CN111893198A

CN111893198A - 用于银白色葡萄球菌鉴定的特异性分子靶标、检测引物组及其快速检测方法

Info

Publication number: CN111893198A
Application number: CN202010685146.XA
Authority: CN
Inventors: 吴诗; 黄嘉慧; 庞锐; 张峰; 吴清平; 张菊梅; 杨小鹃; 陈谋通; 王涓; 丁郁; 薛亮; 古其会; 韦献虎; 张友雄
Original assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Current assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Priority date: 2020-07-16
Filing date: 2020-07-16
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2040-07-16
Also published as: CN111893198B

Abstract

本发明公开了一种用于银白色葡萄球菌鉴定的特异性分子靶标、检测引物组及其快速检测方法。用于银白色葡萄球菌鉴定的特异性分子靶标，其特征在于，如SEQ ID NO：1～5任一所示。本发明公开了用于鉴别银白色葡萄球菌的特异性分子靶标，并提供了相关的引物组，以及对应的PCR检测方法。与现有技术相比，本发明的检测方法可为银白色葡萄球菌的鉴定提供更多的思路和方案，弥补生化鉴定解决不了的缺陷，增强了实用性；本发明的检测方法还具有操作简单、结果判定易、检测时间短、特异性强、成本低的优点。

Description

用于银白色葡萄球菌鉴定的特异性分子靶标、检测引物组及其快速检测方法

技术领域：

本发明属于微生物鉴定领域，具体涉及一种葡萄球菌的新种—银白色葡萄球菌的特异性分子靶标、检测引物组及其快速检测方法。

背景技术：

银白色葡萄球菌(Staphylococcus argenteus)是近年从金黄色葡萄球菌中独立出来的一个新的物种，早在2002年就有相关的报道。由于无法通过传统的生化鉴定方法将其区别开来，该物种一直被认为是金黄色葡萄球菌。随着测序技术的发展和完善，人们发现银白色葡萄球菌在基因组水平上与金黄色葡萄球菌有着明显的差异。此外，银白色葡萄球菌不能产生葡萄球菌素，在临床致病机制方面也与金黄色葡萄球菌并不一致。

2015年，国际原核生物分类学权威期刊《International Journal of Systematicand Evolutionary Microbiology》正式发表了认可银白色葡萄球菌为新种的文章。文章综合使用基因组分类学和传统多相分类方法，系统阐述了银白色葡萄球菌与金黄色葡萄球菌的差异，提出五条将银白色葡萄球菌划分为新种的理由：1)基因组水平遗传差异非常明显，平均核苷酸同源性(average nucleotide identity，ANI)<95％,DNA-DNA杂交相关性<70％；2)基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS)检测图谱差异明显；3)银白色葡萄球菌不能产生葡萄球菌素；4)银白色葡萄球菌与金黄色葡萄球菌细胞壁肽聚糖肽桥类型不同；5)银白色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌临床致病性不同。

目前，由于部分金黄色葡萄球菌在平板上并不显现金黄色(葡萄球菌素表达不高)，传统方法很难将其与金葡菌区分。其他一些处在可变基因组上的毒力基因，当使用典型金黄色葡萄球菌的引物检测结果为阴性时，银白色葡萄球菌菌株也并不一定缺少这些毒力基因。目前，通过多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)的方法，可将银白色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌进行有效区分。该方法选取了金黄色葡萄球菌的7个管家基因(arcC、aroE、glpF，gmk，pta，tpi和yqiL)，这些管家基因高度保守，并可准确描述菌株之间的遗传差异。然而，目前，MLST数据库(http://saureus.mlst.net/)拥有5874个 ST型，并己整合了世界各国的金黄色葡萄球菌流行株的遗传数据，单纯的依靠MLST分子分型不仅增加了检测成本，部分基因还需要重新设计引物才能得到正确的结果。这种方法学导致的结果偏差是无法根据已有的数据来评判的。因此，目前用于检测银白色葡萄球菌的手段还非常有限，开发适用于银白色葡萄球菌的特异性分子靶标将大大减少该菌的漏检和对该菌的认识等问题。

发明内容：

针对上述问题，本发明的目的是提供用于鉴定银白色葡萄球菌的特异性分子靶标、检测引物组及相应的快速检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：本发明要求保护一组用于鉴别银白色葡萄球菌的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1～5任一所示。

通过生物信息学分析得到银白色葡萄球菌中含有的特异性序列片段，如SEQ IDNO.1～5 所示；所述片段可作为鉴别银白色葡萄球菌的特异性新分子靶标。通过检测待检测物是否含有相应的序列即可得到待检测物是否含有所述银白色葡萄球菌。

进一步地，本发明还要求保护用于鉴别银白色葡萄球菌的引物组，所述引物组为根据如 SEQ ID NO.1～5所示核苷酸序列设计得到。

所述引物组对应的产物为SEQ ID NO.1～5所示核苷酸序列全部或部分序列。

通过根据相应的核苷酸序列涉及对应的用于PCR的引物组，每一个引物组包括一条正向引物和一条反向引物，对应检测一个核苷酸序列。所述引物组扩增产物对应如SEQID NO.1～5 所示核苷酸序列的全部或部分序列。

作为本发明的优选实施方式，所述引物组的如下所示：

引物组1(对应SEQ ID NO.1序列的引物组)：

5’-CAGTGCCCAAAGATAAAA-3’；

5’-TTTGTGTTTGACTCAAGTAGATTTA-3’；

引物组2(对应SEQ ID NO.2序列的引物组)：

5’-CTGATATCGCAACAGTCAATCGT-3’

5’-ACGTCTGCTGAATCTTGGCT-3’；

引物组3(对应SEQ ID NO.3序列的引物组)：

5’-ATGAAAATGGGCGTGAAGCAC-3’；

5’-TCGGCACCCATAGTTCCGT-3’；

引物组4(对应SEQ ID NO.4序列的引物组)：

5’-TTCCGTGTGTATTTGGCGTTC-3’；

5’-ATCGAGCTGTAAGGCATAGTCT-3’；

引物组5(对应SEQ ID NO.5序列的引物组)：

5’-GCTGCTGGCAATGGCTTATT-3’；

5’-ACATCGTCCTCTAACTGCTCA-3’；

进一步地，所述引物组均可用于鉴别银白色葡萄球菌。

本发明还提供了用于鉴别银白色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：

S1：使用所述的引物组中的其中一组对待测样品DNA进行PCR扩增；

S2：进行凝胶电泳检测扩增产物；

S3：观察扩增产物是否符合预期。

一般地，一个PCR体系中仅含有一组引物；可通过设置多个PCR体系，同时对单个菌株的DNA使用不同引物进行扩增，提高检测效率。本发明的引物对应的产物特异较好，通过观察扩增产物是否在预期位置即可判断是否存在所述银白色葡萄球菌。

作为本发明的优选实施方式，所述S1中的PCR扩增，其PCR扩增体系包括：PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTP、模板DNA、引物组、Tag酶和灭菌双蒸水。

作为本发明的优选实施方式，所述的PCR扩增，其PCR扩增体系为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mM MgCl₂ 2μL，2.5mM dNTP 1μL，模板DNA 100ng，5μM上、下游引物各1μL，Tag酶1U，灭菌双蒸水补足体积至25μL。

作为本发明的优选实施方式，所述S1中的PCR扩增，其PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s；变性、退火、延伸共进行30个循环；最后72℃延伸10min。

优选，所述的56～67℃退火30s是当使用引物组1时，退火温度为67℃；当使用引物组 2时，退火温度为56℃；当使用引物组3时，退火温度为67℃；当使用引物组4时，退火温度为65℃；当使用引物组5时，退火温度为65℃.

本发明公开了用于鉴别银白色葡萄球菌的特异性分子靶标，并提供了相关的引物组，以及对应的PCR检测方法。与现有技术相比，本发明的检测方法可为银白色葡萄球菌的鉴定提供更多的思路和方案，弥补生化鉴定解决不了的缺陷，增强了实用性；本发明的检测方法还具有操作简单、结果判定易、检测时间短、特异性强、成本低的优点。

附图说明：

图1为实施例3中针对银白色葡萄球菌的特异性新分子靶标SEQ ID NO.1的PCR检测方法特异性评价电泳结果，使用引物组1。

图2为实施例3中针对银白色葡萄球菌的特异性新分子靶标SEQ ID NO.2的PCR检测方法特异性评价电泳结果，使用引物组2。

图3为实施例3中针对银白色葡萄球菌的特异性新分子靶标SEQ ID NO.3的PCR检测方法特异性评价电泳结果，使用引物组3。

图4为实施例3中针对银白色葡萄球菌的特异性新分子靶标SEQ ID NO.4的PCR检测方法特异性评价电泳结果，使用引物组4。

图5为实施例3中针对银白色葡萄球菌的特异性新分子靶标SEQ ID NO.5的PCR检测方法特异性评价电泳结果，使用引物组5。

具体实施方式：

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1银白色葡萄球菌的特异性新分子靶标的挖掘

根据GenBank数据库及本团队自测的银白色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌全基因组DNA 序列，进行生物信息学分析；筛选得到银白色葡萄球菌的特异性基因片段，所述基因片段的核苷酸序列具体如下：

SEQ ID No:1

ATGATGGAAAATAAATCAACAGATCCAAGAATTATAAGAACAAAACAATTACTAGTAGATGCTTTTCAAAAAGTTT CTCGAGAAAAAAAGTTGTCACAAATTACCGTCAAAGATATCACTGATATCGCAACAGTCAATCGTGCAACATTTTATGCT CACTTTACCGATAAAGAAGATATTTTAGATTACACATTATCTGTAACTATTTTAAAAGACCTCAATGATAACTTGAACAT TTCAAATGTTATTAATGAAAAGGTACTACGCAATATTTTTATTTCGATTGCCAGTTATATGAAAGATGTTGAAAAGTCAT GTGAGTTAAATAGCGAAGCATTTTGCCATAAAGCACACCAACGTATCAATAATGAGTTAGAAGATATTTTTGCCATCATG TTAGAAAACAGCTATCCAGATCACCAAAGAGATATCATTGTAAATAGCGCAAGTTTCTTAGCAGCTGGTGTATCTGGTTT AGCTTTACATTGGTTAAATACAAGCCAAGATTCAGCAGACGTTTTTATTGATAAAAACCTTCCATTTTTAATACATCATA TTGCTCATTTTTAA

SEQ ID No:2

ATGATTCGGCAAGCACGTCCAGGAGACCGATTTGAAATTGCAAAATTAGTTTATATGGTTTGGGAAGATATGGAAT TGGATATGGTAAAAGCAGTGCTCAAAGATAAAATATTAACTGCAATAGAAAAAAGCTGTGTTGATGTAAGATATCGTACA TATTATGAGCATATATATGTTTATGAAGTTGATGACAAAATAGCTGGTTGTATCATTAGTTATAATGGTAAATATGAATT GGAATATGAAAAAACATGGGAGCAGCTTAATTTACCTGAAGAGTTTCAACAATATGGGACACCACTACCTGTAAAAGAAG CAAAAGATGATGAATGTTATATTGAAACAATTGCAACATTTGAGAATTATAGAGGAAGAGGTATAGCTACGAAATTATTA ATAAATCTACTTGAGTCAAACACAAATGTGAAATGGAGTTTGAACTGTGATGTTAATAATGAGGCAGCATTAAAATTATA TCAAAAAGTAGGGTTTACATCTGATGGATATATAGAGCTTTACAAACATAAGTACCATCATTTA

SEQ ID No:3

ATGAAATATAAAACAATAAAACTGCCTAAATTAACTTTGCTGGGAATTAAGAAATCATATGAAAATGGGCGTGAAG CACAACAACATATTGCAGATTTTTGGAGAACATGTTTTGCAGAAGGAACGATTTCAAAGTTACAAGCATCTAATAATGGT GATTTTGATGGTTTGCTAGGTATTTGTATACCAGAACTTGATGGGAAAATGTCTTACATGATAGCAGTTACTGTGACTAT AGACAATTGTTCAGTCTCTGATGATTTTGAATTAACAACTTTACCAAGTTCAACTTATTTTGTTTTTGAAGCACAAGGTG TAGTTCCTGATGCTGTGCAACTAAAAATGGAAGAAGTGCATAATTATATTCATAAATATCATGGTGATAATATTAGAAAA GCACCATTTTTTGAATATTATCAAGAAGGAGATACATCGAGTGAACAGTATATTACGGAACTATGGGTGCCGATAAATGA ATAA

SEQ ID No:4

ATGTTCTTTTTTCAAAACAATTTAAACCAGCTGCCTAAAGATTATAAATGGTTAGAAACCGAAACTCACAAATCTA TAGAAGTCATTGAATCTAAAGGTTTTCCGTGTGTATTTGGCGTTCAAGGTCACAAAAAAGAAGTACATTTTTATTCTGCA TTAAACTATCCATACAATCCTAAAGAGCTATCGACCGATATTGACCAATATTTAAATGAATTGGATAAAATGAAAAAGAA TGAGCGAGGGATTTCTGGCTTATTAGTATATTTTGAACCAATTGGTGATATGAATATTCATGCGAAACAATTTTTAGCTT GGCAAGTGCTCTCCACAATGAAAAATTTATATGGCAATAAGAATGATAGTATTGATAATGACCCCTTTACTGATGAATAT GCCTTTAAATTCAAAGATGAATTATGGTTTATTAATTTCAGCTCAAGTAGTTATACTCATAGAAAATCTAGAAACTTAGG TTCTTTTATTACATTAGCTATGCAAACGCTTAGTAAATCTGATGAGTATTTTAATTCAAATATTGAAACAAAAGCTAAAG CACAGAAATTAGTTAGAAATCTAGCTGAAAAGTATGATGGTTGTCCTGTTCATTCTGGTTTAGGTCCAGTTATAGGTTCA GGTGAATTTTCTCCTGCAAAATTATCATACTTTATTGGAGATAAAAATGATGACCCATCATATGAACCTTGGAAATTCTC CCCTTTCAAACCTCAAAGAATAATCATAGACGATGCAATAGTTAAAGACTATGCCTTACAGCTCGATTATCTCAGTCAAC TATATAACAACATAACTTTTTCAACACTTACAGAACCTCATAATAATAATGATATTAATAAAGATAATGTCTTAATCACT AATAACCCACGTCATATTGAAAAATATAAAAATAAAATTAAAGTAGCTACATTTAATAATCGTTATGAAACCAATAAGAA TATTTGTAAAATTGACTATATCAATGATTTAATTGCCTTACGATATTTAAAATAA

SEQ ID No:5

ATGACCCAACCTAAAATTATTGTGCATATGACCCAATCTATCAATGGTAACATTACTGGCCCATATCATGAAGCTG CTGGCAATGGCTTATTAAAAGCTTACGAGTCAACAAATCAGCAATTTGAGTCAAACGCTTTGATATTAGGTCGTAAAACG ATTGAAGAAGCATTTGCCAATAATGAAATGCCAACATTACCTGCAAATCCAGAAAAATATTCACGTAAAGAAGATTTTGT GGCTGATACAGAGTTAACGCATTTTGTTATCTCGATTGATCCTTCTGGGAAGGCAGCATGGACACAGAACTATATTCAAT ATAATGACCGACCTGAAATGCATGTGATTGAAGTGATATCAGAACAAGTTTCAGATGCATATTTAGAACATTTAAGAAAT TTAGGTATTTCATATGTCTTTGGTGGCGAAAATTCTGAATTAGATTTGAAGTTAGTTGTATCTAAATTGAACAGCTTATT TAATCTTGAAACGATGACATTGTCAGGTGGTGGTGGTATTAACTGGTCATTCTTTCAACAAGACCTTGTTGATGAAGTGA GTGTTGTTATAGCACCAGTTGTCGATGATCACTATAATAGACCCAATATGTTTGATAATAATAACCCTAATCGTTCTCAT GTTCCTGAAGCTTTTACAATTAAACAGCTTGAGCAGTTAGAGGACGATGTCATCTGGATTCATTACACTAGATAA

实施例2所述银白色葡萄球菌的快速检测方法

1)引物设计

根据实施例1中的所述序列SEQ ID NO.1～5设计特异性PCR扩增引物组(包括正向引物和反向引物)，引物组序列如下表1。

表1特异性PCR检测引物组

2)鉴别银白色葡萄球菌的方法，步骤如下：

S1 DNA模板制备：将待测菌株分别在LB液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模板；

S2 PCR扩增：使用所述的引物组1～5中的其中一组对待测样品DNA进行PCR扩增

PCR检测体系：

其中：

当模板DNA用于鉴别是否存在银白色葡萄球菌时，使用引物组1～5任一组引物；

①PCR扩增程序：

其中：

使用引物组1，退火温度为67℃；

使用引物组2，退火温度为56℃；

使用引物组3，退火温度为67℃；

使用引物组4，退火温度为65℃；

使用引物组5，退火温度为65℃；

S3：取PCR扩增产物进行凝胶电泳；

S4：观察各引物组对应产物大小的位置是否存在单一扩增条带。如果存在，说明样品中含有对应的银白色葡萄球菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有对应的银白色葡萄球菌。

实施例3银白色葡萄球菌特异性分子靶标SEQ ID NO.1～5PCR检测方法的特异性评价

选取不同ST型金黄色葡萄球菌137株以及银白色葡萄球菌118株，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2 PCR扩增时，使用的引物为引物组1～5中任一组引物。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶液。

所用各细菌的菌株及检测结果如下表2和图1-5所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图1-5所示；其中，图1～5分别为对应实施例2中序号分别为1～5的引物组，(a)1～118为118银白色葡萄球菌；(b)为119～255为金黄色葡萄球菌，+为阳性对照；M为2000Maker，C为空白对照。

表2本发明银白色葡萄球菌检测特异性评价试验结果

由图1-5和表2可得，5种引物组的检测结果均只有银白色葡萄球菌能显示出特异性扩增条带，不同遗传型别的金黄色葡萄球菌及金黄色葡萄球菌标准菌株均无特异性条带，说明本发明方法特异性高，且能有效识别银白色葡萄球菌。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 用于银白色葡萄球菌鉴定的特异性分子靶标、检测引物组及其快速检测方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 570

<212> DNA

<213> 银白色葡萄球菌(Staphylococcus argenteus)

<400> 1

atgatggaaa ataaatcaac agatccaaga attataagaa caaaacaatt actagtagat 60

gcttttcaaa aagtttctcg agaaaaaaag ttgtcacaaa ttaccgtcaa agatatcact 120

gatatcgcaa cagtcaatcg tgcaacattt tatgctcact ttaccgataa agaagatatt 180

ttagattaca cattatctgt aactatttta aaagacctca atgataactt gaacatttca 240

aatgttatta atgaaaaggt actacgcaat atttttattt cgattgccag ttatatgaaa 300

gatgttgaaa agtcatgtga gttaaatagc gaagcatttt gccataaagc acaccaacgt 360

atcaataatg agttagaaga tatttttgcc atcatgttag aaaacagcta tccagatcac 420

caaagagata tcattgtaaa tagcgcaagt ttcttagcag ctggtgtatc tggtttagct 480

ttacattggt taaatacaag ccaagattca gcagacgttt ttattgataa aaaccttcca 540

tttttaatac atcatattgc tcatttttaa 570

<210> 2

<211> 540

<212> DNA

<213> 银白色葡萄球菌(Staphylococcus argenteus)

<400> 2

atgattcggc aagcacgtcc aggagaccga tttgaaattg caaaattagt ttatatggtt 60

tgggaagata tggaattgga tatggtaaaa gcagtgctca aagataaaat attaactgca 120

atagaaaaaa gctgtgttga tgtaagatat cgtacatatt atgagcatat atatgtttat 180

gaagttgatg acaaaatagc tggttgtatc attagttata atggtaaata tgaattggaa 240

tatgaaaaaa catgggagca gcttaattta cctgaagagt ttcaacaata tgggacacca 300

ctacctgtaa aagaagcaaa agatgatgaa tgttatattg aaacaattgc aacatttgag 360

aattatagag gaagaggtat agctacgaaa ttattaataa atctacttga gtcaaacaca 420

aatgtgaaat ggagtttgaa ctgtgatgtt aataatgagg cagcattaaa attatatcaa 480

aaagtagggt ttacatctga tggatatata gagctttaca aacataagta ccatcattta 540

<210> 3

<211> 480

<212> DNA

<213> 银白色葡萄球菌(Staphylococcus argenteus)

<400> 3

atgaaatata aaacaataaa actgcctaaa ttaactttgc tgggaattaa gaaatcatat 60

gaaaatgggc gtgaagcaca acaacatatt gcagattttt ggagaacatg ttttgcagaa 120

ggaacgattt caaagttaca agcatctaat aatggtgatt ttgatggttt gctaggtatt 180

tgtataccag aacttgatgg gaaaatgtct tacatgatag cagttactgt gactatagac 240

aattgttcag tctctgatga ttttgaatta acaactttac caagttcaac ttattttgtt 300

tttgaagcac aaggtgtagt tcctgatgct gtgcaactaa aaatggaaga agtgcataat 360

tatattcata aatatcatgg tgataatatt agaaaagcac cattttttga atattatcaa 420

gaaggagata catcgagtga acagtatatt acggaactat gggtgccgat aaatgaataa 480

<210> 4

<211> 1011

<212> DNA

<213> 银白色葡萄球菌(Staphylococcus argenteus)

<400> 4

atgttctttt ttcaaaacaa tttaaaccag ctgcctaaag attataaatg gttagaaacc 60

gaaactcaca aatctataga agtcattgaa tctaaaggtt ttccgtgtgt atttggcgtt 120

caaggtcaca aaaaagaagt acatttttat tctgcattaa actatccata caatcctaaa 180

gagctatcga ccgatattga ccaatattta aatgaattgg ataaaatgaa aaagaatgag 240

cgagggattt ctggcttatt agtatatttt gaaccaattg gtgatatgaa tattcatgcg 300

aaacaatttt tagcttggca agtgctctcc acaatgaaaa atttatatgg caataagaat 360

gatagtattg ataatgaccc ctttactgat gaatatgcct ttaaattcaa agatgaatta 420

tggtttatta atttcagctc aagtagttat actcatagaa aatctagaaa cttaggttct 480

tttattacat tagctatgca aacgcttagt aaatctgatg agtattttaa ttcaaatatt 540

gaaacaaaag ctaaagcaca gaaattagtt agaaatctag ctgaaaagta tgatggttgt 600

cctgttcatt ctggtttagg tccagttata ggttcaggtg aattttctcc tgcaaaatta 660

tcatacttta ttggagataa aaatgatgac ccatcatatg aaccttggaa attctcccct 720

ttcaaacctc aaagaataat catagacgat gcaatagtta aagactatgc cttacagctc 780

gattatctca gtcaactata taacaacata actttttcaa cacttacaga acctcataat 840

aataatgata ttaataaaga taatgtctta atcactaata acccacgtca tattgaaaaa 900

tataaaaata aaattaaagt agctacattt aataatcgtt atgaaaccaa taagaatatt 960

tgtaaaattg actatatcaa tgatttaatt gccttacgat atttaaaata a 1011

<210> 5

<211> 711

<212> DNA

<213> 银白色葡萄球菌(Staphylococcus argenteus)

<400> 5

atgacccaac ctaaaattat tgtgcatatg acccaatcta tcaatggtaa cattactggc 60

ccatatcatg aagctgctgg caatggctta ttaaaagctt acgagtcaac aaatcagcaa 120

tttgagtcaa acgctttgat attaggtcgt aaaacgattg aagaagcatt tgccaataat 180

gaaatgccaa cattacctgc aaatccagaa aaatattcac gtaaagaaga ttttgtggct 240

gatacagagt taacgcattt tgttatctcg attgatcctt ctgggaaggc agcatggaca 300

cagaactata ttcaatataa tgaccgacct gaaatgcatg tgattgaagt gatatcagaa 360

caagtttcag atgcatattt agaacattta agaaatttag gtatttcata tgtctttggt 420

ggcgaaaatt ctgaattaga tttgaagtta gttgtatcta aattgaacag cttatttaat 480

cttgaaacga tgacattgtc aggtggtggt ggtattaact ggtcattctt tcaacaagac 540

cttgttgatg aagtgagtgt tgttatagca ccagttgtcg atgatcacta taatagaccc 600

aatatgtttg ataataataa ccctaatcgt tctcatgttc ctgaagcttt tacaattaaa 660

cagcttgagc agttagagga cgatgtcatc tggattcatt acactagata a 711

Claims

1.用于银白色葡萄球菌鉴定的特异性分子靶标，其特征在于，如SEQ ID NO：1～5任一所示。

2.用于鉴别银白色葡萄球菌的引物组，其特征在于，所述的引物组为根据如SEQ IDNO.1～5所示任一核苷酸序列设计得到，对应的产物为SEQ ID NO.1～5所示核苷酸序列全部或部分序列。

3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述引物组的如下任一组所示：

引物组1：

5’-CAGTGCCCAAAGATAAAA-3’；

5’-TTTGTGTTTGACTCAAGTAGATTTA-3’；

引物组2：

5’-CTGATATCGCAACAGTCAATCGT-3’

5’-ACGTCTGCTGAATCTTGGCT-3’；

引物组3：

5’-ATGAAAATGGGCGTGAAGCAC-3’；

5’-TCGGCACCCATAGTTCCGT-3’；

引物组4：

5’-TTCCGTGTGTATTTGGCGTTC-3’；

5’-ATCGAGCTGTAAGGCATAGTCT-3’；

引物组5：

5’-GCTGCTGGCAATGGCTTATT-3’；

5’-ACATCGTCCTCTAACTGCTCA-3’。

4.一种用于鉴别银白色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：使用权利要求2或3所述的引物组中的其中一组或一组以上对待测样品DNA进行PCR扩增；

S2：进行凝胶电泳检测扩增产物；

S3：观察扩增产物是否符合预期。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述S1中的PCR扩增，其PCR扩增体系包括：PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTP、模板DNA、引物组、Tag酶和灭菌双蒸水。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其PCR扩增体系为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mM MgCl₂ 2μL，2.5mM dNTP 1μL，模板DNA 100ng，5μM上、下游引物各1μL，Tag酶1U，灭菌双蒸水补足体积至25μL。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述S1中的PCR扩增，其PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；56～67℃退火30s；72℃延伸30s；变性、退火、延伸共进行30个循环；最后72℃延伸10min。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的56～67℃退火30s是当使用引物组1时，退火温度为67℃；当使用引物组2时，退火温度为56℃；当使用引物组3时，退火温度为67℃；当使用引物组4时，退火温度为65℃；当使用引物组5时，退火温度为65℃。