CN110846428A

CN110846428A - 检测无乳链球菌的特异性lamp引物、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN110846428A
Application number: CN201911397127.0A
Authority: CN
Inventors: 吴晓玲; 马臣杰; 王雯雯; 邓光存
Original assignee: Ningxia University
Current assignee: Ningxia University
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-02-28

Abstract

本发明公开了一种检测无乳链球菌的特异性LAMP引物、试剂盒及方法。所述试剂盒包括6条环介导等温扩增引物：外引物F3和B3、内引物FIP和BIP及环引物LB和LF，6条引物针对无乳链球菌NR‑113262.1基因的保守序列设计；FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。本发明解决了现有的无乳链球菌检测技术周期长、成本高、不能应用于现场快速检测等问题。

Description

检测无乳链球菌的特异性LAMP引物、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，更具体地，涉及检测无乳链球菌的特异性LAMP引物、试剂盒及方法。

背景技术

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae，Sa)是一种传染性很强的革兰氏阳性细菌，可引起败血症、肺炎、新生儿脑膜炎及乳腺炎等多种疾病。

目前，无乳链球菌的检测方法主要有传统分离培养、免疫学检测、分子生物学检测。传统分离培养具有操作繁琐，检验时间较长等缺点，不能满足快速检测的要求。免疫学检测简单快速，但灵敏度差，假阳性高，易产生交叉反应。分子生物学检测，特异性、灵敏度较高，但需要昂贵的仪器设备、对检测人员技术要求较高而使其不适用于现场快速检测及基层普及和推广应用。因此，建立一种简便、快速、特异、灵敏、经济可靠的无乳链球菌检测方法十分必要。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)是2000年由日本荣研株式会社Notomi等人提出的一种新颖的恒温核酸扩增技术，继该技术报道以来一直成为广大研究人员关注的焦点。经过不断改进和发展，该技术已经得到快速发展和广泛应用。其特点是针对靶基因的6个不同位点设计4条特异性引物，依赖于Bst DNA聚合酶的高自循环链置换作用，在恒温条件下孵育一定时间，以高灵敏度，高特异性，高效性和快速性扩增靶核酸。通常在30～60分钟内可将目的基因扩增10⁹～10¹⁰拷贝。

发明内容

本研究提供一种快速、特异性强、灵敏度高且成本低的环介导等温扩增方法检测无乳链球菌的试剂盒，并提供配套使用该试剂盒快速检测无乳链球菌的方法，从而为奶牛养殖和食品安全提供科学的依据和指导作用。

本发明的目的是建立一种快速、特异、灵敏、检测方便的环介导恒温扩增方法检测无乳链球菌。

本发明提供了一种检测无乳链球菌的环介导等温扩增(LAMP)引物，6条引物针对无乳链球菌NR-113262.1基因的保守序列设计，包括：外引物F3和B3、内引物FIP和BIP及环引物LB和LF；FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。

本发明提供了一种检测无乳链球菌的环介导等温扩增(LAMP)试剂盒，其特征在于，所述环介导等温扩增试剂盒包括内引物10μM FIP/BIP、10μM F3/B3、10μM LB/LF各100μL。

在上述环介导等温扩增(LAMP)试剂盒中，所述试剂盒还包括10×反应缓冲液1mL，8U/反应Bst聚合酶l00μL，1.2mM dNTP 500μL，0.8M甜菜碱500μL以及1000×SYBR green I500μL。

本发明提供了一种检测无乳链球菌的方法，包括：提取待检测样品基因组DNA；构建包括以下引物的反应体系：F3和B3、FIP和BIP以及LB和LF，其中，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；进行扩增反应；通过荧光染料的颜色变化来确定是否存在无乳链球菌。

本发明具有以下优点：LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。本发明针对无乳链球菌的NR-113262.1基因保守序列设计筛选得到特异性LAMP引物，对无乳链球菌的目标基因进行检测，特异性与PCR相当，灵敏度高于PCR，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。在所检测菌株中均未出现非特异性扩增，说明该发明具有高特异性。

本发明的另一些优点是(1)不需要特殊试剂与设备；(2)高特异性：针对六个区域设计六条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否；(3)快速、高效扩增：从基因提取到检测只需1小时左右；(4)灵敏度高：检测灵敏度为4.9copies/μL，比常规PCR方法高10倍，(5)鉴定简便：通过裸眼观察鉴定，无需凝胶电泳等其他任何分析步骤。加入SYBR greenI荧光染料后，阳性结果显色为绿色，阴性结果为橙色，更加明显可靠。

附图说明

图1示出了无乳链球菌LAMP反应体系及反应条件优化电泳图。其中：A.Mg²⁺浓度的优化；M：DL2000 DNA Mark；1～9Mg²⁺浓度分别为：2、3、4、5、6、7、8、9mM；N阴性对照；B.dNTPs浓度的优化；1：DL2000DNA Mark；1～8dNTPs浓度分别为：1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4mM；N：阴性对照；C.甜菜碱浓度的优化；1：DL2000 DNA Mark；1～5甜菜碱浓度分别为：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0M；6：阴性对照；D.引物浓度比(外引物：内引物：环引物)的优化；M:DL2000 DNA Mark；1～7外引物：内引物：环引物为：1∶1∶1；1∶2∶2；1∶2∶4；1∶4∶2；1∶4∶4；1∶8∶2；1∶8∶4；N：阴性对照；E.反应温度的优化；M:DL2000DNA Mark；1:57℃；2:59℃；3:61℃；4:63℃；5:65℃；6:67℃；N：阴性对照F.反应时间优化；M:DL2000 DNA Mark；1:20min；2:30min；3:40min；4:50min；5:60min；6:70min；N:阴性对照。

图2示出了LAMP与PCR检测无乳链球菌灵敏度结果。

图3示出了LAMP检测无乳链球菌琼脂糖凝胶电泳与可视化LAMP显色结果图。其中：1：无乳链球菌(亮绿色)；2：停乳链球菌；3：乳房链球菌；4：大肠杆菌；5：肺炎链球菌；6：表皮葡萄球菌；7:绿脓假单包菌；8：奇异变形杆菌；9：白色念珠球菌(ATCC 10231)；10：白色念珠球菌(ATCC 90028)11：伤寒沙门氏菌；12：金黄色葡萄球菌；N：阴性对照。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Ampl ification，LAMP)是2000年由日本荣研株式会社Notomi等人提出的一种新颖的恒温核酸扩增技术，继该技术报道以来一直成为广大研究人员关注的焦点。

本研究针对保守性和特异性良好的无乳链球菌NR-113262.1基因，利用LAMP技术原理，设计了LAMP引物组，进而对LAMP反应体系中的反应温度、反应时间、反应体系中Mg²⁺、甜菜碱、dNTPs、引物浓度进行了优化，成功建立了一种具有良好特异性和灵敏度的无乳链球菌LAMP可视化检测方法。通过对宁夏地区不同奶牛养殖场90份疑似感染无乳链球菌的患病奶样开展LAMP检测和PCR检测平行实验，验证了无乳链球菌LAMP可视化检测方法的可靠性。

本发明第一个目的在于提供一种无乳链球菌特异性LAMP检测引物。

本发明第二个目的在于提供一种无乳链球菌LAMP检测试剂盒。

本发明第三个目的在于提供一种无乳链球菌LAMP检测方法。不仅降低检测成本，同时提高检测的准确性。

为达上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

检测无乳链球菌的LAMP引物，包括以下3对引物：外引物F3和B3、内引物FIP和BIP以及环引物LB和LF；FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。

检测无乳链球菌LAMP引物组序列如下：

SEQ.ID.NO.1：CCAGGCGGAGTGCTTAATGCG-TGCTAGGTGTTAGGCCCTT

SEQ.ID.NO.2：GGAGTACGACCGCAAGGTTGAA-CATGCTCCACCGCTTGTG

SEQ.ID.NO.3：CCACGCCGTAAACGATGAG

SEQ.ID.NO.4：TCTTCGCGTTGCTTCGAATT

SEQ.ID.NO.5：TCAAAGGAATTGACGGGGGC

SEQ.ID.NO.6：AGCTGCGGCACTAAGCC

检测无乳链球菌的LAMP试剂盒包括以下成分：(1)上述的引物序列SEQ.ID.N0.1-SEQ.ID.N0.6；(2)Bst 2.0DNA聚合酶；(3)LAMP反应缓冲液；(4)SYBR Green I荧光染料；(5)阴性对照。

检测无乳链球菌的LAMP检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待检样品基因组DNA；

(2)将以下组份进行混合，构建包括3对引物包括F3和B3、FIP和BIP以及LB和LF的25μL LAMP反应体系：

(3)加样进行扩增反应；

(4)将LAMP反应体系在64℃加热40min，然后在80℃加热5min，即可完成扩增；反应于PCR仪或水浴锅或恒温金属浴。

(5)待反应完成后通过以下方式进行结果的判定：

(6)扩增完成，向扩增产物中添加1μL1000SYBR green I荧光染料，通过观察LAMP反应体系是否有颜色变化来判断是否有无乳链球菌，若LAMP反应体系颜色发生变化(橘红色变为亮绿色)则为阳性反应，表明在待检测对象中检测到无乳链球菌；若LAMP反应体系颜色未发生变化(仍为橘红色)则为阴性反应，表明在待检测对象中未检测到无乳链球菌。

下面结合具体的实例进行说明，以更好地理解本发明。

(1)BLAST分析：从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载无乳链球菌全基因组序列，对所选的基因序列保守性进行比对分析。

(2)据无乳链球菌保守基因序列(GenBank号：NR-113262.1)，在NCBI上进行BLAST比对分析后，基于NR-113262.1基因选取一段高度保守区域，利用LAMP在线引物设计软件Primer Explorer5(http://primerexplorer.jp/e/index.html/)包括4条特异性引物和2条环引物。引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。具体序列见SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.6。

(3)实验用菌株

包括1株无乳链球菌(ATCC 13813)，11株其他非目标菌种：停乳链球菌(ATCC12388)、大肠杆菌(ATCC 8739)、乳房链球菌(ATCC 700407)、肺炎克雷伯菌(ATCC 13883)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)、绿脓假单胞菌(CVCC 3359)、奇异变形杆菌(CVCC1969)、两株白色念珠球菌(ATCC10231、ATCC 90028)、伤寒沙门氏菌(ATCC 1403)、金黄色葡萄球菌(CVCC545)本发明所用所有ATCC菌株均购自美国菌种保藏中心，CVCC菌株均购自中国林业微生物菌种保藏管理中心。

(4)重组质粒的构建与扩增

根据GenBank中公布的无乳链球菌的NR-113262.1基因序列，由上海生工公司进行基因合成，并该将目的基因连接至pUC57载体，并通过双酶切和测序验证构建质粒的准确性。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，于添加100mg/mL Amp抗性的LB固体平板上过夜培养，挑取单克隆抗体，并在添加100mg/mL Amp抗性的LB液体培养基中37℃、180r/min培养，一部分保存于灭菌甘油中，于-80℃保存，其余用于质粒提取。

(5)细菌DNA提取

将各实验菌株接种到肉汤固体平板上进行划线复壮,放入恒温培养箱37℃培养12～36h。挑取细菌单克隆接入肉汤液体培养基中，37℃、180r/min过夜培养。扩大培养后，将菌液分装，一部分保存于灭菌甘油中，于-80℃保存备用，其余用于提取DNA。

细菌DNA的提取

A.取1.0mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，12000r/min离心5min，弃上清液；

B.加入1.0mL去核酸的无菌水，混匀，12000r/min离心5min，弃上清液；

C.加入100uL去核酸的无菌水，混匀，100℃沸水浴10min；

D.12000r/min离心10min，取上清液至一个新的1.5mL离心管中，即为待检模板DNA。

(6)LAMP反应条件的建立

A.LAMP反应体系优化

Mg²⁺浓度的优化范围：2.0～10.0mM，每1.0mM一个梯度。甜菜碱浓度优化范围0～1.0M，每0.2M一个梯度。dNTPs浓度优化范围：1.0～2.4mM，每0.2M一个梯度。引物浓度比(外引物：内引物：环引物)分别为1∶1∶1，1∶2∶2，1∶2∶4，1∶4∶2，1∶4∶4，1∶8∶4和1∶8∶2。

B.LAMP反应条件优化

反应温度优化：57～67℃，每2℃一个梯度。反应时间优化：20～70min，每10min一个梯度。用去核酸的无菌水代替模板加入反应体系作为空白对照，等待反应管冷却完毕后，取5μL扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察条带：LAMP反应阳性扩增后呈阶梯状条带，阴性无条带。选择最佳反应体系及反应条件，反应体系及应条件优化结果图琼脂糖凝胶电泳图见图1。

(7)LAMP反应体系

按照上述优化出来的最佳条件配制无乳链球菌的LAMP检测试剂盒：LAMP反应体系为25μL。其中10

反应缓冲液2.5μL、MgSO₄(8mM)2μL、甜菜碱(10M)4μL、(10mM)dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP的混合物)3.5μL、FIP/BIP(10μM)各1μL、F3/B3(10μM)0.25各μL、LB/LF(10μM)各0.5μL、8U Bst 2.0DNA聚合酶1.0μL、待检测细菌DNA 1μL、用去核酸的无菌水补齐至25μL。将反应液混匀后放入恒温金属浴，64℃反应40min。扩增产物加入1000×1μL SYBRGreen I荧光染料，涡旋混匀，瞬时离心，裸眼通过观察颜色变化来判断阴阳结果。如果颜色为亮绿色，说明待检细菌是无乳链球菌，如颜色为橙红色，则说明样品不是无乳链球菌。

(8)LAMP灵敏度实验

构建无乳链球菌阳性质粒，将阳性质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，并在添加100mg/mL Amp抗性的LB液体培养基中37℃、180r/min过夜培养，用质粒提取试剂盒提取菌液质粒，Nanodrop 8000核酸浓度测定仪测定其浓度和纯度。根据基因拷贝数计算公式将初始浓度调整为4.9×10¹⁰cpies/μL。然后，用去核酸的无菌水进行10倍倍比梯度稀释得到不同浓度的质粒作为扩增模板，浓度分别为4.9×10¹⁰-10¹cpoies/uL。PCR与LAMP进行灵敏度比对。该方法所能检测到无乳链球菌的灵敏度为4.9copies/uL，PCR检测无乳链球菌灵敏度为49copies/uL，比PCR高1个数量级，如图2所示。基因拷贝数计算公式：质粒拷贝数(copies/uL)＝6.0×10²³质粒浓度(ng/uL)×10^-9/(质粒碱基数×660)。

(9)LAMP特异性实验

选取上述其它非目标菌株，验证所建立方法检测无乳链球菌的特异性。采用上述的最佳LAMP反应条件进行特异性检测，向扩增产物中添加荧光染料SYBR Green I(索莱宝)通过肉眼观察颜色变化(阳性为亮绿色、阴性为橙红色)检测扩增结果。检测结果：见图3的A的样品1无乳链球菌呈现梯状条带，对应图3的B的裸眼观察结果为亮绿色，呈阳性，其余样品及阴性对照均为阴性，呈现淡红色。从颜色能够可视化地进行区分。

(10)临床样本的检测

随机采集宁夏地区不同奶牛养殖场90份疑似感染无乳链球菌的患病奶样。采用LAMP和PCR检测技术，分别对90份牛奶样本进行无乳链球菌检测。结果发现，在90份样本中，LAMP技术对无乳链球菌的检出率为95.5％，而PCR对无乳链球菌的检出率为88.9％，见表1。所建立LAMP方法对无乳链球菌的检测比PCR更敏感。

表1

本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。

序列表

<110> 宁夏大学

<120> 检测无乳链球菌的特异性LAMP引物、试剂盒及方法

<130> HP191211LZ

<141> 2019-12-30

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ccaggcggag tgcttaatgc gtgctaggtg ttaggccctt 40

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ggagtacgac cgcaaggttg aacatgctcc accgcttgtg 40

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ccacgccgta aacgatgag 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tcttcgcgtt gcttcgaatt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tcaaaggaat tgacgggggc 20

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

agctgcggca ctaagcc 17

Claims

1.一种检测无乳链球菌的环介导等温扩增(LAMP)引物，其特征在于，6条引物针对无乳链球菌NR-113262.1基因的保守序列设计；包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP及环引物LB和LF，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。

2.一种检测无乳链球菌的环介导等温扩增(LAMP)试剂盒，其特征在于，所述环介导等温扩增试剂盒包括内引物10μM FIP/BIP、10μM F3/B3、10μM LB/LF各100μL。

3.所述的检测无乳链球菌的环介导等温扩增(LAMP)试剂盒，其特征在于，所述环介导等温扩增试剂盒还包括10×反应缓冲液1mL，8U/反应Bst聚合酶l00μL，1.2mM dNTP 500μL，0.8M甜菜碱500μL以及1000×SYBR green I 500μL。

4.一种检测无乳链球菌的方法，包括：

提取待检测样品基因组DNA；

构建包括以下引物的反应体系：F3和B3、FIP和BIP以及LB和LF，其中，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；

进行扩增反应；

通过荧光染料的颜色变化来确定是否存在无乳链球菌。