CN108872573B - 基于纳米磁珠-荧光激团的单增李斯特菌快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于纳米磁珠‑荧光激团的单增李斯特菌快速检测方法，先设计与单增李斯特菌膜上特异性的受体蛋白特异性连接的极性氨基酸肽链YGNGVGC，并在上述肽链的C末端连接极性的纳米磁珠及荧光激团，再将结合好的样品经磁场吸附、富集和分离纯化目标致病菌，通过荧光检测系统检测被测样品中致病菌的含量，快速、高效且准确。

Description

基于纳米磁珠-荧光激团的单增李斯特菌快速检测方法
技术领域
本发明属于食源性致病菌检测技术领域，具体涉及一种基于纳米磁珠-荧光激团的单增李斯特菌快速检测方法。
背景技术
食源性致病菌的污染、增殖是影响食品安全的主要因素之一，单增李斯特菌是一种人畜共患病的病原菌，广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌严重威胁人类安全，在4℃环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，在食品卫生的微生物检验中需要加以重视。目前的检测方法主要遵守GB4789.30-2010检测项目执行，该方法需要培养48-72h，检测时间较长，选择性试验是以小鼠为对象的毒力试验，对实验技术要求高，动物实验又涉及相关证明材料等；PCR检测方法需要提取DNA，一般一次体系需要12-20h，虽然耗时较短，但技术要求高，而且仪器价格昂贵，结果容易出现假阳性。因此，急需一种食源性致病菌快速、简便、准确的检测方法。
发明内容
为克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种基于纳米磁珠-荧光激团的单增李斯特菌快速检测方法，利用单增李斯特菌膜受体蛋白与极性氨基酸特异性连接的形式，设计能与受体蛋白特异性连接的极性氨基酸肽链YGNGVGC，在肽链的C末端连接极性的纳米磁珠及荧光激团(如附图1所示)，再将结合好的样品直接通过磁场进行分离，被测样品中存在的致病菌被磁场吸附进入测试区，其他杂质随缓冲液进入废液区，经磁场吸附、富集和分离纯化目标致病菌，然后通过荧光检测系统检测被测样品中致病菌的含量。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
基于纳米磁珠-荧光激团的单增李斯特菌快速检测方法，具体地，包括以下步骤：
(1)设计与单增李斯特菌膜上受体蛋白特异性连接的极性氨基酸肽链，并在肽链C末端连接极性的纳米磁珠及荧光激团；其中，
所述极性氨基酸肽链的序列为YGNGVGC，所述单增李斯特菌的受体蛋白为十一异戊烯基焦磷酸磷酸酯酶。
(2)将步骤(1)中连接极性的纳米磁珠及荧光激团的极性氨基酸加入到被测样液中，并与缓冲液一起在磁场作用下经磁场吸附、富集和分离进行纯化；其中，
所述被测样液中单增李斯特菌进入测试液，其他杂质随缓冲液进入废液中；
(3)通过荧光检测系统检测步骤(2)所述测试液中单增李斯特菌的含量。
优选的，步骤(2)中，所述纳米磁珠的平均粒径为100nm。
优选的，步骤(2)中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，包括浓度分别为140mM/L、2.7mM/L、10mM/L和1.8mM/L的氯化钠、氯化钾、十二水合磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，且所述缓冲液pH为7.4。
优选的，步骤(2)中，所述磁场的磁场强度为0.5-0.8特斯拉。
优选的，步骤(3)中，所述极性氨基酸肽链与被测样液的质量比为1:20。
优选的，步骤(3)中，所述荧光检测系统的检测波长为488nm。
本发明的技术原理在于：
极性氨基酸肽链可以特异性连接被检测细菌单增李斯特菌的受体蛋白十一异戊烯基焦磷酸磷酸酯酶；处理后的样品在中性缓冲液作为“流动相”条件下经过极性磁场，通过极性纳米磁珠与磁场之间吸附作用，达到被测样品中单增李斯特菌与其他细菌的特异性分离，并通过缓冲液进行洗脱；最后利用荧光检测系统，监测分离样品中荧光激团强度，从而判断被测样品中单增李斯特菌的数量。
需要说明的是，本发明单增李斯特菌快速检测方法中，氨基酸序列的选择是特异性连接目标致病菌的关键，细菌素是一种具有抑菌能力的短肽，主要抑菌机理是N末端短肽通过识别目标细菌表面膜蛋白进行特异性结合，C末端深入细菌内部达到抑菌效果，Pediocin是一类只对单增李斯特菌有明显抑制的细菌素，通过识别并连接单增李斯特菌膜蛋白进行抑菌作用，通过掌握细菌素N末端如何连接细菌膜蛋白的特异性氨基酸序列，即可设计合适的氨基酸序列。
与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：
一、本发明通过极性氨基酸与活体食源性致病菌膜受体蛋白特异性结合，测试样品不需要再培养，直接与极性氨基酸结合，专一性识别被测样品中单增李斯特菌，这就使单增李斯特菌连接到纳米磁珠和荧光基团上，连接时间为30min左右，检测方法快速、高效。
二、本发明经磁场吸附、富集和分离可以实现高通量、全自动和即用型分离目标致病菌，达到纯化目标致病菌的目的，且氨基酸序列特异性的与目标致病菌结合可筛选并鉴定难以在实验室中人工培养的致病菌，1h之内精确完成定量检测，节省成本。
附图说明
图1为带荧光激团的免疫磁珠与极性氨基酸合成特异性连接食源性致病菌的膜受体蛋白的结构示意图；
图2为被测样液在磁场作用下分离过程示意图。
具体实施方式
下面结合附图给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
参见附图1，为带荧光激团的纳米磁珠与极性氨基酸合成特异性连接食源性致病菌的膜受体蛋白，极性氨基酸肽链C末端连接极性的纳米磁珠及荧光激团。
参见附图2，连接极性的纳米磁珠及荧光激团的极性氨基酸加入到被测样液中，并在磁场作用下经磁场吸附、富集和分离进行纯化，被测样液中单增李斯特菌进入测试液，其他杂质随缓冲液进入废液中。
实施例
无菌条件下取25g检测样品研磨后放入975mL生理盐水中，常温静置10min，备用；再取20mL上述样品溶液，加入到1mL带有荧光激团的纳米磁珠/极性氨基酸溶液中，常温静置30min，每5min摇晃一次，然后将上述样液与缓冲液一起经磁场吸附、富集和分离单增李斯特菌；然后将分离后的测试液进入荧光检测器或流式细胞仪，在488nm条件下对检测样品的致病菌数量进行定量检测。
相较于常规的单增李斯特菌检测技术，上述实施例检测单增李斯特菌具有针对性、特异性和准确性，极性氨基酸序列YGNGVGC可以特异性连接单增李斯特菌膜上受体蛋白十一异戊烯基焦磷酸磷酸酯酶，只要样品中存在目标细菌，无需进行实验室培养即可直接锚定目标细菌，避免传统检测中假阳性结果的出现。而且氨基酸序列连接极性纳米磁珠，可以吸附在特定的磁场条件下，该过程只需要30min，比传统国标检测和以PCR为基础的检测技术大大降低检测时间。同时，纳米磁珠在磁场中特异性吸附，富集样品中目标细菌，避免常规检测手段对目标细菌浓度的依赖，减少假阳性结果的出现；样品通过荧光激团在488nm条件下进行检测，大大降低常规手段中人为检测失误，提高数据的准确性。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (6)

1.基于纳米磁珠-荧光激团的单增李斯特菌快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计与单增李斯特菌膜上受体蛋白十一异戊烯基焦磷酸磷酸酯酶特异性连接的极性氨基酸肽链YGNGVGC，并在上述肽链C末端连接极性的纳米磁珠及荧光激团；
(2)将步骤(1)中连接有极性的纳米磁珠及荧光激团的极性氨基酸加入到被测样液中，并与缓冲液一起在磁场作用下经磁场吸附、富集和分离进行纯化；其中，所述被测样液中单增李斯特菌进入测试液，其他杂质随缓冲液进入废液中；
(3)通过荧光检测系统检测步骤(2)所述测试液中单增李斯特菌的含量。
2.如权利要求1所述的单增李斯特菌快速检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述纳米磁珠的平均粒径为100nm。
3.如权利要求1所述的单增李斯特菌快速检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述缓冲液为pH7.4的磷酸盐缓冲液，包括浓度分别为140mmol/L、2.7mmol/L、10mmol/L和1.8mmol/L的氯化钠、氯化钾、十二水合磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。
4.如权利要求1所述的单增李斯特菌快速检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述磁场的磁场强度为0.5-0.8特斯拉。
5.如权利要求1所述的单增李斯特菌快速检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述极性氨基酸肽链与所述被测样液的质量比为1：20。
6.如权利要求1所述的单增李斯特菌快速检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述荧光检测系统的检测波长为488nm。
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