CN108384851A - 检测多粘菌素耐药基因的多重pcr引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明一方面提供一种检测多粘菌素耐药基因的多重PCR引物，由以下五个引物对组成：SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物对，SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物对，SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的引物对，SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的引物对，以及SEQ ID No:9和SEQ ID No:10所示的引物对。本发明还提一种检测多粘菌素耐药基因的检测试剂盒及检测方法。本发明通过在mcr‑1、mcr‑2、mcr‑3、mcr‑4、mcr‑5的基因序列基础上进行引物设计，利用不同PCR产物的大小对相应的耐药基因加以区分。对反应体系及条件加以优化之后，最终确定了一套较为完善的多重PCR反应体系。本发明为同时检测多粘菌素耐药基因—mcr基因家族提供了一套快速、有效的检测方法，本检测方法具有较高的灵敏度和特异性。

Description

检测多粘菌素耐药基因的多重PCR引物、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测多粘菌素耐药基因的多重PCR引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

多粘菌素是一种在临床治疗中使用时间较长的抗生素，其最早于1947年被分离提取，随后进入临床使用。但由于多粘菌素的神经毒性和肾毒性的存在，所以其在临床当中的使用逐渐减少。近年来，随着多重耐药的革兰氏阴性细菌的逐渐增多，多粘菌素被认为是对抗多重耐药革兰氏阴性细菌的“最后一道防线”。

在2016年，中国科学家率先报道了可通过质粒在细菌间水平转移的多粘菌素耐药基因mcr-1，这一发现引起了公共卫生领域的广泛关注，同时也对多粘菌素这个“最后一道防线”构成了巨大的威胁。mcr-1是一种位于质粒或者染色体上编码磷酸乙醇胺转移酶的基因，其可通过编码磷酸乙醇胺转移酶，对革兰氏阴性细菌的细胞膜上的lipid A进行磷酸乙醇胺修饰，进而降低多粘菌素与细胞膜的亲和力产生耐药性。在近几年，在全球超过四十个国家和地区的牲畜和人体当中都检测出了mcr-1基因。与此同时，mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5等mcr基因家族的其他基因也陆续被报道出来。传统PCR检测方法往往只能检测mcr-1这一种抗性基因，无法同时对多个耐药基因进行检测，且过程较为繁琐，因此亟需建立一套快速、有效的针对整个mcr基因家族的检测方法。

发明内容

针对现有的检测方法只能检测mcr-1这一种抗性基因的上述问题，本发明提供一种检测多粘菌素耐药基因的多重PCR引物、试剂盒及检测方法，能够对mcr相关抗性基因进行较为全面的检测，大大节省时间、试剂和费用，并且具有较高的灵敏度及特异性。

本发明一方面提供一种检测多粘菌素耐药基因的多重PCR引物，由以下五个引物对组成：SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物对、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物对、SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的引物对、SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的引物对以及SEQ ID No:9和SEQ ID No:10所示的引物对。

本发明另一方面提一种检测多粘菌素耐药基因的检测试剂盒，所述检测试剂盒中包含权利要求1所述的五个引物对。

本发明还提供一种检测多粘菌素耐药基因的多重PCR检测方法，包括以下步骤

(1)配置多重PCR反应体系：1μL待测菌液或50ng左右的质粒DNA为模板，权利要求1所述的五个引物对，每条引物均为3μmol/L，80％甘油1.5μL，2×Taq MasterMix 12.5μL，最后加水补足体积为25μL；

(2)进行PCR扩增，多重PCR反应程序：预变性94℃2min；变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃1min共25个循环；终延伸72℃2min；

(3)对多重PCR产物进行凝胶电泳检测

本发明通过在mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5的基因序列基础上进行引物设计，利用不同PCR产物的大小对相应的耐药基因加以区分。对反应体系及条件加以优化之后，最终确定了一套较为完善的多重PCR反应体系。

本发明对构建的含mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5基因的pBAD2质粒进行多重PCR检测，其检测结果与质粒携带的基因情况相符。同时对于已经保存的mcr阳性及阴性菌株进行检测，结果也与之前的鉴定结果保持一致，这也进一步证明本发明的方法具有较高的灵敏度及特异性。

本发明为同时检测多粘菌素耐药基因—mcr基因家族提供了一套快速、有效的检测方法，本检测方法具有较高的灵敏度和特异性。

附图说明

图1为实施例1单重PCR扩增电泳结果；

图2为实施例2多重PCR引物间特异性检测电泳结果；

图3为实施例3不同来源野生型菌株的多重PCR检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

以下实施例用的材料如下：

(1)菌株与质粒

构建在pBAD24质粒上的mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5的大肠杆菌MG1655、检测所用的野生型型菌株均由申请人保存。

(2)主要试剂

LB培养基、氨苄西林抗生素；DNA分子标准量Marker购自宝日医生物技术有限公司；2×Taq MasterMix(Dye)购自康为世纪生物科技有限公司；TAE缓冲液；琼脂糖、GelRed染料购自上海拜力生物科技有限公司；质粒抽提试剂盒购自生工生物技术有限公司。

(3)主要仪器：摇床、37℃恒温培养箱、凝胶电泳仪、凝胶成像仪、PCR仪。

实施例1多重PCR检测方法

(一)引物设计

根据已报道的文献，在NCBI当中获取mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5的DNA序列作为目的基因。使用primer premier 5.0软件在不同目的基因上进行不同PCR产物长度的引物设计，以保证最终能够清楚的区分出不同的耐药基因。随后利用Vector NTI软件，对设计完成的引物的特异性以及与目的基因的同源性进行比较分析，使每条引物与目的基因的同源性为100％，且与其他基因的同源性保持较低，保证引物在目的基因内通用，而在基因间特异，最终确定5对鉴定引物序列(见表1)，引物由杭州擎科生物科技有限公司合成。

表1实验中所用的鉴定引物

(二)DNA模板制备

分别从mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5的大肠杆菌MG1655培养基平板上挑取单个菌落，接种于2ml含100μg/mL的LB液体培养基中，在37℃的条件下220rpm摇培16h，离心收菌，随后使用质粒抽提试剂盒对含mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5的pBAD24质粒进行提取，作为PCR检测模板。

(三)多重PCR反应体系及程序

以质粒DNA以及待测菌株为模板，利用表1中设计的特异性引物进行PCR扩增。经过条件优化之后，最终确定合适的多重PCR反应体系及反应条件。多重PCR反应体系：1μL待测菌液或50ng左右的质粒DNA为模板，引物mcr-1-F、mcr-1-R、mcr-2-F、mcr-2-R、mcr-3-F、mcr-3-R、mcr-4-F、mcr-4-R、mcr-5-F、mcr-5-R各3μmol/L，80％甘油1.5μL，2×TaqMasterMix 12.5μL，最后加水补足体积为25μL。

多重PCR反应程序：预变性94℃2min；变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃1min共25个循环；终延伸72℃2min。多重PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

(四)PCR产物测序

对分别以5个含耐药基因质粒为模板的PCR产物进行DNA测序，测序工作由杭州擎科生物科技有限公司完成。

结果见图1，凝胶成像结果显示，各个条带清晰且单一。同时对其PCR产物进行测序，获得测序结果后，以其结果在NCBI中进行BLAST比对，测序片段与数据库中相应的基因的片段同源性为：mcr-1(907/908)99.8％、mcr-2(378/379)99.7％，mcr-3(463/465)99.5％，mcr-4(217/219)99.0％，mcr-5(686/686)100％。针对比对结果进行分析可以发现引物序列与目的基因片段具有高度的同源性。这一结果说明各对引物具有很强的特异性以及相对目的基因的保守性。

实施例2引物间特异性检测

对含mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5基因的大肠杆菌MG1655进行单重、双重、三重、四重及五重的菌株组合，然后对所有的菌株组合进行多重PCR扩增，通过观察电泳结果，对引物间的特异性进行验证。

通过对琼脂糖凝胶电泳结果(如图2所示)观察，各个目的基因条带都较为清晰，且均无非特异性条带，这说明本试验中所建立的多重PCR体系对不同菌株组合都显示出很好的特异性和灵敏度，初步确定这一反应体系可以有效的对mcr基因家族的基因进行筛选。

实施例3野生菌株的检测鉴定

利用已经经过检测的mcr阴性及阳性菌株(菌株信息见表2，由申请人保存)作为模板利用多重PCR对其进行鉴定，与采用常规方法针对这些野生型菌株获得的检测结果进行对比，以确定多重PCR反应体系是否适用于不同来源的野生型菌株的检测。

表2野生型菌株信息

在所有的156株待测菌株当中，共有检出77株具有mcr耐药基因(结果如图3所示)，且所有耐药基因阳性菌株相对应的耐药基因片段大小正确，条带单一，这一统计结果与采用传统方法针对这些菌株的鉴定检测结果相一致，且针对存在差异的不同菌株间都表现出很高的适用性。这一统计结果证明本发明所建立的多重PCR检测方法能够为微生物中的多粘菌素耐药基因的检测提供快速准确的技术支持，由此建立了一套针对mcr基因家族的高效检测方法。

序列表

<110> 青岛智烨生物科技有限公司

<120> 检测多粘菌素耐药基因的多重PCR引物、试剂盒及检测方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcgccgatt gggcttgatc gtggc 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcataggca ttgctgtgcg tctgc 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgatggcgg tctatcctgt atcgg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggctgacacc ccatgtcatc gcacg 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttgcacttct tatcgcactt agtgc 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgggcttact ttgattagta tcccg 25

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tctcagtgaa gtggtgaata aattaaaa 28

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcaacacaag tcatgttcaa ctgatta 27

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cttgaaaatg cgcccgcaag tgcgc 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cggcggcctt gttcttgagg ccctc 25

Claims (3)

1.一种检测多粘菌素耐药基因的多重PCR引物，其特征在于，由以下五个引物对组成：SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物对、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物对、SEQID No:5和SEQ ID No:6所示的引物对、SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的引物对以及SEQID No:9和SEQ ID No:10所示的引物对。

2.一种检测多粘菌素耐药基因的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包含权利要求1所述的五个引物对。

3.一种检测多粘菌素耐药基因的多重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配置多重PCR反应体系：1μL待测菌液或50ng左右的质粒DNA为模板，权利要求1所述的五个引物对，每条引物均为3μmol/L，80％甘油1.5μL，2×Taq MasterMix 12.5μL，最后加水补足体积为25μL；

(2)进行PCR扩增，多重PCR反应程序：预变性94℃2min；变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃1min共25个循环；终延伸72℃2min；

(3)对多重PCR产物进行凝胶电泳检测。