CN104342496A - 一种快速检测、鉴定李斯特属细菌的方法 - Google Patents

一种快速检测、鉴定李斯特属细菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物检测技术领域，提供了一种从环境中分别检测、鉴定李斯特属六个种细菌的六对PCR引物、检测的方法。本发明提供的PCR引物对是根据李斯特属细菌特异性靶基因iap设计而成，该靶基因稳定高、特异性强，经合理的PCR反应体系，凝胶电泳检测手段，可快速、准确地鉴定出存在于环境中的六个种的李斯特菌。检测方法步骤包括：(1)提取样品DNA，分别选用不同引物对进行PCR扩增；(2)根据PCR扩增产物片段长度判断待测样品中是否含有李斯特属细菌。该方法可快速、准确、灵敏地检测和鉴定环境和食品样中6种李斯特菌，不仅提高了效率，节约时间，而且节省检测成本。

Description

一种快速检测、鉴定李斯特属细菌的方法
技术领域
本发明涉及一种快速检测、鉴定环境中李斯特属细菌的方法，属分子生物检测技术领域。
背景技术
李斯特菌属(Listeria spp.)厚壁菌门，与芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、肠球菌、链球菌和葡萄球菌并列；该属低G+C含量(36-42％)、好氧或兼性厌氧、无孢子杆菌，在10-25℃下产生鞭毛，能够运动。目前，李斯特菌属有6个种，分别是单增李斯特菌(L.monocytogenes)、绵羊李斯特菌(L.ivanovii)(伊氏李斯特菌)、英诺克李斯特菌(L.innocua)、威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)、西尔李斯特菌(L.seeligeri)和格氏李斯特菌(L.grayi)。这六个种在环境中广泛分布，其中单增和绵羊李斯特菌具有致病性。单增李斯特菌是一种人畜共患的病原菌，能产生严重的败血症、脑膜炎，引起人类死亡率约为20-30％李氏杆菌病；食品是导致人类感染的主要途径。单增李斯特菌的一个重要特点是，可在冷藏温度4℃下繁殖生长，若时间足够长，将达到很大的数量。近二十年以来，发达国家由于饮食习惯其食源性李氏杆菌病发病率日渐增多，国内亦有单增李斯特菌污染食品及李斯特菌病发生的报道。由于单增李斯特菌的耐受性，可污染种类繁多的食品，而引起食物中毒甚至引起高病死率的李氏杆菌病。2002年被WHO列为仅次于大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌后的第4大重要的食源性致病菌。绵羊李斯特菌为动物性致病菌，主要引起反刍动物的流产；英诺克李斯特菌常常伴随单增李斯特菌存在，对人类具有一定的潜在致病性；剩余3个种的李斯特菌对人和动物的危害相对较小。非致病性李斯特菌由于常与致病的李斯特菌共同存在于环境中尤其是食品中，因此也被作为致病李斯特菌的指示菌。
从有记载的最早1924年Murray在发病的兔子和豚鼠中分离到单增李斯特菌开始，尤其进入21世纪后，每年李斯特菌造成了巨大的损失；其中仅2011年美国单增李斯特菌污染甜瓜事件就导致30人死亡，1名孕妇流产。
目前鉴别菌株的方法有：传统方法、自动生化鉴定、抗体技术(酶联免疫吸附分析)和分子生物学技术(聚合酶链反应(PCR)或DNA杂交)。传统微生物学方法作为金标准，已用于细菌的鉴定许多年，目前仍然是微生物实验室不可分割的一部分，但由于其时间长，不适合测试与保质期短的产品。例如现行的GB4789.30-2010检测李斯特氏菌的方法，从样品处理后经42-48h的两次增菌后，再经24-48h的显色培养基筛选，经24-48h的纯化培养后，进行生化鉴定、溶血和协同溶血实验，整个过程步骤繁琐、时间长(最短120小时，最长168小时)、花费大且工作强度大；亟需建立操作简单，时间快、特异性好，无需特殊、大型、昂贵设备的分子生物学方法。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种快速检测和鉴定环境中李斯特菌属六个种细菌的方法。
本发明还提供了用于检测李斯特菌属六个种细菌的特异性引物。
上述是一种快速、准确、灵敏的PCR检测、鉴定六个种李斯特菌的方法，为鉴定李斯特菌提供选择。本发明不仅提高效率，节约时间，而且节省检测成本。
本发明技术方案为，基于iap特异性引物建立一种多重PCR快速检测和鉴定六种李斯特菌的方法，包括如下步骤：
(1)取待检样品菌液分别制备基因组总DNA作为模板，使用引物对分别进行PCR扩增；所述的引物对中，上游引物为Iap-F，特异性下游引物选择以下六个序列中的至少一种：
(a)鉴定单增李斯特菌的LM-R：TAGCACTTGCACTTGAATTGCTG，如SEQ ID No.1；
(b)鉴定英诺克李斯特菌的LIN-R：GTGTTTTTTGATGGTGTGCTTGC，如SEQ ID No.2；
(c)鉴定西尔李斯特菌的LS-R：TTTTTAACAGTAGTAGTAGGAGTG，如SEQ ID No.3；
(d)鉴定威尔李斯特菌的LW-R：GTGCAGGCGCTGGAGCC，如SEQ IDNo.4；
(e)鉴定绵羊李斯特菌的LIV-R：TGCCGCTTGCGCTTGAG，如SEQ IDNo.5；
(f)鉴定格氏李斯特菌的LG-R：CAGGTGTACTTACTTTTTGTTCTAC，如SEQ ID No.6；
Iap-F上游引物的序列为：ATGAATATGAAAAAAGCAACKATC，如SEQ IDNo.7；其中的K为兼并引物，为G或T；
(2)根据PCR扩增产物片段长度判断待测样品中是否含单增李斯特菌、英诺克李斯特菌、西尔李斯特菌、威尔斯李斯特菌、绵羊李斯特菌和格氏李斯特菌，判断标准为：
Iap-F与LM-R引物对扩增，得到1110～1130bp片段的，为单增李斯特菌；
Iap-F与LIN-R引物对扩增，得到980～1000bp片段的，为英诺克李斯特菌；
Iap-F与LS-R引物对扩增，得到840～860bp片段的，为西尔李斯特菌；
Iap-F与LW-R引物对扩增，得到910～930bp片段的，为威尔李斯特菌；
Iap-F与LIV-R引物对扩增，得到470～490bp片段的，为绵羊李斯特菌；
Iap-F与LG-R引物对扩增，得到840～860bp片段的，为格氏李斯特菌。
优选的，PCR扩增产物进行电泳分析，更优选用0.6％～1.5％琼脂糖凝胶进行电泳。
优选的，步骤(1)中PCR扩增条件为：
鉴定单增李斯特菌、英诺克李斯特菌，93～95℃预变性4.5～6分钟；93～95℃变性40～50秒、55～57℃退火40～50秒、71～74℃延伸55～60秒，30～40个循环，再于71～74℃延伸9～12分钟；
鉴定西尔李斯特菌，93～95℃预变性4.5～6分钟，93～95℃变性40～50秒，93～95℃变性40～50秒、50～53℃退火40～50秒、71～74℃延伸45～60秒，30～40个循环，再于71～74℃延伸9～12分钟；
鉴定威尔李斯特菌，93～95℃预变性4.5～6分钟，93～95℃变性40～50秒，93～95℃变性40～50秒、58～60℃退火40～50秒、71～74℃延伸55～60秒，30～40个循环，再于71～74℃延伸9～12分钟；
鉴定绵羊李斯特菌，93～95℃预变性4.5～6分钟，93～95℃变性40～50秒，93～95℃变性40～50秒、57～60℃退火40～50秒、71～74℃延伸45～60秒，30～40个循环，再于71～74℃延伸9～12分钟；
鉴定格氏李斯特菌，93～95℃预变性4.5～6分钟，93～95℃变性40～50秒，93～95℃变性40～50秒、53～55℃退火40～50秒、71～74℃延伸40～50秒，30～40个循环，再于71～74℃延伸9～12分钟。
更优选的，PCR扩增条件为：
鉴定单增李斯特菌、英诺克李斯特菌，94℃预变性5分钟；94℃变性45秒、56℃退火45秒、72℃延伸60秒，35个循环，再于72℃延伸10分钟；
鉴定西尔李斯特菌，94℃预变性5分钟，94℃变性45秒、52℃退火45秒、72℃延伸50秒，35个循环，再于72℃延伸10分钟；
鉴定威尔李斯特菌，94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，59℃退火45秒、72℃延伸60秒，35个循环，再于72℃延伸10分钟；
鉴定绵羊李斯特菌，94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，58℃退火45秒、72℃延伸30秒，35个循环，再于72℃延伸10分钟；
鉴定格氏李斯特菌，94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，54℃退火45秒、72℃延伸45秒，35个循环，再于72℃延伸10分钟。
更优选的，步骤(2)中，判断标准为：
Iap-F和LM-R为引物扩增，得到1120bp条带的，判定为单增李斯特菌；
Iap-F和LIN-R为引物扩增，得到919bp条带的，判定为英诺克李斯特菌；
Iap-F和LS-R为引物扩增，得到851bp条带的，判定为西尔李斯特菌；
Iap-F和LW-R为引物扩增，得到919bp条带的，判定为威尔斯李斯特菌；
Iap-F和LIV-R为引物扩增，得到483bp条带的，判定为绵羊李斯特菌；
Iap-F和LG-R为引物扩增，得到847bp条带的，判定为格氏李斯特菌。
本发明是一种快速、准确、灵敏的PCR检测和鉴定环境中6种李斯特菌的方法，有益效果在于，提供的六对PCR引物对是根据李斯特属细菌特异性靶基因iap设计而成，设计的引物具有准确、特异的优势，通过PCR方法能够鉴定区分环境中尤其食品中的李斯特菌。该靶基因稳定高、特异性强，经合理的PCR反应体系、凝胶电泳检测手段，可快速、准确地鉴定出存在于环境中的六个种的李斯特菌。与传统方法相比，本方法的检测速度快、灵敏度高、特异性强；与已有的多重PCR相比，本方法有效避免了非特异扩增，特异性强；适合对环境特别是食品行业对大批量猪肉及猪肉产品销售中食源性李斯特菌监测以及流行病学调查，不仅提高了效率，节约时间，而且节省检测成本，可应用前景良好，为使用分子生物学方法鉴定李斯特菌提供选择。
附图说明
图1为本发明标准阳性菌株的PCR扩增产物电泳图的特异性评价。其中M为DL2000bp DNA Ladder Marker；1～8为单增李斯特菌用特异性引物对扩增的结果；9和10为英诺克李斯特菌用特异性引物对扩增的结果；11为西尔李斯特菌用特异性引物对扩增的结果；12～14为威尔斯李斯特菌用特异性引物对扩增的结果；15为绵羊李斯特菌用特异性引物对扩增的结果；16为格斯李斯特菌用特异性引物对扩增的结果。
具体实施方式
实施例1 PCR检测方法对不同菌种特异性评价
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 培养基
李斯特菌选择性增菌液(LB1，LB2)，胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)，胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)等购自北京陆桥技术责任有限公司；李斯特菌选择性琼脂(PALCAM)、脑心浸液(BHI)、抗生素等购自英国OXOID公司；
1.1.2 主要试剂
PCR Premix(包括rTaq、10×buffer(+Mg2+)、和dNTP Mixture)、DNA Marker(DL2000bp)、DNA回收试剂盒均购于大连宝生物工程有限公司；Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒购自杭州Bioer公司；琼脂糖、EB(溴化乙锭)购于天根生物技术公司；生化鉴定试剂盒购于北京陆桥有限公司；其他试剂：无水乙醇、95％乙醇、甘油、氯化钠等均为国产分析纯。
1.1.3 主要仪器
台式高速冷冻离心机离心机、PCR仪、微量移液器，德国eddendorf；凝胶成像分析系统，英国UVP公司；电泳仪，美国Bio-Rad公司；均质仪BagMixter法国Interscince公司；超净工作台(苏州苏净集团有限公司)；蒸汽灭菌锅(日本SANYO公司)。
1.1.4 引物的设计与合成
根据Genbank中公布的李斯特菌的六个种(单增李斯特菌、英诺克李斯特菌、西尔李斯特菌、威尔斯李斯特菌、绵羊李斯特菌和格氏李斯特菌)的iap基因全长序列设计新引物，选择了分别可以鉴定李斯特菌六个菌种的引物。
各菌种的参考序列分别如下。
单增李斯特菌：FM242711.1，AF532254.1，DQ054587.1，DQ054586.1，AF532272.1，AF532272.1和FM242711.1；
英诺克李斯特菌：AY729925.1和M80349.1；
西尔李斯特菌：AF532223.1；
威尔李斯特菌：M80354.1；
绵羊李斯特菌：M80350.1；
格氏李斯特菌：M95579.1。
引物委托上海生工生物技术有限公司合成，引物具体情况如表1。
表1 鉴定李斯特菌六个种的特异性引物序列
其中的K为兼并引物，为G或T；预期扩增的片段大小分别为：单增李斯特菌1110-1130bp，英诺克李斯特菌980-1000bp，西尔李斯特菌840-860bp，威尔斯李斯特910-930bp，绵羊李斯特菌470-490bp，格氏李斯特菌840-860bp。
1.1.4 主要仪器
台式高速冷冻离心机离心机、PCR仪、微量移液器，德国eddendorf；凝胶成像分析系统，英国UVP公司；电泳仪，美国Bio-Rad公司；均质仪BagMixter法国Interscince公司；超净工作台(苏州苏净集团有限公司)；蒸汽灭菌锅(日本SANYO公司)。
2、阳性对照标准菌液的DNA模板的制备：
取如表2的16株六个种的李斯特菌标准菌株细菌培养液1mL(最多5×109个细菌)，置于无菌的Eppendorf离心管中，12000rpm离心1min，去上清，用灭菌蒸馏水洗涤两次，收集菌体；菌体按杭州Bioer生物公司细菌DNA提取试剂盒(Biospin Bacteria DNA Kit)的操作说明提取细菌基因组DNA，作为PCR的模板。菌株购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)。
表2 阳性对照菌株信息一览表。
标号 ATCC菌株编号 菌种 血清型
LM1 ATCC13932 单增李斯特菌 4b
LM2 ATCC 19112 单增李斯特菌 2
LM3 ATCC 19113 单增李斯特菌 3
LM4 ATCC 19114 单增李斯特菌 4a
LM5 ATCC 19116 单增李斯特菌 4c
LM6 ATCC 19117 单增李斯特菌 4d
LM7 ATCC 19118 单增李斯特菌 4e
LM8 ATCC19115 单增李斯特菌 4b
LI1 ATCC 33090 英诺克李斯特菌 6a
LI2 ATCC 33091 英诺克李斯特菌 6b
LS ATCC 51335 西尔李斯特菌 4a
LW1 ATCC 43548 威尔斯李斯特菌 6a
LW2 ATCC 43549 威尔斯李斯特菌 6b
LW3 ATCC 43550 威尔斯李斯特菌 1/2b
LL ATCCBAA-678 绵羊李斯特菌 5
LG ATCC 25400 格斯李斯特菌 未知
①向菌体沉淀加入100μL EL Buffer，使用tip头吹打均匀。
②37℃温育40分钟～1小时。
③加入100μL RS Buffer，随后加入10μL PK Solution，充分混匀。可选：加入2μLRNase A(20mg/mL)并混匀。注意：混合充分将有助于裂解。
④于56℃环境中温浴15分钟，然后移出。对难于裂解的样本适当延长温浴时间。
⑤加200μl GA Buffer并混合均匀。于12,000xg离心1分钟。将上清液转移到一个新的1.5mL离心管。
⑥加400μl的BA Buffer，并混合均匀。将混合液体转移至吸附柱(Spincolumn)。于10,000xg离心1分钟，弃接液管中液体。
⑦向吸附柱中加入500μl的G Binding Buffer。于10,000xg离心30秒，弃接液管中液体。
⑧向吸附柱中加入500μl的Wash Buffer。于10,000xg离心30秒，弃接液管中液体。
⑨重复步骤12的操作一次。
⑩再次将吸附柱于10,000xg离心1分钟，并将吸附柱转移至一个新的1.5mL离心管。向吸附柱中加入100μL Elution Buffer，并于室温温育1分钟。于12,000xg离心1分钟，并弃去Spin column。1.5mL离心管中液体含有DNA。
提取的DNA可直接用于实验；如不立即使用，置于-20℃的冰箱存放，待用。
3、PCR反应体系的建立
建立PCR检测体系：25ul反应体系包含，rTaq酶(5U/μL)0.5μL，10×buffer(+Mg2+)2.5μL dNTP Mixture(各2.5mM)2μL(以上试剂均为大连宝生物工程有限公司)；上游引物(10μM)和下游引物(10μM)，各1μL；细菌DNA模板(2μL)，加灭菌蒸馏水至25μL。
PCR扩增反应条件：为特异、快速扩增目的条带，鉴定李斯特菌的六个种，经优化后的扩增反应条件见表3。
表3 本发明设计的引物鉴定李斯特属的细菌时的PCR反应条件
在PCR仪中按照反应体系和反应程序分别以步骤2中提取的各菌菌株DNA为模板，分别用相应的特异性引物对进行PCR扩增，以做凝胶电泳进行检测。
4.凝胶电泳检测
将上述进行PCR扩增后的产物、作为Marker的DL2000按照既定的顺序分别取产物9μL混合1μL 10×Loading buffer(购于大连宝生物公司),点样于1％琼脂糖凝胶，其中含0.5μg/mL溴化乙锭，10V/cm进行电泳；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析。
表2的16个菌株分别用相应的特异性引物和PCR条件进行扩增，电泳检测结果如图1。实验表明李斯特菌的6个种分别产生特异性扩增条带。其中M为DL 2000bp DNA Ladder Marker；1～8为单增李斯特菌LM1～LM8用特异性引物对扩增的结果；9和10为英诺克李斯特菌LI1和LI2用特异性引物对扩增的结果；11为西尔李斯特菌LS用特异性引物对扩增的结果；12～14为威尔斯李斯特菌LW1～LW3用特异性引物对扩增的结果；15为绵羊李斯特菌LL用特异性引物对扩增的结果；16为格斯李斯特菌LG用特异性引物对扩增的结果。
切下含有所需DNA片段的凝胶，用DNA回收试剂盒(大连生物工程有限公司)从琼脂糖凝胶中回收纯化目的片段；DNA测序由大连宝生物工程有限公司完成；测序证明，PCR扩增片段与预期一致：单增李斯特菌1110～1130bp，英诺克李斯特菌980～1000bp，西尔李斯特菌840～860bp，威尔斯李斯特910～930bp，绵羊李斯特菌470～490bp，格氏李斯特菌840～860bp。
每种菌株用特异性引物以外的其他引物及相应扩增条件进行PCR扩增时，经电泳检测均未扩增出片段。
SEQ ID No.7中的兼并引物K为G或T时，检测效果相同。
5、PCR产物的序列鉴定
切下含有所需DNA片段的凝胶，用DNA回收试剂盒(大连生物工程有限公司)从琼脂糖凝胶中回收纯化目的片段；DNA测序由大连宝生物工程有限公司完成；测序证明，PCR扩增片段与预期一致：单增李斯特菌特异性引物对扩增标准品的片段1120bp，英诺克李斯特菌特异性引物对扩增标准品的片段989bp，西尔李斯特菌特异性引物对扩增标准品的片段851bp，威尔斯李斯特特异性引物对扩增标准品的片段919bp，绵羊李斯特菌特异性引物对扩增标准品的片段483bp，格氏李斯特菌特异性引物对扩增标准品的片段847bp。
实施例2 以新鲜猪肉样品为代表检测环境中李斯特菌的实验
1.试验方法
1.1 猪肉样品采集及处理
2014年3月-2014年6月，从农贸市场和超市采集150个新鲜猪肉样品。每份样品取25g，放入无菌均质袋中，加入225mL LB1(李斯特菌选择性增菌液)，BagMixter均质仪(法国Interscince公司)均质2min。
1.2 微生物培养
均质液，置于30℃培养箱中培养24h后；取LB1增菌液0.1mL加入到10mLLB2增菌液中，置于培养箱中30℃培养18h；取增菌液划线接种于PALCAM琼脂平板，37℃培养箱中培养24h。挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒进行鉴定；典型菌落在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。
1.3 PCR检测
1.3.1 增菌培养
取LB1增菌液0.1mL加入到10mL LB2增菌液中，置于培养箱中30℃培养18h，然后按照实施例1的进行细菌DNA提取和PCR扩增。
PCR产物用1％琼脂糖进行电泳分析。
2.结果与分析
分别应用基于GB 4789.30—2010的传统微生物培养鉴定方法和上述的基于iap特异性引物PCR方法对150份猪肉样品进行李斯特菌六个种细菌污染的调查，结果见表4。由表4可知，PCR检测结果与传统微生物培养鉴定方法，对李斯特菌六个种细菌的检测结果一致。
表4 李斯特菌在猪肉样品的污染情况分布
结果表明，PCR检测方法与基于GB 4789.30—2010的传统培养方法更高效，节省时间。

Claims (6)

1.一种快速检测、鉴定李斯特属细菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品中总细菌DNA作为模板，分别使用引物对进行PCR扩增；所述的引物对中，上游引物为Iap-F，特异性下游引物选择以下六个序列中的至少一种：
(a)鉴定单增李斯特菌的LM-R：TAGCACTTGCACTTGAATTGCTG
(b)鉴定英诺克李斯特菌的LIN-R：GTGTTTTTTGATGGTGTGCTTGC
(c)鉴定西尔李斯特菌的LS-R：TTTTTAACAGTAGTAGTAGGAGTG
(d)鉴定威尔李斯特菌的LW-R：GTGCAGGCGCTGGAGCC
(e)鉴定绵羊李斯特菌的LIV-R：TGCCGCTTGCGCTTGAG
(f)鉴定格氏李斯特菌的LG-R：CAGGTGTACTTACTTTTTGTTCTAC；
Iap-F上游引物的序列为：ATGAATATGAAAAAAGCAACKATC；
(2)根据PCR扩增产物片段长度判断待测样品中是否含单增李斯特菌、英诺克李斯特菌、西尔李斯特菌、威尔斯李斯特菌、绵羊李斯特菌和格氏李斯特菌，判断标准为：
Iap-F与LM-R引物对扩增，得到1110～1130bp片段的，为单增李斯特菌；
Iap-F与LIN-R引物对扩增，得到980～1000bp片段的，为英诺克李斯特菌；
Iap-F与LS-R引物对扩增，得到840～860bp片段的，为西尔李斯特菌；
Iap-F与LW-R引物对扩增，得到910～930bp片段的，为威尔李斯特菌；
Iap-F与LIV-R引物对扩增，得到470～490bp片段的，为绵羊李斯特菌；
Iap-F与LG-R引物对扩增，得到840～860bp片段的，为格氏李斯特菌。
2.权利要求1所述快速检测、鉴定李斯特属细菌的方法，其特征在于，步骤(2)中的PCR扩增产物进行电泳分析。
3.权利要求1或2所述快速检测、鉴定李斯特属细菌的方法，其特征在于，步骤(2)中的PCR扩增产物用0.6％～1.5％琼脂糖凝胶进行电泳。
4.权利要求1所述快速检测、鉴定李斯特属细菌的方法，其特征在于，步骤(1)中PCR扩增条件为：
鉴定单增李斯特菌、英诺克李斯特菌，93～95℃预变性4.5～6分钟；93～95℃变性40～50秒、55～57℃退火40～50秒、71～74℃延伸55～60秒，30～40个循环，再于71～74℃延伸9～12分钟；
鉴定西尔李斯特菌，93～95℃预变性4.5～6分钟，93～95℃变性40～50秒，93～95℃变性40～50秒、50～53℃退火40～50秒、71～74℃延伸45～60秒，30～40个循环，再于71～74℃延伸9～12分钟；
鉴定威尔李斯特菌，93～95℃预变性4.5～6分钟，93～95℃变性40～50秒，93～95℃变性40～50秒、58～60℃退火40～50秒、71～74℃延伸55～60秒，30～40个循环，再于71～74℃延伸9～12分钟；
鉴定绵羊李斯特菌，93～95℃预变性4.5～6分钟，93～95℃变性40～50秒，93～95℃变性40～50秒、57～60℃退火40～50秒、71～74℃延伸45～60秒，30～40个循环，再于71～74℃延伸9～12分钟；
鉴定格氏李斯特菌，93～95℃预变性4.5～6分钟，93～95℃变性40～50秒，93～95℃变性40～50秒、53～55℃退火40～50秒、71～74℃延伸40～50秒，30～40个循环，再于71～74℃延伸9～12分钟。
5.权利要求1所述快速检测、鉴定李斯特属细菌的方法，其特征在于，步骤(1)中PCR扩增条件为：
鉴定单增李斯特菌、英诺克李斯特菌，94℃预变性5分钟；94℃变性45秒、56℃退火45秒、72℃延伸60秒，35个循环，再于72℃延伸10分钟；
鉴定西尔李斯特菌，94℃预变性5分钟，94℃变性45秒、52℃退火45秒、72℃延伸50秒，35个循环，再于72℃延伸10分钟；
鉴定威尔李斯特菌，94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，59℃退火45秒、72℃延伸60秒，35个循环，再于72℃延伸10分钟；
鉴定绵羊李斯特菌，94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，58℃退火45秒、72℃延伸30秒，35个循环，再于72℃延伸10分钟；
鉴定格氏李斯特菌，94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，54℃退火45秒、72℃延伸45秒，35个循环，再于72℃延伸10分钟。
6.权利要求1所述快速检测、鉴定李斯特属细菌的方法，其特征在于，步骤(2)中，判断标准为：
Iap-F和LM-R为引物扩增，得到1120bp条带的，判定为单增李斯特菌；
Iap-F和LIN-R为引物扩增，得到919bp条带的，判定为英诺克李斯特菌；
Iap-F和LS-R为引物扩增，得到851bp条带的，判定为西尔李斯特菌；
Iap-F和LW-R为引物扩增，得到919bp条带的，判定为威尔斯李斯特菌；
Iap-F和LIV-R为引物扩增，得到483bp条带的，判定为绵羊李斯特菌；
Iap-F和LG-R为引物扩增，得到847bp条带的，判定为格氏李斯特菌。
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