CN103421904B - 一种单核细胞增生李斯特菌lamp可视化检测方法 - Google Patents
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Abstract
发明名称：一种单核细胞增生李斯特菌LAMP可视化检测方法本发明属于食源性病原菌分子检测技术领域，具体涉及一种基于单核细胞增生李斯特菌prfA基因的LAMP可视化检测方法。反应体系包括针对靶基因prfA的4条特异性引物、LAMP检测的反应体系、显色溶剂和反应覆盖液。60℃温育50min，80℃5min后终止反应，电泳后阳性扩增产物为不同大小区带组成的阶梯式图谱。扩增产物中加入显色溶剂，肉眼观察结果，天蓝色为阳性，紫罗兰色为阴性。本发明特异性强，操作简单，结果易于观察，可用于基层单位对于临床样品中单核细胞增生李斯特菌的初步筛选和快速检测。
Description
技术领域
本发明属于食源性病原菌检测技术领域。具体涉及一种基于单核细胞增生李斯特菌靶基因prfA的LAMP可视化检测方法。
背景技术
单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是Murray等在1924年首次从患有单核白细胞增多和败血症的兔子体内分离到，并于1940年由Pirie命名为Listeriamonocytogenes。1986年，LM被认定为一种重要的食源性致病菌，能引起人的严重胃肠炎、脑膜炎、孕妇流产和全身性感染，可导致死亡。最常见于老人、孕妇或免疫缺陷的人群。美国CDC公布2011年夏秋季科罗拉多州Jensen农场甜瓜污染引起李斯特菌病的流行，其中146个病例中30例死亡，死亡率高达20.5％。
环介导等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年由日本Notomi等开发的新的恒温核酸扩增方法，该方法能在水浴锅等简单设备提供的60-65℃恒温条件下通过成环产物介导来高效率扩增基因，通过电泳或目视颜色变化判定检测结果。该方法操作简单，特异性强，灵敏度高，目前已经成为检测食源性病原的新型检测方法之一。
常规传统的细菌培养分离检测依赖于实验室，结果可信，一直作为检测LM的“金标准”，但其耗时长，不利于紧急事件发生时病原的快速筛查，而免疫学方法如ELISA法等和分子检测方法如PCR法等需要较昂贵的仪器设备和技术支撑。LAMP反应仅需水浴锅或温箱提供60-65℃的恒温条件即可进行，操作简单，适用于实验条件相对薄弱的基层地区开展食源性致病菌的快速检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、特异而又简单实用的单核细胞增生李斯特菌的的环介导等温扩增（LAMP）检测方法。本发明为实验条件相对薄弱的基层地区利用LAMP方法检测单核细胞增生李斯特菌提供了新的解决方案。
本发明的具体方案包括下列步骤：
（1）引物设计：根据Genbank公布的LM L312（serotype4b）菌株（登录号：FR733642.2）、LM EGDe（登录号：NC_003210.1）菌株、LM NVH295菌株（JF431463.1）等的靶基因prfA基因序列设计特异性引物组合，所述引物组合的DNA序列如下所示：
外引物prfA-B3：5′-AAGCTTCCCGTTAATCGA-3′（序列见SEQ ID NO：1）；
外引物prfA-F3：5′-GGCTTTCGTTATAATGTCTGG-3′（序列见SEQ ID NO：2）；
内引物prfA-BIP：
5′-AACTACTGAGCAAAAATCTTACGCAGCTAGACTGTATGAAACTTGTT-3′（序列见SEQID NO：3）；
内引物prfA-FIP：5′-TAGCCTGCTCGCTAATGACTTTATTGATACAGAAACATCGGTT-3′（序列见SEQ ID NO：4）。
（2）样品中细菌基因组的提取：按照中华人民共和国国家标准GB4789.30-2010《食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》中指定的方法对待检样品进行增菌培养12～24h；采用细菌基因组提取试剂盒（离心柱型，购自TIANGEN公司，产品目录号：DP302）或者常规热煮沸法提取细菌基因组。其中热煮沸法步骤为：取待检样品增菌培养液1mL，10000r/min离心5min，弃上清。用100μL灭菌水重悬菌体沉淀，沸水浴10min，冰上放置5min，12000r/min离心5min，取上清即为基因组DNA，-20℃短期保存备用。
（3）环介导等温扩增技术（LAMP）检测方法：
1）建立LAMP反应体系：反应总体积为25μL。由内引物prfA-BIP（10μmol/L）和prfA-FIP（10μmol/L）各3.5μL，外引物prfA-B3（10μmol/L）和prfA-F3（10μmol/L）各0.5μL；10×ThermoPol反应缓冲液2.5μL，其组成成分为0.2mol/L Tris-HCl，0.1mol/L(NH4)2SO4，0.1mol/L KCl，1%TritonX-100，2mmol/L MgCl2，0.6mol/L甜菜碱；25mmol/L MgSO44μL；10mmol/L dNTPs3.5μL；细菌基因组DNA模板1μL；8U/μL BstDNA聚合酶1μL；200mmol/L羟基萘酚蓝（HNB）染料显色剂2.5μL；用灭菌双蒸水补齐至25μL，在反应液面上方覆盖适量反应覆盖液隔绝污染，并作阳性、阴性对照。其中阳性对照为单核细胞增生李斯特菌模式菌株（CCTCCAB97021）基因组DNA提取物；阴性对照为灭菌水；反应覆盖液为灭菌液体石蜡。
2）LAMP反应：将25μL LAMP反应体系配制好后，于60℃温育50min后再在80℃下作用5min终止反应；
3）扩增产物分析：反应结束后，肉眼观察颜色反应或琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，对检测结果进行判定。
显色反应判定：在自然光下肉眼观察显色情况，天蓝色判为阳性，紫罗兰色判为阴性。
琼脂糖凝胶电泳结果判定：取反应产物10μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭（EB）染料的2%的琼脂糖凝胶中，于120V电压下电泳30min，在凝胶成像系统上成像观察扩增产物的图谱。如观察到不同大小区带组成的阶梯式图谱判为阳性。
按照常规方法，本发明的引物组合物、专用显色试剂及其配套的LAMP反应试剂可组装成专用试剂盒，以便用于单核细胞增生李斯特菌的的环介导等温扩增（LAMP）检测中。本发明为实验条件相对薄弱的农业基层单位利用LAMP方法检测单核细胞增生李斯特菌提供了新的解决方案
本发明的有益效果是：
（1）本发明为基层对于食品样品中单核细胞增生性李斯特菌的快速检测丰富及其检测试剂，其具有特异性强，灵敏度高，操作简单，反应所需设备价廉、易得等特点。
（2）由于目前LAMP检测的都是采用SYBR Green I染料作为显色剂，该显色剂必须反应完成后打开盖子添加；而本发明使用羟基萘酚蓝染料作为显色剂，可在配制反应体系时添加，反应后可直接观察显色结果，避免了反应后添加的污染风险和减少了反应的步骤。
（3）本发明提供的方法、引物组合无及配套试剂可以作为中华人民共和国国家标准规定的细菌菌分离培养法（GB4789.30-2010）检测前的初筛方法。
附图说明
图1：实施例2中2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中：泳道1：阳性反应；2：阴性反应；M：DL2000 DNA Marker
图2：实施例2中反应体系加入显色剂HNB时颜色变化结果。图中1号管为阳性反应；2号管为阴性反应
图3：实施例3中LAMP检测方法特异性实验结果。图中：泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1-2：单核细胞增生李斯特菌；泳道3-9：肠出血性大肠杆菌O157:H7，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，鼠伤寒沙门菌，猪霍乱沙门菌，格氏李斯特菌和无害李斯特菌；泳道10：阴性对照
图4：实施例4中LAMP检测方法灵敏度实验结果。图中：泳道1-10：检测的单核细胞增生李斯特菌浓度依次为108CFU/mL，107CFU/mL，106CFU/mL，105CFU/mL，104CFU/mL，103CFU/mL，102 CFU/mL，10CFU/mL，5CFU/mL，1CFU/mL；泳道M：DL2000DNA Marker
图5：利用LAMP方法检测样品中单核细胞增生李斯特菌的试验流程图
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步具体描述本方明，本发明的特点和优点会随着描述而更加清楚。但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如没有特别说明均为实验室常规方法。
实施例1LAMP引物的设计及环介导等温扩增（LAMP）方法的建立；
根据Genbank公布的LM L312（serotype4b）菌株（登录号：FR733642.2）、LM EGDe（登录号：NC_003210.1）菌株、LM NVH295菌株（JF431463.1）的转录调控蛋白基因prfA的核苷酸序列，采用LAMP引物设计软件Primer Explorer4.0设计特异性引物，得到如下所示的4条引物：
外引物prfA-B3，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
外引物prfA-F3，其DNA序列如SEQ ID NO：2所示。
内引物prfA-BIP，其DNA序列如SEQ ID NO：3所示。
内引物prfA-FIP，其DNA序列如SEQ ID NO：4所示。
（2）样品中细菌基因组的提取：按照中华人民共和国国家标准GB4789.30-2010《食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》中指定的方法对待检样品进行增菌培养12～24h；采用细菌基因组提取试剂盒（离心柱型，购自TIANGEN公司，产品目录号：DP302）或者常规热煮沸法提取细菌基因组。其中热煮沸法步骤为：取待检样品增菌培养液1mL，10000r/min离心5min，弃上清。用100μL灭菌水重悬菌体沉淀，沸水浴10min，冰上放置5min，12000r/min离心5min，取上清即为基因组DNA，-20℃短期保存备用。
（3）环介导等温扩增技术（LAMP）检测方法：
1）建立LAMP反应体系：反应总体积为25μL。由内引物prfA-BIP（10μmol/L）和prfA-FIP（10μmol/L）各3.5μL，外引物prfA-B3（10μmol/L）和prfA-F3（10μmol/L）各0.5μL；10×ThermoPol反应缓冲液2.5μL，其组成成分为0.2mol/LTris-HCl，0.1mol/L(NH4)2SO4，0.1mol/L KCl，1%TritonX-100，2mmol/L MgCl2，0.6mol/L甜菜碱；25mmol/L MgSO44μL；10mmol/LdNTPs3.5μL；细菌基因组DNA模板1μL；8U/μL Bst DNA聚合酶1μL；200mmol/L羟基萘酚蓝（HNB）染料显色剂2.5μL；用灭菌双蒸水补齐至25μL，在反应液面上方覆盖适量反应覆盖液隔绝污染，并作阳性、阴性对照。其中阳性对照为单核细胞增生李斯特菌模式菌株（CCTCCAB97021）基因组DNA提取物；阴性对照为灭菌水；反应覆盖液为灭菌液体石蜡。
2）LAMP反应：将反应总体积为25μL的LAMP反应体系配制好后，于60℃温育50min后再在80℃下作用5min终止反应；
3）扩增产物分析：反应结束后，肉眼观察颜色反应或琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，对检测结果进行判定。
显色反应判定：在自然光下肉眼观察显色情况，天蓝色判为阳性，紫罗兰色判为阴性。
琼脂糖凝胶电泳结果判定：取反应产物10μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭（EB）染料的2%的琼脂糖凝胶中，于120V电压下电泳30min，在凝胶成像系统上成像观察扩增产物的图谱。如观察到不同大小区带组成的阶梯式图谱判为阳性。
按照常规方法，本发明的引物组合物、专用显色试剂及其配套的LAMP反应试剂可组装成专用试剂盒，以便用于单核细胞增生李斯特菌的的环介导等温扩增（LAMP）检测。
实施例2样品中单核细胞增生性李斯特菌的LAMP检测
步骤1.样品中细菌基因组的提取：按照中华人民共和国国家标准GB4789.30-2010《食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》中指定的方法对待检样品用LB1增菌肉汤培养基（购自青岛高科园海博生物技术有限公司）进行增菌培养12～24h；采用细菌基因组提取试剂盒（离心柱型，购自TIANGEN公司，产品目录号：DP302）或者热煮沸法提取细菌基因组。其中热煮沸法步骤为：取待检样品增菌培养液（即上述增菌肉汤培养基）1mL，10000r/min离心5min，弃上清。用100μL灭菌水重悬菌体沉淀，沸水浴10min，冰上放置5min，12000r/min离心5min，取上清即为基因组DNA，于-20℃短期保存备用。
步骤2.环介导等温扩增技术（LAMP）检测
（1）建立LAMP反应体系：反应总体积为25μL。该体系包括内引物prfA-BIP（10 μmol/L）和prfA-FIP（10μmol/L）各3.5μL，外引物prfA-B3（10μmol/L）和prfA-F3（10μmol/L）各0.5μL；10×ThermoPol反应缓冲液（组成成分为0.2mol/L Tris-HCl，0.1mol/L(NH4)2SO4，0.1mol/LKCl，1%TritonX-100，2mmol/LMgCl2，0.6mol/L甜菜碱）2.5μL；25mmol/L MgSO44μL；10mmol/L dNTPs3.5μL；细菌基因组DNA模板1μL；8U/μL Bst DNA聚合酶1μL；200mmol/L羟基萘酚蓝（HNB）染料显色剂2.5μL；用灭菌双蒸水补齐至25μL，在反应液面上方覆盖适量反应覆盖液隔绝污染，并作阳性、阴性对照。其中阳性对照为单核细胞增生李斯特菌模式菌株（CCTCCAB97021，中华人民共和国珠海出入境检验检疫局惠赠，为通用菌株）基因组DNA提取物（基因组DNA提取参照常规方法进行）；阴性对照为灭菌水；反应覆盖液为灭菌液体石蜡。将25μL LAMP反应体系配制好反应液后，水浴锅或温箱60℃温育50min后80℃作用5min终止反应；
（2）扩增产物分析：反应结束后，肉眼观察颜色反应或琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，对检测结果进行判定。
显色反应判定：在自然光下肉眼观察显色情况，天蓝色判为阳性，紫罗兰色判为阴性。结果如图2。
琼脂糖凝胶电泳结果判定：取反应产物10μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭（EB）染料的2%的琼脂糖凝胶中，于120V电压下电泳30min，在凝胶成像系统上成像观察扩增产物的图谱。如观察到不同大小区带组成的阶梯式图谱判为阳性。结果如图1。
实施例3：单核细胞增生李斯特菌LAMP可视化检测方法特异性试验
操作步骤：分别取实验室保存的单核细胞增生李斯特菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、格氏李斯特菌和无害李斯特菌（相关检测用的媒介菌株的编号及其来源参见表1）的培养菌液，采用实施例2的热煮沸法获得各菌株模板，配制25μL LAMP反应体系，进行LAMP反应和进行结果判定。
表1单核细胞增生李斯特菌LAMP检测的特异性试验
结论：肉眼观察显色反应和琼脂糖凝胶电泳结果均显示，只有单核细胞增生李斯特菌菌株呈现阳性反应，肠出血性大肠杆菌O157:H7、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、格氏李斯特菌和无害李斯特菌均呈现阴性反应。说明本检测方法具有良好的特异性。
实施例4：单核细胞增生李斯特菌LAMP可视化检测方法敏感性试验
操作步骤：将单核细胞增生李斯特菌模式菌株CCTCCAB97021接种于BHI液体培养基（购自青岛高科园海博生物技术有限公司），37℃摇床培养12h，以平板计数法测定细菌浓度。将菌液10倍倍比稀释后，采用实施例2的热煮沸法提取模板，配制25μL LAMP反应体系，进行LAMP反应和进行结果判定。
结论：肉眼观察显色反应和琼脂糖凝胶电泳结果均显示，当LM细菌浓度为10CFU/mL即可呈现阳性反应，因此该方法对LM菌液检测的最低检出浓度为10CFU/mL。
实施例5：单核细胞增生李斯特菌LAMP和细菌分离鉴定的符合性试验
操作步骤：对实验室从临床猪肉样品中分离的51株菌落形态符合李斯特菌特征的疑似菌株，按照中华人民共和国国家标准GB4789.30-2010《食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》中指定的细菌溶血反应、细菌动力试验、过氧化氢酶试验、糖发酵试验进行生化鉴定，同时按照实施例2的方法对样品增菌培养液采用热煮沸法提取基因组DNA模板，配制25μL的LAMP反应体系，进行LAMP反应和进行结果判定。
结论：生化鉴定和LAMP反应均证实51株疑似菌株中有3株为单核细胞增生李斯特菌，48株不是单核细胞增生李斯特菌。两种方法符合率为100%。
Claims (1)
1.如下所示的引物组合在非诊断目的的单核细胞增生李斯特菌的LAMP检测方法中的应用，其特征在于，所述引物组合的DNA序列如下所示：
外引物prfA-B3：AAGCTTCCCGTTAATCGA；
外引物prfA-F3：GGCTTTCGTTATAATGTCTGG；
内引物prfA-BIP：AACTACTGAGCAAAAATCTTACGCAGCTAGACTGTATGAAACTTGTT；和
内引物prfA-FIP：TAGCCTGCTCGCTAATGACTTTATTGATACAGAAACATCGGTT。
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