CN111041111A - 同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的三重pcr引物、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的三重pcr引物、试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的三重PCR引物和试剂盒，其中三重PCR引物包括引物TDH_F、引物TDH_R、引物TRH_F、引物TRH_R、引物pVA1_F、引物pVA1_R，使用该引物制得的试剂盒，可用于检测副溶血性弧菌中是否含有tdh基因、trh基因或者pVA1质粒，特异性强，准确度高。

Description

同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的三重PCR引物、试剂盒 及其检测方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的三重PCR引物、试剂盒及其检测方法。
背景技术
副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)，为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无芽胞。目前，用于检测该菌的PCR方法主要有任意引物PCR(arbitrarilyprimedPCR，Ap-PCR)、常规PCR、多重PCR(multiplex-PCR)、实时PCR(Real-timePCR)。细菌鉴定的分子生物学方法通常采用检测细菌的16S rRNA基因，但是在亲缘关系较近的物种之间，16SrRNA基因差异较小，常常导致种间鉴定失败。KWOK等人对15种共29株海洋弧菌部分热休克蛋白HSP60基因序列分析表明，弧菌种间HSP60基因序列相似性为71％～82％，种内菌株间的相似行为96％～100％，与种间相似度很高的16S rRNA基因序列和常规鉴定系统相比，HSP60基因更适合于海洋弧菌的系统发育分析和鉴定。
不耐热溶血毒素tlh基因是Hatsumi等人在1985年发现，无论是临床分离株还是环境分离株都有tlh基因，具有种特异性，因此它的编码基因tlh基因常被用作检测副溶血性弧菌的靶基因。然而不是所有的副溶血性弧菌都有相同的致病性，耐热直接溶血毒素TDH和耐热直接溶血相关毒素TRH是引起腹泻的主要致病因子，所有的副溶血性弧菌都扩增出tlh基因，54％的副溶血性弧菌扩增出TDH基因，只有38.73％的副溶血性弧菌扩增出TRH基因。从2009年开始，一种特异性的副溶血性弧菌引起关注，该种菌株因携带了一种130kb大小的毒力质粒pVA1而具有特殊的毒性，其可以引起对虾肝胰腺上皮细胞大量脱落等。携带毒力质粒pVA1的副溶血性弧菌给对虾养殖业造成严重危害，但不会引起腹泻。因此根据不同的检测目的，需要选择不同的靶基因进行检测。
目前，基于副溶血性弧菌tlh基因、tdh基因、trh基因等的分子生物学方法建立的比较成熟，但是，由于pVA1是近几年研究确认的一种带有特殊毒性的质粒，所以目前国际上尚无能够同时检测副溶血性弧菌菌株是否含有tdh基因、trh基因，或者pVA1质粒的检测方法。因此，建立同时检测副溶血性弧菌菌株是否含有tdh基因、trh基因或者pVA1质粒的方法，能够极大的提高副溶血性弧菌菌株毒性的检测效率。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明提出同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的三重PCR引物、试剂盒及其检测方法，采用三重PCR引物、试剂盒以及检测方法对副溶血性弧菌进行检测，易于操作、特异性强、灵敏高、结果准确可靠。
本发明所提供的技术方案如下：
同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的三重PCR引物，各引物核苷酸序列如下：
TDH_F：5’-aggtctctgacttttggacaa-3’；
TDH_R：5’-atgttgaagctgtacttgat-3’
TRH_F：5’-tccttctcctgggtcggctga-3’
TRH_R：5’-tacacttggtattgattcttcg-3’
pVA1_F：5’-gaaggaagggcgaagccaat-3’
pVA1_R：5’-ttaacaatctgaatcaggaag-3’。
本发明还公开了同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的试剂盒，包括上述引物组合、Taq酶、阳性对照DNA和阴性对照品。
优选地，所述各引物组分的浓度为0.4～0.5μmol/L；所述阳性对照DNA为副溶血性弧菌tdh基因、trh基因或pVA1质粒基因序列的DNA；所述阴性对照品为水。
优选地，所述阳性对照DNA为副溶血性弧菌tdh基因、trh基因或pVA1质粒基因的重组质粒。
本发明还公开了同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品基因组DNA模板；
(2)将提取获得的DNA模板、Taq酶和水混合进行三重PCR，三重PCR的扩增体系包括：10×扩增缓冲液5～8μl、四种dNTP混合物200～300μmol/L、引物0.4～0.5μmol/L、DNA模板2～5μg、Taq DNA聚合酶2～3U、MgCl21.5～2mmol/L，加双蒸水补足至50μl；
(3)采用琼脂糖凝胶电泳法对扩增后产物进行测定。
优选地，四种dNTP混合物为三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、脱氧胸苷三磷酸dTTP、脱氧鸟苷三磷酸三钠dGTP和脱氧胞苷三磷酸dCTP，各组分的浓度分别为200μmol/L。
优选地，所述扩增缓冲液包括100mM Tris-HCl(pH8.8，25℃)、500mM KCl、0.8％(v/v)乙基苯基聚乙二醇。
优选地，扩增程序为：90～95℃变性3～5min；(90～95℃15～20s、55～60℃30～35s、70～75℃40～45s)×30；70～75℃延伸4～8min。
优选地，步骤(3)中，琼脂糖凝胶电泳测定的具体方法为：取扩增后的产物点样于琼脂糖凝胶，采用2000bp Marker为标准分子参照，以5V/cm的电场强度于0.5×TBE电泳缓冲液中电泳30min，电泳结果采用紫外凝胶成像系统分析、拍照。
与现有技术相比，本发明具有以下技术优势：
本发明得到的三重PCR引物，可同时检测副溶血性弧菌菌株是否含有tdh基因、trh基因或者pVA1质粒，特异性强，准确度高；采用三重PCR方法，利用本发明中的引物和试剂盒对副溶血性弧菌进行检测，无需分三次进行PCR反应，操作简单，检测周期短，可重复性强，试剂盒使用方便，检测快速灵活，降低了成本。
附图说明
图1为本发明的多重PCR扩增产物电泳图
其中：数字1表示质粒标准品pVA1；数字2表示质粒标准品TRH；数字3表示质粒标准品TDH；数字4表示携带pVA1质粒的副溶血性弧菌；数字5表示携带TRH基因的副溶血性弧菌；数字6表示携带TDH基因的副溶血性弧菌；字母M表示2000bp DNALadder Marker。
具体实施方式
现结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明。
实施例1
本发明提供了同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的三重PCR引物，三种基因型为tdh基因、trh基因或pVA1质粒基因的引物组合，其中三重PCR引物包括引物TDH_F、引物TDH_R、引物TRH_F、引物TRH_R、引物pVA1_F、引物pVA1_R；所述引物TDH_F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述引物TDH_R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述引物TRH_F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述引物TRH_R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述引物pVA1_F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述引物pVA1_R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。本发明中引物组合对根据GenBank中tdh基因、trh基因，或者pVA1质粒基因保守序列设计，具体的序列和特征如表1所示；
表1引物对的核苷酸序列和特征参数
Figure BDA0002359908440000031
本发明还公开了同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的试剂盒，包括TDH_F、引物TDH_R、引物TRH_F、引物TRH_R、引物pVA1_F、引物pVA1_R、Taq酶、副溶血性弧菌tdh基因、trh基因、pVA1质粒基因的重组质粒和水，其中各引物组分的浓度为0.4μmol/L。
本发明还公开了同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的检测方法，包括以下步骤：
1、提取待测样品基因组DNA模板
1.1取副溶血性弧菌的细菌培养液1ml，置于无菌的1.5ml Eppendorf离心管中，12000rpm离心1min，去上清，用灭菌蒸馏水洗涤两次，收集菌体；加入400μl裂解液(40mmol/LTris-醋酸，20mmol/L醋酸钠，1mmol/L EDTA，1％SDS，pH7.8)混匀，置于37℃水浴1h；
1.2加入200μl浓度为5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min取上清液，再分别用苯酚抽提2次、氯仿抽提1次后加两倍体积的无水乙醇、1/10体积醋酸钾(3mol/L，pH8.0)，-20℃保存1h后取出，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50μlTE溶液中，置4℃保存备用。
2、PCR扩增反应
将提取获得的DNA模板、Taq酶和水混合进行三重PCR，三重PCR的扩增体系包括：10×扩增缓冲液5μl、200μmol/L的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、200μmol/L的脱氧胸苷三磷酸dTTP、200μmol/L的脱氧鸟苷三磷酸三钠dGTP、200μmol/L的脱氧胞苷三磷酸、0.5μmol/L的引物、DNA模板2μg、Taq DNA聚合酶2U、1.5mmol/L的MgCl2，加双蒸水补足至50μl；其中，扩增缓冲液包括100mM Tris-HCl(pH8.8，25℃)、500mM KCl、0.8％(v/v)乙基苯基聚乙二醇。
PCR反应条件如下：95℃变性3min；95℃15s、58℃30s、72℃45s，进行30个循环扩增；72℃延伸5min。
3、采用琼脂糖凝胶电泳法对扩增后产物进行测定
取扩增后的产物点样于琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)，采用2000bp Marker为标准分子参照，以5V/cm的电场强度于0.5×TBE电泳缓冲液中电泳30min，电泳结果采用紫外凝胶成像系统分析、拍照，结果如图1。
特异性引物和质粒标准品鉴定
1、引物的获取
根据Genebank中公布的副溶血性弧菌tdh基因、trh基因或pVA1质粒基因序列的保守区和可变区，以及本技术领域已公开的文献，使用Primer5.0软件设计引物；经预实验选择3对引物(引物TDH_F、引物TDH_R、引物TRH_F、引物TRH_R、引物pVA1_F、引物pVA1_R)为最佳组合，引物由大连宝生物工程有限公司合成；预期扩增的片段大小分别为：tdh基因215bp、trh基因349bp、pVA1质粒基因491bp。
2、阳性对照DNA标准品模板的制备
大连宝生物工程有限公司根据Genebank中公布的副溶血性弧菌tdh基因、trh基因以及pVA1质粒基因序列合成三种质粒标准品，置4℃保存备用。
3、阳性对照DNA标准品模板的PCR扩增反应
在阳性对照质粒标准品制备的基因组DNA模板中添加所述上游引物和下游引物进行PCR扩增反应；PCR扩增体系包括：10×扩增缓冲液5μl、200μmol/L的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、200μmol/L的脱氧胸苷三磷酸dTTP、200μmol/L的脱氧鸟苷三磷酸三钠dGTP、200μmol/L的脱氧胞苷三磷酸、0.5μmol/L的引物、DNA模板2μg、Taq DNA聚合酶2U、1.5mmol/L的MgCl2，加双蒸水补足至50μl；其中，扩增缓冲液包括100mM Tris-HCl(pH8.8，25℃)、500mMKCl、0.8％(v/v)乙基苯基聚乙二醇。
PCR反应条件如下：95℃变性3min；95℃15s、58℃30s、72℃45s，进行30个循环扩增；72℃延伸5min。
4、扩增后产物的琼脂糖凝胶电泳法测定
取扩增后的产物5μL点样于1％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)，以2000bpMarker为标准分子参照，5V/cm的电场强度于0.5×TBE电泳缓冲液中电泳30min；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析、拍照；结果如图1。
5、PCR产物的序列鉴定
切下含有所需DNA片段的凝胶，用DNA回收试剂盒(TAKARA)从琼脂糖凝胶中回收纯化目的片段；DNA测序由大连宝生物工程有限公司完成；测序证明，PCR扩增片段与预期一致：tdh基因215bp、trh基因349bp、pVA1质粒基因491bp。
检测结果分析
如图1所示，本实施例中的副溶血性弧菌样品中含有携带tdh基因的菌株、携带trh基因的菌株以及携带pVA1质粒的菌株。待检样品与阳性对照同时扩增出215bp条带的，判定为tdh基因阳性(如数字3和数字6对应的电泳条带所示)；待检样品与阳性对照同时扩增出349bp条带的，判定为trh基因阳性(如数字2和数字5对应的电泳条带所示)；待检样品与阳性对照同时扩增出491bp条带的，判定为pVA1质粒基因阳性(如数字1和数字4对应的电泳条带所示)。同时对PCR产物的序列鉴定：切下带有所需DNA片段的凝胶，用DNA回收试剂盒(TAKARA)从琼脂糖凝胶中回收纯化目的片段；DNA测序由大连宝生物工程有限公司完成；测序证明，PCR扩增片段与预期一致。

Claims (9)

1.同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的三重PCR引物，其特征在于：各引物核苷酸序列如下：
TDH_F：5’-aggtctctgacttttggacaa-3’；
TDH_R：5’-atgttgaagctgtacttgat-3’
TRH_F：5’-tccttctcctgggtcggctga-3’
TRH_R：5’-tacacttggtattgattcttcg-3’
pVA1_F：5’-gaaggaagggcgaagccaat-3’
pVA1_R：5’-ttaacaatctgaatcaggaag-3’。
2.同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的三重PCR引物、Taq酶、阳性对照DNA和阴性对照品。
3.根据权利要求2所述的同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在于：所述各引物组分的浓度为0.4～0.5μmol/L；所述阳性对照DNA为副溶血性弧菌tdh基因、trh基因或pVA1质粒基因序列的DNA；所述阴性对照品为水。
4.根据权利要求2所述的同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照DNA为副溶血性弧菌tdh基因、trh基因或pVA1质粒基因的重组质粒。
5.一种利用权利要求1所述的同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)提取待测样品基因组DNA模板；
(2)将提取获得的DNA模板、Taq酶和水混合进行三重PCR，三重PCR的扩增体系包括：10×扩增缓冲液5～8μl、四种dNTP混合物200～300μmol/L、引物0.4～0.5μmol/L、DNA模板2～5μg、Taq DNA聚合酶2～3U、MgCl21.5～2mmol/L，加双蒸水补足至50μl；
(3)采用琼脂糖凝胶电泳法对扩增后产物进行测定。
6.根据权利要求5所述的同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于：四种dNTP混合物为三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、脱氧胸苷三磷酸dTTP、脱氧鸟苷三磷酸三钠dGTP和脱氧胞苷三磷酸dCTP，各组分的浓度分别为200μmol/L。
7.根据权利要求5所述的同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于：所述扩增缓冲液包括100mM Tris-HCl(pH8.8，25℃)、500mM KCl、0.8％(v/v)乙基苯基聚乙二醇。
8.根据权利要求5所述的同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于扩增程序为：90～95℃变性3～5min；(90～95℃15～20s、55～60℃30～35s、70～75℃40～45s)×30；70～75℃延伸4～8min。
9.根据权利要求5所述的同时检测三种基因型的副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于：步骤(3)中，琼脂糖凝胶电泳测定的具体方法为：取扩增后的产物点样于琼脂糖凝胶，采用2000bp Marker为标准分子参照，以5V/cm的电场强度于0.5×TBE电泳缓冲液中电泳30min，电泳结果采用紫外凝胶成像系统分析、拍照。
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