CN113186315B - 一种用于检测水稻细菌性条斑病菌的引物对及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测水稻细菌性条斑病菌的引物对及检测方法，属于生物技术领域。所述引物对包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别为：5'‑ATCGAACGATGTCACCAGGG‑3'；5'‑AGAAACGTGCGGCCAGATAA‑3'。本发明通过泛基因组学和比较基因组学分析等方法，获取水稻细菌性条斑病菌的特异性基因片段，并设计用于PCR扩增该基因片段的特异性引物对，该引物对特异性好且灵敏度高。本发明建立了可对水稻细菌性条斑病菌实现高效精准定量的荧光定量PCR检测方法，该方法可应用于市售田间水稻种子的检测，尤其是针对带菌量低的水稻种子样品，检测灵敏度高，检测时间短，具有重要的应用价值。

Description

一种用于检测水稻细菌性条斑病菌的引物对及检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测水稻细菌性条斑病菌的引物对以及检测方法。

背景技术

水稻细菌性条斑病(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)是我国水稻上重要的检疫性病害之一，已成为继稻瘟病、纹枯病以及白叶枯病后我国第四大水稻病害，同时世界上许多国家也将其列为检疫性细菌，并限制从疫区调运种子。该病害最早发现于1918年的菲律宾，目前主要分布在热带和亚热带气候的水稻产区，我国水稻细菌性条斑病主要分布在南方的大部分省区，如云南、广东、广西、贵州、四川、福建、浙江、安徽等。该病害主要危害水稻的叶片，可以导致水稻大幅度减产，一般发病轻的减产10％-20％，严重时减产可达40.16％，给我国水稻产业的健康发展带来严重的威胁。

针对水稻细菌性条斑病的检测方法，主要有经典的产地检验、育苗生长观察法、选择性分离、噬菌体检测、致病性测定血清学检测技术和PCR检测法，这些仍是各国现阶段普遍采用和认可的检测技术，但是传统检测方法费时费力，需要对病原进行分离纯化，往往因为样品带菌少和分离纯化过程复杂等而失败，从而造成漏检及病菌的扩散。血清学检测法主要是依靠ELISA，但由于不同菌株的抗体较难获得，且特异性低，容易发生免疫交叉反应。

近年来，已有多种不同的PCR检测方法应用于水稻细菌性条斑病菌的鉴定，如常规PCR、多重PCR等，但这些方法所用引物特异性低，检测的灵敏度也低，不能有效区分开水稻细菌性条斑病和水稻细菌性白叶枯病这两种处于亚种水平关系的病原，而且普通PCR过程复杂，需要PCR后处理及电泳鉴定，易引起污染和假阳性的发生。

荧光定量PCR技术是在常规PCR基础上发展起来的第2代PCR技术，主要有两种方法，SYBR荧光染料法和Tagman探针法。Taqman探针法的特异性较荧光染料法强，但是Taqman探针价格昂贵。SYBR Green I染料是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料，其与双链DNA结合后荧光信号显著增强，不需要设计探针，通用性较好，并且价格相对较低，国内外在科研、检测中使用比较普遍。

廖晓兰等(2003)基于Taqman探针法建立了同时检测条斑病菌和白叶枯病菌的荧光PCR方法，但是不能有效区分形态结构、生物学特性、病害流行因素等均存在许多相似处的水稻细菌性条斑病和水稻细菌性白叶枯病。韩阳等(2012)基于SYBR Green I建立的检测水稻细菌性条斑病菌的荧光PCR方法所用引物Xoc2071F/Xoc2071R对Xanthomonas oryzaepv.oryzicola的检测特异性低，容易造成检测结果的假阳性。

因此，开发一种能够高效精准检测水稻细菌性条斑病菌的方法是本领域技术人员需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能高效、准确的检测出水稻细菌性条斑病菌的方法，克服现有PCR检测水稻细菌性条斑病菌引物特异性和灵敏度低、检测易出现假阳性或假阴性的缺点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明采用PGAP进行泛基因组学分析，将水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzicola)各菌株的全基因组序列提交至RAST(Rapid Annotation usingSubsystem Technology)原核生物基因组注释网站(http://rast.nmpdr.org/)进行注释，以消除不同注释工具识别编码基因的差异。从运行PGAP得到的Orthologs_Cluster结果中找到Xanthomonas oryzae pv.oryzicola种所有菌株都有但其他菌株没有的特异性标志蛋白，将它们的氨基酸序列在NCBI非冗余蛋白数据库中用默认设置进行在线BLASTP检索，排除在其他科属菌株有同源序列的蛋白，最后将特有蛋白的编码基因的核苷酸序列在Xanthomonas oryzae pv.oryzicola种所有菌株全基因组序列组成的数据库中进行本地BLASTN，以再次确定序列仅在种内有高度同源性，确定GenBanK登录号为AEQ97713.1的蛋白作为Xanthomonas oryzae pv.oryzicola特有蛋白。

针对Xanthomonas oryzae pv.oryzicola特有蛋白设计引物，在NCBI数据库中Blast评估引物对Xanthomonas oryzae pv.oryzicola种各菌株的通用性和特异性。选择通用性和特异性强的引物，对Xanthomonas oryzae pv.oryzicola种各菌株和近缘种进行PCR检测，检验引物的通用性和特异性，确定Xanthomonas oryzae pv.oryzicola的特异引物。

本发明提供了一种用于检测水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)的引物对，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别为：

上游引物：5'-ATCGAACGATGTCACCAGGG-3'；

下游引物：5'-AGAAACGTGCGGCCAGATAA-3'。

利用上述引物可以特异性扩增出水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)特有的目标片段，长度为159bp。

本发明还提供了所述的引物对在检测水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)中的应用。

所述应用为利用DNA引物扩增DNA模板的方法，可以是使用荧光定量PCR进行检测，也可以是利用常规PCR扩增后通过凝胶电泳检测扩增结果或者利用数字PCR方法进行检测，当然也可以是其他由本引物参与的衍生的方法。检测的结果说明待测样品中是否含有特定的DNA片段，检测的对象可以是提取纯化的DNA、细菌菌体、含有细菌或细菌DNA的样品(如植物组织、种子等)。

本发明还提供了所述的引物对在制备用于检测水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)的试剂盒中的应用。

作为优选，所述试剂盒为荧光定量PCR试剂盒。所述试剂盒中除了所述引物对，还包括SYBR Green I染料。

本发明还提供了一种检测水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)以待测样品的DNA作为扩增模板，采用如权利要求1所述的引物对，建立SYBRGreen荧光定量PCR反应体系，进行荧光定量PCR扩增；

(2)根据Ct值和Tm值判定检测结果，若反应曲线呈“S”型，且Ct值≤36、Tm值介于87.5℃-88℃之间，判定待测样品中含有水稻细菌性条斑病菌；若扩增曲线为一条直线，则判定待测样品中不含有水稻细菌性条斑病菌。

步骤(1)中，待测样品为细菌、提取的细菌DNA或含有细菌/细菌DNA的粗提液。

作为优选，以每20μL计，荧光定量PCR反应体系组成为：2×ChamQ SYBR MasterMix 10μL，10μM的上、下游引物各0.4μL，基因组DNA1μL，无菌超纯水8.2μL。

作为优选，荧光定量PCR扩增程序为：1)95℃预变性30s；2)95℃10s、60℃30s，进行40个循环。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明通过泛基因组学和比较基因组学分析等方法，获取水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)的特异性基因片段，并设计用于PCR扩增该基因片段的特异性引物对，本发明的引物与水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、柑橘溃疡病菌(Xanthomonas campestris pv.citri)、水稻细菌性褐条病菌(Acidovoraxoryzae)、水稻细菌性基腐病菌(Dickeya zeae)、水稻细菌性穗枯病菌(Burkholderiaglumae)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)均无交叉反应，具有良好的特异性，灵敏度可达0.25pg/μL。

(2)本发明建立了可对水稻细菌性条斑病菌实现高效精准定量的荧光定量PCR检测方法，该方法可应用于市售田间水稻种子的检测，尤其是针对带菌量低的水稻种子样品，该方法检测灵敏度高，检测时间短，可以提高检测效率，无需病原菌培养、性状分析等复杂操作，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为水稻细菌性条斑病菌荧光定量PCR标准曲线。

图2为水稻细菌性条斑病菌荧光定量PCR灵敏度检测，样品浓度分别为25×10^-1ng/μL、25×10^-2ng/μL、25×10^-3ng/μL、25×10^-4ng/μL、25×10^-5ng/μL和25×10^-6ng/μL的Xanthomonas oryzae pv.oryzicola RS105的基因组DNA。

图3为水稻细菌性条斑病菌荧光定量PCR溶解曲线分析结果。

图4为水稻细菌性条斑病菌人工带菌种子荧光定量PCR灵敏度检测，带菌种子样品的带菌量分别为10⁶个/mL，10⁵个/mL，10⁴个/mL和10³个/mL。

图5为水稻细菌性条斑病菌荧光定量PCR特异性检测，样品1-2为水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、3-11分别为水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae)、十字花科蔬菜黑腐病菌(Xanthomonas campestris)、柑橘溃疡病菌(Xanthomonas campestris pv.citri)、甘蔗白条病菌(Xanthomonas albilineans)以及水稻上的一些常发性细菌病害水稻细菌性褐条病菌(Acidovorax oryzae)、水稻细菌性基腐病菌(Dickeya zeae)、水稻细菌性穗枯病菌(Burkholderia glumae)、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)和无菌去离子水。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明所保护范围不限于此。若无特别说明，下述实施例中采用的实验方法均为常规技术手段，采用的试剂、原材料均为市售商品。

供试菌株：水稻细菌性条斑病菌标准菌株Xanthomonas oryzae pv.oryzicolaRS105、水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae、柑橘溃疡病菌Xanthomonascampestris pv.citri、甘蔗白条病菌Xanthomonas albilineans、水稻细菌性基腐病菌Dickeya zeae由上海出入境检验检疫局赠送；十字花科蔬菜黑腐病菌Xanthomonascampestris购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；水稻上的一些常发性细菌病害如水稻细菌性褐条病菌Acidovorax oryzae购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；水稻细菌性穗枯病菌Burkholderia glumae由本实验自水稻上分离保存；成团泛菌Pantoeaagglomerans由舟山海关综合技术服务中心赠送。

实施例1

引物的设计与合成

根据NCBI基因组数据库中水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)的基因组序列，用PGAP对水稻条斑病菌和其近缘种进行泛基因组学分析，找到Xanthomonas oryzae pv.oryzicola致病变种所有菌株都有但其他近缘种没有的特异性标志蛋白，之后将特有蛋白的编码基因的核苷酸序列在Xanthomonas oryzaepv.oryzicola致病变种所有菌株全基因组序列组成的数据库中进行本地BLASTN，以再次确定序列仅在种内有高度同源性，确定GenBanK登录号为AEQ97713.1的蛋白作为Xanthomonasoryzae pv.oryzicola特有蛋白。

针对Xanthomonas oryzae pv.oryzicola特有蛋白设计引物，在NCBI数据库中Blast评估引物对Xanthomonas oryzae pv.oryzicola种各菌株的通用性和特异性，最终找到了一对针对水稻细菌性条斑病菌特异的引物对，具体如下：

上游引物：5’-ATCGAACGATGTCACCAGGG-3’；

下游引物：5’-AGAAACGTGCGGCCAGATAA-3’。

具体生产引物的公司为杭州擎科生物技术有限公司。

实施例2

水稻细菌性条斑病菌荧光定量PCR检测方法的建立

1)主要实验仪器及试剂

荧光定量PCR仪(Bio-rad CFX96)购自伯乐(美国)公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；荧光定量PCR反应所需的试剂2×ChamQ SYBRMaster Mix购自诺唯赞生物科技(南京)股份有限公司。

2)待测样品的DNA提取

挑取待检测菌株单菌落于5mL NA液体培养基中，220r·min^-1，30℃摇床中震荡培养12h，至浓度为10⁸CFU·mL^-1，离心收集菌体，利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，紫外分光光度计Nanodrop 2000检测提取DNA质量和浓度。-20℃备用。

3)荧光定量PCR扩增体系和方法的建立

扩增反应体系为20μL体系，具体为：2×ChamQ SYBR Master Mix 10.0μL、10μmol/L上下游引物各0.4μL、DNA模板1μL，灭菌双蒸水8.2μL。

扩增程序为：95℃预变性30s；之后95℃10s、60℃30s，进行40个循环。

根据Ct值和Tm值，判定水稻细菌性条斑病菌的检测结果。判定标准为当待测样品SYBR Green荧光定量PCR反应曲线呈“S”型，且Ct值≤36、Tm值介于87.5℃-88℃之间，判定待测样品中含有水稻细菌性条斑病菌；若反应曲线为一条直线，则判定样品中不含有水稻细菌性条斑病菌。

实施例3

水稻细菌性条斑病菌荧光定量PCR标准曲线的建立

按照实施例2的方法提取水稻细菌性条斑病菌标准菌株Xanthomonas oryzaepv.oryzicola RS105的DNA，用紫外分光光度计测定DNA的纯度和浓度，以10倍倍比稀释成标准品，取每个稀释度的DNA作模板进行荧光定量PCR扩增。扩增结束后以起始模板浓度的对数为X轴，Ct值为Y轴绘制回归曲线，建立水稻细菌性条斑病检测的标准曲线。

结果表明，将稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的DNA模板进行荧光PCR检测，扩增曲线呈典型S型，以起始模板浓度的对数为X轴，Ct值为Y轴绘制回归曲线。水稻细菌性条斑病菌检测的标准曲线为y＝-3.924x+45.665，斜率为-3.924，R²＝0.991(图1)。

实施例4

水稻细菌性条斑病菌荧光定量PCR灵敏度检测

将浓度为25ng/μL的Xanthomonas oryzae pv.oryzicola RS1051基因组DNA以10倍系列稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，各取1μL DNA溶液为模板，以灭菌蒸馏水为阴性对照，进行荧光定量PCR扩增。扩增结束后，分析扩增曲线和溶解曲线，以Ct值＝36为检测底限，确定本方法能检测出的最低模板浓度作为水稻细菌性条斑病菌荧光定量PCR检测的灵敏度。

结果表明，在进行水稻细菌性条斑病菌DNA的荧光定量PCR检测时，模板浓度≥0.25pg/μL(25×10^-5ng/μL)时都能顺利检测出水稻细菌性条斑病，扩增曲线呈典型S型(图2)，溶解曲线为单峰，无杂峰出现，Tm值为87.5℃-88℃(图3)。模板浓度＜0.25pg/μL以及阴性对照的扩增曲线为一条直线，均未检测到荧光信号。

实施例5

人工模拟带菌水稻种子荧光定量PCR灵敏度检测

将水稻细菌性条斑病菌RS105在NA培养基上30℃划线培养48小时，待平板上长出单菌落后，挑取单菌落于NA液体培养基中，30℃、220rpm/min条件下过夜震荡培养，利用分光光度计测定菌液OD₆₀₀＝0.8时，菌悬液的浓度为10⁸cfu/mL(连续平板稀释法测定)，用RS105菌悬液浸泡10粒健康水稻种子2h，倒掉菌悬液后，将带菌种子室温风干，用无菌水浸泡研磨，最后将10粒带菌水稻种子研磨液稀释成不同浓度，以无菌水和健康水稻种子的研磨液为对照进行定量PCR检测。

结果表明当水稻细菌性条斑病菌10粒种子带菌量为10⁴个/mL时(图4)，利用荧光定量PCR可以检测到，健康水稻种子和无菌水均为一条直线，表明建立的荧光定量PCR方法可以用于水稻细菌性条斑病菌带菌量低的水稻种子的检测，特异性好，灵敏度高，可以加以推广应用。

实施例6

水稻细菌性条斑病菌荧光定量PCR特异性检测

按照实施例2的方法，对与水稻细菌性条斑病菌亲缘关系近的水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、十字花科蔬菜黑腐病菌(Xanthomonas campestris)、柑橘溃疡病菌(Xanthomonas campestris pv.citri)、甘蔗白条病菌(Xanthomonasalbilineans)以及水稻上的一些常发性细菌病害水稻细菌性褐条病菌(Acidovoraxoryzae)、水稻细菌性基腐病菌(Dickeya zeae)、水稻细菌性穗枯病菌(Burkholderiaglumae)和成团泛菌(Pantoea agglomerans)的DNA进行SYBR Green荧光定量PCR。

结果显示：两株水稻细菌性条斑病菌的DNA反应曲线呈“S”型，Ct值为18～20之间，而其他近缘菌株和水稻上其他常发性病原菌的扩增曲线均曲线为一条直线，为阴性结果(图5)，表明SYBR Green荧光定量PCR的特异性强。

序列表

<110> 上海市农业技术推广服务中心

<120> 一种用于检测水稻细菌性条斑病菌的引物对及检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcgaacgat gtcaccaggg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agaaacgtgc ggccagataa 20

Claims (8)

1.一种用于检测水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)的引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别为：

上游引物：5'-ATCGAACGATGTCACCAGGG-3'；

下游引物：5'-AGAAACGTGCGGCCAGATAA-3'。

2.如权利要求1所述的引物对在检测水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)中的应用。

3.如权利要求1所述的引物对在制备用于检测水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzicola)的试剂盒中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括SYBR Green I染料。

5.一种检测水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以待测样品的DNA作为扩增模板，采用如权利要求1所述的引物对，建立SYBR Green荧光定量PCR反应体系，进行荧光定量PCR扩增；

(2)根据Ct值和Tm值判定检测结果，若反应曲线呈“S”型，且Ct值≤36、Tm值介于87.5℃-88℃之间，则判定待测样品中含有水稻细菌性条斑病菌；若扩增曲线为一条直线，则判定待测样品中不含有水稻细菌性条斑病菌。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，待测样品为细菌、提取的细菌DNA或含有细菌/细菌DNA的粗提液。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，以每20μL计，荧光定量PCR反应体系组成为：2×ChamQ SYBR Master Mix 10μL，10μM的上、下游引物各0.4μL，基因组DNA1μL，无菌超纯水8.2μL。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR扩增程序为：1)95℃预变性30s；2)95℃10s、60℃30s，进行40个循环。

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