CN101693919B - 日本囊对虾线粒体cytb基因片段PCR扩增引物及鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于虾类种群识别领域，提供一对用于鉴别日本囊对虾地理群体的PCR扩增引物，分别具有L10945：5’-TGAGGAGGTTTCGCAGTA-3’或H11563：5’-AGATGAGGGTGAGTGGGT-3’的核苷酸序列；鉴别方法包括(1)利用所述的一对扩增引物对4个地理群体的待测样品的线粒体DNA中细胞色素b基因片段进行PCR扩增；(2)扩增产物纯化后测序，其中，核苷酸序列第528位和第534位碱基为G的待测样品来自福建群体。本发明具有扩增结果稳定、重复性好，鉴别方法简单有效的特点。

Description

日本囊对虾线粒体cytb基因片段PCR扩增引物及鉴别方法

技术领域

本发明涉及一种用于重要虾类种群识别的标记，具体涉及用线粒体DNA分子标记来鉴别日本囊对虾福建群体与其他3个地理群体。

背景技术

日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)属于对虾科，囊对虾属，广泛分布于日本沿海、我国东南沿海及东南亚沿海等海域。在我国对虾养殖品种中，日本囊对虾能适应低溶解氧而具有适宜长途活运的能力，并且经济价值在对虾品种中位于榜首，是我国东南沿海重要的对虾增养殖品种之一，主要分布海域包括浙江、福建、广东及台湾等省份。随着海洋资源的日益枯竭及日本囊对虾近亲繁殖苗种的大量推广，日本囊对虾出现了养殖周期变长，生长速度减慢及抗逆性衰退等问题。水产品种可持续健康发展的最重要的因素是保证苗种的质量，如何对现有的各重要海域的日本囊对虾苗种进行可靠科学的遗传评估，分析其遗传背景及育种潜力就变得非常重要。准确的评价各海域日本囊对虾群体的遗传多样性指标及遗传分化信息，可以为种质资源保护，优良亲本的筛选、家系选育、分子标记辅助育种及增养殖方案的正确制定提供科学理论依据。

根据中国发明专利CN200610031791.X中的内容介绍，目前常用的DNA分子标记技术主要有5种。其中动物线粒体DNA(mtDNA)由于具有绝大多数母系遗传、进化速度快、结构简单等优点，已经广泛应用于研究动物的系统进化、遗传结构调查、种群鉴别以及系谱发生分析。

目前的文献报道主要关注的是对日本囊对虾DNA序列的分析，比如栾生等发表的“日本囊对虾基因组小卫星的特征分析”[J]，水产学报，2007，31(2)：138-143；郑连明等发表的“日本囊对虾线粒体DNA COI基因片段序列分析”[J]，厦门大学学报(自然科学版)，2005，44(6)：821-826。

发明人大量研究的结果表明，日本囊对虾的福建群体具有较高的遗传多样性指数，具有较好的育种潜能，可以利用福建群体的个体进行良种选育，但是从表观上是很难看出群体之间区别的，因此就需要一种稳定可靠的鉴别方法来从育种的亲本中准确地筛选出福建群体的日本囊对虾。

发明内容

本发明针对现有技术缺乏有效筛选日本囊对虾福建群体的不足，从PCR扩增引物角度出发，发明人首先提供一对保守引物；另一个发明目的是提供利用所述的一对保守引物，通过PCR扩增技术来实现对日本囊对虾地理群体的鉴别，进一步可从育种的亲本中准确地筛选出福建群体的日本囊对虾。

为实现本发明的目的，发明人提供以下技术方案：

发明人首先是提供了一对日本囊对虾线粒体cytb基因片段PCR扩增引物，这对引物是根据GenBank数据库中已经公布的日本囊对虾的线粒体基因组全序列设计的，分别具有SEQ No.1或SEQ No.2所示的核苷酸序列：

L10945(SEQ No.1)：5’-TGAGGAGGTTTCGCAGTA-3’、

H11563(SEQ No.2)：5’-AGATGAGGGTGAGTGGGT-3’。

利用上述的一对日本囊对虾线粒体cytb基因片段PCR扩增引物，可实现对日本囊对虾地理群体的鉴别，从而鉴别选出日本囊对虾福建群体。具体来说，所述的日本囊对虾福建群体的鉴别方法包括下述步骤：

(1)利用上述的一对扩增引物对日本囊对虾待测样品的线粒体DNA中细胞色素b基因片段进行PCR扩增；

(2)扩增产物纯化后测序，其中，核苷酸序列第528位和第534位碱基为G的待测样品来自福建群体。

作为优选，本发明所述的鉴别方法中，所述步骤(1)中的日本囊对虾待测样品选自广东群体、台湾群体、浙江群体和福建群体。

作为优选，本发明所述的鉴别方法中，所述步骤(1)中PCR扩增的条件为：94℃预变性4min，94℃变性30sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec；经30个循环后再在72℃延伸7min。

作为优选，本发明所述的鉴别方法中，所述步骤(1)中PCR扩增的反应体系组成为：

0.2ml PCR薄壁管中加入以下组分：10×Buffer 5μL，dNTP各0.2mmol/L，L10945、H11563引物各0.2μmol/L，Taq plus DNA聚合酶2U，DNA模板50-100ng，最后用灭菌的双蒸水补至50μL。

作为优选，本发明所述的鉴别方法中，所述步骤(2)中的扩增产物纯化采用胶回收试剂盒。所述的胶回收试剂盒为本领域通用产品，比如采用OMEGA公司生产的胶回收试剂盒。

作为优选，本发明所述的鉴别方法中，所述步骤(2)中的测序采用自动测序仪进行双向测序。所述的自动测序仪为本领域通用产品，比如采用ABI公司生产的3730型自动测序仪。

作为优选，本发明所述的鉴别方法中，所述步骤(2)中的扩增产物序列经比对剪切后分析长度为552bp。

本发明申请具有以下优点：

本发明具有扩增产物结果稳定、重复性好，鉴别方法简单有效的特点。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。

主要材料、试剂和仪器设备：

实验样本日本囊对虾采集于中国的广东省湛江市、台湾省新竹市、福建省莆田市及浙江省舟山市的沿海海域。

本发明实施例所用的常规药品柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、Na₂-EDTA、NaCl、HCl、NaOH、SDS、苯酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇等购自天根生化科技(北京)有限公司，Taq酶、dNTP、DNA Marker及核酸酶为天根生化科技(北京)有限公司产品，柱式胶回收试剂盒购自OMEGA公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；

本发明实施例所用主要仪器包括：pH计(Mettler Toledo 320PH Meter)、高压灭菌锅、高速冷冻离心机(CENTRIFVGE C 30P，Sigma)、电泳仪、水浴锅、凝胶成像系统(Bio-Rad GD2000)、PCR仪(Bio-Rad Mycycler)、自动测序仪(ABI 3730型)。

实施例1

1、设计合成具有SEQ No.1或SEQ No.2所示的序列的一对保守引物：

L10945(SEQ No.1)：5’-TGAGGAGGTTTCGCAGTA-3’；

H11563(SEQ No.2)：5’-AGATGAGGGTGAGTGGGT-3’，

由上海生工生物工程技术服务有限公司根据发明人要求合成。

2、按下述步骤来鉴别日本囊对虾福建群体与其他3个群体的方法为：

(1)、选用日本囊对虾福建群体5个样本、浙江群体5个样本、广东群体4个样本和台湾群体5个样本，采用常规的酚-氯仿抽提法提取DNA后，对日本囊对虾4个群体各4-5个个体的线粒体DNA-cytb基因片段进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性30sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec，经30个循环后再在72℃延伸7min；其中采用的PCR反应体系组成为：0.2ml PCR薄壁管中加入以下组分：10×Buffer 5μL，dNTP各0.2m mol/L，L 10945、H 11563引物各0.2μmol/L，Taq plus DNA聚合酶2U，DNA模板50ng，最后用灭菌的双蒸水补至50μL；

(2)、扩增产物利用OMEGA公司胶回收试剂盒纯化后，利用ABI 3730型自动测序仪进行双向测序。扩增产物序列经比对剪切后分析长度为552bp。

序列比对后获得以下结果：

1          11         21         31         41         51         61

GD-1 TTTCTGTTCC CATTCATTGT AGCAGCAGCT ACAATTATTC ACATTCTTTT TATTCACCAA ACAGGTTCTA

GD-2 .......... .......... .......... .....C.... .......... .......... ..........

GD-3 .....A.... .......... .......... .....C.... .......... .......... ..........

GD-4 .......... .......... .......... .....C.... .......... .......... ..........

TW-1 .......... .......... .......... .....C.... .......... .......... ..........

TW-2 .......... .......... .......... .....C.... .......... .......... ..........

TW-3 .......... .......... .......... .....C.... .......... .......... ..........

TW-4 .......... .......... .......... .....C.... .......... .......... ..........

TW-5 .......... .......... .......... .....C.... .......... .......... ..........

ZJ-1 .......... .......... ......G... .....C.... .......... .......... ..........

ZJ-2 .......... .......... .......... .....C.... .......... .......... ..........

ZJ-3 .......... .......... .......... .....C.... .......... .......... ..........

ZJ-4 .......... .......... .......... .....C.... .......... .......... ..........

ZJ-5 .......... .......... .......... .....C.... .......... .......... ..........

FJ-1 .......... .......... .......... .....C.... .......... .......... ..........

FJ-2 .........G .......... .......... .....C.... .......... .......... ..........

FJ-3 .........G .......... .......... .....C.... .......... .......... ..........

FJ-4 .......... .......... .......... .....C.... .......... .......... ..........

FJ-5 .....A.... .......... .......... .....C.... .......... .......... ..........

71         81         91         101        111        121        131

GD-1 ACAATCCCCT AGGAATCGTT AGAAATGTAG ATAAAGTACC ATTCCATCCT TATTTTACAT TCAAAGACAT

GD-2 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

GD-3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

GD-4 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TW-1 .......... ...G...... .......... .......... .......... .......... ..........

TW-2 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TW-3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TW-4 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TW-5 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

ZJ-1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

ZJ-2 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

ZJ-3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

ZJ-4 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

ZJ-5 .......... G......... .......... .......... .......... .......... ..........

FJ-1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

FJ-2 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

FJ-3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

FJ-4 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

FJ-5 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

141        151        161        171        181        191        201

GD-1 CACCGGATTT ATCGTAATAC TAACTGCCCT TATTTTATTG ACTTTACTAA ACCCTTATCT TTTAGGAGAC

GD-2 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

GD-3 .......... ........G. .......... .........A .......... .......... .........T

GD-4 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

TW-1 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

TW-2 .......... ........G. .......... .........A .......... .......... ..........

TW-3 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

TW-4 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

TW-5 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

ZJ-1 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

ZJ-2 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

ZJ-3 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

ZJ-4 .......... .......... .......... .........A .......... ........A. ..........

ZJ-5 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

FJ-1 .......... .......... .......... .........A .......... ........A. ..........

FJ-2 .......... .......... .......... .........A .......... ........A. ..........

FJ-3 .......... .......... .......... .........A .......... ........A. ..........

FJ-4 .......... .......... .......... .........A .......... ........A. ..........

FJ-5 .......... ........G. .......... .........A .......... ........A. ...G......

211        221        231        241        251        261        271

GD-1 CCAGACAATT TTATTCCCGC TAACCCTTTA GTTACCCCGG CCCATATCCG GCCCGAATGG TATTTTTTAT

GD-2 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

GD-3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

GD-4 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

TW-1 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

TW-2 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

TW-3 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

TW-4 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

TW-5 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

ZJ-1 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

ZJ-2 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

ZJ-3 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

ZJ-4 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

ZJ-5 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ..........

FJ-1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

FJ-2 .......... .......... .......... C......... .......... .......... ..........

FJ-3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

FJ-4 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

FJ-5 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

281        291        301        311        321        331        341

GD-1 TTGCATATGC CATCTTGCGA TCTATTCCTA ATAAGTTAGG GGGAGTAATT GCCTTGGTTA TATCTATCTT

GD-2 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

GD-3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

GD-4 .......... ......A... .......... .......G.. .......... .......... ..........

TW-1 .......... .......... .......... .......... .......... .....A.... ..........

TW-2 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TW-3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TW-4 .......... ......A... .......... .......... .......... .......... ..........

TW-5 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

ZJ-1 .......... .......... .......... .C........ .......... .......... ..........

ZJ-2 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

ZJ-3 .......... .......... .......... .......... .......... .....A.... ..........

ZJ-4 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

ZJ-5 .......... ......A... .......... .......... .......... .......... ..........

FJ-1 .......... .......... .......... .......G.. .......... .......... ..........

FJ-2 .......... .......... .......... .......G.. .......... .......... ..........

FJ-3 .......... .......... .......... .......G.. .......... .......... ..........

FJ-4 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......T..

FJ-5 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .G........

351        361        371        381        391        401        411

GD-1 GATTCTTCTC ATCTTACCTT TTACGCATGC AGCTAAATTT CGGAGCCTTA CATTTTACCC TCTTAACCAG

GD-2 .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... ..........

GD-3 .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... ..........

GD-4 .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... ..........

TW-1 .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... ..........

TW-2 .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... ..........

TW-3 .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... ..........

TW-4 .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... ..........

TW-5 .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... ..........

ZJ-1 .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... ..........

ZJ-2 .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... ..........

ZJ-3 .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... ..........

ZJ-4 .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... ..........

ZJ-5 .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... ..........

FJ-1 .......... .......... ....A..... .......... .........G .......... ..........

FJ-2 .......... .......... ....A..... .......... .........G .......... ..........

FJ-3 .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... ..........

FJ-4 .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... .........

FJ-5 .......... .......... ....A..... .......... .......... .......... ..........

421        431        441        451        461        471        481

GD-1 ACCATATTCT GATCTTTAGT AAGTATTGTA TTCCTACTTA CATGAATTGG AGCTCGCCCT GTTGAAGATC

GD-2 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

GD-3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

GD-4 .......... .......G.. .......... .......... .......... .......... ..........

TW-1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TW-2 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TW-3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TW-4 .......... .......G.. .......... .......... .......... .......... ..........

TW-5 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

ZJ-1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

ZJ-2 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

ZJ-3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

ZJ-4 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

ZJ-5 .......... .......G.. .......... .......... .......... .......... ..........

FJ-1 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

FJ-2 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....GC...

FJ-3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....GC...

FJ-4 .......... .......... .......... .......... .......... ......G... ..........

FJ-5 .......... .......... .......... .......... ......G... ......G... ......C...

491        501        511        521        531        541        551

GD-1 CTTATGTGAT TACAGGACAA ATCCTAACCG TGCTTTATTT CTCATATTAC ATTATTAACC CA

GD-2 .......T.. .......... .......... .......... .......... .......... ..........

GD-3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

GD-4 .......T.. .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TW-1 .......T.. .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TW-2 .......T.. .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TW-3 .......T.. .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TW-4 .......T.. .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TW-5 .......T.. .......... .......... .......... .......... .......... ..........

ZJ-1 .......T.. .......... .......... .......... .......... .......... ..........

ZJ-2 .......T.. .......... .......... .....G.... .......... .......... ..........

ZJ-3 .......T.. .......... .......... .....G.... ..T....... .......... ..........

ZJ-4 .......T.. .......... .......... .......... .......... .......... ..........

ZJ-5 .......T.. .......... .......... .......... .......... .......... ..........

FJ-1 .......T.. .......... .......... .......G.. ...G...... .......... ..........

FJ-2 .......... .......... .......... .......G.. ..TG...... .......... ..........

FJ-3 .......... .......... .......... .......G.. ..TG...... .......... ..........

FJ-4 .......... .......... .......... .......G.. ...G...... .......... ..........

FJ-5 .......... .......... .....G.... .......G.. ...G...... .......... ..........

▲     ▲

其中“.”表示与GD-1个体相同的碱基位点，GD：日本囊对虾广东群体的样本，TW：日本囊对虾台湾群体的样本，ZJ：日本囊对虾浙江群体的样本，FJ：日本囊对虾福建群体的样本；“▲”表示福建群体所特有的碱基变异位点。

对比序列结果可以看出，日本囊对虾4个群体共19个个体在552bp的线粒体cytb基因片段中存在一些变异位点，一些转换和颠换位点在4个群体中均有发生，还有一些变异位点仅仅出现在个别个体中。但是福建群体的日本囊对虾在两个位点的碱基与其他3个群体的样本完全不同，具体表现为：福建群体在528位点T颠换成G，福建群体在534位A转换为G。以上2个位点的差异可以作为鉴别福建群体日本囊对虾和其他3个群体的分子标记。即核苷酸序列第528位和第534位的碱基为G的待测样品来自福建群体。

实施例2

本实施例步骤2中DNA模板100ng，其他操作同实施例1。核苷酸序列结果显示，在552bp的线粒体cytb基因片段中，福建群体的日本囊对虾在528位点T颠换成G，福建群体在534位A转换为G。以上2个位点的差异可以作为鉴别福建群体日本囊对虾和其他3个群体的分子标记。即核苷酸序列第528位和第534位的碱基为G的待测样品来自福建群体。

实施例1-2测序结果表明，日本囊对虾的4个群体的扩增结果大小一致，结果稳定，可重复性好。

尽管发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域一个熟练的技术人员来说，对上述实施例作出修改和/或变通或者采用等同的替代方案是显然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不能构成对本发明的限制。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江海洋学院

<120>日本囊对虾线粒体cytb基因片段PCR扩增引物及鉴别方法

<130>Z091917

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tgaggaggtt tcgcagta                                18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

agatgagggt gagtgggt                                18

Claims (8)

1.日本囊对虾线粒体cytb基因片段PCR扩增引物，其特征在于，所述扩增引物为一对，分别为SEQ No.1或SEQ No.2所示的核苷酸序列。

2.日本囊对虾福建群体的鉴别方法，其特征在于，所述方法步骤如下：

(1)利用权利要求1所述的一对扩增引物对待测样品的线粒体DNA中细胞色素b基因片段进行PCR扩增；

(2)扩增产物纯化后测序，其中，核苷酸序列第528位和第534位碱基为G的待测样品来自福建群体。

3.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(1)中的待测样品选自广东群体、台湾群体、浙江群体和福建群体。

4.根据权利要求2或3所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(1)中PCR扩增的条件为：94℃预变性4min，94℃变性30sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec；经30个循环后再在72℃延伸7min。

5.根据权利要求2或3所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(1)中PCR扩增的反应体系组成为：0.2ml PCR薄壁管中加入以下组分：10×Buffer 5μL，dNTP各0.2mmol/L，一对扩增引物各0.2μmol/L，Taq plus DNA聚合酶2U，DNA模板50-100ng，最后用灭菌的双蒸水补至50μL。

6.根据权利要求2或3所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(2)中的扩增产物纯化采用胶回收试剂盒。

7.根据权利要求2或3所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(2)中的测序采用自动测序仪进行双向测序。

8.根据权利要求2或3所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(2)中的扩增产物序列经比对剪切后分析长度为552bp。