CN110684773B - 特异性识别甲硝唑的ssDNA适配体及其应用 - Google Patents

特异性识别甲硝唑的ssDNA适配体及其应用 Download PDF

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Abstract

特异性识别甲硝唑的ssDNA适配体及其应用，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。本发明通过磁珠‑SELEX技术，将包含35个随机核苷酸的ssDNA初始文库进行PCR扩增后固定在链霉亲和素修饰的磁珠上，加入甲硝唑将与之有亲和力的ssDNA竞争下来，扩增后再投入下一轮筛选。经过十轮筛选及克隆测序获得39条甲硝唑适配体序列，进一步亲和力评估后挑选出ap2、ap19、ap21、ap32四条亲和力较高的序列，其中ap32具有亲和力高、特异性高、结构稳定等优点被选作最优甲硝唑适配体。本发明为甲硝唑检测提供了性能优良的识别元件。

Description

特异性识别甲硝唑的ssDNA适配体及其应用
技术领域
本发明涉及一种特异性识别甲硝唑的ssDNA适配体及其应用，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。
背景技术
甲硝唑属于硝基咪唑类抗生素，是人工合成的具有5-硝基咪唑基本结构的抗菌抗原虫药物，该药物也能作为禽类、畜类以及水产养殖的饲料药物添加剂，并且被广泛用于预防和控制蜂箱中的蜜蜂微孢子虫。但研究表明，甲硝唑存在致畸、致癌、致突变的潜在风险和遗传毒性，不合理使用甲硝唑可能导致可食性动物组织中的药物残留，甚至污染水源。1999年，我国农业部发布17号文《动物性食品中兽药最高残留限量》规定甲硝唑在所有食品动物可食性组织的最高残留限量为零。2002年3月，国家开始对此类化合物进行严格控制，农牧发[2002]1号文件《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》规定了在食源性动物中禁用甲硝唑和二甲硝咪唑，在中华人民共和国农业行业标准NY 5030-2006无公害食品畜禽饲养兽药使用准则和NY/T472-2006绿色食品兽药使用准则中规定，禁止以促生长为目的在所有食品动物中使用甲硝唑、二甲硝唑及其盐、酯和制剂禁用于所有食品动物促生长。因此，检测食品动物、饲料及相关产品中甲硝唑的含量，对保障食品质量安全具有重要意义。
目前国内外报道甲硝唑残留的检测方法主要有高效液相色谱法、极谱分析法、分光光度法、薄层色谱法、化学发光法、免疫检测法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法、光谱法、伏安法等。仪器分析方法灵敏度高，准确性好，但设备昂贵难以普及，对实验人员要求较高，对样品的预处理比较复杂，并且分析费时，难以满足轻便高效的现场检测。免疫分析法检测甲硝唑主要方法是酶联免疫法。酶联免疫法是利用结合抗体抗原免疫反应与酶催化反应检测甲硝唑，通过抗体（抗原）与酶结合形成酶标记复合物，酶标记复合物在相应的底物中催化反应，通过电信号、光信号或肉眼识别达到检测目的的检测分析技术。目前市场上已有一些针对甲硝唑残留检测的ELISA试剂盒产品，不过价格昂贵，酶标抗体的种类有限，并且由于甲硝唑是小分子化合物，本身不具有免疫原性，生产与应用存在较多的限制。这些都在很大程度上限制了免疫分析方法在甲硝唑检测中的应用。
指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands byexponential enrichment，简称为SELEX）是一种从含有随机序列的初始文库中体外筛选能与靶分子特异性结合的核苷酸序列的分子生物学技术，通常具有纳摩尔到皮摩尔的亲和力。SELEX基本原理是构建人工合成的随机寡核苷酸文库，将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸序列，经反复扩增，多轮筛选，即可得到与靶分子强亲和力高特异性的寡核苷酸序列，筛选出的寡核苷酸被称为适配体。SELEX筛选技术具有靶分子广，亲和力高、特异性高，筛选周期短，可代替抗体的特点。
本发明通过磁珠-SELEX技术，将双链DNA分子中反义链的末端修饰生物素，利用链霉亲和素与生物素之间极高的亲和力，使双链DNA结合在磁珠表面，然后再与靶分子孵育，与靶分子有较高亲和力的ssDNA被靶分子从互补链中竞争性脱离互补链和磁珠，通过磁力架将ssDNA和磁珠分离。经过多轮筛选得到与甲硝唑高特异结合的ssDNA适配体序列，并挑选ap2、ap19、ap21、ap32四条具有高度相似的二级结构的ssDNA适配体序列进行解离常数测量，得到最优适配体ap32。本发明为甲硝唑检测提供了稳定性良好、亲和力高、易制备、易修饰和标记的高特异性适配体序列。
发明内容
本发明的目的在于提供特异性识别甲硝唑的ssDNA适配体及其应用，通过磁珠SELEX技术，将与靶分子特异性结合的高亲和力寡核苷酸序列和链霉亲和素修饰的磁珠分离开来，经过10轮筛选后，进行纯化和克隆测序，最终得到39个适配体序列。该适配体是甲硝唑的新型识别元件，具有稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性的优势，并能应用于多种检测方法的构建。
本发明的技术方案，特异性识别甲硝唑的ssDNA适配体，选自序列表ap1~ap39所示序列中的一种或多种，包括含有ap1~ap39所述序列的ssDNA。其中，序列表ap1~ap39在结构上均符合下述通式1所示的结构特征，5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CC-N35-CTGCAGGTCGACGCATGCGC CG-3′（通式1）；其中N代表碱基A，T，C，G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。
ap1&8: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGTAGAG TCAATCCGGA AAACTGCCACCCCACGTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap2: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGTGCAGAA ATTGCCAAGA GTAGCGGAAGTTGCCAGCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap3: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGGGCGTTG CGGCAGTGCC AGCTTGCATGCGTGCAGCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap4: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGGA GAGATGTTAT AGTGTGTCACGGAAGGACTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap5: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGGATCCGG TTATTTGGAC CAGCCTCCGTTCCGTGCCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap6: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGTAGGT GAGCAGAATG ATAGCGAGGTCACGACTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap7: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGTT GTCTCGAAGC ATACTCACTGTAGACCGCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap9: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCAGTACGC CTTTACTGCA GGTCGACGCATGCGCCGCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap10: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGGATCCCC CTGGGTTTCC TGGTGTGAGTTACTTCCCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap11: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCTCGCACCA ATTACCTGCA GGTCGACGCATGCGCCGCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap12: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCTGGCCGTG CGGCCAGTGA CAGCTTGCATGCCTGCACTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap13: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGGGCGCTT ACGGGGCAGT GCAGCTTGCATGCGTGCCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap14: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCTGGGGGTG CGGGCAGTGC CAGCTTGCATGCCTGCACTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap15: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCACTGAAGA TGAACCGAAT AAACCGGGTGGGCGAGGCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap16: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGCAAGCTC TCCCGCAAAT TGTGTCGGACTGCAGGTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap17: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCGCGCTTA CGGCCAGTGC AGCTTGCATGCCTGCAGCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap18: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGAG ATCAGTATGT ACCTCCGGCGAGGATCGCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap19: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGTT GTCGGTCCCA ATGTGCACATGGTGTACCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′
ap20: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGTAGCG GCCCGAGAGC GCCATTAAACGTCGGGACTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′
ap21: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGAG TTAGTTATAA AGGCGGTTGGGGCGGGCCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap22: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGTC TGAGGATGGA TGGAGTGCGTTTTTAGGCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap23: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGAA CAAGCACGAG CGTACGCCCCTTGCACTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap24: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGGATCCAC TGGTACTGCG GACGTGTCCATCGCCTTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap25: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGGATCCGT GCTGATAAAC ACTCGCCGTTCACGGCGCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap26: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGCC TAATTGGGAT CGCATAGTTGCGCTCACCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap27: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGGC ACCGAACAGA TGTACGCGTCAACCGCCCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap28: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGTGGCTGC GGCAGTGCAG CAGCTTGCATGCCTGCACTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap29: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGCC TAATTGGGAT CGCATAGTTGCGCTCACCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap30: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGGATCCAG ACGACTAAAG GACTTGCCCCAGACTGCCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap31&38: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGGATGGCA GTCAAGCACG GGTCTCCCTCGAGATAGCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap32: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGTT TGGTAGGGTG CGAGCAACATCAGGCACCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap33: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGTT GAGATCCACG TCAGAACTACCCACATTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap34: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGTAGTG TTTCCTGAGG CATATCGGCCAGCAAACCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap35: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGAGGCATC CGGGGCAGTG CCAGCTTGCATGCCTGCCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap36: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCTGTAGCGC AAATCCGGAA AGCGGACTTCCCCTGCCCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap37: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGAT TTCCCGTATT GGCTCTTCAAAGAACTTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap39: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGAG TCAACGTGAT CATGGAGTCCACATGATCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′
在序列表中，优选序列ap2、ap19、ap21和ap32所示的序列，包括含有ap2、ap19、ap21、ap32所述序列的ssDNA；具体如下：
ap2：5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGTGCAGAA ATTGCCAAGA GTAGCGGAAGTTGCCAGCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap19：5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGTT GTCGGTCCCA ATGTGCACATGGTGTACCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap21：5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGAG TTAGTTATAA AGGCGGTTGGGGCGGGCCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap32：5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGTT TGGTAGGGTG CGAGCAACATCAGGCACCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′。
根据序列表ap1~ap39所述的适配体，其能够被提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基等所修饰。
所述特异性识甲硝唑的ssDNA适配体的应用，用于甲硝唑检测的组合物、试剂盒或芯片中，其中含有序列表ap1~ap39中任一项的适配体。
筛选特异性结合甲硝唑的ssDNA适配体的方法（图1），包括步骤（a）~（i）：
（a）ssDNA文库：5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CC-N35-CTGCAGGTCG ACGCATGCGCCG-3′，其中N代表碱基A，T，C，G中任一个，随机片段长度为35个核苷酸；
正向引物：5′-FAM-TAGGGAATTC GTCGACGGAT-3′；
反向引物：5′-biotin-CGGCGCATGC GTCGACCTG-3′；
（b）使步骤（a）中的引物对ssDNA文库按照以下条件进行PCR扩增： ssDNA 1 pmol，正向引物10 pmol，反向引物10 pmol，12.5 μL 2*PrimeSTAR®Max DNA聚合酶，去离子水9.5 μL；工作温度循环为95℃ 300 s，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 15 s，首次扩增循环数为29，在接下来的筛选流程中逐渐减少循环次数；
（c）链霉亲和素磁珠：粒径1-2 µm，浓度为10 mg·mL-1，用PBS缓冲液（NaCl 137mmol·L-1，KCl 2.7 mmol·L-1，Na2HPO4 4.3 mmol·L-1，KH2PO4 1.4 mmol·L-1, pH 8.0）清洗5次；
（d）使步骤（c）的链霉亲和素磁珠与步骤（b）中扩增的DNA在适宜的条件下结合，适宜的条件包括室温25℃，结合时间2 h；
（e）甲硝唑溶液：配制成浓度为300 mmol·L-1；
（f）使步骤（d）中的混合物用磁力架进行分离后，去上清，再用结合缓冲液（Tris-HCl 50 mmol·L-1, KCl 5 mmol·L-1, NaCl 100 mmol·L-1, MgCl2 1 mmol·L-1, pH7.4）清洗5次，然后与步骤（e）中的甲硝唑溶液混合，在室温25℃孵育2 h；
（g）使步骤（f）中的混合物用磁力架进行分离后，取上清，收集上清中与甲硝唑结合的ssDNA序列；
（h）重复步骤（b）~（g）10次；
（i）收集经步骤（h）得到的甲硝唑和ssDNA的混合液，用不带荧光团的正向引物5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT-3′和不带生物素的反向引物5′- CGGCGCATGC GTCG ACCTG-3′进行PCR扩增，电泳，切胶后用胶回收试剂盒回收PCR产物，纯化。参照T载体说明书将纯化后的PCR产物与pMD 18-T Vector载体进行连接转化，挑取39个阳性克隆子并提取其质粒进行序列测定。
本发明的有益效果：本发明采用磁珠-SELEX技术并将寡核苷酸文库固定至磁珠，通过竞争置换和扩增筛选得到与甲硝唑高特异结合的ssDNA适配体，方法快速简便易操作，使用仪器简单，一般的实验条件都可以达到。筛选得到的高亲和力适配体序列可以特异性地跟甲硝唑结合，为甲硝唑残留的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性检测识别元件和可能的检测方法。
附图说明
图1 磁珠-SELEX筛选甲硝唑特异性适配体原理图。
图2 测定适配体序列ap2、ap19、ap21、ap32的Kd值的拟合曲线图。
图3 荧光法检测甲硝唑的方法特异性验证。
具体实施方式
实施例1：随机ssDNA文库及其引物的构建
（a）构建长度79个碱基的随机ssDNA文库：
5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CC-N35-CTGCAGGTCG ACGCATGCGC CG-3′，其中N代表碱基A，T，C，G中任一个。
（b）合成正向引物：
正向引物1：5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT-3′；
正向引物2：5′-FAM-TAGGGAATTC GTCGACGGAT-3′；
（c）合成反向引物：
反向引物1：5′-CGGCGCATGC GTCGACCTG-3′；
反向引物2：5′-biotin-CGGCGCATGC GTCGACCTG-3′。
实施例2：核酸适配体的体外筛选
为筛选出与甲硝唑有高亲和力和高特异性的ssDNA适配体，共进行了10轮核酸适配体的筛选。
（a）25 μL 的PCR扩增体系如表1所示。
表1
扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸15 s；72℃延伸5 min；29个循环。
（b）体外筛选主要步骤：将链霉亲和素偶联好的磁珠用PBS缓冲液清洗5次后，将200 μL初始文库PCR产物溶于200 μL结合缓冲液中，再添加链霉亲和素偶联好的磁珠，在室温下轻轻摇晃2 h后将其放到磁力分离器上，去除上清液，用结合缓冲液清洗磁珠5次后，再添加300 mmol·L-1的甲硝唑溶液，在室温下继续轻轻摇晃2 h，并将其放到磁力分离器上3min后，收集上清液投入到下一轮筛选。
（c）筛选次数的确定：每一轮的筛选之后，取上清液100 μL，混合100 μL结合缓冲液，利用多功能酶标仪测定荧光值(发射波长520 nm，激发波长494 nm)。实验组与对照组荧光值的差值即是与甲硝唑结合的ssDNA序列的荧光值。直至荧光值不再有增长的趋势即可停止筛选过程。
（d）下一轮筛选根据上面的筛选方法重复进行，重复10次，第8轮筛选后荧光强度趋于稳定。
实施例3：筛选得到的ssDNA克隆、测序
ssDNA克隆测序：经过终轮筛选得到的ssDNA，用正向引物1和反向引物1进行PCR扩增，扩增产物全量上样于3%琼脂糖，对PCR产物进行回收。参照T载体说明书将纯化后的PCR产物与pMD 18-T Vector载体进行连接，16℃连接过夜后，转化进大肠杆菌JM109，过夜培养。经菌落PCR以及琼脂糖凝胶验证正确的转化子，挑取39个阳性克隆子并提取其质粒进行序列测定，测序得到ap1~ap39的39条不同序列的适配体。
实施例4：用荧光法测定适配体序列的解离常数Kd值
对39条适配体序列的中间35个随机序列做了同源性分析，根据这些序列的同源性并分组，并用Mfold在线软件分析这些ssDNA序列的稳定性和二级结构。将有荧光基团6-羧基荧光素(FAM)修饰的不同浓度的适配体序列加入到结合缓冲液中，并用结合缓冲液补充体积至200 μL，90℃变性10 min，迅速冰浴10 min，常温放置10 min。加入氧化石墨烯，直至完全萃灭荧光，再将 10 μmol甲硝唑加入到溶液中，轻微震荡，室温反应2 h后，室温条件下孵育2 h，将混合液以13000 r·min-1离心5 min，取上清。最后将全部上清液加入到96孔板中用酶标仪测其荧光强度。适配体序列的含量与荧光强度成正比。
由方程：y=Bmax×free ssDNA/ ( Kd+free ssDNA)，可对每一条适配体序列的Kd值进行分析。方程中y表示核酸适配体结合的甲硝唑占总的甲硝唑的比例，即饱和度；Bmax表示最大结合位点的数目，free ssDNA表示未与甲硝唑结合的游离的ssDNA浓度。拟合曲线如图2所示，测得ap2、ap19、ap21、ap32的Kd值分别为137.67±15.31 nmol·L-1、144.59±38.56 nmol·L-1、151.35±29.26 nmol·L-1和77.77±15.93 nmol·L-1，均具有较高的亲和力，其中ap32与甲硝唑具有最高的亲和力。
实施例5：荧光法验证甲硝唑适配体的特异性
向荧光基团6-羧基荧光素(FAM)修饰的相同浓度的适配体ap32中加入200 μL结合缓冲液，90℃变性10 min，迅速冰浴10 min，常温放置10 min。再加入氧化石墨烯，室温条件下孵育2 h，再将1 μmol的甲硝唑、二甲硝唑、赛可硝唑、奥硝唑、卡那霉素、妥布霉素、氧氟沙星以及盐酸四环素溶液，加入到溶液中，轻微震荡，室温反应2 h后，将混合液以13000r·min-1离心5 min，取上清。最后将全部上清液加入到96孔板中用酶标仪测其荧光强度。在甲硝唑存在下，检测到的荧光强度明显高于其他抗生素（图3）。因此，ap32具有良好的特异性。
序列表
<110> 江南大学
<120> 特异性识别甲硝唑的ssDNA适配体及其应用
<160> 39
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 79
<212> DNA
<213> ap1&8(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
tagggaattc gtcgacggat ccctgtagag tcaatccgga aaactgccac cccacgtctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 2
<211> 79
<212> DNA
<213> ap2(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
tagggaattc gtcgacggat ccgtgcagaa attgccaaga gtagcggaag ttgccagctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 3
<211> 79
<212> DNA
<213> ap3(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
tagggaattc gtcgacggat ccgggcgttg cggcagtgcc agcttgcatg cgtgcagctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 4
<211> 79
<212> DNA
<213> ap4(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
tagggaattc gtcgacggat ccctgcagga gagatgttat agtgtgtcac ggaaggactg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 5
<211> 79
<212> DNA
<213> ap5(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
tagggaattc gtcgacggat ccggatccgg ttatttggac cagcctccgt tccgtgcctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 6
<211> 79
<212> DNA
<213> ap6(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
tagggaattc gtcgacggat ccctgtaggt gagcagaatg atagcgaggt cacgactctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 7
<211> 79
<212> DNA
<213> ap7(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
tagggaattc gtcgacggat ccctgcagtt gtctcgaagc atactcactg tagaccgctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 8
<211> 79
<212> DNA
<213> ap9(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
tagggaattc gtcgacggat cccagtacgc ctttactgca ggtcgacgca tgcgccgctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 9
<211> 79
<212> DNA
<213> ap10(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 9
tagggaattc gtcgacggat ccggatcccc ctgggtttcc tggtgtgagt tacttccctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 10
<211> 79
<212> DNA
<213> ap11(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 10
tagggaattc gtcgacggat cctcgcacca attacctgca ggtcgacgca tgcgccgctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 11
<211> 79
<212> DNA
<213> ap12(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 11
tagggaattc gtcgacggat cctggccgtg cggccagtga cagcttgcat gcctgcactg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 12
<211> 79
<212> DNA
<213> ap13(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 12
tagggaattc gtcgacggat ccgggcgctt acggggcagt gcagcttgca tgcgtgcctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 13
<211> 79
<212> DNA
<213> ap14(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 13
tagggaattc gtcgacggat cctgggggtg cgggcagtgc cagcttgcat gcctgcactg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 14
<211> 79
<212> DNA
<213> ap15(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 14
tagggaattc gtcgacggat ccactgaaga tgaaccgaat aaaccgggtg ggcgaggctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 15
<211> 79
<212> DNA
<213> ap16(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 15
tagggaattc gtcgacggat ccgcaagctc tcccgcaaat tgtgtcggac tgcaggtctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 16
<211> 79
<212> DNA
<213> ap17(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 16
tagggaattc gtcgacggat cccgcgctta cggccagtgc agcttgcatg cctgcagctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 17
<211> 79
<212> DNA
<213> ap18(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 17
tagggaattc gtcgacggat ccctgcagag atcagtatgt acctccggcg aggatcgctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 18
<211> 79
<212> DNA
<213> ap19(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 18
tagggaattc gtcgacggat ccctgcagtt gtcggtccca atgtgcacat ggtgtacctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 19
<211> 79
<212> DNA
<213> ap20(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 19
tagggaattc gtcgacggat ccctgtagcg gcccgagagc gccattaaac gtcgggactg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 20
<211> 79
<212> DNA
<213> ap21(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 20
tagggaattc gtcgacggat ccctgcagag ttagttataa aggcggttgg ggcgggcctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 21
<211> 79
<212> DNA
<213> ap22(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 21
tagggaattc gtcgacggat ccctgcagtc tgaggatgga tggagtgcgt ttttaggctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 22
<211> 79
<212> DNA
<213> ap23(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 22
tagggaattc gtcgacggat ccctgcagaa caagcacgag cgtacgcccc ttgcactctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 23
<211> 79
<212> DNA
<213> ap24(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 23
tagggaattc gtcgacggat ccggatccac tggtactgcg gacgtgtcca tcgccttctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 24
<211> 79
<212> DNA
<213> ap25(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 24
tagggaattc gtcgacggat ccggatccgt gctgataaac actcgccgtt cacggcgctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 25
<211> 79
<212> DNA
<213> ap26(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 25
tagggaattc gtcgacggat ccctgcagcc taattgggat cgcatagttg cgctcacctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 26
<211> 79
<212> DNA
<213> ap27(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 26
tagggaattc gtcgacggat ccctgcaggc accgaacaga tgtacgcgtc aaccgccctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 27
<211> 79
<212> DNA
<213> ap28(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 27
tagggaattc gtcgacggat ccgtggctgc ggcagtgcag cagcttgcat gcctgcactg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 28
<211> 79
<212> DNA
<213> ap29(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 28
tagggaattc gtcgacggat ccctgcagcc taattgggat cgcatagttg cgctcacctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 29
<211> 79
<212> DNA
<213> ap30(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 29
tagggaattc gtcgacggat ccggatccag acgactaaag gacttgcccc agactgcctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 30
<211> 79
<212> DNA
<213> ap31&38(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 30
tagggaattc gtcgacggat ccggatggca gtcaagcacg ggtctccctc gagatagctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 31
<211> 79
<212> DNA
<213> ap32(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 31
tagggaattc gtcgacggat ccctgcagtt tggtagggtg cgagcaacat caggcacctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 32
<211> 79
<212> DNA
<213> ap33(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 32
tagggaattc gtcgacggat ccctgcagtt gagatccacg tcagaactac ccacattctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 33
<211> 79
<212> DNA
<213> ap34(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 33
tagggaattc gtcgacggat ccctgtagtg tttcctgagg catatcggcc agcaaacctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 34
<211> 79
<212> DNA
<213> ap35(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 34
tagggaattc gtcgacggat ccgaggcatc cggggcagtg ccagcttgca tgcctgcctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 35
<211> 79
<212> DNA
<213> ap36(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 35
tagggaattc gtcgacggat cctgtagcgc aaatccggaa agcggacttc ccctgccctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 36
<211> 79
<212> DNA
<213> ap37(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 36
tagggaattc gtcgacggat ccctgcagat ttcccgtatt ggctcttcaa agaacttctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 37
<211> 79
<212> DNA
<213> ap39(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 37
tagggaattc gtcgacggat ccctgcagag tcaacgtgat catggagtcc acatgatctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 正向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 38
tagggaattc gtcgacggat 20
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 反向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 39
cggcgcatgc gtcgacctg 19

Claims (3)

1.特异性识别甲硝唑的ssDNA适配体，其特征在于：具体为ap2、ap19、ap21或ap32所示的序列；具体如下：
ap2：5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGTGCAGAA ATTGCCAAGA GTAGCGGAAG TTGCCAGCTGCAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap19：5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGTT GTCGGTCCCA ATGTGCACAT GGTGTACCTGCAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap21：5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGAG TTAGTTATAA AGGCGGTTGG GGCGGGCCTGCAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
ap32：5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTGCAGTT TGGTAGGGTG CGAGCAACAT CAGGCACCTGCAGGTCGACG CATGCGCCG-3′。
2.根据权利要求1所述特异性识别甲硝唑的ssDNA适配体，其特征在于：其能够被提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基所修饰。
3.权利要求1所述特异性识别甲硝唑的ssDNA适配体的应用，其特征在于：将所述适配体用于甲硝唑检测的组合物、试剂盒或芯片中，其中含有ap2、ap19、ap21或ap32中任一项的适配体。
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