CN108866065A

CN108866065A - 特异性识别庆大霉素的ssDNA适配体及其应用

Info

Publication number: CN108866065A
Application number: CN201810801316.9A
Authority: CN
Inventors: 周楠迪; 韩旭艳; 巫朦朦; 田亚平
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-07-20
Filing date: 2018-07-20
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2038-07-20
Also published as: CN108866065B

Abstract

本发明涉及一种特异性识别庆大霉素的ssDNA适配体及其应用，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。本发明提供了利用庆大霉素修饰的琼脂糖凝胶亲和层析‑SELEX技术筛选庆大霉素适配体的方法，得到ap5、ap8、ap22、ap26四条与庆大霉素具有高亲和力的ssDNA适配体序列，且最优适配体ap26已被成功用于金胶比色法（AuNPs）检测庆大霉素。本发明为庆大霉素残留的检测提供了亲和力高、特异性高、易修饰和标记的识别元件和多种检测方法。

Description

特异性识别庆大霉素的ssDNA适配体及其应用

技术领域

本发明涉及一种特异性识别庆大霉素的ssDNA适配体及其应用，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。

背景技术

氨基糖苷类抗生素如卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、链霉素等，是常见的一类抗生素。主要作用机制是抑制细菌核糖体循环中的多个环节，包括抑制70S始动复合物的形成；选择性地与30S亚基上的靶蛋白结合，诱导错误匹配，合成异常无功能的蛋白质；阻止终止密码子与核蛋白体结合，使已合成的肽链不能释放，并阻止70S核糖体解离，造成细菌体内核糖体耗竭，从而阻碍细菌的蛋白质合成。氨基糖苷类抗生素的分子结构主要是通过氧桥将氨基糖与氨基环醇连接而成，主要对金黄色葡萄球菌和需氧革兰阴性杆菌，包括铜绿假单胞菌有强大的抗菌作用，对沙雷菌属、产碱杆菌属、布鲁杆菌、沙门杆菌、嗜血杆菌、痢疾杆菌以及结核分支杆菌、其他分支杆菌属亦具有良好的抗菌作用，但对革兰阴性球菌如淋球菌、脑膜炎球菌的作用差，各型链球菌、肠球菌及各种厌氧菌对该类抗生素耐药。

当动物体内氨基糖苷类抗生素长期积累达到某个程度时，生物体内对此类抗生素的耐药性增强，耐药细菌的数量逐渐增加，最后导致此类药物的药效降低。除此之外，还有耳毒性和肾毒性危害。大剂量的此类抗生素进入人体，会导致胃肠道不适，中枢神经受损等不良反应。庆大霉素是小单孢菌属发酵产生的一组结构相近的多组分氨基糖苷类抗生素。长期食用兽药超标的动物源食品不仅对人体健康造成直接或间接的伤害，还会造成人体对此类药物产生抗药性，不利于细菌性疾病的预防和治疗。因此，很多国家和地区均规定了此类抗生素在动物源食品中的最大残留限量。我国严格规定了动物源食品中庆大霉素药物的残留量，GBT21329-2007文件指出庆大霉素在内脏、牛奶和奶粉中不得检出超过20 μg·kg^-1的残留，肉类和水产品中不得超过10μg·kg^-1。由于养殖过程中经常存在着违法使用或者不合理使用的现象，食品中氨基糖苷类抗生素的过量残留，已经成为国内外普遍关注的食品安全问题之一。因此，加大对药物残留的监控力度，加强药残检测新技术的开发是十分有必要的。基于适配体的生物传感检测方法具有灵敏度高、特异性强等特点，因此筛选庆大霉素的特异性适配体对于建立高效快速、特异灵敏的庆大霉素检测方法具有十分重要的意义。

指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands byexponential enrichment，简称为SELEX）是近年来新建立的一种体外筛选技术，基于单链寡核苷酸碱基之间可以形成多种空间结构，这些结构容易与靶分子结合的原理，从含有10¹³~10¹⁵个不同基元的初始文库中，经过数十轮的重复筛选富集过程，获得高亲和性、高特异性的核酸适配体。核酸适配体的筛选技术可以应用于各种类型靶分子的筛选上，不仅可以筛选无机或有机小分子、蛋白质、糖、抗生素等单个靶分子，还可以筛选复杂的靶结构或组成不明确的复合靶如靶分子混合物、生物体、完整细胞等。利用SELEX技术筛选获得的适配体有着比抗体分子更高的特异性和亲和力，甚至能识别单抗不能区分的抗原物质。同时，与蛋白质性质的抗体相比，核酸适配体具有明显的优越性，例如：靶分子范围广，不受免疫条件和免疫原性的限制，可在体外人工合成并且合成技术已非常成熟，变性与复性可逆，可应用于非生理条件下，可根据需求进行多种化学修饰，易于长期室温保存等。这些特性使得适配体在生物医药研究领域得到广泛应用。近年来已有学者将适配体应用于抗生素的检测领域，同生物传感器平台结合，发展出快速、新颖的检测方法而备受关注。

本发明通过琼脂糖凝胶亲和层析SELEX技术，利用亲和层析柱富集与庆大霉素结合的ssDNA分子，通过多轮筛选得到与庆大霉素高特异结合的ssDNA适配体序列，并将最优适配体ap26用于庆大霉素AuNPs比色检测法的构建。本发明为庆大霉素残留的检测提供了稳定性良好、亲和力高、易制备、易修饰和标记的高特异性检测识别元件和多种方法。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种特异性识别庆大霉素的ssDNA适配体，通过亲和层析SELEX技术，借助于亲和层析柱可以富集与庆大霉素结合的ssDNA分子，而不富集未与庆大霉素结合的ssDNA的特点，以其作为结合与分离的介质，筛选得到能特异性结合庆大霉素的ssDNA适配体。在此基础上构建金纳米颗粒 (AuNPs) 比色法检测庆大霉素的方法，并对检测条件进行优化和检测方法的特异性进行验证，最后将这种检测方法应用到牛奶样品中庆大霉素浓度的检测。该适配体是庆大霉素的新型识别元件，具有稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性的优势，并能应用于多种检测方法的构建。

按照本发明提供的技术方案：特异性识别庆大霉素的ssDNA适配体，选自序列表ap1~ap34所示序列中的一种或多种，包括含有ap1~ap34所述序列的ssDNA。其中，序列表ap1~ap34在结构上均符合下述通式1所示的结构特征，5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CC-N35-CTGCAGGTCG ACGCATGCGC CG-3′ （通式1）；其中N代表碱基A，T，C，G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。

所述ap1~ap34所述序列具体如序列ap1~ap34所示。

在序列表中，优选序列ap5、ap8、ap22或ap26所示的序列，包括含有ap5、ap8、ap22、ap26所述序列的ssDNA；具体如下：

ap5: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGTTCTGTA CGCGAACCGG TCCTTGGATC GTAATCGCTGCAGGTCGACG CATGCGCCG-3′

ap8: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCGGGAACG GGGGCTAAGA ACTTGGGAAC TGCGCCTCTGCAGGTCGACG CATGCGCCG-3′

ap22: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCTGTATATG CAACGTCTCC GCTCTGGTACTTTGTATCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′

ap26: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCATCGTCT TCTTGAAGTG TGTTCTCAATAGCGTGGCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′。

根据序列表ap1~ap34所述的适配体，其能够被提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基等所修饰。

所述特异性识别庆大霉素的ssDNA适配体的应用，用于检测庆大霉素的组合物、试剂盒或芯片中，其中含有序列表ap1~ap34中任一项的适配体。

筛选特异性结合庆大霉素的ssDNA适配体的方法（图1），包括步骤（a）-（l）：

（a）筛选文库：ssDNA文库；

5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CC-N35-CTGCAGGTCG

ACGCATGCGC CG-3′ 其中N代表碱基A，T，C，G中任一个。

（b）亲和层析柱：功能化的Sepharose 4 FF；

（c）庆大霉素溶液：配置成浓度为10 mmol·L^-1；

（d）链霉亲和素磁珠：粒径1-2µm，浓度为10mg·mL^-1；

（e）使步骤（b）中的亲和层析柱和步骤（c）中的庆大霉素在适宜的条件下保温、洗涤；所述适宜条件是指庆大霉素能和功能化的亲和层析柱偶联的条件，包括温度28℃，作用时间4h，偶联缓冲液成分为0.2 mol·L^-1NaHCO₃，0.5 mol·L^-1NaCl，pH 8.0；

（f）使步骤（e）与步骤（a）中的ssDNA在适宜的条件下结合；适宜的条件包括室温25℃，结合时间1h；

（g）收集经步骤（f）处理的与（c）中庆大霉素结合的ssDNA序列；

（h）对步骤（g）的文库成员进行PCR扩增处理，下游引物5′-端标记生物素；

（i）将步骤（h）中的文库成员与（d）中的链霉亲和素磁珠在适宜条件下接触，得到单链次级文库，将单链次级文库与步骤（e）中的亲和层析柱在适宜条件下接触；

单链次级文库制备：取链霉亲和素磁珠，用Bind and Wash buffer（B&W 10 mmol·L^-1Tris-HCl，1 mmol·L^-1 EDTA，2 mol·L^-1 NaCl，pH 7.5）冲洗，将第一轮筛选后用上游引物跟生物素标记的下游引物进行扩增的产物加入链霉亲和素磁珠中，室温结合1h（轻微震荡），用B&W缓冲液冲洗，磁性分离，洗去未结合到磁珠上的DNA，在链霉亲和素磁珠中加入NaOH溶液，37℃孵育2h，磁性分离，将带生物素的一条链留在链霉亲和素磁珠上，洗下不带生物素的一条单链DNA即为下一轮筛选的次级文库；

（j）收集步骤（g）或（i）中与（c）特异性结合的文库成员；

（k）重复步骤（d）～（j），重复次数1、2、3、4、5、6、7、8、9次，优选重复9次；

（l）任选地，对（j）步骤获得的文库成员进行确定，优选序列测定。

基于适配体的AuNPs比色法检测庆大霉素。

本发明构建了基于适配体的AuNPs比色法，实现对庆大霉素的检测。AuNPs溶液在稳定条件下，由于表面等离子共振作用而呈现为酒红色，且在520 nm处有最大吸收值。但在较高浓度的盐离子(如钠离子、钾离子等) 存在的情况下，AuNPs会发生聚集，AuNPs溶液颜色会由原来的酒红色变为紫色或蓝色甚至是蓝灰色。研究表明，ssDNA可以靠静电作用包裹在AuNPs的表面，使得AuNPs在高浓度盐离子溶液中保持稳定而不会发生聚集反应。当适配体与AuNPs结合后，在庆大霉素存在的情况下，庆大霉素能够竞争性地与适配体结合，使得适配体从AuNPs表面脱离，当再加入高浓度的NaCl时，AuNPs会发生聚集，溶液颜色将会变为紫色或蓝灰色。AuNPs的颜色变化和对应的吸收值可以分别作为定性定量分析的依据。

本发明的有益效果：本发明采用亲和层析-SELEX技术，筛选得到与庆大霉素高特异结合的ssDNA适配体，方法快速简便易操作，使用仪器简单，一般的实验条件都可以达到。筛选得到的高亲和力适配体序列可以特异性地跟庆大霉素结合，为食品中庆大霉素残留的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性检测识别元件和多种检测方法。

附图说明

图1：亲和层析-SELEX筛选庆大霉素特异性适配体原理图。

图2：每一轮筛选，庆大霉素结合的ssDNA的荧光强度。

图3：测定适配体序列ap5、ap8、ap22、ap26的K_d值的拟合曲线图。

图4：AuNPs溶液在520 nm处的吸光值与庆大霉素浓度的线性关系图。

图5：AuNPs比色法检测庆大霉素的方法特异性验证，1、庆大霉素，2、卡那霉素，3、新霉素，4、四环素，5、氨芐青霉素，6、妥布霉素。

具体实施方式

实施例1 随机ssDNA文库及其引物的构建

（a）构建长度79个碱基的随机ssDNA文库

5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CC -N35-CTGCAGGTCG ACGCATGCGC CG-3′ 其中N代表碱基A，T，C，G中任一个。

（b）合成上游引物：

上游引物1：5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT-3′；

上游引物2：5′-FAM-TAGGGAATTC GTCGACGGAT-3′；

（c）合成下游引物：

下游引物1：5′-CGGCGCATGC GTCGACCTG-3′；

下游引物2：5′-biotin-CGGCGCATGC GTCGACCTG-3′。

实施例2 核酸适配体的体外筛选

为筛选出与庆大霉素有高亲和力和高特异性的ssDNA适配体，共进行了9轮核酸适配体的筛选。每一轮筛选，适配体跟庆大霉素的结合后ssDNA的荧光强度如图2所示。

（a）取15μL 100μmol·L^-1（1.5 nmol）的初始文库ssDNA，加入5mL的结合缓冲液中，混合均匀，于90℃下变性10min，迅速冰浴10min，常温放置10min。将处理过的ssDNA溶液加入到亲和层析柱中，在室温下孵育1h。再用结合缓冲液冲洗，洗去未与庆大霉素结合的ssDNA序列，用洗脱缓冲液再孵育1h并洗脱。

（b）上清液通过苯酚、氯仿、异戊醇（苯酚:氯仿:异戊醇体积比=25:24:1）混合液抽提，12000r·min^-1离心10min，吸取上层水相，并加入1/10体积的3mol·L^-1的醋酸钠，2.5倍体积的乙醇（-20℃）混匀，置于-20℃的冰箱放置过夜，4℃，10000r·min^-1离心15min，弃掉上清液，用4℃预冷过的75%的乙醇洗涤后，4℃，10000r·min^-1离心15min。沉淀部分室温干燥，用10μL的灭菌水重溶。取适量灭菌水重溶ssDNA为模板，以带荧光标记的上游引物2和不带标记的下游引物2进行PCR扩增，核酸电泳进行验证。

25 μL 的PCR扩增体系如表1所示。

表1

扩增条件：95℃，预变性5 min；95℃，变性30s；55℃，退火30s；72℃，延伸15s；72℃，延伸5 min；30个循环。

（c）制备次级文库：取25μL链霉亲和素修饰过的磁珠，用B&W缓冲液清洗5遍，再加入第一轮的PCR产物20 μL和B&W缓冲液80μL，轻微震荡，室温反应1h，将其置于磁性分离架上，取出上清，用B&W缓冲液清洗5遍后，加入0.1mol·L^-1的NaOH 30μL，在37℃的水浴锅中洗脱2h，重复洗脱两次收集洗脱液，此时反义链仍连接在磁珠上，该洗脱液即可作为下一轮筛选的文库用于第二轮筛选。

（d）筛选次数的确定：每一轮的筛选之后，在PCR过程中加入上游引物2和下游引物1，使得目的单链带荧光团。分别取5μL每一轮带荧光团的PCR产物，加入100μL结合缓冲液，混合均匀后于90℃条件下放置10min，迅速冰浴10min，再放置在常温下10min。实验组加入10μmol·L^-1庆大霉素溶液10μL，对照组加入等体积的结合缓冲液，再用结合缓冲液分别将体系补充至250μL。常温下轻微摇晃1h，实验组和对照组分别加入5μL氧化石墨烯溶液，混匀后常温轻微摇晃2h。将混合液8000 r.min^-1离心10min。取上清液200μL，利用多功能酶标仪测定荧光值 (发射波长520nm，激发波长494nm)。实验组与对照组荧光值的差值即是与庆大霉素结合的ssDNA序列的荧光值。直至荧光值不再增加即可停止筛选过程。

（e）下一轮筛选根据上面的筛选方法重复进行，重复9次。如图2所示，当筛选进行到第9轮时，荧光强度趋于平稳。因此，第9次重复筛选结束后即可停止筛选。

实施例3 筛选得到的ssDNA克隆、测序、结构分析

ssDNA克隆测序：经过终轮筛选得到的ssDNA，用上游引物1和下游引物1进行PCR扩增，扩增产物全量上样于3%琼脂糖，对PCR产物进行回收。用7μL纯化的PCR产物与1μL pMD-19T载体混合均匀，在T4连接酶的作用下16℃连接过夜，转化进大肠杆菌JM109感受态细胞，37℃过夜培养。随机挑取34个阳性克隆子转接到液体LB培养基中，培养12h，用质粒提取试剂盒提取质粒，测序得到ap1~ap34的34条不同序列的适配体。

实施例4 用荧光法测定适配体序列的解离常数K_d值

对34条适配体序列的中间35个随机序列做了同源性分析，根据这些序列的同源性并分组，并用Mfold在线软件分析这些ssDNA序列的稳定性和二级结构。将有荧光基团6-羧基荧光素(FAM)修饰的不同浓度的适配体序列加入到结合缓冲液中，并用结合缓冲液补充体积至240μL，90℃变性10min，迅速冰浴10min，常温放置10min。再将10μL 10μmol·L^-1庆大霉素加入到溶液中，轻微震荡，室温反应1h后，再加入氧化石墨烯，室温条件下孵育2h，将混合液以8000 r·min^-1的速度离心10min，取上清。沉淀用200μL结合缓冲液重悬，再以相同的条件离心取上清。最后将全部上清液加入到96孔板中用酶标仪测其荧光强度。适配体序列的含量与荧光强度成正比。

由方程：y=Bmax×free ssDNA/ ( K_d+free ssDNA)，可对每一条适配体序列的K_d值进行分析。方程中y表示核酸适配体结合的庆大霉素占总的庆大霉素的比例，即饱和度；Bmax表示最大结合位点的数目，free ssDNA表示未与庆大霉素结合的游离的ssDNA浓度。拟合曲线如图3所示，测得ap5、ap8、ap22、ap26的K_d值分别为74.50±9.77 nmol·L^-1、80.25±9.04 nmol·L^-1、96.34±18.96 nmol·L^-1、 14.00±3.34 nmol·L^-1，均具有较高的亲和力，其中ap26与庆大霉素具有最高的亲和力。

实施例5 AuNPs的制备与浓缩

采用柠檬酸三钠还原法配制AuNPs。实验中所需要用到的玻璃容器全部用新配制的王水 (HCl:HNO₃=3:1) 清洗并浸泡30 min，再用超纯水浸泡过夜，然后放入烘箱中烘干备用。

取制备好的AuNPs溶液，加入到烧瓶中，以300 r·min^-1的速度匀速搅拌，并持续加热直到溶液体积为总体积的1/5，此时得到的AuNPs溶液的浓度为17.5 nmol·L^-1。将制备的金胶储存在提前准备好的试剂瓶中，用锡纸包裹，放在4℃的冰箱中备用。

实施例6 AuNPs比色法检测庆大霉素标准品

取0.5 mL的离心管9个，依次加入100 μL 浓缩5倍的AuNPs溶液，再加入100 nmol·L^-1适配体ap26 100 μL，室温避光放置反应1 h后，再依次加入浓度分别为0 nmol·L^-1、50nmol·L^-1、100 nmol·L^-1、200 nmol·L^-1、300 nmol·L^-1、400 nmol·L^-1、500 nmol·L^-1、600 nmol·L^-1、700 nmol·L^-1的庆大霉素标准溶液50 μL，避光反应50 min，最后向每个离心管中加入200 mmol·L^-1的NaCl溶液50 μL，先观察离心管中溶液的颜色变化，再进行紫外-可见吸收光谱表征，以确定庆大霉素的检测范围。当庆大霉素的浓度在50-700 nmol·L^-1范围内时，AuNPs溶液在520 nm处的吸光值随着庆大霉素浓度的增大而逐渐减小，呈现良好的线性关系。线性关系式为：y=-2.849e^-4x+0.8528（x是庆大霉素浓度/nmol·L^-1，y是吸光度值），线性相关系数R² = 0.9897，检测限为11.50 nmol·L^-1（图4）。

实施例7 AuNPs比色法检测庆大霉素方法的特异性验证

为了验证AuNPs比色法检测庆大霉素的特异性，依次向适配体ap26 修饰的AuNPs中加入100 μL 600 nmol·L^-1的庆大霉素、卡那霉素、新霉素、四环素、氨苄青霉素以及妥布霉素溶液，避光放置反应50 min，再加入50 μL 200 mmol·L^-1的NaCl溶液。如图5所示，加入庆大霉素的离心管中AuNPs溶液变为蓝灰色，而加入其它类抗生素的离心管中AuNPs溶液颜色未发生明显变化。由此可见，构建的基于适配体和AuNPs检测庆大霉素的方法具有特异性。

实施例8 牛奶样品中庆大霉素的检测分析

为进一步确定本发明中建立的AuNPs比色法检测庆大霉素的实用性，将该方法应用于实际样品牛奶中进行检测。首先向市售牛奶中添加庆大霉素，庆大霉素的浓度为200nmol·L^-1、300 nmol·L^-1，再滴加浓度为20%的三氯乙酸溶液，将pH调到4.6，然后在45℃水浴锅中水浴10 min沉淀牛奶样品中的蛋白，再以10000 r·min^-1的转速离心20 min除去凝结的蛋白质和脂肪，即可得到预处理的含庆大霉素的牛奶样品。将预处理的牛奶样品作为检测液，按上述AuNPs比色法的条件检测。根据检测出的庆大霉素浓度与实际添加的庆大霉素浓度的百分比，计算出回收率 (Recovery)。如表2所示，实际加入的庆大霉素的回收率均超过90%，RSD均低于5%。结果表明对实际样品进行检测时，牛奶样品基质成分对检测结果影响很小，即建立的这种方法可以用于实际样品中庆大霉素的检测。

表2 AuNPs比色法检测牛奶样品中庆大霉素的回收率和RSD

。

序列表

<110> 江南大学

<120> 特异性识别庆大霉素的ssDNA适配体及其应用

<141> 2018-07-20

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 79

<212> DNA

<213> ap1(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

tagggaattc gtcgacggat ccaatgaata gcgggctgta ctgtgggtca gccacccctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 2

<211> 79

<212> DNA

<213> ap2(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

tagggaattc gtcgacggat cccgcataag tggcgttcgc agcgagatag gaacctcctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 3

<211> 79

<212> DNA

<213> ap3，4(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

tagggaattc gtcgacggat cccatcaccg gcaagggtag ccctcgattt ccatcgtctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 4

<211> 79

<212> DNA

<213> ap5(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

tagggaattc gtcgacggat ccgttctgta cgcgaaccgg tccttggatc gtaatcgctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 5

<211> 79

<212> DNA

<213> ap6(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

tagggaattc gtcgacggat ccgtaattcg gaccggaact attcgcgttt gcattatctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 6

<211> 79

<212> DNA

<213> ap7(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

tagggaattc gtcgacggat ccgcaccgtg acttttggtt ctctttcgcg ccaagtcctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 7

<211> 79

<212> DNA

<213> ap8，9(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

tagggaattc gtcgacggat cccgggaacg ggggctaaga acttgggaac tgcgcctctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 8

<211> 79

<212> DNA

<213> ap10(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 8

tagggaattc gtcgacggat ccgcgtccgt aatacatttc tgttcggttg tccgactctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 9

<211> 79

<212> DNA

<213> ap11(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 9

tagggaattc gtcgacggat ccggctctgt aaaattatat ccgatcgtat taccctcctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 10

<211> 79

<212> DNA

<213> ap12(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 10

tagggaattc gtcgacggat cccccttctt aaattgtcta ggttcccttc tttctatctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 11

<211> 79

<212> DNA

<213> ap13(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 11

tagggaattc gtcgacggat ccgcaagtat attgtgttgg tccttctctg agaggtactg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 12

<211> 79

<212> DNA

<213> ap14(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 12

tagggaattc gtcgacggat cccgcctata cctaagcgcc ttgattcgac tttcatcctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 13

<211> 79

<212> DNA

<213> ap15(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 13

tagggaattc gtcgacggat ccaccctggc gtaaagggtt ttgcataagc ttacacactg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 14

<211> 79

<212> DNA

<213> ap16(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 14

tagggaattc gtcgacggat cccgccatat tccattctag cttctaattt gcggacgctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 15

<211> 79

<212> DNA

<213> ap17(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 15

tagggaattc gtcgacggat ccacattcgt tgaggattct ggcttcttcc ttgtaccctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 16

<211> 79

<212> DNA

<213> ap18(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 16

tagggaattc gtcgacggat ccgactggta cttcctttgg tgtgtacgaa ttgcgcgctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 17

<211> 79

<212> DNA

<213> ap19(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 17

tagggaattc gtcgacggat cctgttggtg tgagcgtgcc gtaatatgcg agattttctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 18

<211> 79

<212> DNA

<213> ap20(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 18

tagggaattc gtcgacggat cctttgccaa tcccatggtg ttcttctagt ccaggttctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 19

<211> 79

<212> DNA

<213> ap21(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 19

tagggaattc gtcgacggat ccgttctata tcgattgtct cggcatcagt tctcatcctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 20

<211> 79

<212> DNA

<213> ap22(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 20

tagggaattc gtcgacggat cctgtatatg caacgtctcc gctctggtac tttgtatctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 21

<211> 79

<212> DNA

<213> ap23(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 21

tagggaattc gtcgacggat ccctgttagc ctagttttca gtcgcagttg cttccctctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 22

<211> 79

<212> DNA

<213> ap24(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 22

tagggaattc gtcgacggat ccaggctttc aaacaggtcc taccgctgag tttgacactg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 23

<211> 79

<212> DNA

<213> ap25(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 23

tagggaattc gtcgacggat ccacattggc atgtaagtcg tatcgctact cgcgggtctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 24

<211> 79

<212> DNA

<213> ap26(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 24

tagggaattc gtcgacggat cccatcgtct tcttgaagtg tgttctcaat agcgtggctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 25

<211> 79

<212> DNA

<213> ap27(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 25

tagggaattc gtcgacggat cccgcatcct tctctagcga ggtcttgccc aatcatgctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 26

<211> 79

<212> DNA

<213> ap28(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 26

tagggaattc gtcgacggat ccttagccgg ttagtatttg cttgatggtg ggcacgtctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 27

<211> 79

<212> DNA

<213> ap29(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 27

tagggaattc gtcgacggat ccaggtctcc gaatccgcta gtactaattt caggttcctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 28

<211> 79

<212> DNA

<213> ap30(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 28

tagggaattc gtcgacggat ccagttgtct aatggtgatt gtactagtaa agggacactg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 29

<211> 79

<212> DNA

<213> ap31(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 29

tagggaattc gtcgacggat ccgtccaatc ctactcaaga cgatacagag tacaatgctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 30

<211> 79

<212> DNA

<213> ap32(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 30

tagggaattc gtcgacggat cccttgccat acgataagca gttgtttacg tgtctctctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 31

<211> 79

<212> DNA

<213> ap33(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 31

tagggaattc gtcgacggat ccccggcggg gggttttaat ccttcctgtg tattaggctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

<210> 32

<211> 79

<212> DNA

<213> ap34(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 32

tagggaattc gtcgacggat ccggttgatg tcgaccccta tttgaccttc gtcttgtctg 60

caggtcgacg catgcgccg 79

Claims

1.特异性识别庆大霉素的ssDNA适配体，其特征在于：选自ap1~ap34所示序列中的一种或多种，包括含有ap1~ap34所述序列的ssDNA；

其中，序列ap1~ap34在结构上均符合下述通式所示的结构特征，5′-TAGGGAATTCGTCGACGGAT CC-N35-CTGCAGGTCG ACGCATGCGC CG-3′；其中N代表碱基A，T，C，G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。

2.根据权利要求1所述特异性识别庆大霉素的ssDNA适配体，其特征在于：所述ap1~ap34所述序列具体如序列ap1~ap34所示。

3.根据权利要求2所述特异性识别庆大霉素的ssDNA适配体，其特征在于：选自ap5、ap8、ap22或ap26所示的序列，包括含有ap5、ap8、ap22、ap26所述序列的ssDNA；具体如下：

4.根据权利要求1所述特异性识别庆大霉素的ssDNA适配体，其特征在于：其能够被提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基所修饰。

5.权利要求1-4之一所述特异性识别庆大霉素的ssDNA适配体的应用，其特征在于：将所述适配体用于检测庆大霉素的组合物、试剂盒或芯片中，其中含有序列表ap1~ap34中任一项的适配体。