CN112961859B

CN112961859B - 特异性识别金刚烷胺的适配体及其应用

Info

Publication number: CN112961859B
Application number: CN202110150295.0A
Authority: CN
Inventors: 段诺; 吕辰; 王周平; 吴世嘉
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: CN112961859A

Abstract

本发明公开了一种特异性识别金刚烷胺的适配体及其应用。本发明的特异性识别金刚烷胺的适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用文库固定化的指数级富集配体的系统进化技术，以金刚烷胺为靶标，筛选得到1条亲和力高、特异性强的金刚烷胺的适配体序列，且筛选得到的适配体序列灵敏度高、易制备、易修饰，将应用于食品中金刚烷胺兽药残留的快速检测。

Description

特异性识别金刚烷胺的适配体及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种特异性识别金刚烷胺的适配体及其应用。

背景技术

金刚烷胺是母体结构为饱和三环癸胺的氨基衍生物，通常情况下以盐酸盐的形式存在，能够在较低的浓度下抑制甲型流感病毒的复制。长期服用金刚烷胺类抗病毒药物容易导致流感类病毒产生抗药性，且使得流感类病毒变异的可能性增加。对于金刚烷胺类药物代谢的研究表明，金刚烷胺可以以原体的形式在体内富集，而在畜禽动物体内残留的金刚烷胺可通过食物链进入人体，从而对人体健康造成一定的损害。我国农业部于2005年12月禁止对禽畜使用金刚烷胺抗病毒药物，且美国FDA也于2006年禁止在禽类上使用金刚烷胺类化合物。虽有明文禁止，但是仍有小部分商家为了节约成本，而非法向动物饲料中添加此类药物，严重影响了人类健康和畜牧业的发展。

我国目前对金刚烷胺的检测方法多集中在两大类：色谱分析法和酶免疫法。色谱法包括高效液相色谱法、气相色谱法、高效液相串联质谱法、气相色谱串联质谱法等，其中，高效液相色谱串联质谱法是检测金刚烷胺的较常用的分析方法；酶免疫法包括酶联免疫吸附测定法和化学发光免疫分析法。这两类方法虽然常用，但也存在一定的弊端:色谱分析法样品处理繁琐耗时，检测设备昂贵，需要专业的技术人员操作，现场检测中具有局限性；酶免疫法灵敏度和准确度较低，过程繁琐、耗时，成本高，制备出的抗体也易受温度等环境因素的影响。

适配体是可与靶标具有高亲和力，高特异性的核糖核酸(RNA)或单链脱氧核糖核酸 (ssDNA)，一般由几十个核苷酸组成，适配体可与靶标通过非共价键作用相互结合，形成复杂的三维结构从而特异性识别靶标。适配体相对分子质量小、性质稳定，广泛应用于环境检测、生物分析、医疗诊断等。几乎所有的核酸适配体都是通过指数富集配体进化系统(SELEX技术)进行筛选得到，而利用传统的SELEX技术中对于小分子靶标适配体的筛选较少，因其缺少用于化学固定在载体上的基团，或者即使可以将小分子靶标固定，但靶标的天然结构在筛选过程中往往会遭到破坏。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明利用文库固定化的指数级富集配体的系统进化技术(Capture-SELEX技术)，以金刚烷胺为靶标，筛选得到1条亲和力高、特异性强的金刚烷胺的适配体序列，将应用于食品中金刚烷胺兽药残留的快速检测。

本发明的第一个目的是提供了一种特异性识别金刚烷胺的适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述适配体的3’端或5’端修饰有功能基团或分子。

所述功能基团或分子用于提高适配体的稳定性、提供检测信号，或者用于连接适配体与其他物质形成组合物。

进一步地，所述功能基团或分子为荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物、生物素、氨基、亲和配基或巯基。

进一步地，所述的适配体还包括以如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为核心序列，在两边或单边延伸或缩短序列，并与所述的适配体具有相同功能的适配体。

本发明的第二个目的是提供所述的适配体在分离富集或分析检测金刚烷胺中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种用于检测金刚烷胺的组合物，含有所述的适配体。

本发明的第四个目的是提供一种用于检测金刚烷胺的试纸，含有所述的适配体。

本发明的第五个目的是提供一种用于检测金刚烷胺的试剂盒，含有所述的适配体。

本发明的第六个目的是提供一种用于检测金刚烷胺的芯片，含有所述的适配体。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明利用文库固定化的指数级富集配体的系统进化技术，以金刚烷胺为靶标，筛选得到1条亲和力高、特异性强的金刚烷胺的适配体序列，且筛选得到的适配体序列灵敏度高、易制备、易修饰，将应用于食品中金刚烷胺兽药残留的快速检测。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

图1为氨基化磁珠的透射电镜图；

图2为电泳结果验证：A、B:PCR轮数优化，C:15轮大量PCR后结果验证；

图3为金刚烷胺候选适配体二级结构；

图4为候选适配体亲和性；

图5为候选适配体特异性；

图6为金刚烷胺浓度与相对荧光强度的标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：适配体及捕获探针的的合成

由上海生物工程有限公司合成带有随机文库的适配体序列、5’端生物素化捕获探针。

适配体序列(SEQ ID NO.2)：

5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’

生物素化捕获探针(SEQ ID NO.3)：

5’-botin-GACCTCTGTGCTGCT-3’。

实施例2：Fe₃O₄磁性纳米颗粒的制备和包被

2.1氨基化磁珠的制备

采用热熔剂一步法制备氨基化磁珠，过程如下：1、将30mL乙二醇，1g六水合三氯化铁和2g醋酸钠依次加入圆底烧瓶，摇晃均匀后加入6.50g的1,6-己二胺；2、将上述溶液在50℃水浴锅中磁力搅拌至均匀的紫红色胶体溶液；3、将溶液转移至100mL的聚四氟乙烯内衬的高压反应釜里，198℃下加热反应6h；4、待反应釜冷却后，在外加磁场的作用下去除釜内的上清液，向釜内加入100mL无水乙醇搅拌均匀倒至烧杯中；5、磁分离去除上清液，再加入100mL的水进行超声清洗和磁分离。按此做法分别采用无水乙醇和水清洗三次；6、最后将氨基化磁珠置于50℃烘箱中烘干。采用透射电镜和对磁珠进行表征。(图1所示)

2.2亲和素包被磁珠

称取5mg磁珠加入3mL PBS缓冲液中，于70w超声下溶解20min，超声结束磁珠分散均匀后加入200μL，25％戊二醛，在37℃，130rpm摇床中避光反应3h，反应结束后加2mL 的PBS清洗三次，再向体系中加入1.8mL的PBS和200μL亲和素溶液(1mg/mL)，确保亲和素的终浓度为100μg/mL，将混合溶液在37℃，130rpm摇床中避光孵育12h。反应后取上清液利用紫外分光光度法验证亲和素是否成功包被在磁珠上，磁珠在外加磁场的作用下，用PBS缓冲液清洗2次后置于4℃冰箱中备用。

实施例3：金刚烷胺适配体序列的筛选

3.1文库的固定与筛选

采用基于磁分离的Capture-SELEX技术进行循环筛选，步骤如下：每一轮筛选开始前，将文库或次级文库与生物素化的捕获探针按照摩尔比1:2的比例结合，加入一定量的缓冲溶液，95℃变性10min后置于37℃，200rpm孵育器中孵育2h；孵育结束后，加入亲和素化的氨基化磁珠中，置于37℃，200rpm的孵育器中孵育3h，利用生物素与亲和素的特异性结合，将文库或次级文库固定在磁珠上。孵育结束后留上清液，利用紫外分光光度法验证文库的固定程度；用缓冲溶液将固定文库后的磁珠清洗5次，后将靶标金刚烷胺分散在缓冲溶液后加入磁珠，置于37℃，200rpm的孵育器中孵育2h，由于靶标的加入导致文库从磁珠解离至上清液中。利用磁分离收集上清液作为PCR模板。

3.2PCR扩增

反应总体系(50μL)为：正向引物DNA3-1(10μM)0.5μL，反向引物DNA3-2(10μM) 0.5μL，dNTP 1μL，Taq聚合酶0.5μL，10×PCR缓冲液5μL，灭菌超纯水40.5μL，文库模板 2μL。PCR反应条件为：95℃变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环 15轮数后，72℃变性延伸2min。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物，利用Gelred染色 5min后置于凝胶成像仪系统下拍照验证确定PCR特异性地扩增80bp大小的dsDNA，优化最佳PCR轮数后进行大量PCR。(图2所示)

3.3纯化与酶切

利用PCR纯化试剂盒对大量PCR后得到的产物进行纯化。将100μL PCR产物与500μLbinding solution加入吸附柱，放置5min后在4℃，8000rpm条件下离心2min，再将离心后的溶液再次加入吸附柱，放置5min后在4℃，8000rpm条件下离心2min，随后倒掉离心液，向吸附柱中加入500μL 80％的乙醇溶液，4℃，12000rpm条件下离心1min，重复该步骤后将离心液倒掉，4℃，12000rpm条件下离心1min。接着将离心柱放入干净的1.5mL的离心管中，置于50℃烘箱开盖烘干，约10-15min后取出。向烘干后的离心柱加入50μLTE缓冲溶液，放置5min后在4℃，12000rpm条件下离心2min并重复该步骤。最后利用NanoDrop微量紫外可见分光光度计测定纯化后的PCR产物浓度。

向纯化后的PCR产物中加入2μL核酸外切酶和1/10体积的酶切缓冲液，在37℃下进行酶切。利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶切产物，凝胶经Gelred染色后放在Bio-Rad凝胶成像仪中拍照验证dsDNA是否酶切完全。酶切完全后75℃下灭酶10min以终止反应。

向酶切产物中加入1/10体积的NaAC和2倍体积无水乙醇混匀后，置于-20℃冰箱中沉淀过夜。沉淀后的溶液经4℃，14000rpm离心15min去上清后加入200μL 70％乙醇，上下颠倒洗净沉淀，再在4℃，14000rpm离心15min，去上清可见微小的白色固体沉淀，置于50℃孵育器中干燥后加入50μL的TE缓冲液溶解。利用NanoDrop微量紫外可见分光光度计测定纯化后的ssDNA浓度并将其作为下一轮筛选的文库。

3.4克隆测序及序列分析

经过16轮的筛选循环后，金刚烷胺适配体序列得到富集。将16轮筛选得到的PCR产物送上海生工技术有限公司、安徽通用生物系统有限公司进行TA克隆测序。测序得到38条序列，采用MEGA-X软件分析其序列的同源性，并用Mfold在线工具(http://http//unafold.rna.albany.edu/？q＝mfold)对序列的二级结构进行预测。根据候选序列的一、二级结构特征，综合分析结果挑选出4条自由能较低、结构稳定的金刚烷胺候选适配体 Am-5、Am-14、Am-20、Am-23(图3所示)，由苏州金唯智公司合成候选适配体序列，以做进一步的亲和力与特异性分析。

实施例4：亲和力特异性分析

4.1适配体亲和力分析

利用SYBR Green I(SGI)法分析候选适配体的亲和力，步骤如下：用BB缓冲液配制一系列不同浓度梯度(10nM、25nM、50nM、75nM、100nM、200nM、300nM)的金刚烷胺候选适配体溶液，向不同浓度的适配体溶液中加入SGI染料使其终浓度为1×，在95℃条件下共同变性10min。冷却到室温后取不同浓度的适配体-SGI混合溶液各200μL，向混合溶液中加入固定量的金刚烷胺靶标，室温下孵育20min，同时设置以BB缓冲液代替靶标的空白组作为对照。孵育结束后利用多功能酶标仪在激发波长485nm发射波长522nm的条件下，测量空白组(F0)和实验组(F1)的荧光强度。通过Graghpad prism 5.0软件对不同适配体浓度下的相对荧光强度ΔF(ΔF＝F1-F0)进行分析，绘制不同候选适配体的结合饱和曲线并计算其解离常数(如图4所示)。实验设置三次平行重复。

4.2适配体特异性分析

根据亲和力实验结果，挑选与金刚烷胺亲和力较强，即解离常数较小的2条候选适配体 Am-5，Am-20分析其特异性。将浓度为100nM的候选适配体Am-5，Am-20与1×的SGI染料，在95℃条件下共同变性10min，冷却到室温后取7份200μL上述候选适配体-SGI溶液，分别与相同量金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚胺、吗啉双胍、利巴韦林、阿昔洛韦以及空白BB 缓冲液于室温下孵育20min。利用多功能酶标仪在激发波长485nm发射波长522nm的条件下测定荧光强度。通过Graghpad prism 5.0软件对各溶液的相对荧光强度进行分析(如图5所示)。Am-20对金刚烷胺有较高的特异性，因此得到与金刚烷胺有高亲和力和高特异性的适配体Am-20。

实施例5、实际样品检测

利用筛选得到的适配体构建无标记荧光法检测金刚烷胺。将终浓度为1×的SGI染料及终浓度为0.1μM的Am-20适配体溶液混合均匀后，取16只离心管分为两组，A组为加靶标的实验组，B组为加入缓冲液替代靶标的空白对照组。将适配体-SGI混合溶液均匀分装至两组，每管200μL。向实验组适配体-SGI混合体系中加入靶标金刚烷胺配制成一定的浓度梯度 (0,0.005,0.1,1,10,50,75,100ng/mL)，实验组和对照组在室温下孵育10min后，使用多功能酶标仪在激发波长493nm，发射波长525nm条件下测定溶液的荧光强度。最后以靶标金刚烷胺的浓度为横坐标，以空白组与实验组的相对荧光强度为纵坐标绘制标准曲线(如图6所示)。得到的相对荧光强度与金刚烷胺的浓度有良好的线性关系，校正后方程为：y＝50.18x+157.51 (R²＝0.9917)，检测限(3S/N)为0.82ng/mL。

利用构建的方法对动物源食品牛奶进行加标回收实验，对牛奶样品的处理方法如下：将 2mL的牛奶稀释后加入标准品金刚烷胺，并设置以缓冲液替代标准品为空白对照组。随后加入1％的三氯乙酸，涡流混合后超声处理10min。将超声后的混合溶液于14000rpm下离心 10min，离心结束后弃沉淀取上清液，将得到的上清液再次于14000rpm离心10min。离心结束后用0.22μm的滤膜进行对上清液过滤收集。用上述荧光法进行检测，将得到的相对荧光强度带入标准曲线得到检测值并计算回收率(如表1所示)。其回收率在93.80％～103.15％之间，展现该方法较好的实用性。

表1

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江南大学

<120> 特异性识别金刚烷胺的适配体及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

agcagcacag aggtcagatg tttgttaaga tctgtaggcg tccataaaac cagccgttct 60

cctatgcgtg ctaccgtgaa 80

<210> 2

<211> 80

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

agcagcacag aggtcagatg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

cctatgcgtg ctaccgtgaa 80

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

gacctctgtg ctgct 15

Claims

1.一种特异性识别金刚烷胺的适配体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的特异性识别金刚烷胺的适配体，其特征在于，所述适配体的3’端或5’端修饰有功能基团或分子。

3.根据权利要求2所述的特异性识别金刚烷胺的适配体，其特征在于，所述功能基团或分子为荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物、生物素、氨基、亲和配基或巯基。

4.权利要求1~3任一项所述的适配体在分离富集金刚烷胺中的应用。

5.权利要求1~3任一项所述的适配体在分析检测金刚烷胺中的应用。

6.一种用于检测金刚烷胺的组合物，其特征在于，含有权利要求1~3任一项所述的适配体。

7.一种用于检测金刚烷胺的试纸，其特征在于，含有权利要求1~3任一项所述的适配体。

8.一种用于检测金刚烷胺的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1~3任一项所述的适配体。

9.一种用于检测金刚烷胺的芯片，其特征在于，含有权利要求1~3任一项所述的适配体。