CN102286631A

CN102286631A - 多重pcr快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法

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Publication number: CN102286631A
Application number: CN2011102713368A
Authority: CN
Inventors: 郭书林; 陈信忠; 龚艳清; 孔繁德; 杨俊萍; 陈垚; 徐淑菲; 叶妍妍
Original assignee: INSPECTION AND QUARANTINE CENTER OF XIAMEN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Current assignee: INSPECTION AND QUARANTINE CENTER OF XIAMEN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Priority date: 2011-09-14
Filing date: 2011-09-14
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2031-09-14
Also published as: CN102286631B

Abstract

本发明公开了了一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，包括如下步骤：1）首先选择5条上游引物和1条下游引物；2）取阳性对照标准菌液和待检菌液分别制备基因组DNA模板；3）分别在阳性对照标准菌液制备的基因组DNA模板和待检菌液制备的基因组DNA模板中添加所述上游引物和下游引物进行PCR扩增反应；4）取扩增后的产物进行电泳；5）结果判定。本发明是一种快速、准确、灵敏的多重PCR检测和鉴定5种李斯特菌的方法，为分子生物学方法鉴定李斯特菌种提供选择。不仅提高了效率，节约时间，而且节省检测成本。

Description

多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法

技术领域

本发明涉及一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法。

背景技术

目前国际上公认的李斯特菌共有6种：单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌）、绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)、威尔李斯特菌(Listeria welshimeri)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)和西尔李斯特菌(Listeria seeligcri)。其中单增李斯特菌是一种人畜共患的病原菌，可引起严重的传染病，如败血症、脑炎、脑膜炎。该菌广泛存在于自然界中，肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是单增李斯特菌的感染源，食品中存在的单增李斯特菌对人类的安全具有威胁，该菌在4 ℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原之一，2000年被WHO食品安全工作计划列为检测的食源性致病菌之一；绵羊李斯特菌主要危害动物，特别是反刍兽，常表现为败血症和流产，对人危害较少；英诺克李斯特菌在近期国内外报道存在食品中，对人类具有一定的潜在致病性。尤其在发生由非溶血性变为溶血性的变异时，有致病的潜力；其余3种李斯特菌对人和动物的危害相对较小。英诺克李斯特菌、威尔李斯特菌、格氏李斯特菌等李斯特菌虽不是常规致病菌，但由于其常与致病的李斯特菌共同存在于食品中，因此也被作为致病李斯特菌的指示菌。在食品中，虽然不同李斯特菌的危害严重性不同，但任何一种李斯特菌的存在，均被认为是卫生状况不良的指示。

从上世纪80年代起，美国、日本、新西兰、德国、英国、法国、欧洲等国家多次因食品污染爆发人类李斯特菌病。至2003年，我国有报道的散发性李斯特菌病例150例，死亡率26%。2008年，加拿大共发生57起李斯特菌感染，造成23人死亡。

目前，鉴定李斯特菌的方法主要分为两类：一类是传统的生化鉴定方法，包括微量生化反应方法和血清学方法等。另一类是分子生物学方法，包括普通PCR方法和实时荧光PCR方法等。传统方法费时、费力，且实验重复性相对较低，但其准确性使很多国家在制定标准时依然采用传统方法。分子生物学方法鉴定细菌具备快速、简便的特点，但在准确性和特异性方面尚有需要改进之处。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法；本发明是一种快速、准确、灵敏的多重PCR检测和鉴定5种李斯特菌的方法，为分子生物学方法鉴定李斯特菌种提供选择。不仅提高效率，节约时间，而且节省检测成本。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，包括如下步骤：1）首先选择5条上游引物和1条下游引物；2）取阳性对照标准菌液和待检菌液分别制备基因组DNA模板；3）分别在阳性对照标准菌液制备的基因组DNA模板和待检菌液制备的基因组DNA模板中添加所述上游引物和下游引物进行PCR扩增反应；4）取扩增后的产物5 μL点样于1%琼脂糖凝胶，其中含0.5 μg/mL溴化乙锭，以2000 bp Marker为标准分子参照，进行电泳；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析；5）结果判定，待检样品与阳性对照同时扩增出230～250 bp条带的，判定为格氏李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出650～660 bp条带的，判定为单增李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出460～470 bp条带的，判定为威尔李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出360～370 bp条带的，判定为绵羊李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出860～870 bp条带的，判定为英诺克李斯特菌阳性。

所述的5条上游引物和1条下游引物的引物序列分别为：

上游引物MonoA：5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3；

上游引物Ino2：5'-ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3'；

上游引物WelD：5'-ACAGTAATACAACTGCACCAA-3'；

上游引物Gra1：5'-AATCAAGTAGGTCTTAGCCTTTCTG-3'；

上游引物IvaA：5'-TAGCAGCACGGCAAGCGCAA-3'；

下游引物lis1B：5'-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3'。

所述的PCR反应条件如下：95 ℃变性3 min；95 ℃15 s、58 ℃30 s、72 ℃45 s，进行30个循环扩增；72 ℃延伸5 min。

所述PCR反应体系如下：

10×扩增缓冲液　 5 μl；（购于FERMENTAS）

　 4种dNTP混合物　各200 μmol/L ；　

引物　　　　　各0.5 μmol/L；　

DNA模板　　　　 2 μg；　　

Taq DNA聚合酶　 2 u；（购于生工生物工程（上海）有限公司）　

MgCl₂　　　　　 1.5 mmol/L；加ddH₂O至　 50 μl；

其中所述的4种dNTP混合物指：三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，脱氧胸苷三磷酸dTTP，脱氧鸟苷三磷酸三钠dGTP ，脱氧胞苷三磷酸dCTP。（购于Bio Basic Inc）

所述的扩增缓冲液配方为：pH 8.8，25℃，100 mM Tris-HCl；500 mM， KCl；0.8%(v/v)，乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P40）。所述的阳性对照标准菌液和待检菌液分别制备基因组DNA模板的方法为：取5种李斯特菌（ATCC33090英诺克李斯特菌，CMCC54002单核增生李斯特菌，ATCC19119绵羊李斯特菌，ATCC35897威尔李斯特菌，ATCC25401格氏李斯特菌）的标准菌株细菌培养液1 ml（购于上海复祥生物公司）或者是待检菌液1 ml，置于无菌的1.5 ml Eppendorf离心管中，12000 rpm离心1 min，去上清，用灭菌蒸馏水洗涤两次，收集菌体；加入400 μl裂解液混匀，置于37 ℃水浴1 h；然后加入200 μl 5 mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000 rpm离心15 min；取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；加两倍体积无水乙醇，1/10体积，3 mol/L ,pH8.0的醋酸钾，-20 ℃保存1 h后，13000 rpm离心15 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50 μl TE溶液（购于上海索莱宝生物科技有限公司）中，置4 ℃保存备用。

所述的裂解液配方为：40 mmol/L Tris-醋酸，20 mmol/L醋酸钠，1 mmol/L EDTA，1%十二烷基硫酸钠（SDS），pH7.8。本发明的有益效果为：本发明建立了利用多条引物竞争性退火的多重PCR方法检测和鉴别5种李斯特菌的方法，并经实际样本检测测试，未发现假阳性结果，表明该方法切实可行。本方法采用PCR扩增技术，使得检测5种李斯特菌的灵敏度大大提高。由于本方法经一次PCR即可鉴别5种李斯特菌，不需要对每种李斯特菌分别进行确证鉴定，节省了实验时间，加快了检出速度。综上所述：本发明的李斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，较传统的生理生化鉴定方法具有更高的可重复性，较普通PCR更为快速、简便，可实现对5种李斯特菌的快速、准确、特异的检测和分析。

附图说明

图1为本发明标准菌株的多重PCR扩增产物电泳图；其中1、格氏李斯特菌，2、单增李斯特菌，3、威尔李斯特菌，4、绵羊李斯特菌，5、英诺克李斯特菌，M、2000 bp DNA Ladder Marker；

图2为本发明实施例1的样品检测的多重PCR电泳图；其中1、单增李斯特菌，2、威尔李斯特菌，3、绵羊李斯特菌，4、英诺克李斯特菌，5、格氏李斯特菌，6、样品，N、阴性对照，M、2000 bp DNA Ladder Marker。

具体实施方式

实施例1

特异性引物和标准菌株鉴定实验

1）、引物：

根据Genebank中公布的5种李斯特菌（单增李斯特菌，绵羊李斯特菌，英诺克李斯特菌，威尔李斯特菌，格氏李斯特菌）iap基因序列的保守区和可变区，以及相关文献，使用Primer5.0软件设计引物；经预实验选择5条上游引物（MonoA、Ino2、WelD、Gra1、IvaA）和1条下游引物（lis1B）为最佳组合，引物序列如下：

上游引物MonoA：5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3；

上游引物Ino2：5'-ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3'；

上游引物WelD：5'-ACAGTAATACAACTGCACCAA-3'；

上游引物Gra1：5'-AATCAAGTAGGTCTTAGCCTTTCTG-3'；

上游引物IvaA：5'-TAGCAGCACGGCAAGCGCAA-3'；

下游引物lis1B：5'-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3'

引物由大连宝生物工程有限公司合成；预期扩增的片段大小分别为：格氏李斯特菌230～250 bp，单增李斯特菌650～660 bp，威尔李斯特菌460～470 bp，绵羊李斯特菌360～370 bp，英诺克李斯特菌860～870 bp。

2）、阳性对照标准菌液的DNA模板的制备：

取5种李斯特菌（ATCC33090英诺克李斯特菌，CMCC54002单核增生李斯特菌，ATCC19119绵羊李斯特菌，ATCC35897威尔李斯特菌，ATCC25401格氏李斯特菌）的标准菌株细菌培养液1 ml，置于无菌的Eppendorf离心管中，12000 rpm离心1 min，去上清，用灭菌蒸馏水洗涤两次，收集菌体；加入400 μl裂解液（40 mmol/L Tris-醋酸，20 mmol/L醋酸钠，1 mmol/L EDTA，1%SDS，pH7.8）混匀，置于37 ℃水浴1 h；然后加入200 μl 5 mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000 rpm离心15 min。取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3 mol/L，pH8.0)，-20 ℃保存1 h后，13000 rpm离心15 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50 μl TE溶液中，置4 ℃保存备用。

3）、在阳性对照标准菌液制备的基因组DNA模板中添加所述上游引物和下游引物进行PCR扩增反应；

所述PCR反应体系如下：

10×扩增缓冲液　 5 μl；（购于FERMENTAS；100 mM Tris-HCl(pH 8.8,25℃),500 mM KCl,0.8%(v/v) Nonidet P40）　 4种dNTP混合物　各200 μmol/L ；　

引物　　　　　各0.5 μmol/L；　

DNA模板　　　　 2 μg；　　

Taq DNA聚合酶　 2 u；　

MgCl₂　　　　　 1.5 mmol/L；加ddH₂O至　 50 μl；

其中所述的4种dNTP混合物指：三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，脱氧胸苷三磷酸dTTP，脱氧鸟苷三磷酸三钠dGTP ，脱氧胞苷三磷酸dCTP。 PCR反应条件如下：

95 ℃变性3 min；95 ℃15 s、58 ℃30 s、72 ℃45 s，进行30个循环扩增；72 ℃延伸5 min。

4）取扩增后的产物5 μL点样于1%琼脂糖凝胶，其中含0.5 μg/mL溴化乙锭，以2000 bp Marker为标准分子参照，以5 V/cm的电场强度于0.5×TBE电泳缓冲液中电泳30 min；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析、拍照；结果如图1。实验表明5种李斯特菌分别产生长度差异显著的特异性扩增条带。

5）PCR产物的序列鉴定：

切下含有所需DNA片段的凝胶，用DNA回收试剂盒（TAKARA）从琼脂糖凝胶中回收纯化目的片段；DNA测序由大连宝生物工程有限公司完成；测序证明，PCR扩增片段与预期一致：格氏李斯特菌230～250 bp，单增李斯特菌650～660 bp，威尔李斯特菌460～470 bp，绵羊李斯特菌360～370 bp，英诺克李斯特菌860～870 bp。

实施例2

冻猪肉样品培养物（经生化鉴定为单增李斯特阳性）检测实验

1）样品DNA模板的制备：

取疑似菌落的细菌培养液1 ml，置于无菌的1.5 ml Eppendorf离心管中，12000 rpm离心1 min，去上清，用灭菌蒸馏水洗涤两次，收集菌体；加入400 μl裂解液（40 mmol/L Tris-醋酸，20 mmol/L醋酸钠，1 mmol/L EDTA，1%SDS，pH7.8）混匀，置于37 ℃水浴1 h；.然后加入200 μl 5 mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000 rpm离心15 min。取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3 mol/L，pH8.0)，-20 ℃保存1 h后，13000 rpm离心15 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50 μl TE溶液中，置4 ℃保存备用。

2）、在待检样品菌液制备的基因组DNA模板中添加所述上游引物和下游引物进行PCR扩增反应；

所述PCR反应体系如下：

引物　　　　　各0.5 μmol/L；　

DNA模板　　　　 2 μg；　　

Taq DNA聚合酶　 2 u；　

MgCl₂　　　　　 1.5 mmol/L；加ddH₂O至　 50 μl；

其中所述的4种dNTP混合物指：三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，脱氧胸苷三磷酸dTTP，脱氧鸟苷三磷酸三钠dGTP，脱氧胞苷三磷酸dCTP。

PCR反应条件如下：

3）取扩增后的产物5 μL点样于1%琼脂糖凝胶，其中含0.5 μg/mL溴化乙锭，以2000 bp Marker为标准分子参照，以5 V/cm的电场强度于0.5×TBE电泳缓冲液中电泳30 min；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析、拍照；结果如图2。

4）结果判定，实验表明冻猪肉样品中含有单增李斯特菌。待检样品与阳性对照同时扩增出230～250 bp条带的，判定为格氏李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出650～660 bp条带的，判定为单增李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出460～470 bp条带的，判定为威尔李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出360～370 bp条带的，判定为绵羊李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出860～870 bp条带的，判定为英诺克李斯特菌阳性。同时对PCR产物的序列鉴定：切下带有所需DNA片段的凝胶，用DNA回收试剂盒（TAKARA）从琼脂糖凝胶中回收纯化目的片段；DNA测序由大连宝生物工程有限公司完成；测序证明，PCR扩增片段与预期一致。

Claims

1.一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于包括如下步骤：1）首先选择5条上游引物和1条下游引物；2）取阳性对照标准菌液和待检菌液分别制备基因组DNA模板；3）分别在阳性对照标准菌液制备的基因组DNA模板和待检菌液制备的基因组DNA模板中添加所述上游引物和下游引物进行PCR扩增反应；4）取扩增后的产物5 μL点样于1%琼脂糖凝胶，其中含0.5 μg/mL溴化乙锭，以2000 bp Marker为标准分子参照，进行电泳；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析；5）结果判定，待检样品与阳性对照同时扩增出230～250 bp条带的，判定为格氏李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出650～660 bp条带的，判定为单增李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出460～470 bp条带的，判定为威尔李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出360～370 bp条带的，判定为绵羊李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出860～870 bp条带的，判定为英诺克李斯特菌阳性。

2.如权利要求1所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于：所述的5条上游引物和1条下游引物的引物序列分别为：

上游引物MonoA：5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3；

上游引物Ino2：5'-ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3'；

上游引物WelD：5'-ACAGTAATACAACTGCACCAA-3'；

上游引物Gra1：5'-AATCAAGTAGGTCTTAGCCTTTCTG-3'；

上游引物IvaA：5'-TAGCAGCACGGCAAGCGCAA-3'；

下游引物lis1B：5'-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3'。

3.如权利要求1所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于所述的PCR反应条件如下：95 ℃变性3 min；95 ℃15 s、58 ℃30 s、72 ℃45 s，进行30个循环扩增；72 ℃延伸5 min。

4.如权利要求3所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于所述PCR反应体系如下：

10×扩增缓冲液　 5 μl；

　 4种dNTP混合物　各200 μmol/L ；　

引物　　　　　各0.5 μmol/L；　

DNA模板　　　　 2 μg；　　

Taq DNA聚合酶　 2u；　　

MgCl₂　　　　　 1.5 mmol/L；加双蒸水至　 50 μl；

其中所述的4种dNTP混合物指：三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，脱氧胸苷三磷酸dTTP，脱氧鸟苷三磷酸三钠dGTP ，脱氧胞苷三磷酸dCTP。

5.如权利要求4所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于所述的扩增缓冲液配方为：pH 8.8，25℃，100 mM Tris-HCl；500 mM， KCl；0.8%(v/v)，乙基苯基聚乙二醇。

6. 如权利要求1所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于所述的阳性对照标准菌液和待检菌液分别制备基因组DNA模板的方法为：取5种李斯特菌的标准菌株细菌培养液1 ml或者是待检菌液1 ml，置于无菌的1.5 ml Eppendorf离心管中，12000 rpm离心1 min，去上清，用灭菌蒸馏水洗涤两次，收集菌体；加入400 μl裂解液混匀，置于37 ℃水浴1 h；然后加入200 μl 5 mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000 rpm离心15 min；取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；加两倍体积无水乙醇，1/10体积，3 mol/L ，pH8.0的醋酸钾，-20 ℃保存1 h后，13000 rpm离心15 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50 μl TE溶液（上海索莱宝生物科技有限公司）中，置4 ℃保存备用。

7.如权利要求6所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于所述的裂解液配方为：40 mmol/L Tris-醋酸，20 mmol/L醋酸钠，1 mmol/L EDTA，1%十二烷基硫酸钠（SDS），pH7.8。