CN112175958B

CN112175958B - 一种特异识别单核细胞增生李斯特氏菌的优化适配体序列及其应用

Info

Publication number: CN112175958B
Application number: CN202011073374.8A
Authority: CN
Inventors: 王周平; 孙羽菡; 段诺
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-10-09
Filing date: 2020-10-09
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2040-10-09
Also published as: CN112175958A

Abstract

本发明提供了一种特异识别单核细胞增生李斯特氏菌的优化适配体序列及其应用，属于适配体应用生物技术领域。本发明方法以单核细胞增生李斯特氏菌为靶标，在SELEX筛选获得的原始适配体序列的基础上，利用剪裁手段获得可与靶细胞以高亲和性、高特异性结合的适配体。本发明的适配体是单核细胞增生李斯特氏菌的新型识别元件，具有灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的优势，并能应用于多种检测方法的构建。

Description

一种特异识别单核细胞增生李斯特氏菌的优化适配体序列及其应用

技术领域

本发明属于适配体应用生物技术领域，尤其是涉及一种特异识别单核细胞增生李斯特氏菌的优化适配体序列及其应用。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌是普遍存在于自然环境中的革兰氏阳性、嗜冷、兼性厌氧细菌。其致病性由李斯特细胞溶菌酶O、磷酸脂酶C、内化素和金属蛋白酶等毒力因子决定。与其他革兰氏阳性菌不同的是，单增李斯特氏菌表面含有大量共价结合到其胞壁质上的表面蛋白，也正是由于这些表面蛋白的存在，使得单增李斯特氏菌能够在各种环境下复制增殖，并侵染多种真核细胞。此外，该菌的另一危险性在于其可穿越宿主的三个主要免疫屏障--肠屏障、血脑屏障和胎盘屏障，引起轻度胃肠炎，严重的血液或中枢神经系统感染以及流产。因此，实现食品中单核细胞增生李斯特氏菌准确、快速和灵敏的检测，对于保障食品安全和保护人类健康都有极其重要的意义。

常用的检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法包括传统平板分离培养和生理生化鉴别法、ELISA法、PCR法、荧光定量PCR法、电化学传感器法等，然而传统的细菌培养和生化鉴定工作量大，操作繁琐且耗时；ELISA法虽有良好的特异性、准确性及较高的灵敏度，但制备特异性抗体的过程仍然繁琐且耗时，制备出的抗体稳定性差，且检测仪器较为昂贵；PCR方法虽然快速、准确，但易受实验操作及周围环境的影响，无法保证其重复性及特异性。

适配体是利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)对人工合成的随机核苷酸序列文库进行体外筛选后获得的、能够特异性识别结合靶标的一段短的单链核苷酸序列，具有筛选周期短、亲和性高、特异性好、靶标范围广且成本低廉等显著优点。与抗体相比合成方便、易于修饰、性能稳定且易于保存。这些特点使得适配体在药物递送、医学诊断、食品安全等领域具有无可匹敌的优势，且已被广泛用作各类生物传感器的识别元件。

然而由SELEX过程产生的全长适配体序列含有70～100个核苷酸，其两端均包含一段用于PCR扩增的固定引物区，这部分区域的核苷酸通常并不参与靶标的识别与结合，这种非必需的核苷酸同样可能出现在序列随机区中，它们可能形成各种二级结构从而降低适配体的靶结合构象稳定性，且较长的序列会带来较低的产率和较高的合成成本。因此，在实际使用中，在保留适配体亲和性能的前提下，获得适配体最短序列大有裨益。

发明内容

本申请针对现有技术的不足，本发明提供了一种特异识别单核细胞增生李斯特氏菌的优化适配体序列及其应用。本发明方法以单核细胞增生李斯特氏菌为靶标，在SELEX筛选获得的原始适配体序列A15的基础上，利用剪裁手段获得4条可与靶细胞以高亲和性、高特异性结合的适配体，即A15-2、A15-3、A15-5和A15-8，所述适配体A15的序列为：GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATACTATCGCGGAGACAGCGCGGGAGGCACCGGGGATTCGACATGAGGCCCGGATC。

本发明的技术方案如下：

一种适配体，所述适配体为A15-2、A15-3、A15-5与A15-8，所述适配体对应核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3与SEQ ID No.4所示。

所述适配体在单核细胞增生李斯特氏菌中的应用。

所述适配体在检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌中的应用。

所述适配体的应用还可以在制备临床医学中单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂中应用。

所述适配体可被可提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基、氨基所修饰。

本发明有益的技术效果在于：

(1)与抗体相比，适配体具有可在体外筛选、筛选周期短、合成方便、易标记各种功能基团和报告分子、性质稳定可长期保存使用等优势；

(2)该序列是基于原始序列的二级结构，通过剪裁获得的亲和力和特异性均较强的适配体序列，能够特异性识别单核细胞增生李斯特氏菌；

(3)与筛选获得的原始单核细胞增生李斯特氏菌适配体相比，该适配体具有理想的亲和力、良好的特异性、更高的产率以及较低的合成成本，能够更灵敏地检测分离出环境和食品中存在的单核细胞增生李斯特氏菌。

(4)本发明的适配体是单核细胞增生李斯特氏菌的新型识别元件，具有灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的优势，并能应用于多种检测方法的构建。

(5)本发明中提供的适配体可以对单核细胞增生李斯特氏菌进行定性与定量的检测，其中定性/定量的检测方法为：对适配体进行修饰，在其两端引入荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物、亲和配基或巯基，得到功能化的适配体，之后与单核细胞增生李斯特氏菌孵育反应，然后利用功能化适配体所表现出的性能，比如荧光强度、半衰期、酶活性等等进行定性与定量检测。

(6)其次，本发明提供的适配体还可以利用其与磁性纳米颗粒结合达到定量检测与富集单核细胞增生李斯特氏菌的目的。具体为：对适配体5′端进行生物素修饰，得到生物素化适配体；之后利用生物素与亲和素的特异性结合将所述适配体结合到磁性纳米颗粒表面，得到适配体功能化磁性纳米颗粒；之后利用适配体和单核细胞增生李斯特氏菌的特异性结合，在外磁场的作用下可分离并富集样品中的单核细胞增生李斯特氏菌，实现单核细胞增生李斯特氏菌的定性或定量检测。。

附图说明

图1是RNAstructure软件拟合的适配体A15、A15-2、A15-3、A15-5、A15-8的二级结构；

图2是实施例1中Graphpadprism 8软件拟合的适配体A15、A15-2、A15-3、A15-5、A15-8的饱和结合曲线；

图3是实施例1中流式细胞分析获得的适配体A15、A15-2、A15-3、A15-5、A15-8的特异性结果；

图4是实施例2单增李斯特氏菌特异性适配体功能化MNP的靶标捕获特异性结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1

(1)本实施例中适配体的合成：

本发明适配体由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，并将适配体A15、A15-2、A15-3、A15-5、A15-8的5′端使用FAM基团进行标记。

(2)适配体与单核细胞增生李斯特氏菌的亲和力检测：

S1：取对数期(OD₆₀₀＝0.3)的单核细胞增生李斯特氏菌的菌液1mL于离心管中，5000r/min，4℃离心5min，弃去上清，用1×结合缓冲液(1×BB)(50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)，5mmol/L KCl，100mmol/L NaCl，1mmol/L MgCl₂)清洗两遍，去除多余的培养基成分。

S2：将(1)中合成的适配体使用TE缓冲液配制成100μM溶液。取不同体积的100μM适配体加入500μL BB缓冲液中稀释为不同的浓度梯度(0、25、50、100、125和200nmol/L)，于95℃变性8min，立即冰浴冷却8min。将适配体溶液加入步骤S1中配制好的单核细胞增生李斯特氏菌液中，在37℃下缓慢振荡孵育45min。

S3：然后用BB缓冲液清洗，重悬于500μL BB缓冲液后进行流式细胞分析。并设置样品组和空白组(未添加适配体)，之后使用流式细胞分析仪进行前向散射、侧向散射和荧光强度的检测。样品的门控荧光强度百分比表征亲和性大小，利用GraphPad Prism 8软件计算各适配体的解离常数K_d值并绘制其饱和结合曲线(图2所示)。结果见表1：

表1不同适配体解离常数值

由此可见，同原始全长序列A15一样，本发明中适配体A15-2、A15-3、A15-5、A15-8对单核细胞增生李斯特氏菌具有良好的亲和性。

(3)适配体特异性分析：

将100pmol FAM修饰后的A15、A15-2、A15-3、A15-5、A15-8适配体溶液分别与单核细胞增生李斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、福氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和蜡样芽孢杆菌在500μL BB缓冲液中于37℃缓慢振荡孵育45min，然后用BB缓冲液清洗，重悬于500μL BB缓冲液中，避光混匀后进行流式细胞分析。特异性结果见图3。

实施例2

适配体功能化MNP捕获效率的考察

(1)实施例中适配体的合成：

本发明适配体由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，并将适配体A15-8的5′端使用生物素进行标记得到生物素化适配体。

(2)氨基化磁珠的适配体功能化

称取5mg氨基化磁珠并加入5mL的1×B&W缓冲液中，超声20min。然后加入200μL的25％戊二醛混合均匀，于37℃，130r/min避光振荡反应3h。使用1×B&W缓冲液清洗氨基化磁珠3次，并将磁珠重新分散于5mL亲和素浓度为100μg/mL的PBS缓冲液中，将反应体系置于37℃，130r/min下避光振荡反应4h，得到亲和素包被的磁珠。反应后使用1×B&W缓冲液清洗。

将生物素化适配体与上述所得亲和素包被的磁珠在37℃，130r/min下反应，利用亲和素与生物素的特异性结合得到适配体功能化MNP，使适配体固定在磁珠上，将适配体功能化MNP使用1×B&W缓冲液在外部磁场的帮助下清洗三次，以去除过量的适配体，并过夜放置以达到DNA的解离平衡，将合成的适配体功能化MNP重悬于PBS缓冲液中，至终浓度为1mg/mL。

(3)适配体功能化MNP捕获效率的计算

通过稀释单核细胞增生李斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、福氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和蜡样芽孢杆菌的细菌培养液获得浓度为10³cfu/mL的菌悬液，并将其分别与0.1mg适配体功能化MNP在37℃下孵育。随后借助外部磁场分离、收集磁珠捕获的细菌，使用1×BB缓冲液洗涤捕获的菌体两次，并将其再次分散于1×BB缓冲液中。通过平板记数法三次计数富集前菌悬液中的细菌总数和富集后磁珠捕获的的细菌数来确定适配体功能化MNP的捕获效率。捕获效率＝捕获细菌数/菌悬液细菌总数。

实验结果如图4所示，该单增李斯特氏菌特异性适配体功能化MNP对溶液中单增李斯特氏菌的捕获效率为73.01％，而对其他菌种的捕获效率均不超过20％，具有良好的特异性。

(4)实际样品捕获效率的考察

无菌取样25g等份的三文鱼样品浸入225mL生理盐水中，并将细菌的梯度稀释液加入其中，随后将混合物均质2min以制备1∶10样品均质液。每毫升均质样品中加入0.1mg的适配体功能化MNP，于37℃下缓慢震荡孵育60min。通过平板计数法检测富集前样品中细菌总数和富集后磁珠捕获的的细菌数，计算捕获效率，结果见表2：

表2三文鱼加标回收实验结果

MNP对三文鱼样品中单增李斯特氏菌的捕获效率在67.80％～77.50％范围内。该结果不仅证实了适配体可以作为磁分离实验中的有效识别分子，还说明了合成的适配体功能化MNP具有应用于实际样品检验的广泛前景。此外因可针对不同的食源性致病菌筛选获得其特异性适配体，通过简单替换磁珠上的适配体序列，即可将其应用于分离富集各种食源性致病菌。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种特异识别单核细胞增生李斯特氏菌的优化适配体序列及其应用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aatactatcg cggagacagc gcgggaggca ccggggattc gacatgaggc ccggatc 57

<210> 2

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggagctcag aataaacgct caatacggca ccggggattc gacatgaggc ccggatc 57

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccggggattc gacatgaggc ccggatc 27

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccggggattc gacatgaggc ccgg 24

Claims

1.一种适配体，其特征在于，所述适配体为A15-3、A15-5与A15-8，所述适配体对应核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.3与SEQ ID No.4所示。

2.一种如权利要求1所述适配体在检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌中的应用。

3.根据权利要求2中所述的应用，其特征在于，所述适配体的应用还可以在制备临床医学中单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂中应用。

4.根据权利要求2中所述的应用，其特征在于，所述适配体可被可提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基、氨基所修饰。