CN111926094B - 一种气单胞菌属内不同物种的条形码鉴定引物、鉴定方法和试剂盒 - Google Patents
一种气单胞菌属内不同物种的条形码鉴定引物、鉴定方法和试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111926094B CN111926094B CN202010692281.7A CN202010692281A CN111926094B CN 111926094 B CN111926094 B CN 111926094B CN 202010692281 A CN202010692281 A CN 202010692281A CN 111926094 B CN111926094 B CN 111926094B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- species
- aeromonas
- primer
- sequence
- bar code
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000894007 species Species 0.000 title claims abstract description 56
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 101100166957 Anabaena sp. (strain L31) groEL2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 101100439396 Synechococcus sp. (strain ATCC 27144 / PCC 6301 / SAUG 1402/1) groEL1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 101150077981 groEL gene Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 abstract description 11
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 abstract description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 241000607574 Aeromonas veronii Species 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 241000607528 Aeromonas hydrophila Species 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 2
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 241000607493 Vibrionaceae Species 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 1
- 201000009840 acute diarrhea Diseases 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种气单胞菌属内不同物种的条形码鉴定引物、鉴定方法和试剂盒。它包括F：5’‑GGAATTCGCAACCGTTCTGGCTCAGGCTATCGT‑3’；R：5’‑TGTCGACGACGGCAGCCACTTTCAC‑3’。16S rRNA序列分析鉴定方法普遍认为,序列相似性达到97％以上即视为同种水平，而实际应用中往往出现气单胞菌属多个不同的物种满足该序列相似性要求。这种情况下，16S rRNA序列分析只能鉴定到属水平而无法准确鉴定到种。本发明可以解决上述问题，待测物种cpn60序列经BLAST比对后，满足相似性大于98.8％且覆盖度大于98％的比对结果高度专一，为气单胞菌属下特定种，比对结果中不存在不同物种的情况。
Description
技术领域：
本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种气单胞菌属内不同物种的条形码鉴定引物、鉴定方法和试剂盒。
背景技术：
气单胞菌(Aeromonas spp)隶属弧菌科，兼性厌氧，是一种革兰阴性细菌，广泛分布于河流、湖泊、池塘、海水、河口等水生生境。气单胞菌可感染多种动物，引起动物患病甚至死亡，给水产养殖业带来巨大的挑战。此外，致病性气单胞菌还可引起人发生急性腹泻，菌血症、脑膜炎、心内膜炎等疾病，给公共卫生安全带来隐患，给人类健康带来影响。因此,如何快速准确地对病原菌进行鉴定,从而有针对性地对病情进行控制,在生产实践上具有重要的意义。
目前，针对气单胞菌的检测主要采用生理生化特征结合16S rRNA序列分析进行鉴定。生理生化特征旨在利用不同种类的气单胞菌对底物的分解利用能力、代谢产物方面存在的差别，根据一系列生化指标将不同种类的气单胞菌区分开来。该方法缺点是需要综合利用生化指标及其培养特征进行判断，检测过程繁琐,试验所需时间比较长。16S rRNA序列分析是细菌种属鉴定中最常用的分子技术,该基因通用性好、广泛存在于细菌内，利用该基因序列可实现在属的水平上对几乎所有细菌进行鉴定。但16SrRNA序列分析也存在一定局限性。气单胞菌不同种的16SrRNA基因间差异较低,仅0.06％～0.66％，根据普遍采用的标准,序列相似性达到97％以上即视为同种水平,而使用16SrRNA序列进行分析,可能会出现与两个或两个以上的种相似性均大于97％的情况,而导致无法准确鉴别种类。
DNA条形码鉴定技术是一种利用基因在不同物种之间进化的差异来对物种进行鉴别的生物物种鉴定技术。DNA条形码技术利用标准的DNA片段，在分子水平上建立新的生物识别系统，借助分子生物学和生物信息学的方法实现对物种快速准确地鉴定，是对传统物种鉴定方法的有效补充。目前很多分类学家和检测技术人员正研究寻找适合细菌种快速鉴定的通用DNA条形码基因。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种气单胞菌属不同物种的条形码鉴定引物。
所述的气单胞菌属不同物种的条形码鉴定引物，包括：
F：5’-GGAATTCGCAACCGTTCTGGCTCAGGCTATCGT-3’，具体如SEQ ID NO.1所示；
R：5’-TGTCGACGACGGCAGCCACTTTCAC-3’，具体如SEQ ID NO.2所示。
本发明第二个目的是提供一种气单胞菌属不同物种的条形码鉴定方法，包括以下步骤：
A、提取待测气单胞菌基因组DNA；
B、使用上述条形码鉴定引物进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后送至公司进行测序；
C、将待测PCR产物序列作BLAST比对分析，以序列覆盖度大于98％且相似度大于98.8％作为筛选标准，GenBank数据库中满足此条件的物种与待测物种为同一物种。
优选，从GenBank上下载气单胞菌属代表种的cpn60序列，与待测序列一起构建系统发育树，聚为同一最小分支具有最高的同源性。以此辅助验证鉴定结果。
优选，所述的进行PCR扩增是：50μl的PCR反应体系，体系成分为：ddH2O 40μl、10×PCR Buffer 5μl、10mM的dNTPs 1μl、10μM的引物-F 1μl、10μM的引物-R 1μl、DNA模板1μl、2U/μl的Taq DNA聚合酶1μl；
PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s、退火温度49℃，退火时间为30s、72℃延伸1min、共30个循环；72℃再延伸10min。
本发明的第三个目的是提供一种鉴定气单胞菌属不同物种的试剂盒，其含有上述气单胞菌属不同物种的条形码鉴定引物和PCR反应试剂。其可以应用于鉴定或区分气单胞菌属不同物种。所述的气单胞菌属内不同物种为维氏气单胞菌(A.veronii)、嗜水气单胞菌(A.hydrophila)。
本发明不仅操作简单、快速，无需进行繁琐的操作程序，同时还具备非常高的精确性和准确性，具备在已知属的水平上准确鉴定到种的能力。以往16S rRNA序列分析鉴定法经BLAST后会出现多个不同种气单胞菌比对结果，且它们的相似性和覆盖度几乎一致。16SrRNA序列分析鉴定方法普遍认为,序列相似性达到97％以上即视为同种水平，而实际应用中往往出现气单胞菌属多个不同的物种满足该序列相似性要求。这种情况下，16S rRNA序列分析只能鉴定到属水平而无法准确鉴定到种。本发明可以解决上述问题，待测物种cpn60序列经BLAST比对后，满足相似性大于98.8％且覆盖度大于98％的比对结果高度专一，为气单胞菌属下特定种，比对结果中不存在不同物种的情况。
附图说明
图1是PCR扩增产物电泳图，M、5000bp marker；1，阳性对照(嗜水气单胞菌ATCC7966基因组为模板)2，阴性对照(无菌水为模板)；3-13，不同株气单胞菌基因组DNA为模板；
图2是基于cpn60基因序列构建的系统发育树，括号内表示菌株编号或GenBank序列登录号。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1.1 引物的设计与合成
以Genbank中维氏气单胞菌的cpn60基因序列(登录号为EU306841.1)为靶基因，运用DNAStar-Lasergene软件设计引物，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成,引物信息见表1。
表1 cpn60基因的特异性引物序列
1.2 菌株的活化及基因组的提取
1.2.1 方法
(1)菌株的活化：从超低温冰箱中取出保存好的甘油菌，在无菌环境中按照1:200的比例用移液枪吸取50μl的菌液接种于10ml的LB液体培养基中，37℃，140rpm振荡培养过夜。
(2)细菌的收集：取1ml培养物于1.5ml Ep管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，再加满培养物于Ep管中，重复离心，沉淀重新悬于1ml双蒸水中。
(3)加入15μl 20mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h，再加2mol/L NaCl 50μl，10％SDS10μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h。
(4)采用酚-氯仿提取法抽提：把菌液均分到两个1.5ml Ep管中，加等体积的酚-氯仿溶液(饱和酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)混匀，室温放置2～3min，12000rpm离心10min。抽提两次取上清。
(5)沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，室温静置10min使充分反应，12000rpm离心10min。
(6)洗涤：沉淀用75％的乙醇洗涤。
(7)抽干后，溶于50μl双蒸水中,备用，获得基因组DNA。
1.2.2 主要试剂
LB液体培养基配制方法：称取细菌学蛋白胨10g、酵母提取粉5g、NaCl 10g于大烧杯，用去离子水定容至1000ml，混匀后用10mol/LNaOH调pH至7.0，分别装到试管中，每个试管10ml，再将试管包好，121℃高压灭菌20分钟。琼脂糖凝胶电泳缓冲液(TAE buffer)：9.68g Tris碱、2.28ml冰乙酸、0.68g EDTA定容至2000mL。
蛋白酶K、SDS、EDTA、溶菌酶(均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，NaCl(购自天津百世化工有限公司)，冰乙酸、酚、氯仿、异戊醇(均购自广州市番禺力强化工厂)，Tris碱(购自广州威佳科技有限公司)。
菌株：11株气单胞菌(Aeromona)。由电子科技大学中山学院材料与食品学院实验室保存，菌株信息见表2。
表2 11株气单胞菌菌株来源
1.3 cpn60基因的PCR扩增
1.3.1 方法
本实验采用50μl的PCR反应体系，体系成分为：ddH2O 40μl、10×PCR Buffer 5μl、10mM的dNTPs 1μl、10μM的引物-F 1μl、10μM的引物-R 1μl、DNA模板1μl、2U/μl的Taq DNA聚合酶1μl。PCR扩增条件为：94℃预变性5min、94℃变性30s、退火温度49℃，退火时间为30s、72℃延伸1min、共30个循环、72℃再延伸10min。用1％琼脂糖凝胶电泳检验PCR扩增的DNA目的条带(图1)，电泳条带单一、明亮同时大小介于500～750bp之间说明PCR扩增成功，产物可用于测序分析。
1.3.2 试剂
dNTPs(购自美国Genview公司)；Biowest Agarose、SDS、10×PCR Buffer、GoldViewTMNucleic Acid Stain核酸染料、EDTA(均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；Taq DNAPolymerase、DL5,000DNAMarker(购自宝生物工程(大连)有限公司)。
1.4 PCR扩增产物测序及序列比对分析
对已成功扩增的PCR产物送交Invitrogen公司进行测序，并将测序成功得到的序列与提交至美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中进行BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)分析，在BLAST得到的结果中，以一致性(Identities)和序列覆盖度(Query Cover)作为评价标准，当待测序列与GenBank数据库中已有序列的相似度大于98.8％且序列覆盖度大于98％时，即可判定待测序列与该已有序列为同一物种(表3)。
表3 BLAST比对结果
1.5 系统发育树的构建
从GenBank数据库中下载气单胞菌属代表物种的cpn60序列，存储为fasta格式。打开MEGA7软件，导入待测菌株PCR扩增产物序列和GenBank下载序列，用Clustal W方法进行序列比对后保存为meg格式，采用邻接法(Neighbor-Joining method,NJ)构建系统发育树，bootstrap设定为1000以检验进化树分支支持率，其他参数采用默认设置。系统发育树可作为鉴定气单胞菌物种的辅助手段，树中聚为一簇的物种同源性高，亲缘关系最近，最有可能是同一物种。系统发育树见下图2，图中可清晰地发现菌株ZSWL13018与A.veronii(JF920632.1)聚为同一最小分支；GDZS0902与A.veronii(MH270522.1)聚为同一最小分支；ZSWL13054与A.hydrophila(JN711560.1)聚为同一最小分支；ZSWL13050与A.veronii(JQ004748.1)聚为同一最小分支；ZSWL13031与A.hydrophila(JN711573.1)聚为同一最小分支。这些聚为同一最小分支的菌株具有最高的同源性，最可能为同一物种。建树结果与BLAST比对结果基本吻合。
目前，针对气单胞菌的检测鉴定主要采用生理生化特征结合16S rRNA序列分析的方法。然而，在实际应用中该方法存在诸多不足，如检测过程繁琐,试验所需时间比较长；最为致命的是，由于气单胞菌不同种的16SrRNA基因间差异较低(仅0.06％～0.66％)，导致16S rRNA序列分析无法准确鉴别到种。传统鉴定方法的费时费力和不准确性限制了实际应用中病原菌快速、准确的鉴定，无法及时针对水产养殖爆发的病害进行检测并给出科学的解决方案。
为了解决上述存在的关键问题，本发明以Genbank中维氏气单胞菌的cpn60基因序列(登录号为EU306841.1)为靶基因设计了一对通用引物，鉴定步骤分为以下几步：首先提取待测气单胞菌基因组；第二步，使用本研究设计的专用引物配制体系进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后送至公司进行测序；第三步，将待测PCR产物序列作BLAST比对分析，以序列覆盖度大于98％且相似度大于98.8％作为筛选标准，GenBank数据库中满足此条件的物种与待测物种为同一物种。通过此方法即可以鉴定到种。最后从GenBank上下载气单胞菌属代表种的cpn60序列，与待测序列一起构建系统发育树，聚为同一最小分支具有最高的同源性，以此辅助验证鉴定结果。
Claims (3)
1.一种气单胞菌属不同物种的条形码鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、提取待测气单胞菌基因组DNA；
B、使用条形码鉴定引物进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后进行测序；
C、将待测PCR产物序列作BLAST比对分析，以序列覆盖度大于98%且相似度大于98.8%作为筛选标准，GenBank数据库中满足此条件的物种与待测物种为同一物种；
所述的条形码鉴定引物为：F：5’-GGAATTCGCAACCGTTCTGGCTCAGGCTATCGT-3’；R：5’-TGTCGACGACGGCAGCCACTTTCAC-3’。
2.根据权利要求1所述的条形码鉴定方法，其特征在于，从GenBank上下载气单胞菌属代表种的cpn60序列，与待测序列一起构建系统发育树，聚为同一最小分支具有最高的同源性。
3. 根据权利要求1所述的条形码鉴定方法，其特征在于，所述的进行PCR扩增是：50μl的PCR反应体系，体系成分为：ddH2O 40μl、10×PCR Buffer 5μl、10mM的dNTPs 1μl、10μM的引物-F 1μl、10μM的引物-R 1μl、DNA模板1μl、2U/μl 的Taq DNA聚合酶1μl；PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s、退火温度49℃，退火时间为30s、72℃延伸1min、共30个循环；72℃再延伸10min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010692281.7A CN111926094B (zh) | 2020-07-17 | 2020-07-17 | 一种气单胞菌属内不同物种的条形码鉴定引物、鉴定方法和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010692281.7A CN111926094B (zh) | 2020-07-17 | 2020-07-17 | 一种气单胞菌属内不同物种的条形码鉴定引物、鉴定方法和试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111926094A CN111926094A (zh) | 2020-11-13 |
| CN111926094B true CN111926094B (zh) | 2022-07-22 |
Family
ID=73313696
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010692281.7A Active CN111926094B (zh) | 2020-07-17 | 2020-07-17 | 一种气单胞菌属内不同物种的条形码鉴定引物、鉴定方法和试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111926094B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101942505A (zh) * | 2010-04-28 | 2011-01-12 | 南京农业大学 | 致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒 |
| CN108424866A (zh) * | 2018-04-11 | 2018-08-21 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种鲟源中间气单胞菌AMth-1及PCR检测引物及应用 |
| CN108707679A (zh) * | 2018-04-18 | 2018-10-26 | 海南大学 | 基于特异性序列的维氏气单胞菌检测引物、试剂盒、检测方法及其开发方法 |
-
2020
- 2020-07-17 CN CN202010692281.7A patent/CN111926094B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101942505A (zh) * | 2010-04-28 | 2011-01-12 | 南京农业大学 | 致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒 |
| CN108424866A (zh) * | 2018-04-11 | 2018-08-21 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种鲟源中间气单胞菌AMth-1及PCR检测引物及应用 |
| CN108707679A (zh) * | 2018-04-18 | 2018-10-26 | 海南大学 | 基于特异性序列的维氏气单胞菌检测引物、试剂盒、检测方法及其开发方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| cpnDB:A Chaperonin Sequence Database;JanetE.Hill等;《Genome Research》;20041231;第14卷;全文 * |
| Phylogenetic analysis and identification of Aeromonas species based onsequencing of cpn60 universal target;David Min ˜ana-Galbis等;《International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology》;20090630;摘要，第2-3页 * |
| 团头鲂致病嗜水气单胞菌的分离鉴定与毒力基因的检测及耐药分析;田佳鑫等;《中国兽医科学》;20170120(第01期);全文 * |
| 鲫鱼源致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏试验;张冬星等;《中国兽医科学》;20170320(第03期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111926094A (zh) | 2020-11-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106755424B (zh) | 一种基于crispr的大肠杆菌st131系菌株检测引物、试剂盒及检测方法 | |
| Hugenholtz et al. | Novel division level bacterial diversity in a Yellowstone hot spring | |
| Coram et al. | Molecular relationship between two groups of the genus Leptospirillum and the finding that Leptospirillum ferriphilum sp. nov. dominates South African commercial biooxidation tanks that operate at 40 C | |
| Tsykun et al. | A new multilocus approach for a reliable DNA-based identification of Armillaria species | |
| De Ley | Phylogeny of procaryotes | |
| CN111893198B (zh) | 用于银白色葡萄球菌鉴定的特异性分子靶标、检测引物组及其快速检测方法 | |
| CN103898108A (zh) | 对河流弧菌o2，o4，o13，o15和o18特异的核苷酸及其应用 | |
| Glöckner et al. | Phylogeny and identification in situ of Nevskia ramosa | |
| CN104059975A (zh) | 对普罗威登斯菌o3，o4，o8，o12，o13和o20特异的核苷酸及其应用 | |
| Zehentner et al. | Evidence for numerous embedded antisense overlapping genes in diverse E. coli strains | |
| CN111154900A (zh) | 铜绿假单胞菌特异性新分子靶标及其快速检测方法 | |
| CN108913768B (zh) | 一种同时检测七个氨基糖胺类耐药基因的多重液相基因芯片引物、试剂盒及其分析方法 | |
| CN111926094B (zh) | 一种气单胞菌属内不同物种的条形码鉴定引物、鉴定方法和试剂盒 | |
| CN111057775A (zh) | 鉴定沙门氏菌属的特异性新分子靶标及其快速检测方法 | |
| CN111705149A (zh) | 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌荧光定量pcr内参基因及其引物的筛选和应用 | |
| CN115976235B (zh) | 德氏乳杆菌cicc 6047菌株的鉴定方法及其引物、试剂盒和应用 | |
| CN111518931A (zh) | 牛奶中3种致病菌多重pcr诊断试剂盒 | |
| CN116287344A (zh) | 一种检测阪崎克罗诺杆菌的引物对、试剂盒和方法 | |
| CN110863061A (zh) | 检测金黄色葡萄球菌的特异性lamp引物、试剂盒及方法 | |
| CN107723348B (zh) | 鉴定单增李斯特菌1/2c血清型的NASBA检测方法 | |
| CN113136443B (zh) | 一种快速鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核酸检测方法 | |
| CN112899382B (zh) | 一种鉴定拟无枝酸菌的检测方法 | |
| Saroj et al. | A rapid, one step molecular identification of Trichoderma citrinoviride and Trichoderma reesei | |
| CN113249506B (zh) | 一种用于迟缓爱德华氏菌检测的基因芯片探针组 | |
| CN110628927B (zh) | 一种基于gyrB基因序列的伯克霍尔德菌检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |