CN105039541A - 用于河流弧菌lamp-lfd检测的引物和探针序列及引物和探针的应用 - Google Patents
用于河流弧菌lamp-lfd检测的引物和探针序列及引物和探针的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于河流弧菌LAMP-LFD检测的引物和探针及引物和探针的应用，特点是包括三对LAMP的引物VflompU-F3、VflompU-B3；VflompU-FIP、VflompU-BIP；VflompU-LF、VflompU-LB；和一条探针VflompU-HP，核苷酸序列如SEQ？NO1-NO7所示，利用上述的引物和探针，通过LAMP反应体系扩增步骤，探针杂交LAMP反应产物步骤，使用LFD检测步骤实现河流弧菌的可视化检测，优点是具有更高的快捷性、特异性和灵敏度，仪器需求简单，有利于河流弧菌的早期诊断和检测，可满足基层检测机构和现场疫源地检测的需要。
Description
技术领域
本发明涉及检测河流弧菌的引物和探针序列，尤其是涉及一种用于河流弧菌LAMP-LFD检测的引物和探针序列及引物和探针的应用。
背景技术
河流弧菌为嗜盐性革兰性阴性菌，广泛分布于河流和近海口水域，可导致鱼虾贝等多种水生动物患病，是海水养殖的主要病原菌之一。同时，河流弧菌可从不同水体、城市污水、动物和人类粪便，以及水产品中分离得到，感染后导致人出现严重的水样腹泻，伴随呕吐、腹痛、发烧，以及不同程度的脱水等症状。在美国，该细菌还被认为是引起婴儿小肠结肠炎的重要病原之一。因此，河流弧菌已成为一种重要的全球性人兽共患病病原菌，不仅危害水产养殖业的发展，而且对食品安全和人类健康也构成了严重威胁，迫切需要建立快捷、灵敏，特异的检测技术用于基层检测。
目前，河流弧菌的检测以传统的细菌分离培养、生化鉴定为主，但是该方法存在检测周期长、费时费力等缺点，而且检测人员需要专业的知识背景，远不能满足疾病的快速诊断和及时治疗。尤其，该病原菌被认定为人兽共患病病原菌使得对于该病原的快速准确鉴定变得更加重要。以蛋白或核酸为检测靶标的分子检测技术，因其检测快速、灵敏度和特异性高等优点，在病原微生物的诊断与鉴定等领域获得了广泛使用。但针对河流弧菌分子检测技术的相关报道还很少，国内的相关专家对河流弧菌的检测研究进行了一定的探索。也取得了一些有效的成果。鄢庆枇等通过利用灭火的河流弧菌抗原制备了效价较高的特异性抗血清，利用该血清建立了河流弧菌的荧光抗体检测技术应用于牙鲆(Paralichthysolivaceus)体内该病原的检测；文万侥等基于toxR基因建立了河流弧菌的PCR检测技术，针对细菌纯培养物的检测灵敏度可达103cfu·mL-1数量级；曹际娟等将PCR技术与高效液相色谱联合应用于河流弧菌的检测，也取得了较好的效果。但是，这些方法存在着实验设备要求高，工作环境严格，仅限于实验室诊断，不能很好的在基层检测中普及推广。
环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）自被报道以来，凭借其低设备依赖性、高灵敏度和特异性等优势，在基于核酸扩增的检测领域取得了巨大成功。但该方法在检测过程的某些阶段也存在很大的改善空间，其中一个重要的亟待解决的问题就是针对扩增产物做到如何有效、准确判读。常用的方法是使用琼脂糖凝胶电泳，该方法成本较低，但需接触EB等有毒试剂，而且很难避免环境中气溶胶污染；利用浊度或荧光检测不仅增加了检测成本，而且易产生假阳性；这在一定程度上限制了该技术的推广。LAMP-LFD技术是将LAMP的反应产物与特异性的探针杂交，通过荧光素标记在横向流动试纸条（lateralflowdipstick，LFD）上完成显色和结果判读。该方法不需要EB等有毒试剂，也摆脱了对电泳装置和凝胶成像系统等的依赖，肉眼即可观察到反应结果，在微生物的基层检测和现场快速检测中展现了重大潜力。目前，该技术已成功运用于传染性脾肾坏死病毒（Infectiousspleenandkidneynecrosisvirus，ISKNV）、传染性肌肉坏死病毒（Infectiousmyonecrosisvirus，IMNV）、创伤弧菌（Vibriovulnificus），以及海豚链球菌（Strepstococcusiniae）等水产病原微生物的检测，国内外还未见报道将该技术应用于河流弧菌的诊断和检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快，检测成本低，检测灵敏度和准确性高的用于河流弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列及引物和探针的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一种用于河流弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列，根据河流弧菌的外膜蛋白ompU（GenBank登录号：KC182592）的编码序列设计LAMP的三对引物序列和一条探针序列，引物序列具体如下：
VflompU-F3：5’-TCATGGCTTACCACGGTA-3’
VflompU-B3：5’-GGTGTAAGACGCTGCTAG-3’，
VflompU-FIP：5’-AGTTGAACCGTCATCGCTACGttttGGCCAGTTCTCTGACCTA-3’，
VflompU-BIP：5’-TCTACGCAATCGGCGACACttttCTTTGTCTTGGTCAGCGT-3’，
VflompU-LF：5’-ACGGTAAGTTGCACGTAGAG-3’，
VflompU-LB：5’-GTGAAACTAGGTGCTGGCT-3’，VflompU-FIP的5’端为生物素标记；
探针序列如下：
VflompU-HP：5’-CTCTGATAACAAACAAGATGG-3’，5’端为异硫氰酸荧光素标记。
2、一种用于河流弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列在河流弧菌LAMP-LFD可视化检测方法中的应用，具体检测方法步骤如下：
1）配置LAMP反应体系：反应体系各成分的终浓度分别为：VflompU-F3和VflompU-B3各0.2μmol/L，VflompU-FIP和VflompU-BIP各1.6μmol/L，VflompU-LF和VflompU-LB各0.4μmol/L，dNTPs1.4mmol/L，Tris-HCl（pH8.8）20mmol/L，KCl10mmol/L，MgSO46.5mmol/L，(NH4)2SO410mmol/L，TritonX-1000.1%，8UBstDNA聚合酶大片段(NewEnglandBiolabs)和2μL样品模版，加双蒸水使反应体系总体积为25μl；
2）LAMP反应条件：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为63℃，扩增反应时间为20min；
3）探针杂交和LFD检测：扩增后将20pmol的VflompU-HP探针加入反应体系中，63℃温育5min，进行杂交，取5μL杂交液加入100μLbuffer中混匀，然后将LFD试纸条浸入加入杂交液的缓冲液中显色，判断横向流动试纸条检测LAMP扩增的结果。
3、一种根据权利要求1所述的用于河流弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针在制备河流弧菌LAMP-LFD可视化检测试剂盒中的应用，该试剂盒包括LAMP反应体系：反应体系各成分的终浓度分别为VflompU-F3和VflompU-B3各0.2μmol/L，VflompU-FIP和VflompU-BIP各1.6μmol/L，VflompU-LF和VflompU-LB各0.4μmol/L，dNTPs1.4mmol/L，Tris-HCl（pH8.8）20mmol/L，KCl10mmol/L，MgSO46.5mmol/L，(NH4)2SO410mmol/L，TritonX-1000.1%，8UBstDNA聚合酶大片段(NewEnglandBiolabs)和2μL样品模版，加双蒸水使反应体系总体积为25μl。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1.灵敏度高，对河流弧菌纯培养物的检测灵敏度为1.0×102cfu/mL；
2.特异性强，所用的特异性引物根据河流弧菌的外膜蛋白基因中的八个不同区域设计，并且还有DNA的特异性探针，可有效避免利用琼脂糖凝胶电泳、荧光染料等方法引起的假阳性问题；
3.检测时间短，扩增反应只需20min，从样品基因组DNA的提取到完成结果判断，整个检测流程仅需70min，比常规PCR检测技术缩短约2h；
4.仪器设备要求低，无需常规PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统等，只需一个水浴锅即可完成检测；
5.操作简单，结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，稍具分子生物学基础的人员即可完成操作；检测结果清晰明显，肉眼观察即可判断；
6.对人身和环境更加安全，检测过程中不涉及EB等有毒试剂。
综上所述，使用本发明的引物和探针采用LAMP-LFD方法对河流弧菌进行检测，具有更高的便捷性、特异性和灵敏度，仪器需求简单，有利于河流弧菌的早期诊断和检测，可满足基层检测机构和现场疫源地检测的需要。
附图说明
图1为LAMP特异性实验结果。M：100bpPlusDNAladder(Fermentas,美国)；1：以无菌去离子水作为模板；2：以河流弧菌ATCC33809的基因组DNA为模板；3～11：分别以迟缓爱德华氏菌MCCC235、嗜水气单胞菌ATCC7966、创伤弧菌ATCC27562、哈维氏弧菌ATCC33866、海豚链球菌ATCC29178、溶藻弧菌ATCC33787、鳗弧菌ayu-H080701、单增李斯特菌ATCC19115、铜绿假单胞菌ATCC9027的基因组DNA为模板；
图2为LAMP-LFD特异性实验结果。1：以无菌去离子水作为模板；2：以河流弧菌ATCC33809的基因组DNA为模板；3～11：分别以迟缓爱德华氏菌MCCC235、嗜水气单胞菌ATCC7966、创伤弧菌ATCC27562、哈维氏弧菌ATCC33866、海豚链球菌ATCC29178、溶藻弧菌ATCC33787、鳗弧菌ayu-H080701、单增李斯特菌ATCC19115、铜绿假单胞菌ATCC9027的基因组DNA为模板；
图3为LAMP检测的灵敏度结果。M：100bpPlusDNAladder(Fermentas,美国)；1：以无菌去离子水作为模板；2~10：浓度依次为1.0×108,1.0×107,1.0×106,1.0×105,1.0×104,1.0×103,1.0×102,1.0×101,1.0×100cfu·mL-1的河流弧菌ATCC33809菌液提取的基因组DNA作为模板；
图4为LAMP-LFD可视化检测的灵敏度结果。1：以无菌去离子水作为模板；2～10：浓度依次为1.0×108,1.0×107,1.0×106,1.0×105,1.0×104,1.0×103,1.0×102,1.0×101,1.0×100cfu·mL-1的河流弧菌ATCC33809菌液提取的基因组DNA作为模板；
图5为PCR检测的灵敏度结果。M：100bpPlusDNAladder(Fermentas,美国)；1：以无菌去离子水作为模板；2～10：浓度依次为1.0×108,1.0×107,1.0×106,1.0×105,1.0×104,1.0×103,1.0×102,1.0×101,1.0×100cfu·mL-1的河流弧菌ATCC33809菌液提取的基因组DNA作为模板。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
LAMP-LFD技术检测河流弧菌方法的建立
1.引物设计：根据NCBI中已经发表的河流弧菌的外膜蛋白ompU（GenBank登录号：KC182592）的编码序列进行设计，其中，引物序列具体如下：
VflompU-F3：5’-TCATGGCTTACCACGGTA-3’，
VflompU-B3：5’-GGTGTAAGACGCTGCTAG-3’，
VflompU-FIP：5’-AGTTGAACCGTCATCGCTACGttttGGCCAGTTCTCTGACCTA-3’，
VflompU-BIP：5’-TCTACGCAATCGGCGACACttttCTTTGTCTTGGTCAGCGT-3’，
VflompU-LF：5’-ACGGTAAGTTGCACGTAGAG-3’，
VflompU-LB：5’-GTGAAACTAGGTGCTGGCT-3’，
探针VflompU-HP：5’-CTCTGATAACAAACAAGATGG-3’，
其中，VflompU-FIP的5’端为生物素标记，探针VflompU-HP的5’端为异硫氰酸荧光素标记。
2.样品DNA提取：将-70℃长期保存的河流弧菌菌种（Vibriofluvialis，ATCC33809）划线于TCBS固体培养基，30℃培养过夜，挑取单克隆于5mLLB液体培养基中，30℃，165r/min摇床培养24小时左右，进行菌落计数后调整浓度至1.0×108cfu/mL，作为起始浓度，通过10倍浓度梯度稀释，获得1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100cfu/mL等9个浓度梯度的菌液各1mL，采用商品化的试剂盒提取基因组DNA，溶解于50μL无菌ddH2O用于LAMP和PCR验证。
3.河流弧菌LAMP反应
利用步骤1设计的特异性引物，以河流弧菌基因组DNA为模版进行LAMP扩增。
3.1LAMP反应体系，各成分的终浓度分别为：外引物VflompU-F3和VflompU-B3各0.2μmol/L，内引物VflompU-FIP和VflompU-BIP各1.6μmol/L，环引物VflompU-LF和VflompU-LB各0.4μmol/L，dNTPs1.4mmol/L，Tris-HCl（pH8.8）20mmol/L，KCl10mmol/L，MgSO46.5mmol/L，(NH4)2SO410mmol/L，TritonX-1000.1%，8UBstDNA聚合酶大片段(NewEnglandBiolabs)和2μL样品模版，加双蒸水使反应体系总体积为25μL；
3.2LAMP反应条件：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为63℃，扩增反应时间为20min。
4.探针杂交和LFD检测：扩增后将20pmol的VflompU-HP探针加入反应体系中，63℃温育5min，进行杂交，取5μL杂交液加入100μLbuffer中混匀，然后将LFD试纸条浸入加入杂交液的buffer中显色，判断LAMP的扩增情况。
实施例2
使用本发明的引物和探针进行河流弧菌LAMP-LFD检测的特异性测定
利用所设计的特异性引物和探针，分别以河流弧菌ATCC33809、迟缓爱德华氏菌MCCC235、嗜水气单胞菌ATCC7966、创伤弧菌ATCC27562、哈维氏弧菌ATCC33866、海豚链球菌ATCC29178、溶藻弧菌ATCC33787、鳗弧菌ayu-H080701、单增李斯特菌ATCC19115、铜绿假单胞菌ATCC9027等的基因组DNA为模版，按上述实施例1的步骤3和步骤4进行LAMP-LFD反应，验证引物和探针的特异性，双蒸水作为阴性对照。结果如图1和图2所示，利用电泳法（图1）和LFD（图2）都只能从河流弧菌的基因组DNA样品中扩增获得目的条带，其它样品无扩增条带，说明使用本发明提供的引物和探针进行LAMP-LFD检测，具有良好的特异性。
实施例3
使用本发明的引物和探针进行河流弧菌LAMP-LFD检测的灵敏度测定
采用上述实施例1的步骤2的方法提取河流弧菌的基因组DNA，进行10倍梯度稀释，选择1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100cfu/mL等作为模板，按上述实施例1的步骤3和步骤4进行LAMP-LFD反应，验证引物和探针的灵敏度，双蒸水作为阴性对照。结果如图3、图4和图5所示，使用本发明提供的引物和探针进行的LAMP-LFD检测的灵敏度为1.0×102cfu·mL-1（图4），与LAMP的扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳检测获得的灵敏度一致（图3），是VflompU-F3和VflompU-B3作为引物建立的常规PCR检测方法的100倍（图5）。
实施例4
用本发明LAMP-LFD技术具体检测人工污染的大黄鱼组织中的河流弧菌。
1.河流弧菌人工污染及待检测样品基因组DNA提取
取若干份健康大黄鱼的肝脏组织100mg加入少量无菌水，充分匀浆后，定容至1mL。取1mL新鲜培养的河流弧菌菌液（约1.0×108cfu/mL）进行10倍浓度梯度稀释，分别取浓度为1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101cfu/mL的菌液各1mL与大黄鱼肝组织匀浆液等体积混匀。每个浓度平行制备三个样品。取1mL细菌污染的组织样品按实施例1步骤2所述方法提取基因组DNA。各取2μL用于LAMP-LFD和PCR扩增。健康大黄鱼的肝脏组织匀浆液作阴性对照。
2.LAMP反应体系配制及反应条件，按照实施例1步骤3进行。
3.LFD显色，检测结果判断，按照实施例1步骤4进行。
结果显示在大黄鱼组织中等体积污染不同浓度的河流弧菌后，LAMP-LFD可以从用1.0×103cfu/mL污染的肝脏组织中稳定检测到病原，检测灵敏度为20CFU。PCR只能从用1.0×104cfu/mL污染的肝脏组织中稳定检测到病原。
表1利用河流弧菌人工污染大黄鱼组织样品后本发明LAMP-LFD检测和PCR检测结果
注：“+”表示检测结果阳性；“-”表示检测结果阴性。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种用于河流弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列，其特征在于根据河流弧菌的外膜蛋白ompU（GenBank登录号：KC182592）的编码序列设计LAMP的三对引物序列和一条探针序列，引物序列具体如下：
VflompU-F3：5’-TCATGGCTTACCACGGTA-3’
VflompU-B3：5’-GGTGTAAGACGCTGCTAG-3’，
VflompU-FIP：5’-AGTTGAACCGTCATCGCTACGttttGGCCAGTTCTCTGACCTA-3’，
VflompU-BIP：5’-TCTACGCAATCGGCGACACttttCTTTGTCTTGGTCAGCGT-3’，
VflompU-LF：5’-ACGGTAAGTTGCACGTAGAG-3’，
VflompU-LB：5’-GTGAAACTAGGTGCTGGCT-3’，VflompU-FIP的5’端为生物素标记；
探针序列如下：VflompU-HP：5’-CTCTGATAACAAACAAGATGG-3’，5’端为异硫氰酸荧光素标记。
2.一种根据权利要求1所述的用于河流弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列在河流弧菌LAMP-LFD可视化检测方法中的应用。
3.根据权利要求2所述的河流弧菌的LAMP-LFD检测方法，其特征在于具体检测方法步骤如下：
1）配置LAMP反应体系：反应体系各成分的终浓度分别为：VflompU-F3和VflompU-B3各0.2μmol/L，VflompU-FIP和VflompU-BIP各1.6μmol/L，VflompU-LF和VflompU-LB各0.4μmol/L，dNTPs1.4mmol/L，Tris-HCl（pH8.8）20mmol/L，KCl10mmol/L，MgSO46.5mmol/L，(NH4)2SO410mmol/L，TritonX-1000.1%，8UBstDNA聚合酶大片段(NewEnglandBiolabs)和2μL样品模版，加双蒸水使反应体系总体积为25μl；
2）LAMP反应条件：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为63℃，扩增反应时间为20min；
3）探针杂交和LFD检测：扩增后将20pmol的VflompU-HP探针加入反应体系中，63℃温育5min，进行杂交，取5μL杂交液加入100μLbuffer中混匀，然后将LFD试纸条浸入加入杂交液的缓冲液中显色，判断横向流动试纸条检测LAMP扩增的结果。
4.一种根据权利要求1所述的用于河流弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针在制备河流弧菌LAMP-LFD可视化检测试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的河流弧菌LAMP-LFD可视化检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括LAMP反应体系：反应体系各成分的终浓度分别为VflompU-F3和VflompU-B3各0.2μmol/L，VflompU-FIP和VflompU-BIP各1.6μmol/L，VflompU-LF和VflompU-LB各0.4μmol/L，dNTPs1.4mmol/L，Tris-HCl（pH8.8）20mmol/L，KCl10mmol/L，MgSO46.5mmol/L，(NH4)2SO410mmol/L，TritonX-1000.1%，8UBstDNA聚合酶大片段(NewEnglandBiolabs)和2μL样品模版，加双蒸水使反应体系总体积为25μl。
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2015
- 2015-07-14 CN CN201510411863.2A patent/CN105039541A/zh active Pending
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |