JP2013188224A - 病原性リステリア菌の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】Listeria monocytogenesが有するhlyA遺伝子、clpC遺伝子、inlA遺伝子、plcA遺伝子の一塩基多型によって分類し、各遺伝子内の一塩基多型に特異的な一塩基置換若しくは分類可能に特定された組み合わせからなる複数の一塩基多型を検出ことにより、臨床株で見出された菌株と同じグループに属する病原性の高い菌株を検出する。そして、このための増幅用プローブ及び一塩基置換を検出するためのサイクリングプローブとして、例えば、特定の塩基配列を有するプライマーセット及び特定の塩基配列を有するサイクリングプローブを備えた検出用キットを提供する。
【選択図】図20
Description
次に、実施例に基づき、本発明についてさらに詳細に説明する。
(1)hlyA、clpC、inlA及びplcA遺伝子の塩基配列の決定
まず、食品及び環境並びに臨床から分離されたL. monocytogenesについて、各遺伝子の塩基配列を決定した。決定には、食品・環境中からの分離株111株及び臨床からの分離株15株が用いられた。これらの血清型別分類を表6に示した。
hlyA、clpC、inlA及びplcA遺伝子の内部塩基配列用のプライマーセットを、塩基配列既知のL. monocytogenesであるEDG−e株(血清型1/2a)及びF2365株(血清型4b)で共通の配列部分をもとに設計した。
(a)hlyAプライマーセット(hlyA遺伝子の1070−1558bp部分を増幅する)
Forward・・・AAATCATCGACGGCAACCT(配列番号12)
Reverse・・・ATTTCGGATAAAGCGTGGTG(配列番号13)
(b)clpCプライマーセット(clpC遺伝子の378−1210bp部分を増幅する)
Forward・・・TCTTGGTATTAGTTTGAATAAAGCTC(配列番号14)
Reverse・・・TCAAACGTACTTTAGAACCAGATT(配列番号15)
(c)inlAプライマーセット(inlA遺伝子の1099−1918bp部分を増幅する)
Forward・・・TTTTTCTATAATAACAAGGTAAGTGAC(配列番号16)
Reverse・・・CTGTATAGCTATTGGCGCTAT(配列番号17)
(d)plcAプライマーセット(plcA遺伝子の101−920bp部分を増幅する)
Forward・・・ACTGGAATAAGCCAATAAAGAACTC(配列番号18)
Reverse・・・ATTGTTTGTTTTTCGGGGAAGT(配列番号19)
各菌株の純粋培養液から、DNA Tissue Kit(QIAGEN社製)を用いて調製した。
以下の反応液組成でPCR反応を行った。
上記反応液を0.2mlマイクロチューブ中で調製し,全量が30μlになるように滅菌水を加え、TaKaRa PCR Thermal Cycler若しくはThermo HyBaid PCR Expressを用いて以下の条件でPCRを行った。
<反応条件>
DNAの変性: 94℃、30sec
アニーリング: 60℃、30sec
伸長反応: 72℃、1min
94℃で3分間加熱後、上記反応を30サイクル行った。
得られたPCR産物の確認はアガロースゲル電気泳動により行った。
上記PCRにより得られたPCR産物をQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用い、付属のプロトコールに従って精製した。
精製後のPCR産物の塩基配列解析は、サンガー法により行った。
各遺伝子毎に決定した菌株の塩基配列のマルチプルアライメントをClustalWプログラムにより作成し、系統樹を近隣結合法により作成した。
各遺伝子の系統樹は図1〜4に示したとおりであり、塩基配列のマルチプルアライメントは図5〜図14に示したとおりである。また、各菌株における系統樹と血清型との関係は表2〜5に示したとおりである。
配列解析の結果、同一グループには食品環境由来株では、1/3の血清型1/2a型株と1株の3a型、1株の3c型、2株の血清型別不能株が含まれたが、臨床由来の血清型1/2a型5株は全てhlyA内多型グループ5に分類された。このグループを特異的に検出するために、決定した配列中の特定の一塩基置換部分を含む配列をPCRにより増幅し、蛍光標識キメラプローブを用いて検出する方法を開発した。
(i)臨床由来高病原性株(血清型1/2a型:臨床株I〜Lグループ)の検出用キット
このグループに特異的な塩基置換、すなわち、hlyA遺伝子グループ5の決定された塩基配列(図5参照)の258番目の塩基(G)の置換部分を挟む領域を選択し、この配列に基づきプライマーを設計した。具体的には、塩基番号の199−217塩基部分でForwardプライマーを、279−297塩基部分でReverseプライマーを設計、作製した。
プライマーには、このグループに特異的な塩基置換、すなわちclpC遺伝子の多型グループ13の106番目の塩基(T)部分を挟む領域及び同多型グループ13の166番目の塩基(A)部分を挟む領域を選択し、この配列に基づきプローブを設計し、まずclpC遺伝子多型グループ10,11,13を検出することとした。
次に、実施例1で作成したPCR用プライマーセット及びサイクリングプローブを用いて、菌株の同定、検出を行った。
hlyA遺伝子型9グループの各グループの菌株から調製したDNAを鋳型として、上記で作製したプライマーセット及びサイクリングプローブを用いて菌株の同定を行った。その結果を図20に示す。なお、同定条件は次のとおりである。
(i)ゲノムDNAの調整
各菌株の純粋培養液から、DNA Tissue Kit(QIAGEN社)を用いて調製した。
(ii)リアルタイムPCRによる検出
Cycleave PCR core kitを用いて、以下の反応液組成でPCR反応を行った。
(反応液組成)
上記反応液を0.2mlマイクロチューブ中に調製し、Stratagene社製リアルタイムPCR装置MP3000を用いて以下の条件でリアルタイムPCRにより検出を行った。
<反応条件>
DNAの変性: 95℃、 5sec
アニーリング: 50℃、15sec
伸長反応: 72℃、20sec
95℃で30sec加熱後、上記反応を40サイクル行った。
clpC遺伝子型14グループの各グループの菌株から調製したDNAを鋳型として、上記で作製したclpC遺伝子内塩基置換検出用サイクリングプローブ法による検出結果を図21(プローブ1による)及び図22(プローブ2による)に示す。また、inlA遺伝子型17グループの各グループの菌株から調製したDNAを鋳型として、上記で作製したinlA遺伝子内塩基置換検出用サイクリングプローブ法による検出結果を図23に示す。検出条件は上記と同様である。
Claims (15)
- 検査対象であるリステリア菌が病原性のリステリア菌であるかどうかを推定する方法であって、
次の条件(1)又は(2)を満たす場合に、病原性のリステリア菌であると推定する方法。
(1)検査対象であるリステリア菌のhlyA遺伝子の1383番目の塩基がGであること
(2)同リステリア菌のplcA遺伝子の274番目の塩基がCであり、770番目の塩基及び833番目の塩基がそれぞれAであること - 検査対象であるリステリア菌が病原性のリステリア菌であるかどうかを推定する方法であって、
次の条件(1)及び(2)を満たす場合に、病原性のリステリア菌であると推定する方法。
(1)検査対象であるリステリア菌のhlyA遺伝子の1383番目の塩基がGであること
(2)同リステリア菌のplcA遺伝子の274番目の塩基がCであり、770番目の塩基及び833番目の塩基がそれぞれAであること - 検査対象であるリステリア菌が病原性のリステリア菌であるかどうかを推定する方法であって、
次の条件(3)又は(4)を満たす場合に、病原性のリステリア菌であると推定する方法。
(3)検査対象であるリステリア菌のhlyA遺伝子の1263番目の塩基がCであり、1377番目の塩基がTであること
(4)検査対象であるリステリア菌のclpC遺伝子の508番目の塩基、654番目の塩基、961番目の塩基がそれぞれAであり、かつ、594番目の塩基がTであること - 検査対象であるリステリア菌が病原性のリステリア菌であるかどうかを推定する方法であって、
次の条件(3)及び(4)を満たす場合に、病原性のリステリア菌であると推定する方法。
(3)検査対象であるリステリア菌のhlyA遺伝子の1263番目の塩基がCであり、1377番目の塩基がTであること
(4)検査対象であるリステリア菌のclpC遺伝子の508番目の塩基、654番目の塩基、961番目の塩基がそれぞれAであり、かつ、594番目の塩基がTであること - さらに、次の条件(5)及び/又は(6)を満たす場合に、病原性のリステリア菌であると推定する請求項3又は4に記載の方法。
(5)検査対象であるリステリア菌のinlA遺伝子の1278番目の塩基、1350番目の塩基、1359番目の塩基、1383番目の塩基が何れもTであること
(6)検査対象であるリステリア菌のplcA遺伝子の378番目の塩基がCであり、859番目の塩基がAであること - 病原性が推定されるリステリア菌の検出方法であって、
検査対象である分離されたリステリア菌から、検査対象であるリステリア菌のhlyA遺伝子の1383番目の塩基を挟む領域を増幅するプライマーと配列番号3で示された塩基配列からなるサイクリングプロープを用いてRT−PCRを適用した結果、前記サイクリングプローブとハイブリダイゼーションする前記hlyA遺伝子の増幅が認められた場合に病原性であると判断する検出方法。 - 配列番号1及び配列番号2で示された塩基配列からなるプライマーを用いる請求項6に記載の検出方法。
- 病原性が推定されるリステリア菌の検出方法で、次の(7)及び(8)の条件を満たす場合に病原性であると判断する検出方法。
(7)検査対象である分離されたリステリア菌から、検査対象であるリステリア菌のclpC遺伝子の594番目の塩基を挟む領域及び654番目の塩基を挟む領域を増幅するプライマーと配列番号6及び配列番号7で示された塩基配列からなるサイクリングプローブを用いてRT−PCRを適用した結果、前記サイクリングプローブとハイブリダイゼーションする前記clpC遺伝子の増幅が認められること
(8)検査対象である分離されたリステリア菌から、検査対象であるリステリア菌のinlA遺伝子の1359番目の塩基を挟む領域を増幅するプライマーと配列番号10又は配列番号11で示された塩基配列からなるサイクリングプローブを用いてRT−PCRを適用した結果、前記サイクリングプローブとハイブリダイゼーションする前記inlA遺伝子の増幅が認められること - 配列番号4及び配列番号5で示された塩基配列からなるプライマーを用いる請求項8に記載の検出方法。
- 配列番号8及び配列番号9で示された塩基配列からなるプライマーを用いる請求項8又は9に記載の検出方法。
- 請求項6の検出方法に用いられる検出用キットであって、
配列番号1及び配列番号2で示された塩基配列からなるプライマーセットと、
配列番号3で示された塩基配列からなるサイクリングプローブを有する検出用キット。 - 請求項8の検出方法に用いられる検出用キットであって、
配列番号4及び配列番号5で示された塩基配列からなるプライマーセットと、
配列番号6及び配列番号7で示された塩基配列からなるサイクリングプローブを有する検出用キット。 - 請求項8の検出方法に用いられる検出用キットであって、
配列番号8及び配列番号9で示された塩基配列からなるプライマーセットと、
配列番号10で示された塩基配列からなるサイクリングプローブを有する検出用キット。 - 請求項8の検出方法に用いられる検出用キットであって、
配列番号8及び配列番号9で示された塩基配列からなるプライマーセットと、
配列番号11で示された塩基配列からなるサイクリングプローブを有する検出用キット。 - 請求項8の検出方法に用いられる検出用キットであって、
配列番号4及び配列番号5で示された塩基配列からなるプライマーセットと、
配列番号8及び配列番号9で示された塩基配列からなるプライマーセットと、
配列番号6及び配列番号7で示された塩基配列からなるサイクリングプローブと、
配列番号10又は配列番号11で示された塩基配列からなるサイクリングプローブを有する検出用キット。
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CN105821123A (zh) * | 2016-04-01 | 2016-08-03 | 刘二龙 | 基于单增李斯特菌毒力基因的三重实时荧光定量pcr检测用引物、mgb探针及检测方法 |
CN108872573A (zh) * | 2018-07-04 | 2018-11-23 | 中国水产科学研究院东海水产研究所 | 基于纳米磁珠-荧光激团的单增李斯特菌快速检测方法 |
CN112011537A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-12-01 | 上海国际旅行卫生保健中心(上海海关口岸门诊部) | 一组扩增李斯特氏菌mlst分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用 |
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2013
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CN108872573A (zh) * | 2018-07-04 | 2018-11-23 | 中国水产科学研究院东海水产研究所 | 基于纳米磁珠-荧光激团的单增李斯特菌快速检测方法 |
CN108872573B (zh) * | 2018-07-04 | 2021-04-30 | 中国水产科学研究院东海水产研究所 | 基于纳米磁珠-荧光激团的单增李斯特菌快速检测方法 |
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