CN108103152A - 一种鳗利斯顿氏菌快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鳗利斯顿氏菌快速检测方法，所提供的检测方法最低能够检测出1pg/μL鳗利斯顿氏菌基因组模板，对人工污染的样品最低检测线为3.4×10²cfu·mL^‑1，比常规的Real‑time PCR检测方法高出一个数量级，且稳定性良好。因此，利用本研究建立的Real‑time RPA检测技术，能特异、准确、高效地检测出鳗利斯顿氏菌，而且操作简单、耗时短，有望成为鳗利斯顿氏菌的常规检测方法。

Description

一种鳗利斯顿氏菌快速检测方法

技术领域

本发明属于病害微生物检测技术领域，具体涉及一种鳗利斯顿氏菌快速检测方法。

背景技术

弧菌(Vibrio)病是造成鱼、虾、贝类危害较为严重的细菌性疾病之一,水产养殖业常因其遭受巨大的经济损失。它是属于一种典型的条件致病菌，当外界水体环境恶化，各种因素造成水生动物抵抗力下降时，致病弧菌会迅速繁殖，导致水生动物感染弧菌病。鳗利斯顿氏菌(Listonellaanguillarum)，也叫作鳗弧菌(Vibrio anguillarum)，是导致鱼、虾、贝类等弧菌病的最主要病原之一,其能感染的寄主范围广泛,能感染鳗鲡(Anguillajaponica)、大菱鲆(Psetta maxima)、大黄鱼(Larimichthyscrocea)、半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)、鲈鱼(Lateolabrax japonicus)等多种鱼类的败血症。然而传统的鳗利斯顿氏菌检测方法，例如选择性培养基和生理生化试验检测，尽管也能检测出病原体，但是费力、费时和低灵敏度等缺点使得其不能满足病害防治的要求。

发明内容

本发明提供一种鳗利斯顿氏菌快速检测方法，能够快速的检测鳗利斯顿氏菌，区分有毒株和无毒株，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种非疾病诊断治疗目的的检测鳗利斯顿氏菌的方法，所述的方法包括如下的步骤：

1)准备待检测菌的核酸样品

提取待检测菌的基因组DNA作为扩增样品备用；

2)构建Real-time RPA反应体系体系

将用于扩增鳗利斯顿氏菌目的基因的正向引物和反向引物和RPA探针加入到重组酶聚合酶扩增(RPA)体系中，再加入步骤1)制备的核酸样品；加入冻干酶粉，混匀后，转移到PCR管中，加入启动剂MgAc后进行荧光定量反应；采集荧光信号,判断是否形成熔解曲线，以溶解曲线存在与否判定是否存在有毒鳗利斯顿氏菌。

所述的正向引物，其核苷酸序列如下：

5′-TTCCCAGGGTTAGTGATAAATAAAGTAGGC-3′(30bp)(SEQ ID NO:1)

反向引物，其核苷酸序列如下：

5′-ACGCATAGTTAGCTGGAAGGTTAATGGAGTG-3′(31bp)(SEQ ID NO:2)；

所述的RPA探针，其核苷酸序列如下：

5′-ACCGTGGATATGAAGCATGCGACATCGGGTGGTTCAACGTTCAGCTA-3′(47bp)(SEQ IDNO:3)；

其中探针序列的第30个碱基胸腺嘧啶T用FAM进行标记，第31个碱基鸟嘌呤G由四氢呋喃(THF)替换，第32个碱基胸腺嘧啶T(已加粗)用BHQ进行标记，3′端进行C3Spacer修饰。

所述的荧光定量反应，其反应条件如下：恒等温37℃温度下30s为一个循环，共40个循环。

本发明所使用的引物和探针，可用于制备检测鳗利斯顿氏菌的制品。

本发明所提供的检测方法能够在20min内完成样品的检测，相比于其他检测技术，反应时间大大缩短；经特异性实验验证，本发明所提供的引物、探针和检测方法在其他弧菌属细菌如哈维氏弧菌、创伤弧菌和河流弧菌等，及铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌其他3种常见致病菌均无交叉反应。使用结果表明本发明所建立的检测方法灵敏度高、重复性好，操作简单，检测速度快、成本低，不需要特殊的仪器设备和实验条件，设备便携，广泛适合于鳗利斯顿氏菌的POCT。

附图说明

图1：引物筛选结果图；

图2：温度优化结果图；

图3：灵敏度检测结果图；

图4：特异性检测结果图；

图5：Real-time RPA检测方法重复性实验结果图。

具体实施方式

申请人发现，鳗利斯顿氏菌分为有毒株和无毒株，而不产生金属蛋白酶(zincmetalloprotease,empA)的突变株浸泡感染实验,比野生株毒性下降100倍。因此，本发明根据根据鳗利斯顿氏菌重要的致毒因子empA基因设计了引物和探针,建立了快速检测鳗利斯顿氏菌的Real-time RPA方法。

本发明所使用的样品的来源信息如下：

鳗利斯顿氏菌(Listonellaanguillarum ATCC19264)、创伤弧菌(V.vulnificusATCC27562)、河流弧菌(V.fluvialisLMG7894)和铜绿假单胞菌(PseudomonasaeruginosaCGMCC1.1785)购买于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MarineCulture Collection of China,MCCC)，嗜水气单胞菌(AeromonashydrophilaCGMCC1.2017)、副溶血弧菌(VibrioparahaemolyticusCGMCC1.1997)、哈氏弧菌(Vibrio harveyiCGMCC1.1599)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescensCGMCC1.6279)购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center)，健康大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)购买于宁波大学东校区附近水产市场。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述

实施例1：引物、探针的设计及筛选

鳗利斯顿氏菌金属蛋白酶(zinc metalloprotease,empA)基因编码一种锌金属蛋白酶，申请人通过分析鳗利斯顿氏菌empA基因序列发现,不同血清型鳗利斯顿氏菌empA基因的部分序列非常保守,鳗利斯顿氏菌种间的金属蛋白酶序列同源性达99％,而与其它细菌属存在差异。根据GeneBank中已经公布的鳗利斯顿氏菌empA基因序列(AY428808、FM866242、AY091854.1和EU360910),设计4对PCR扩增引物(表1)，经PCR扩增、测序获得鳗利斯顿氏菌ATCC19264 empA基因的编码序列，经Blast比对发现此序列只与鳗利斯顿氏菌基因组有较高匹配。通过保守结构域搜索(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)empA基因的高度保守序列区域，根据RPA扩增技术引物设计原则,在empA基因保守区域设计一条探针，在探针的两侧设计了4条上游和五条下游RPA引物(表1)用于筛选。上述所有引物、探针均有由生工生物工程股份有限公司(上海，中国)合成。

合成的引物采用如下的步骤进行筛选，并将筛选出的最好引物组合用于反应温度的优化(37℃、38℃、39℃)。

1)细菌基因组的提取

将上述提到的五种弧菌划线接种于2216E固体培养基，37℃培养18h后，挑取单菌落于2216E液体培养基中，在37℃条件下于摇床中过夜培养至对数期生长期；将铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌划线接种于LB固体培养基，30℃培养18h后，挑取单菌落于LB液体培养基中，在30℃条件下于摇床中过夜培养至对数期生长期。取2ml各种新鲜菌液，按照细菌基因组提取试剂盒(Omega，美国)说明书步骤提取各种细菌基因组DNA，将DNA溶解于100μlddH₂O中，-20℃保存备用。

2)Real-time RPA反应体系体系的构建

RPA的反应体系是20μL，包含0.84μL(10μM)正反向引物，0.24μL(10μM)exo探针，11.8μL缓冲液(rehydration buffer)，0.8μL鳗利斯顿氏菌基因组模板或0.8μLddH₂O做空白对照组，加ddH₂O至19μL。混匀后，加入冻干酶粉，振荡混匀、离心。最后转移至罗氏专用PCR管，加入1.0μL启动剂MgAc(280mM),盖上盖子，迅速振荡并离心，使管壁上液体收集到管底。将反应管迅速转移至设定好程序的96实时荧光定量PCR仪(罗氏，美国)。反应条件：恒等温37℃30s为一个循环，采集一次荧光信号，共40个循环，整个反应过程共20min。

检测结果有4对得到扩增曲线，根据Ct值及荧光强度得到引物组合(RPA-F2和RPA-R3)扩增效果最佳(图1),利用该组引物进行后续实验。根据试剂盒说明书上推荐的反应温度(37～39℃),选择37、38、39℃3个不同的反应温度进行Real-time RPA等温扩增技术扩增，结果见图3。在同样的反应体系下，39℃时Ct值最小、荧光强度最强,故确定Real-time RPA等温扩增技术反应温度为39℃。

表1：相关引物和探针序列信息表

最终确定使用的引物和探针如下：

正向引物，其核苷酸序列如下：

5′-TTCCCAGGGTTAGTGATAAATAAAGTAGGC-3′(SEQ ID NO:1)

反向引物，其核苷酸序列如下：

5′-ACGCATAGTTAGCTGGAAGGTTAATGGAGTG-3′(SEQ ID NO:2)；

探针的序列及荧光标记如下：

5′-ACCGTGGATATGAAGCATGCGACATCGGG[FAM-dT][THF]G[BHQ-dT]TCAACGTTCAGCTA(3Spacer)-3′(SEQ ID NO:3)。

本发明的引物所扩增的核酸片段的序列如下(SEQ ID NO:4)

其中方框内为引物和探针所在的位置。

实施例2：引物和方法的灵敏度

将提取的鳗利斯顿氏弧菌基因组DNA用ddH₂O稀释到浓度为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL六个浓度梯度。分别取0.8μL各种浓度的模板DNA和ddH₂O进行Real-time RPA和Real-time PCR检测方法灵敏度差异的比较。Real-time RPA反应条件和体系见1.3和1.4。Real-time PCR扩增引物(Q-F/Q-R)引用文献中已经报道的(M EHickey et al.，2015)(表1)，扩增产物长611bp。Real-time PCR扩增体系为20μL，包括2xPower SYBR Green I预混液(康维世纪，北京)10μL,筛选出的正、反向引物各1μL，DNA模板或ddH₂O 1μL,用ddH₂O补齐至20μL。Real-time PCR反应程序为三步法：95℃预变性10min；95℃变性10s，56℃退火50s和72℃延伸60s，共30循环，熔解曲线分析(96实时荧光定量PCR仪默认程序):95℃10s,65℃60s,97℃1s,此过程不断收集荧光信号,形成熔解曲线。

以不同浓度梯度(10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL)鳗利斯顿氏菌ATCC19264基因组DNA为模板，进行Real-time RPA检测方法的灵敏度实验，同时和文献中构建的Real-time PCR检测方法进行比较。结果表明本发明的引物探针最低能检测出的模板浓度为1pg/μL，100fg/μL及无模板阴性对照组则无扩增曲线出现而呈现阴性(图3)，Real-time PCR检测方法能检测出最低的模板浓度为10pg/μL

实施例3：引物探针和检测方法特异性

选择提取的7种常见水产致病菌基因组DNA，包括创伤弧菌、河流弧菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌和荧光假单胞菌，与鳗利斯顿氏菌基因组DNA，将各种基因组DNA稀释到10ng/μL，反应体系和程序见1.3和1.4，以验证优化后的real-timeRPA检测方法的特异性。结果表明：除了鳗利斯顿氏菌出现阳性扩增曲线，而其他七株菌未出现扩增曲线，无模板加水对照组也无扩增曲线出现(图4)，说明构建的Real-time RPA检测方法特异性良好。

实施例4：检测方法的重复性

以实施例2中确定的能检测出最低基因组DNA浓度，按实施例中构建的反应体系和条件，进行三组平行实验，验证建立的检测方法的可重复性。结果表明：在三组平行实验中，均出现阳性扩增曲线，而加水阴性对照组则无扩增曲线，说明构建的Real-time RPA检测方法稳定性良好(图5)。

实施例5：人工污染样品的检测

取1mL过夜培养的新鲜鳗利斯顿氏菌ATCC19264菌液，平板计数并10倍浓度梯度稀释至3.4×10⁵、3.4×10⁴、3.4×10³、3.4×10²、3.4×10¹及3.4×10⁰cfu·mL^-1浓度，取上述浓度菌液各1mL与等体积健康大黄鱼肌肉组织匀浆液混匀。每个浓度平行制备3个样品。取各种浓度细菌污染的大黄鱼肌肉组织样品1mL，采用动物组织基因组DNA提取试剂盒(Omega，美国)提取细菌污染样品的基因组DNA，溶解于100μLddH₂O中，用作Real-time RPA和Real-time PCR检测的模板，取健康大黄鱼的肌肉组织匀浆液基因组DNA和鳗利斯顿氏菌基因组DNA(10ng/μL)作阴性和阳性对照。结果表明，本发明所构建的方法可以从3.40×10²cfu/mL鳗利斯顿氏菌污染的大黄鱼肌肉组织匀浆液中稳定检测到病原；而Real-time PCR只能从3.40×10³cfu/mL鳗利斯顿氏菌污染的大黄鱼肌肉组织匀浆液中稳定检测到病原(表2)。以鳗利斯顿氏菌基因组DNA为模板的阳性对照组呈现阳性扩增，以ddH₂O为模板的阴性对照组无扩增曲线出现。

表2鳗利斯顿氏菌人工污染健康大黄鱼肌肉组织的检测结果

上述结果表明本发明所提供的引物、探针以及构建的检测方法的检测灵敏度很高，能够特异地检测出鳗利斯顿氏菌，而其他7株水产常见致病菌均呈现阴性，其特异性及重复性均良好。由于是在恒等温的条件下进行，不需要对模板链进行预变性，故扩增的效率大大提高，仅需20min即可完成扩增，而PCR技术检测时间则需要1～2h，所以本发明方法在检测时间上具有巨大优势，非常适合水产病害的检测。

序列表

<110> 宁波海洋研究院

<120> 一种鳗利斯顿氏菌快速检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcccagggt tagtgataaa taaagtaggc 30

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgcatagtt agctggaagg ttaatggagt g 31

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accgtggata tgaagcatgc gacatcgggt ggttcaacgt tcagcta 47

Claims (8)

1.一种非疾病诊断治疗目的的检测鳗利斯顿氏菌的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)准备待检测菌的核酸样品：提取待检测菌的基因组DNA作为扩增样品；

2)构建Real-time RPA反应体系体系：将用于扩增鳗利斯顿氏菌目的基因的正向引物和反向引物和RPA探针加入到重组酶聚合酶扩增体系中，再加入步骤1)制备的核酸样品；加入冻干酶粉，混匀后，转移到PCR管中，加入启动剂MgAc后进行荧光定量反应；采集荧光信号,判断是否形成熔解曲线，以溶解曲线存在与否判定是否存在有毒鳗利斯顿氏菌；

所述的正向引物，其核苷酸序列如下：

5′-TTCCCAGGGTTAGTGATAAATAAAGTAGGC-3′

反向引物，其核苷酸序列如下：

5′-ACGCATAGTTAGCTGGAAGGTTAATGGAGTG-3′；

所述的RPA探针，其核苷酸序列如下：

5′-ACCGTGGATATGAAGCATGCGACATCGGGTGGTTCAACGTTCAGCT A-3′。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的探针序列的第30个碱基胸腺嘧啶T用FAM进行标记，第31个碱基鸟嘌呤G由四氢呋喃THF替换，第32个碱基胸腺嘧啶T用BHQ进行标记，3′端进行C3Spacer修饰。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的荧光定量反应，其反应条件如下：恒等温37℃温度下30s为一个循环，共40个循环。

4.一种用于检测鳗利斯顿氏菌的引物和探针，其特征在于，所述的引物包含正向引物和反向引物，所述的正向引物，其核苷酸序列如下：

5′-TTCCCAGGGTTAGTGATAAATAAAGTAGGC-3′

反向引物，其核苷酸序列如下：

5′-ACGCATAGTTAGCTGGAAGGTTAATGGAGTG-3′；

所述的RPA探针，其核苷酸序列如下：

5′-ACCGTGGATATGAAGCATGCGACATCGGGTGGTTCAACGTTCAGCTA-3′。

5.如权利要求4所述的引物和探针，其特征在于，所述的探针的第30个碱基胸腺嘧啶T用FAM进行标记，第31个碱基鸟嘌呤G由四氢呋喃THF替换，第32个碱基胸腺嘧啶T用BHQ进行标记，3′端进行C3Spacer修饰。

6.权利要求4或5所述的引物和探针在制备检测鳗利斯顿氏菌的制品中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的制品为检测试剂盒。

8.一种用于检测鳗利斯顿氏菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求4或5所述的引物和探针。