-3’，
TolC-LF：5’-GGTTGCTTCTAATGCTGAACG-3’，
TolC-LB: 5’-AACCTATCGAATGCACGCT-3’， TolC-FIP的5’端为生物素标记；
同时，设计一套探针，能够特异性结合LAMP扩增产物，用于LFD检测，序列如下: 
TolC-HP：5’-GGTACTCGTACTATTGTGGAT-3’，5’端为异硫氰酸荧光素标记。
2. 样品DNA提取：采用水煮法。创伤弧菌ATCC 27562菌株于TCBS培养基上划线培养（28℃），挑取单克隆于TSB培养基中培养10 h-12 h（28℃，150rpm/min）。取1 mL细菌的液体培养悬液于1.5 mL离心管中，12000 rpm离心2 min，弃上清；使用100 mL细菌裂解液（Tris-HCl 0.1 molL-1，蛋白酶K 0.2 μgμL-1，Triton X-100 2.0%）充分悬浮细菌，沸水浴10 min，立即冰浴7 min；重复上一步操作1次；12000 rpm离心2 min，取上清用作LAMP和PCR扩增的模板，-30℃贮存备用。 
3. 创伤弧菌LAMP反应 
利用步骤1设计的特异性引物，以创伤弧菌基因组DNA为模版进行LAMP扩增。
3.1 LAMP反应体系，各成分的终浓度分别为：TolC-F3和TolC-B3各0.2 μmol/L，TolC-FIP和TolC-BIP各1.6 μmol/L，TolC-LF和TolC-LB各0.4 μmol/L，dNTPs 1.4 mmol/L，Tris-HCl（pH 8.8）20 mmol/L，KCl 10 mmol/L，MgSO4 6.5 mmol/L，(NH4)2SO4 10 mmol/L，Triton X-100 0.1%，8U Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)和2 μL样品模版，加双蒸水使反应体系总体积为25 μl； 
3.2 LAMP反应条件：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为63℃，扩增反应时间为35 min。
4. 探针杂交和LFD检测：扩增后将20 pmol的TolC-HP探针加入反应体系中，63℃温育5 min，进行杂交，取5 μL杂交液加入100 μL buffer中混匀，然后将LFD试纸条浸入加入杂交液的buffer中显色，判断LAMP的扩增情况。 
 实施例2 
使用本发明的引物和探针进行创伤弧菌LAMP-LFD检测的特异性测定
利用所设计的特异性引物和探针，分别以创伤弧菌ATCC 27562、哈维氏弧菌ATCC 33866、河流弧菌ATCC 33809、副溶血弧菌ATCC 33847、轮虫弧菌DSM 17186T、溶藻弧菌ATCC 17749、鳗弧菌香鱼分离株、嗜水气单胞菌（Ah0201）、金黄色葡萄球菌ATCC 6538以及单增李斯特菌ATCC 19115等的基因组DNA为模版，按上述实施例1的步骤3和步骤4进行LAMP-LFD反应，验证引物和探针的特异性，双蒸水作为阴性对照。结果如图1和图2所示，利用电泳法（图1）和LFD（图2）都只能从创伤弧菌的基因组DNA样品中扩增获得目的条带，其它样品无扩增条带，说明使用本发明提供的引物和探针进行LAMP-LFD检测，具有良好的特异性。
 实施例3 
使用本发明的引物和探针进行创伤弧菌LAMP-LFD检测的灵敏度测定
采用上述实施例1的步骤2的水煮法提取创伤弧菌的基因组DNA，以此作为LAMP-LFD反应的模板起始浓度（相当于3.7×109 cfumL-1），进行10倍梯度稀释，分别作为模板，按上述实施例1的步骤3和步骤4进行LAMP-LFD反应，验证引物和探针的灵敏度，双蒸水作为阴性对照。结果如图3、图4和图5所示，使用本发明提供的引物和探针进行的LAMP-LFD检测的灵敏度为3.7×102 cfumL-1（图4），与LAMP的扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳检测获得的灵敏度一致（图3），是TolC-F3和TolC-B3作为引物建立的常规PCR检测方法的100倍（图5）。
 实施例4 
用本发明LAMP-LFD技术具体检测人工污染蛤蜊组织中的创伤弧菌。
1. 创伤弧菌人工污染及待检测样品基因组DNA提取 
实验蛤蜊购自浙江宁波当地超市，在去壳的蛤蜊样品中添加等体积的无菌碱性蛋白冻水，充分匀浆。取适量匀浆样品经TCBS平板检验，其余样品于-80℃贮存。TCBS过夜培养，确认无弧菌感染后用于后续试验。
创伤弧菌ATCC 27562菌株于TCBS培养基上划线培养（28℃），挑取单克隆于TSB培养基中增菌培养10 h-12 h（28 ℃，150 rpm）至菌液浓度约为3.7×109 cfumL-1。副溶血弧菌ATCC 33847菌株于TCBS培养基上划线培养（28℃），挑取单克隆于TSB培养基中增菌培养10 h-12 h（28 ℃，150 rpm）至菌液浓度约为1×109 cfumL-1。利用无菌水10倍浓度梯度连续稀释菌液。取创伤弧菌ATCC 27562的3.7×105 cfumL-1、3.7×104 cfumL-1、3.7×103 cfumL-1、3.7×102 cfumL-1、3.7×101 cfumL-15个稀释浓度和副溶血弧菌ATCC 33847菌株的1×107 cfumL-1稀释浓度的菌液各1 mL，分别与解冻的蛤蜊组织匀浆等体积混合。每个菌液稀释度制备5个重复。充分混匀后，300 rpm离心10 min去除蛤蜊组织，取上清液于新的离心管中，18000 rpm离心10 min。除去上清液，利用100 mL细菌裂解液（Tris-HCl 0.1 molL-1，蛋白酶K 0.2 μgμL-1，Triton X-100 2.0%）充分悬浮细菌，沸水浴10 min，立即冰浴7 min；重复上一步操作1次；12000 rpm离心2 min，取上清用作LAMP和PCR扩增的模板，-30 ℃贮存备用。 
2. LAMP反应体系配制及反应条件，按照实施例1步骤3进行。 
3. LFD显色，检测结果判断 
经LAMP扩增后，将20 pmol的TolC-HP探针加入反应体系中，63℃温育5 min，进行杂交，取5 μL杂交液加入100 μL buffer中混匀，然后将LFD试纸条浸入加入杂交液的buffer中显色。如果质控线和检测线位置均出现条带，证明检测结果阳性；如果仅有质控线位置出现条带，证明结果阴性；如果质控线和检测线位置均未出现条带，证明检测失败。同时，上述模板利用常规PCR技术检测，并与本发明LAMP-LFD检测结果比较（如表1）。
结果显示在蛤蜊组织中等体积污染不同浓度的创伤弧菌后，LAMP-LFD灵敏度浓度以上的创伤弧菌污染样品的检测结果均为阳性，PCR只能检测到用3.7×104 cfumL-1污染的组织样品；LAMP-LFD对副溶血弧菌污染的蛤蜊样品检测的结果为阴性，特异性良好，实验结果如表1所示。 
表1 利用创伤弧菌和副溶血弧菌人工污染蛤蜊组织样品后本发明LAMP-LFD检测和PCR检测结果 
注：“+”表示检测结果阳性；“-”表示检测结果阴性。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。 
Figure IDA0000411705630000021
Figure IDA0000411705630000031

Claims (1)

1.一种用于创伤弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列，其特征在于根据创伤弧菌外膜蛋白基因TolC（GenBank登录号：DQ296643）的编码序列设计LAMP- LFD的三对引物序列和一条探针序列，引物序列具体如下：
TolC-F3：5’-TCTTGAAGCCACTTATCGC-3’，
TolC-B3：5’-CAGCATCAACATCCAGTACA-3’，
TolC-FIP：5’ –TACCAACATCAAAGCCCGCTTttttCGTGCGTATGAGCAATCT-3’，
TolC-BIP：5’-GATGCCACTCGTCGCCTTttttGCAGTACACTCAAGATGTAGTT-3’，
TolC-LF：5’-GGTTGCTTCTAATGCTGAACG-3’，
TolC-LB: 5’-AACCTATCGAATGCACGCT-3’，
探针TolC-HP：5’-GGTACTCGTACTATTGTGGAT-3’，
其中，TolC-FIP的5’端为生物素标记；探针TolC-HP 的5’端为异硫氰酸荧光素标记。
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C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20140305

Assignee: Ningbo snow Verne Biotechnology Co. Ltd.

Assignor: Ningbo University

Contract record no.: 2016990000470

Denomination of invention: Primers for loop-mediated isothermal amplification-lateral flow dipstick (LAMP-LFD) detection of vibrio vulnificus and probe sequences

Granted publication date: 20150826

License type: Common License

Record date: 20161114

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