CN106755424B - 一种基于crispr的大肠杆菌st131系菌株检测引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR的大肠杆菌ST131系菌株检测引物、试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。该引物针对CRISPR3位点基因序列或者与该序列同源性达95％以上的同源序列设计合成，具体见序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2。本发明中检测方法以待测样本基因组DNA或单菌落为模板，利用上述引物进行PCR扩增，扩增产物与阳性对照有相同条带的判定为疑似阳性，回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，检测出SEQ ID NO.4所示序列的判定为大肠杆菌ST131系菌株阳性。该检测方法操作简单，灵敏度高，特异性好，检测结果准确、可靠。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于CRISPR的大肠杆菌ST131系菌株检测引物，同时还涉及包含该引物的试剂盒以及大肠杆菌ST131系菌株检测方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
大肠杆菌ST131系是近年来在肠外致病性大肠杆菌中兴起的一个主要谱系，该类菌株常伴随着多耐药性状的出现，其常携带编码超光谱β-内酰胺酶、产KPC-2碳青霉烯类等的耐药基因，对于多耐药菌株在世界范围内扩散和流行具有重要意义(YasufumiMatsumura,Johann D.D.Pitout,Ryota Gomi,et al.Global Escherichia coli SequenceType 131Clade with blaCTX-M-27Gene[J].Emerging Infectious Diseases,2016,22(11):1900-1907)。国内相关研究也证实，ST131系大肠杆菌对临床上常用的13种抗生素的耐药率比非ST131系大肠杆菌高(董敏,郑书发,余斐等.尿道致病性大肠埃希菌克隆株毒力和耐药性的研究[J].中华检验医学杂志,2014,37(7):531-534)。因此，实现对ST131系大肠杆菌的检测及监控对于预防和控制多耐药菌株的出现具有重要的公共卫生学意义。
目前，ST131系大肠杆菌的检测方法主要借助于Thierry Wirth教授创建的MLST分型法，该方法通过对大肠杆菌的7个管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA)进行扩增和测序分析，获得一个等位基因编号，从而证实ST131系大肠杆菌的存在(Wirth T,Falush D,Lan R,Colles F,et al.Sex and virulence in Escherichia coli:anevolutionary perspective[J].Mol.Microbiol,2006,60(5),1136-1151)。
成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)由正向重复序列(Direct Repeats，DR)和插入其中的间隔序列(spacer)构成，最初由Ishino Y等在大肠杆菌中发现(Ishino Y,Shinagawa H,MakinoK,et al.Nucleotide Sequence of the IapGene,Responsible for AlkalinePhosphatase Isozyme Conversion in Escherichia Coli,and Identification of theGene Product[J].Journal of Bacteriology,1987,169(12):5429-5433)。近年来研究表明CRISPR结构存在于45％的细菌和90％的古生菌中(Bhaya D,Davison M,BarrangouR.CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea:versatile small RNAs foradaptive defense and regulation[J].Annu.Rev.Genet,2011,45:273-297)。目前已证实大肠杆菌中存在4个CRISPR位点，分别命名为CRISPR1、CRISPR2、CRSPR3、CRSPR4。CRISPR1位于基因iap与cysH之间，CRISPR2位于ygcE与ygcF之间，CRISPR3位于clpA与tRNA-ser之间，CRISPR4位于tRNA-infA之间，CRISPR1、CRISPR2与其临近的Cas基因共同构成I-E型CRISPR/Cas系统，而CRISPR3、CRISPR4与其临近的Cas基因构成I-F型CRSPR/Cas系统(Yin S,JensenMA,Bai J,Debroy C，et al.The evolutionary divergence of Shiga toxin-producingEscherichia coli is reflected in clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat(CRISPR)spacer composition[J].Appl.Environ.Microbiol.,2013,79:5710-5720)。在大肠杆菌的CRISPR结构中，正向重复序列是高度保守的，CRISPR1与CRISPR2的重复序列高度一致，CRISPR3与CRISPR4的重复序列高度一致，但是间隔序列高度多变，即使在同一株大肠杆菌的同一个CRISPR位点中也是高度变异的(Díez-
C,Almendros C,García-Martínez J,et al.Diversity of CRISPR loci in Escherichiacoli[J].Microbiology,2010,156(5):1351-1361)。由此可见，间隔序列的高度可变性为区分不同类型的大肠杆菌提供了可能。比如公布号CN105112519A的发明专利公开的一种基于CRISPR的大肠杆菌O157:H7菌株检测引物(如SEQ ID NO.1～2所示)，针对CRISPR1位点基因序列(包括4条重复序列和3条独特的间隔序列)设计合成，PCR扩增后测序分析，如能检测出CRISPR1中3条独特的间隔序列(如SEQ ID NO.5～7所示)即可判定细菌阳性，操作简单，敏感性、特异性高，与大肠杆菌O157:H7血清分型结果相一致。因此，开发出一种基于CRSIRP的菌株检测技术将为大肠杆菌ST131系检测提供极大的便利。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于CRISPR的大肠杆菌ST131系菌株检测引物。
同时，本发明还提供一种包含上述引物的检测试剂盒。
最后，本发明再提供一种基于CRISPR的大肠杆菌ST131系菌株检测方法，该方法操作简单，灵敏度高，特异性好，检测结果准确、可靠。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
大肠杆菌ST131系菌株检测引物，根据CRISPR3位点基因序列或者与该序列同源性达95％以上的同源序列设计合成，引物如下所示：
上游引物：5'-TTGTYAGGTAGGTTGGTGAAG-3'，Y为C或T；
下游引物：5'-GCGAAGAGAAAGAACGAGTA-3'。
大肠杆菌ST131系菌株检测试剂盒，包含以下引物：
上游引物：5'-TTGTYAGGTAGGTTGGTGAAG-3'，Y为C或T；
下游引物：5'-GCGAAGAGAAAGAACGAGTA-3'。
所述试剂盒还可以包括：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNAPolymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mM dNTP，4mM MgSO4)、灭菌超纯水、阳性对照(大肠杆菌ST131系菌株基因组DNA或甘油保存菌液)、10×PCR菌落增强剂以及DNA Marker DL 2000等。
大肠杆菌ST131系菌株检测方法，包括以下步骤：
1)以待测样本基因组DNA或单菌落为模板，利用引物进行PCR扩增，扩增产物经电泳分析与阳性对照有相同条带的判定为疑似阳性；
2)回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，检测出SEQ ID NO.4所示序列的判定为细菌阳性；
步骤1)中引物如下所示：
上游引物：5'-TTGTYAGGTAGGTTGGTGAAG-3'，Y为C或T；
下游引物：5'-GCGAAGAGAAAGAACGAGTA-3'。
步骤1)中待测样本基因组DNA可采用煮沸法或者利用DNA提取试剂盒制得。
步骤1)中PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/mL Taq DNAPolymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mM dNTP，4mM MgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，5～10ng/μL待测样本基因组DNA 2μL，灭菌超纯水8.5μL，总计25μL。
或者，PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/mL Taq DNAPolymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mM dNTP，4mM MgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，单菌落，1×PCR菌落增强剂2.5μL，灭菌超纯水补足至25μL。
步骤1)中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸1min，共32个循环；72℃继续延伸10min。
步骤1)中阳性对照为大肠杆菌ST131系菌株。
本发明的有益效果：
本发明通过对GenBank数据库中大肠杆菌ST131系全基因组测序结果进行分析及对实验室保存的大肠杆菌ST131系菌株检测发现，其具有CRISPR3位点，且CRISPR3中存在一段SEQ ID NO.4所示的独特序列。针对CRISPR3位点基因序列设计上、下游引物，PCR扩增后进行电泳分析，与阳性对照有相同条带的判定为疑似阳性，回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，检测出SEQ ID NO.4所示序列的判定为大肠杆菌ST131系菌株阳性。该检测方法操作简单，灵敏度高，特异性好，检测结果准确、可靠。试验证实，该方法与大肠杆菌ST131系菌株MLST分型结果相一致，但比MLST法省时、省力，检测费用低。
附图说明
图1为试验例中PCR扩增产物的凝胶电泳图。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
大肠杆菌ST131系菌株检测引物，根据CRISPR3位点基因序列或者与该序列同源性达95％以上的同源序列设计合成，引物如下所示：
上游引物：5'-TTGTYAGGTAGGTTGGTGAAG-3'，Y为C或T；
下游引物：5'-GCGAAGAGAAAGAACGAGTA-3'。
实施例2
大肠杆菌ST131系菌株检测试剂盒，包含：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL TaqDNA Polymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mM dNTP，4mM MgSO4)20mL，灭菌超纯水30mL，阳性对照(甘油保存菌液：甘油500μL，大肠杆菌菌液800μL)1.5mL，8μmol/L上、下游引物各1μL，DNA Marker 2000及试剂盒说明书一份。引物如下所示：
上游引物：5'-TTGTYAGGTAGGTTGGTGAAG-3'，Y为C或T；
下游引物：5'-GCGAAGAGAAAGAACGAGTA-3'。
检测原理：试剂盒中含有聚合酶链式反应所需的各种试剂组分，如引物、dNTPs、缓冲液、Taq酶等，在PCR反应液中加入检测样品，进行PCR扩增，扩增产物经电泳分析出现与阳性对照相同条带的判定为疑似阳性，胶回收扩增产物，进行测序分析，检测出SEQ ID NO.4所示序列的判定为大肠杆菌ST131系细菌阳性。可用于获知各种待检测样本(如粪便、食物等)中大肠杆菌ST131系菌株的污染状况。
操作说明：
1)提取待检测样本的基因组DNA或者挑取单菌落；
2)利用上、下游引物进行PCR扩增，配制如下反应体系：
2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mM dNTP，4mM MgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，待测样本基因组DNA 2μL，灭菌超纯水8.5μL，总计25μL；
或者，2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mM dNTP，4mM MgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，单菌落，1×PCR菌落增强剂(市售商品，主要成分为甜菜碱，为10倍浓度，使用时需稀释为1倍浓度)2.5μL，补加灭菌超纯水至25μL；
设置反应程序：94℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸1min，共32个循环，72℃继续延伸10min；
3)扩增产物凝胶电泳分析，分析条件：2.0％琼脂糖凝胶，电压5V/cm，时间20min；在紫外灯下观察结果，若出现与阳性对照相同的条带即判定为疑似阳性，阴性对照不出现特异性条带或者条带不一致；
4)回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，检测出SEQ ID NO.4所示序列的判定为大肠杆菌ST131系细菌阳性。
实施例3
大肠杆菌ST131系菌株检测方法，包括以下步骤：
1)样本的收集和预处理
将500μL待检测样本(粪便)加入到10mL LB液体培养基中，37℃增菌5h，台式高速离心机12000rpm/min离心5分钟，弃上清，沉淀用作检测模板；
2)PCR扩增
利用上、下游引物进行PCR扩增，引物如下所示：
上游引物：5'-TTGTYAGGTAGGTTGGTGAAG-3'，Y为C或T，
下游引物：5'-GCGAAGAGAAAGAACGAGTA-3'；
PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mM dNTP，4mM MgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，单菌落(从增菌沉淀中挑取)，1×PCR菌落增强剂2.5μL，补加灭菌超纯水至25μL；
反应程序：94℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸1min，共32个循环，72℃继续延伸10min；
3)检测结果
取5μL PCR扩增产物，于20g/L琼脂糖凝胶中电泳，用DNA Marker 2000作分子量标记，设置电压5V/cm，电泳20min后，在紫外灯下观察结果，出现与阳性对照相同的条带，判定为疑似阳性；
凝胶回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，结果显示与SEQ ID NO.4所示序列，判定样本受到大肠杆菌ST131系菌株污染。
对比例1
根据国际上公认的大肠杆菌ST131系菌株标准检测方法，通过7对管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA)的扩增识别ST131系菌株。
检测方法为：依据http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli/documents/ primersColi_html公布的大肠杆菌MLST分型的7对管家基因合成相应的引物，扩增相应的管家基因并进行测序，将序列提交至http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli，获得相应的等位基因编号，从而获得菌株的MLST分型结果。
以adk基因为例，步骤如下：
1)合成引物，
依据http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli/documents/primersColi_ html公布的大肠杆菌MLST分型信息合成adk管家基因的扩增引物，引物序列如下所示：
上游引物：5'-ATTCTGCTTGGCGCTCCGGG-3'，
下游引物：5'-CCGTCAACTTTCGCGTATTT-3'。
预期扩增产物的长度为536bp，引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。
2)PCR扩增
参照PCR反应试剂盒(北京天根生化科技有限公司)产品说明，配制25μL反应体系：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mM dNTP，4mM MgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，实施例3中待测样本基因组DNA 2μL，加灭菌超纯水至25μL。
反应程序：95℃预变性2min；95℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；72℃继续延伸5min。
3)测序鉴定
凝胶回收PCR扩增产物，将PCR扩增产物交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果提交至http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli，获得相应的等位基因编号，依上述方法分别获得其它6个基因的等位基因编号，并获得其等位基因编号，最终获得一个MLST分型编号。
4)检测结果
将7对管家基因的测序结果提交至MLST分型数据库，结果显示为ST131系菌株，判断样本受到ST131系菌株的感染。
试验例
一、试验中使用的细菌菌株
大肠杆菌菌株于2014年分离于河南睢县，编号分别为2014011。
GeneBank中Escherichia coli ST131系菌株：Escherichia coli SE15，Escherichia coli NA114，Escherichia coli O25b:H4-ST131，Escherichia coliJJ1886，Escherichia coli MNCRE44，Escherichia coli CD306，Escherichia coliJJ2434，Escherichia coli JJ1897，Escherichia coli SaT040，Escherichia coli G749，Escherichia coli MVAST0167，Escherichia coli ZH193，Escherichia coli ZH063，Escherichia coli JJ1887，Escherichia coli strain Ecol_732，Escherichia colistrain Ecol_743，Escherichia coli strain Ecol_745，Escherichia coli strainEcol_448。
二、试验中使用的试剂及仪器
(1)LB培养基
LB液体培养基：称取1.0g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、1.0g氯化钠，溶于100mL蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，121℃高压灭菌20min，置4℃保存备用。
LB固体培养基：称取1.0g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、1.0g氯化钠、1.5g琼脂粉，溶于100mL蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，121℃高压灭菌20min，冷却至约50℃时倾注平板，保存备用。
(2)PCR反应试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，琼脂糖为BIOWEST公司进口分装，酵母浸粉、胰蛋白胨购自英国Oxoid公司，琼脂粉购自Sigma公司，其他常用试剂均为国产分析纯级试剂。
PTC-100型基因体外扩增仪购自MJRESEARCH公司，DYY-8C型稳压稳流定时电泳仪购自北京六一仪器厂，Gene snap图像扫描仪购自美国Syngene公司。
未作特别说明的试验材料和方法均为公知技术，可在常用工具书包括《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克、D.W拉塞尔著，第三版，科学出版社，2002)等中查找。
三、大肠杆菌2014011的CRISPR3位点检测
(1)DNA模板的制备
采用煮沸法从大肠杆菌菌液中提取全基因组DNA，具体操作为：从-80℃冰箱内取出大肠杆菌2014011冻存保种管，置于4℃冰箱复温5小时(4～6小时均可)，超净台中用无菌接种环快速取菌液，以分段划线法转种于LB固体培养基平板上，37℃恒温箱孵育21小时(18～24小时均可)，挑取LB琼脂平板上单菌落，接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养7小时(6～8小时均可)，取1mL菌液于1.5mL Eppdorf管中，14000r/min转速下离心1分钟，弃上清，加入超纯水100μL，震荡混匀，煮沸10min，14000r/min转速下再次离心10分钟，取上清，即得大肠杆菌2014011基因组DNA，置于-20℃贮存备用。
(2)PCR引物设计与合成
根据大肠杆菌ST131系菌株的CRISPR3位点基因序列或者与该序列同源性达95％以上的同源序列设计引物，如下所示：
上游引物：5'-TTGTYAGGTAGGTTGGTGAAG-3'，Y为C或T，
下游引物：5'-GCGAAGAGAAAGAACGAGTA-3'；
预期扩增产物的长度为700bp左右，引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。
(3)PCR扩增
参照PCR反应试剂盒(北京天根生化科技有限公司)产品说明，配制25μL反应体系：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mM dNTP，4mM MgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，基因组DNA模板2μL，加灭菌超纯水至25μL。
反应程序：94℃预变性5min；94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸1min，共32个循环；72℃继续延伸10min。
(4)PCR产物分析
取5μL PCR扩增产物，于20g/L琼脂糖凝胶中电泳，用DNA Marker DL2000作分子量标记，电压5V/cm，电泳20min后，用凝胶图像扫描仪进行分析，电泳结果见图1(图中M为DNAMarker，1为大肠杆菌2014011扩增产物的电泳结果)。
从图1可以看出，PCR扩增产物的长度与预期长度符合，证实PCR扩增CRISPR3基因成功。
(5)测序鉴定
回收PCR扩增产物，交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果如SEQ ID NO.3所示。将测序得到的基因序列与Gene bank上Escherichia coli SE15公布的CRIAPR3位点基因序列(GenBank：NC_013654.1)进行BLAST比对，结果显示二者99％相同。
(6)测序分析
对测序结果中CRISPR3位点基因序列进行分析，结果显示：在大肠杆菌ST131系的CRISPR3位点可以检测到1条独特的序列，如SEQ ID NO.4所示。将该序列在GenBank中进行BLAST比对，发现其与Escherichia coli SE15的第894816～894895位碱基完全匹配。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学、新乡医学院
<120> 一种基于CRISPR的大肠杆菌ST131系菌株检测引物、试剂盒及检测方法
<170> PatentIn version 3.5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 上游引物（Y为C或T）
<222> (1)..(21)
<400> 1
TTGTYAGGTA GGTTGGTGAA G 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 下游引物
<222> (1)..(20)
<400> 2
GCGAAGAGAA AGAACGAGTA 20
<211> 654
<212> DNA
<213> 扩增序列
<221> 大肠杆菌2014011的CRISPR3位点基因序列
<222> (1)..(654)
<400> 3
GGTAGGTTGG TGAAGTCCGT AATCTCGTCA GGGGTTACGG ACTTTTTATT TATGGGGGGA 60
GGAGGTTCAG ACCCTTTTTT TGATGATGAT GGTAAGTTAT TGATAATTAG TGCTGCGGGT 120
AGGTAAGGAT AAAAAAGGGT GGCAGCAGGA GATTGAGATG GTTTTGCTTT ATTAACAACG 180
GGCTAAACGT GTAGTATTTG AGTTCACTGC CGTACAGGCA GCTTAGAAAT TGCCGCGGAT 240
CCTGTCTGCC AATAATGACA AGTTCACTGC CGTACAGGCA GATAAAATGC GAAAAAAAAG 300
CCCGTACTTT CGTACGAGCT CTTCTTTAAA TATGGCGGTG AGGGGGGGAT TCGAACCCCC 360
GATACGTTGC CGTATACACA CTTTCCAGGC GTGCTCCTTC AGCCACTCGG ACACCTCACC 420
AAATTGTTTT TTTGCCTGAC CTCATGGGGG GCAACGGGGC GCTACTATAG GGAGTTGGAA 480
TAAAACGGTC AAGAAGAATT TTTATGATAA TTATTGTTTG CTCATACTGT AAACAAGTTG 540
TGCAGTATAT CTACATCGAG ACAAGTTACG GACTTATACT TCTAAAGTAC TCCATACATA 600
TCACAAAATA AAAAGGCCGG CTAAACCGAC CTTTTACTCG TTCTTTCTCT TCGC 654
<211> 80
<212> DNA
<213> 序列
<221> CRISPR3中独特序列
<222> (1)..(80)
<400> 4
GTTCACTGCC GTACAGGCAG CTTAGAAATT GCCGCGGATC CTGTCTGCCA ATAATGACAA 60
GTTCACTGCC GTACAGGCAG 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> adk管家基因扩增的上游引物
<222> (1)..(20)
<400> 5
ATTCTGCTTG GCGCTCCGGG 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> adk管家基因扩增的下游引物
<222> (1)..(20)
<400> 6
CCGTCAACTT TCGCGTATTT 20
Claims (4)
1.大肠杆菌ST131系菌株的非诊断目的的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）以待测样本基因组DNA或单菌落为模板，利用引物进行PCR扩增，扩增产物经电泳分析与阳性对照有相同条带的判定为疑似阳性；
2）回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，检测出SEQ ID NO.4所示序列的判定为大肠杆菌ST131系细菌阳性；
步骤1）中引物如下所示：
上游引物：5'-TTGTYAGGTAGGTTGGTGAAG-3'，Y为C或T；
下游引物：5'-GCGAAGAGAAAGAACGAGTA-3'。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：当以待测样本基因组DNA为模板时，步骤1）中PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，5~10ng/μL待测样本DNA 2μL，灭菌超纯水8.5μL，总计25μL。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：当以待测样本单菌落为模板时，步骤1）中PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，单菌落，1×PCR菌落增强剂2.5μL，补加灭菌超纯水至25μL。
4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于：步骤1）中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸1min，共32个循环；72℃继续延伸10min。
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