CN110106264A - 检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，该方法具体包括以下步骤：(1)以Vp_AHPND的PirA^Vp基因为检测靶基因，设计特异性的引物和TaqMan‑MGB探针；(2)提取Vp_AHPND的DNA，并构建重组质粒，制备标准品，‑20℃保存备用；(3)进行荧光定量PCR反应，建立起始模板拷贝数的对数与阈值循环数之间的标准曲线和标准方程；(4)使用步骤(1)中的引物和探针对待测样品进行检测，将所测得的阈值循环数根据标准曲线即可计算出待测样品中Vp_AHPND的拷贝数。本发明建立的非诊断目的检测Vp_AHPND的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、能快速定量等优点，可用于临床对虾样品及水样的Vp_AHPND检测。

Description

检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，更具体的说是涉及一种检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法。

背景技术

2009年以来，急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreas necrosis disease，AHPND)在全球对虾养殖范围内广泛爆发流行，主要危害凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)和中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)，使得对虾产量大幅下降，给养虾业带来了巨大的经济损失，我国以凡纳滨对虾养殖为主的对虾养殖业也遭受重创。该病因无明显发病症状且死亡前没有明显的前兆，绝大部分对虾死亡于池底，不容易被发现，俗称“偷死病”；由于该病主要发生于虾苗放养后7-30d，所以又称为早期死亡综合征(Early mortality syndrome，EMS)。

研究表明，对虾AHPND的病原是携带含毒力基因PirA^Vp和PirB^Vp的pVA1质粒的致AHPND副溶血弧菌(AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus,Vp_AHPND)；随后Vp_AHPND中国株及泰国株的基因组序列完成测定并发布，基于PirA^Vp和PirB^Vp基因序列的Vp_AHPND快速检测技术如一步法PCR(AP1、AP2及AP3引物法)、套式PCR(AP4引物法)、荧光定量PCR(TaqMan探针法)和环介导等温扩增法(LAMP)等也相继报道。

但在实际检测工作中，一步法PCR不够敏感，对潜伏感染样品难以检出；套式PCR敏感性高，但需两轮PCR及电泳，操作繁琐、检测时间长；LAMP灵敏、快速，但易出现假阳性；TaqMan探针荧光定量PCR由于探针长度太长，敏感性不佳。

荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光标记物，利用仪器通过荧光强度的检测对PCR扩增产物进行定量，反应和检测都在封闭的管内完成，可克服套式PCR的上述缺点，并以其速度快、灵敏度高、特异性强、自动化程度高、能定量等优点而被广泛应用于病原体检测。近年来，随着新荧光化学物质的不断开发，TaqMan-MGB探针、TaqMan-LAN探针、Allglo探针等新型探针技术相继涌现，方便了研究工作者在应用荧光定量PCR技术时可依目的基因序列特点以及灵敏度、特异性等方面的不同实验要求选择合适的探针。

而TaqMan-MGB探针是荧光定量PCR使用的TaqMan探针的一种，其在探针的3′端连上不发光的淬灭基团MGB(Minor Groove Binder)结合物，可提高探针Tm值，使高Tm值探针的长度缩短，尤其适合富含AT序列的探针设计；TaqMan-MGB探针原则上只要有一个碱基突变，探针将不会与目的片段杂交，即不产生荧光信号，故特异性更强；此外，MGB探针3′端的Quencher基团为不发光的荧光基团，并且与Report基团在空间的位置更接近，淬灭效果更佳，使杂交的稳定性大大提高、本底小、分辨率更高。

因此，如何提供一种灵敏度高、特异性强、重复性好、能快速定量检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，根据PirA^Vp基因保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针，经优化反应体系及条件，建立非诊断目的检测Vp_AHPND的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法，该方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、能快速定量等优点，可用于临床对虾样品及水样的Vp_AHPND检测。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，具体包括以下步骤：

(1)以致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的PirA^Vp基因为检测靶基因，设计特异性的引物和TaqMan-MGB探针，目标产物长度为60bp，探针的5′端标记荧光基团FAM，3′端标记MGB基团；

(2)提取致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的DNA，并构建重组质粒，测定其浓度后10倍梯度稀释为1.0×10¹-1.0×10⁹拷贝/μL作标准品，-20℃保存备用；

(3)以步骤(2)中9个梯度的标准品DNA为模板，进行荧光定量PCR反应，建立起始模板拷贝数的对数与阈值循环数(CT值)之间的标准曲线和标准方程；

(4)先将待测样品进行前处理，然后使用步骤(1)中的引物和探针对待测样品进行检测，将所测得的CT值根据标准曲线即可计算出待测样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的拷贝数，即为待测样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的含量。

本发明的有益效果在于：

1、用MegAlign比较GenBank公开的不同地域Vp_AHPND的PirA^Vp和PirB^Vp基因序列，发现PirA^Vp基因非常保守(8株来自不同国家Vp_AHPND的Pir^Vp基因核苷酸序列完全相同)，故以Vp_AHPND的PirA^Vp基因为检测靶基因；

2、经分析发现，PirA^Vp和PirB^Vp基因的AT含量分别达57.6％和63.2％，而TaqMan-MGB探针3′端的MGB结合物可提高探针的Tm值，使高Tm值探针的长度缩短，非常适合富含AT序列的探针设计；

3、TaqMan-MGB探针原则上只要有一个碱基突变，探针将不会与目的片段杂交，即不产生荧光信号，故特异性更强；

4、MGB探针3′端的淬灭基团为不发光的荧光基团，且与报告基团的空间距离更接近，淬灭效果更佳，故杂交的稳定性大大提高、本底小、分辨率更高。

进一步，上述步骤(1)中，引物序列为：

上游引物PirA^Vp-qF：5′-CAAACGGAGGCGTCACAGA-3′，

下游引物PirA^Vp-qR：5′-GACCGACTTCCGGGATGAT-3′；

探针序列为：PirA^Vp-P：5′-FAM-AGACAGCAAACATACACC-MGB-3′。

进一步，上述步骤(2)中，提取重组质粒DNA后用核酸蛋白分析仪测定浓度，并按公式(6.02×10²³)×(ng/μL×10^-9)/(DNA length)＝拷贝/μL转换为拷贝数。

进一步，上述步骤(3)中，荧光定量PCR反应的20μL反应体系为：Probe qPCR Mix(2×)10μL，ROX Reference DyeⅡ0.2μL，上游引物PirA^Vp-qF(10μmol/L)1.0μL，下游引物PirA^Vp-qR(10μmol/L)1.0μL，探针PirA^Vp-P(5μmol/L)1.0μL，模板1μL，余量为无核酸酶灭菌ddH₂O。

进一步，上述步骤(3)中，荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火并延伸45s，40个循环，在每次60℃结束时收集荧光信号。

进一步，上述步骤(3)中标准曲线的建立方法为：

以9个梯度(1.0×10¹-1.0×10⁹拷贝/μL)的标准品DNA为模板，用荧光定量PCR方法进行检测；利用仪器自带的数据分析软件分析，建立起始模板拷贝数(X)的对数与CT值(Y)之间的标准曲线和标准方程。

经数据分析软件分析，以纵坐标(Y)代表CT值，横坐标(X)代表起始模板拷贝数，得到标准曲线方程为Y＝-3.345*LOG(X)+40.88，Eff.(扩增效率)和RSq(相关系数方值)分别为99.0％和1.000，各标准品的浓度对数与其CT值之间均呈良好的线性关系。

在Real-time PCR技术中引入了两个重要的概念：荧光阈值和CT值，荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上；CT值是指每个反应管内的荧光信号到达阈值时所经历的循环数，但通常指荧光信号由本底到指数期的拐点所对应的循环数，C代表循环(Cycle)，T代表阈值(Threshold)；每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值，对照未知样品的CT值即可根据标准曲线计算出该样品的起始拷贝数，因此可以做到真正意义上的定量。

检测虾样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，具体包括以下步骤：

(1)将虾样品放入灭菌匀浆管中，加入无核酸酶灭菌ddH₂O，置于匀浆器中匀浆，然后冻融三次，离心，取上清液；

(2)向步骤(1)得到的上清液中加入裂解液，提取总DNA，然后加入洗脱缓冲液溶解DNA；

(3)将步骤(2)得到的DNA按照上述检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法进行检测。

进一步，上述步骤(1)中，灭菌ddH₂O与虾样品的体积质量比为1:1-3；离心的温度为4℃，转速为5000-10000r/min，时间为3-10min。

进一步，上述步骤(2)中，上清液、裂解液和洗脱缓冲液的体积比为2:4:1。

检测水样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，具体包括以下步骤：

(1)取水样品，离心，弃上清液，收集细菌沉淀；

(2)向步骤(1)得到的细菌沉淀中加入裂解液并转移到离心管中，提取总DNA，然后加入洗脱缓冲液溶解DNA；

(3)将步骤(2)得到的DNA按照上述检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法进行检测。

进一步，上述步骤(1)中，离心的转速为5000-10000r/min，时间为1-3min。

进一步，上述步骤(2)中，裂解液和洗脱缓冲液的体积比为4:1。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，该方法标准曲线线性关系好，定量范围1×10¹～1×10⁹拷贝/反应，最低检测限达10拷贝/反应，与对虾其他病原菌及病毒无交叉反应，重复试验的变异系数为0.37％-0.47％，单个样品检测可在1h内完成；该方法对临床对虾样品及水样的检测可提高Vp_AHPND的阳性检出率，且定量PCR检测为阳性的样品包含全部套式PCR检测为阳性的样品。本发明应用TaqMan-MGB探针建立的非诊断目的检测Vp_AHPND的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、能快速定量等优点，可用于临床对虾样品及水样的Vp_AHPND检测。

附图说明

图1为本发明实施例1中PirA^Vp基因的PCR扩增及pTOPO-T-PirA^Vp质粒的PCR鉴定结果；

图2为本发明实施例2中标准品(1.0×10¹-1.0×10⁹拷贝/μL)荧光定量PCR扩增曲线；

图3为本发明实施例2中荧光定量PCR检测Vp_AHPND的标准曲线。

图4为本发明实施例3中Vp_AHPND荧光定量PCR的特异性检测结果。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中，所用材料与试剂为：

Vp_AHPND-BH170612株、副溶血性弧菌VP-FCG151118、哈氏弧菌VH-QZ160809、溶藻弧菌VA-QZ160809、创伤弧菌VV-BH160905、河流弧菌VF-FCG170910、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病病毒(IHHNV)、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、虾肝肠胞虫(EHP)均由本实验室鉴定并保存；健康无Vp_AHPND感染的凡纳滨对虾采自国家级广西SPF凡纳滨对虾良种场；363份对虾样品和60份水样均采自广西凡纳滨对虾主要养殖区钦州市、北海市和防城港市的对虾养殖场。

细菌基因组DNA提取试剂盒、海洋动物组织基因组DNA快速提取试剂盒、2×F8FastLong PCR MasterMix(含反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、MgCl₂、dNTPs)、DL2000、pTOPO-TA克隆试剂盒、小量质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自北京艾德莱生物技术有限公司)；Probe qPCR Mix、DH5α感受态细胞(购自宝生物工程(大连)有限公司)；氨苄青霉素、琼脂糖(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)；其他试剂均为国产分析纯。

实施例1

检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法

1、引物与TaqMan-MGB探针的设计与合成

以Vp_AHPND的PirA^Vp基因为检测靶基因，针对PirA^Vp基因序列采用PrimerExpress3.0软件设计特异性的引物和TaqMan-MGB探针，目标产物长度为60bp，探针的5′端标记荧光基团FAM，3′端标记MGB基团，引物及探针序列为：

上游引物PirA^Vp-qF：5′-CAAACGGAGGCGTCACAGA-3′，

下游引物PirA^Vp-qR：5′-GACCGACTTCCGGGATGAT-3′，

探针PirA^Vp-P：5′-FAM-AGACAGCAAACATACACC-MGB-3′。

2、DNA的提取及重组质粒标准品的制备

(1)Vp_AHPND的复苏及DNA提取：

取冻融的菌株划线接种于TSA培养基上，36±1℃培养18-24h后挑选单菌落接种于TSB培养基，36±1℃继续培养18-24h；取上述菌液1.0-3.0mL，10000r/min离心1min，弃上清液，收集菌体，按细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA。

(2)重组质粒标准品的制备：

将提取的DNA进行特异性目的片段的扩增，用琼脂糖凝胶回收试剂盒按照说明书纯化回收相应的目的片段，然后按pTOPO-TA克隆试剂盒说明书将回收的目的片段与pTOPO-TA载体连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，通过菌落PCR筛选阳性克隆，并测序鉴定；取测序结果正确的阳性克隆菌液5mL，按照质粒小量提取试剂盒说明书提取质粒，命名为pTOPO-T-PirA^Vp。

(3)重组质粒标准品的检验：

PirA^Vp基因PCR扩增产物经电泳，条带大小与预期一致，如图1(PirA^Vp基因的PCR扩增及pTOPO-T-PirA^Vp质粒的PCR鉴定结果)所示。其中，M:DL 1000DNA Marker；1:PirA^Vp基因；2pTOPO-T-PirA^Vp质粒；NC:阴性对照。

目的片段回收纯化后克隆入pTOPO-T载体，重组质粒pTOPO-T-PirA^Vp经PCR及测序鉴定，证实目的基因片段已正确连接入pTOPO-T载体，且所得目的片段序列与GenBank上公布的PirA^Vp基因序列同源性为100％。

提取阳性克隆菌质粒，测定浓度并转换为拷贝数，所得pTOPO-T-PirA^Vp质粒DNA浓度为5.83×10⁹拷贝/μL，能满足标准品的要求。

(4)重组质粒标准品的备用：

提取重组质粒DNA后用核酸蛋白分析仪测定浓度，并按公式(6.02×10²³)×(ng/μL×10^-9)/(DNA length)＝拷贝/μL转换为拷贝数；10倍梯度稀释为1.0×10¹-1.0×10⁹拷贝/μL作标准品，-20℃保存备用。

3、荧光定量PCR检测

(1)荧光定量PCR反应条件的优化

以10⁶拷贝/μL的标准品DNA为模板，在58～62℃范围内以1℃的梯度进行荧光定量PCR扩增，以获得最低的CT值和较高的相对荧光强度增加值(ΔRn)时的退火温度为最佳。

以10⁶拷贝/μL的标准品DNA为模板，将引物终浓度在0.1～0.8μmol/L之间以0.1μmol/L的梯度、探针终浓度在0.1～0.5μmol/L之间以0.05μmol/L的梯度以不同浓度组合进行荧光定量PCR，以获得最低的CT值和较高的ΔRn时的引物和探针浓度组合为最佳。

(2)荧光定量PCR反应

荧光定量PCR反应条件经优化后，将提取的重组质粒DNA进行荧光定量PCR反应，确定20μL反应体系为：Probe qPCR Mix(2×)10μL，ROX Reference DyeⅡ0.2μL，上游引物PirA^Vp-qF(10μmol/L)1.0μL，下游引物PirA^Vp-qR(10μmol/L)1.0μL，探针PirA^Vp-P(5μmol/L)1.0μL，模板1μL，用无核酸酶灭菌ddH₂O补足至20μL；

反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火并延伸45s，40个循环；在每次60℃结束时收集荧光信号。

(3)标准曲线的建立

以9个梯度(1.0×10¹-1.0×10⁹拷贝/μL)的标准品DNA为模板，用优化后的荧光定量PCR方法进行检测；利用仪器自带的数据分析软件分析，建立起始模板拷贝数(X)的对数与CT值(Y)之间的标准曲线和标准方程。

经数据分析软件分析，以纵坐标(Y)代表CT值，横坐标(X)代表起始模板拷贝数，得到标准曲线方程为Y＝-3.345*LOG(X)+40.88，Eff.(扩增效率)和RSq(相关系数方值)分别为99.0％和1.000，各标准品的浓度对数与其CT值之间均呈良好的线性关系。

4、待测样品的检测

先将待测样品进行前处理，然后使用步骤(1)中的引物和探针对待测样品进行检测，将所测得的CT值根据标准曲线即可计算出待测样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的拷贝数，即为待测样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的含量。

实施例2

敏感性试验

以9个梯度(1.0×10¹-1.0×10⁹拷贝/μL)的标准品DNA为模板，用优化后的荧光定量PCR方法进行检测；利用仪器自带的数据分析软件分析，建立起始模板拷贝数(X)的对数与CT值(Y)之间的标准曲线和标准方程，并根据各标准品DNA的扩增结果来判断该方法的定量范围和敏感性。试验结果如图2(标准品(1.0×10¹-1.0×10⁹拷贝/μL)荧光定量PCR扩增曲线)和图3(荧光定量PCR检测Vp_AHPND的标准曲线)所示。

由图2可知，用优化建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法对9个梯度(1.0×10¹-1.0×10⁹拷贝/μL)的标准品DNA进行扩增，结果显示：高浓度标准品(1.0×10³-1.0×10⁹拷贝/μL)的扩增曲线均呈现明显的“S”型，低浓度标准品(1.0×10¹-1.0×10²拷贝/μL)的扩增曲线因未达扩增平台期虽不呈现“S”型但较陡，各梯度标准品扩增曲线荧光增量均明显、间距均匀；空白对照和阴性对照均没有出现扩增。

标准品DNA为10拷贝/反应时，3个重复的CT值分别为37.10、37.15、37.28，且仍有明显的扩增曲线；因此，该方法的灵敏度可达10个拷贝/反应。为保证检测结果的准确性，在实际检测中以CT值35为界限，若检测样品的CT值小于或等于35，且有扩增曲线，则检测样品判为Vp_AHPND阳性；CT值大于35，且有扩增曲线，则重复一次，如结果一致，判为Vp_AHPND阳性；CT值大于35，重复结果未出现扩增曲线，判为Vp_AHPND阴性。

由图3可知，经数据分析软件分析，以纵坐标(Y)代表CT值，横坐标(X)代表起始模板拷贝数，得到标准曲线方程为Y＝-3.345*LOG(X)+40.88，Eff.(扩增效率)和RSq(相关系数方值)分别为99.0％和1.000，各标准品的浓度对数与其CT值之间均呈良好的线性关系。

以上结果表明，本发明所构建的荧光定量PCR反应体系对标准品的扩增效率高，建立的标准曲线能够准确地反映目的产物的扩增，可用于定量分析。

实施例3

特异性试验

以Vp_AHPND、副溶血性弧菌、哈氏弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、WSSV、IHHNV、EHP和SHIV的核酸样品为模板，用优化建立的荧光定量PCR方法进行检测，评价方法的特异性，试验结果如图4(Vp_AHPND荧光定量PCR的特异性检测结果)所示。

其中，弧菌属细菌(Vp_AHPND-BH170612株、副溶血性弧菌VP-FCG151118、哈氏弧菌VH-QZ160809、溶藻弧菌VA-QZ160809、创伤弧菌VV-BH160905、河流弧菌VF-FCG170910)的复苏及DNA提取方法为：取冻融的各弧菌属菌株划线接种于TSA培养基上，(36±1)℃培养18-24h后挑选单菌落接种于TSB培养基，(36±1)℃继续培养18-24h。取上述菌液1.0-3.0mL，10000r/min离心1min，弃上清液，收集菌体，按细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA。

WSSV、IHHNV、SHIV和EHP的核酸用海洋动物组织基因组DNA快速提取试剂盒按说明书操作提取总DNA。

由图4可知，只有Vp_AHPND出现扩增曲线，而其他病原及阴性、空白对照均未出现扩增曲线。

以上试验说明，本发明建立的荧光定量PCR对Vp_AHPND的检测具有很强的特异性。

实施例4

重复性试验

以10⁸、10⁷、10⁶拷贝/μL 3个梯度的标准品DNA为模板，每个浓度3次重复，同时进行荧光定量PCR检测，计算每个浓度重复实验CT值的变异系数。试验结果如表1(Vp_AHPND荧光定量PCR重复试验结果)所示。

表1 Vp_AHPND荧光定量PCR重复试验结果

由表1可知，10⁸、10⁷、10⁶拷贝/μL 3组标准品DNA荧光定量PCR重复性试验CT值的变异系数(CV)分别为0.47％、0.37％、0.47％，均小于2％。

以上试验说明，本发明建立的荧光定量PCR方法具有良好的重复性。

实施例5

检测虾样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法

(1)虾苗取整只虾(体长小于1cm)或取摘除虾眼的头胸部(体长1-3cm)，中成虾取鳃和肝胰腺组织；

(2)将0.5g样品放入2mL灭菌匀浆管中，按质量体积比1:1加入灭菌ddH₂O，置于匀浆器中匀浆；冻融三次，然后4℃5000r/min离心10min；

(3)取100μL上清液加入200μL裂解液用海洋动物组织基因组DNA快速提取试剂盒按说明书提取总DNA，最后加50μL洗脱缓冲液EB(Elution buffer)溶解DNA；

(4)将步骤(3)得到的DNA按照上述检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法进行检测。

应用该TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法对2016-2018年采集的363份凡纳滨对虾样品进行Vp_AHPND的检测，并将结果与世界动物卫生组织(Office international desepizooties,OIE)推荐的套式PCR方法检测结果进行比较。

试验结果发现，荧光定量PCR方法共检出阳性样品36份，2016年、2017年、2018年阳性率分别为12.0％(13/108)、9.7％(11/113)、8.5％(12/142)；而套式PCR仅检出29份阳性，且套式PCR检测为阳性的样品用定量PCR检测也全部为阳性。36份阳性样品的CT值介于19.06～36.81之间，根据标准曲线Y＝-3.345*LOG(X)+40.88计算出反应体系中的Vp_AHPND约为3.3×10⁶～16拷贝/反应，计算虾组织中的Vp_AHPND约为3.3×10⁶～16拷贝/mg。

试验结果表明，在实际检测工作中进行40个循环的反应，该方法对对虾组织的检测灵敏度可达10拷贝/mg。

实施例6

检测水样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法

(1)取10mL海水样品，10000rpm离心1min，弃上清；

(2)在收集的细菌沉淀中加入200μL裂解液并转移到1.5ml离心管中，用海洋动物组织基因组DNA快速提取试剂盒按说明书提取总DNA，最后加50μL洗脱缓冲液EB溶解DNA；

(3)将步骤(2)得到的DNA按照上述检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法进行检测。

应用该TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法对2018年采集的60份凡纳滨对虾养殖池塘水样进行Vp_AHPND的检测，并将结果与OIE推荐的套式PCR方法检测结果进行比较。

试验结果发现，荧光定量PCR方法共检出阳性样品5份，而套式PCR仅检出了3份阳性，且套式PCR检测为阳性的样品用定量PCR检测也全部为阳性；5份阳性样品的CT值介于28.12～37.63之间，根据标准曲线Y＝-3.345*LOG(X)+40.88计算出反应体系中的Vp_AHPND约为6.5×10³～9拷贝/反应，计算水样中的Vp_AHPND约为3.3×10⁴～45拷贝/mL。

综上所述，本发明针对PirA^Vp基因序列AT含量高及TaqMan-MGB探针适用性的特点，根据PirA^Vp基因序列设计引物和TaqMan-MGB探针，并对退火温度及引物、探针使用浓度进行优化，建立了检测Vp_AHPND的荧光定量PCR方法。

试验结果表明，该方法定量范围宽，起始模板范围为1×10¹～1×10⁹拷贝/反应时，浓度的对数与CT值之间呈良好的线性关系，建立的标准曲线能够准确地反映目的产物的扩增；灵敏度高，对质粒的检测灵敏度可达10拷贝/反应，对对虾组织的检测灵敏度可达10拷贝/mg，比套式PCR敏感10倍；特异性强，与对虾其他病原菌及病毒无交叉反应；重复性好，重复性试验CT值的变异系数均小于2％。此外，该方法PCR扩增和产物分析均在单管封闭条件下完成，不需要电泳、染色，整个检测过程自动化程度高、简便快捷，仅需1h左右；且可降低扩增产物对环境的污染，有效减少假阳性。

应用该TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法对2016-2018年采集的363份凡纳滨对虾样品进行Vp_AHPND的检测，共检出阳性样品36份，而套式PCR仅检出29份阳性；对60份凡纳滨对虾养殖池塘水样进行Vp_AHPND的检测，共检出阳性样品5份，而套式PCR仅检出了3份阳性；且套式PCR检测为阳性的样品与定量PCR检测结果符合率为100％。表明所建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法发挥了MGB探针的优势，具有更高的扩增效率及灵敏度，可提高Vp_AHPND的检出率；同时，证明应用于检测对虾感染初期或潜伏期及养殖水样等Vp_AHPND含量较低的样品时，该方法较目前常用的套式PCR更有优势。

本发明建立的检测Vp_AHPNS的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法灵敏度高，对对虾组织的检测灵敏度可达10拷贝/mg，比套式PCR敏感10倍；简便快捷，PCR扩增和产物分析均由仪器完成，检测单个样品仅需1h。因此，该方法的建立迎合了当前对Vp_AHPNS检测技术的需求，是原有Vp_AHPNS检测方法的有效补充，具有广阔的应用前景。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)以致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的PirA^Vp基因为检测靶基因，设计特异性的引物和TaqMan-MGB探针，探针的5′端标记荧光基团FAM，3′端标记MGB基团；

(2)提取致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的DNA，并构建重组质粒，测定其浓度后10倍梯度稀释为1.0×10¹-1.0×10⁹拷贝/μL作标准品，-20℃保存备用；

(3)以步骤(2)中9个梯度的标准品DNA为模板，进行荧光定量PCR反应，建立起始模板拷贝数的对数与阈值循环数之间的标准曲线和标准方程；

(4)先将待测样品进行前处理，然后使用步骤(1)中的引物和探针对待测样品进行检测，将所测得的阈值循环数根据标准曲线即可计算出待测样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的拷贝数。

2.根据权利要求1所述的一种检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(1)中，所述引物序列为：

上游引物PirA^Vp-qF：5′-CAAACGGAGGCGTCACAGA-3′；

下游引物PirA^Vp-qR：5′-GACCGACTTCCGGGATGAT-3′；

所述探针序列为：

PirA^Vp-P：5′-FAM-AGACAGCAAACATACACC-MGB-3′。

3.根据权利要求1所述的一种检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(3)中，所述荧光定量PCR反应的20μL反应体系为：Probe qPCR Mix 10μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2μL，上游引物PirA^Vp-qF 1.0μL，下游引物PirA^Vp-qR 1.0μL，探针PirA^Vp-P1.0μL，模板1μL，余量为无核酸酶灭菌ddH₂O。

4.根据权利要求1所述的一种检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(3)中，所述荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火并延伸45s，40个循环，在每次60℃结束时收集荧光信号。

5.一种检测虾样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)将虾样品放入灭菌匀浆管中，加入无核酸酶灭菌ddH₂O，置于匀浆器中匀浆，然后冻融三次，离心，取上清液；

(2)向步骤(1)得到的上清液中加入裂解液，提取总DNA，然后加入洗脱缓冲液溶解DNA；

(3)将步骤(2)得到的DNA按照权利要求1所述检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法进行检测。

6.根据权利要求5所述的一种检测虾样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(1)中，所述无核酸酶灭菌ddH₂O与虾样品的体积质量比为1:1-3；所述离心的温度为4℃，转速为5000-10000r/min，时间为3-10min。

7.根据权利要求5所述的一种检测虾样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(2)中，所述上清液、裂解液和洗脱缓冲液的体积比为2:4:1。

8.一种检测水样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)取水样品，离心，弃上清液，收集细菌沉淀；

(2)向步骤(1)得到的细菌沉淀中加入裂解液并转移到离心管中，提取总DNA，然后加入洗脱缓冲液溶解DNA；

(3)将步骤(2)得到的DNA按照权利要求1所述检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法进行检测。

9.根据权利要求8所述的一种检测水样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(1)中，所述离心的转速为5000-10000r/min，时间为1-3min。

10.根据权利要求8所述的一种检测水样品中致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(2)中，所述裂解液和洗脱缓冲液的体积比为4:1。