CN101948919B

CN101948919B - 一种用于大熊猫亲子鉴定的试剂盒

Info

Publication number: CN101948919B
Application number: CN2010102771320A
Authority: CN
Inventors: 沈富军; 张志和; 侯蓉; 杨建东; 张亮; 张文平
Original assignee: CHENGDU RESEARCH BASE OF GIANT PANDA BREEDING
Current assignee: CHENGDU RESEARCH BASE OF GIANT PANDA BREEDING
Priority date: 2010-09-09
Filing date: 2010-09-09
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2030-09-09
Also published as: CN101948919A

Abstract

本发明公开了一种用于大熊猫亲子鉴定的试剂盒，采用微卫星研究得到的大熊猫11个STR基因座的68个等位基因作为分型标准物，并且优选了STR基因座的PCR过程中的退火温度和镁离子浓度参数，分型标准物与各基因座的等位基因之间存在明确的一一对应关系，可以非常准确地进行微卫星分型。本发明所述的试剂盒可以准确地对圈养大熊猫种群进行亲子鉴定和遗传监测，完善系谱，整顿血缘，为今后大熊猫的分子进化、野外大熊猫的群体迁移、行为生态等方面的研究提供非常有用的分子标记，对于珍稀物种的保种、育种计划的制定和实施，具有非常重要的理论和现实意义。

Description

一种用于大熊猫亲子鉴定的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因鉴定试剂盒，特别是一种用于大熊猫亲子鉴定的试剂盒。

背景技术

大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)种群的小规模、再分配，以及非自然选择的危险，可能导致遗传变异的损失，现有的“多雄配一雌”的交配方式也会带来诸如亲子关系混乱、近亲繁殖等问题。应用遗传标记对大熊猫进行亲缘关系鉴定、遗传评估和监测已成为大熊猫保护生物学研究的重要课题。

微卫星(microsatellite)被认为是确定人和动物间相互关系以及群体遗传学研究的最有效的新型遗传标记，其中重复单位仅由2-7bp组成，又称为短串联重复序列(Short Tandem Repeat，STR)。目前用于大熊猫亲子鉴定的微卫星标记主要有：张亚平等(1996)开发的8个gp系列引物；LüZhi等(2001)开发的18个Ame系列引物。本实验室与英国利物浦大学合作，采用Dynal磁珠富集技术，曾获得20个CD系列引物(沈富军等，2005)。这些研究为大熊猫的亲子鉴定和谱系管理奠定了坚实的基础。但是，上述微卫星标记没有经过系统的群体遗传学检测和评估，质量参差不齐：许多微卫星标记具有较高的突变率，还容易出现多重扩增、假扩增、零扩增等现象，给基因分型带来种种困难。

为了提高亲子鉴定的准确性，国际法庭遗传学会(International Society forForensic Genetics，ISFG)DNA委员会要求：微卫星分型必须要将清晰的等位基因Ladder(梯度标准物)作为参照标准。由于等位基因Ladder制备依赖于数据库的规模和质量，因此，欧美法庭已经指定了一些他们认可的人类的等位基因数据库(如CODIS，Combined DNA Index System等)，并授权一些生物公司制备专门的等位基因Ladder(商业化试剂盒)来执行这些标准。在动物方面，狗、猫、牛、羊、猪以及马等宠物和家畜的商业化试剂盒也已经研制出来了(http://www.AppliedBiosystems.com)。但是，这些试剂盒却没有制备相应的等位基因分型标准物，而是使用传统的ROX-350或ROX-500来做基因分型。由于这些标准物尺度较大，不同批次、不同系统(如仪器差异、人员更换)的分型产物都非常容易出现系统误差。因此，这些试剂盒仍处于试用阶段，并不能真正用于诊断。并且，在野生动物方面，目前还没有研制微卫星亲子鉴定试剂盒的报道。

发明内容

本发明的主要目的是针对上述现有技术中动物用亲子鉴定试剂盒不足以及对于大熊猫亲子鉴定的需求，提供一种用于大熊猫亲子鉴定的试剂盒：具有稳定的可作为分型标准物的等位基因，并且优化了PCR参数，这些分型标准物与各基因座的等位基因之间存在明确的一一对应关系，可以非常准确地进行微卫星分型。等位基因的命名按照ISFG等位基因命名法则进行甄别和命名的，也为形成学术规范、易化各单位间的交流奠定了基础。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于大熊猫亲子鉴定的试剂盒，主要由至少一组分型标准物、引物、PCR反应各组分、阳性对照DNA和容器组成，所述的分型标准物包含序列表所列的大熊猫11个STR基因座的68个等位基因。

68个等位基因的命名是按照ISFG等位基因命名法则进行的。

从2001年到2009年，发明人用前期研究(《Dynal磁珠富集大熊猫微卫星标记》，遗传学报，2005.5)(《Microsatellite variability reveals the necessity forgenetic input from wild giant pandas(Ailuropoda melanoleuca)into thecaptive population》，Molecular Ecology，2009(18)，1061-1070)(《Di-，tri-andtetranucleotide microsatellite loci for the giant panda(Ailuropodamelanoleuca)》，Molecular Ecology Notes2007(7)，1268-1270)得到的47个大熊猫微卫星标记多次进行了大熊猫亲子鉴定和种群遗传分析，获得大量数据。对这些数据进行整理、合并、筛选和重复实验，建立了个体数达110只的大熊猫微卫星数据库。

为了确保鉴定结果的准确性，试剂盒标记的选择应非常谨慎。首先要满足扩增稳定、多态信息含量高的要求，其次还要作种群遗传分析。因为在不同的群体中，等位基因的频率分布极具变化性，一些标记在某个群体中具有较高的多态性，但在另一个群体中(尤其是在封闭的小群体中)却有可能仅仅出现单一的表型。所以，微卫星标记必须要经反复的验证才能使用。

本发明在对Dynal磁珠富集大熊猫微卫星标记的数据进行标准化的过程中，获得了11个具有高度稳定性的微卫星标记，对这11个大熊猫微卫星标记的一级结构进行细致研究，获得各基因座等位基因单倍型产物82个。按照ISFG等位基因命名法则对这些等位基因进行甄别和命名，并制备成相应的质粒68个，等位基因命名、序列长度以及核心序列结构见表1(具体序列结构见序列表)：

表1大熊猫等位基因命名及其片段大小

制备成相应的68个质粒后，用ROX荧光标记的引物对这些质粒做PCR扩增，11个STR基因座的PCR过程中的引物为表2中的引物b：

表2大熊猫微卫星引物

PCR过程中退火温度和Mg²⁺离子浓度优选如下表3：

表3优化后的11个基因座退火温度和镁离子浓度

在PCR的过程中，退火温度对特异性有较大影响。退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

Mg²⁺离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则会降低聚合酶的活性，使反应产物减少，影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

发明人在长期的研究中得到优选的退火温度和Mg²⁺离子浓度，确保了PCR扩增的效率和特异性。

将PCR扩增所得产物均匀混合，制备成等位基因Ladder。最后以这些等位基因为分型标准物，用于大熊猫的个体识别、亲子鉴定和遗传多样性研究。以真实的等位基因为分型标准物，消除系统误差后，这些分型标准物与各基因座的等位基因之间存在明确的一一对应关系。

本发明所述的试剂盒，可以非常准确地对大熊猫进行微卫星分型，并最终获得准确的大熊猫亲子鉴定结果。

通过个体识别及亲子鉴定效率对本试剂盒进行评价：

个体识别效率

“识别几率P_(ID)”。即随机从一个群体中抽选出来的两个个体具有相同微卫星基因型的概率。根据一个群体样本中各个基因座的等位基因频率计算而来。具体计算式：

P_(ID)＝∑pi⁴+∑∑(2pipj)²

pi和pj分别代表第i和第j个位点的等位基因频率，而且i≠j(Paetkau&Strobeck 1994)。

本发明中11个基因座联合的个体识别非排除概率为1.64E-9，同胞识别的非排除概率为0.0002373。

亲子鉴定效率

父亲鉴定的排除概率计算分两种情况：

情况一：所有可疑个体的基因型都已经列出，而且母-子关系是确定的。在此情况下，每一个微卫星基因座的排除概率Ex按照Jamieson(1965，1997)的算法计算：

E_x＝∑P_i(1-P_i)²-∑(P_iP_j)²[4-3(P_i+P_j)]

情况二：所有可疑个体的基因型都已列出，但母-子关系不清楚。在此情况下，每一个基因座父亲鉴定的排除概率Ex按照Garber和Morris(1983)的算法计算：

E_x＝∑P_i ²(1-P_i)²+∑2(P_iP_j)(1-P_i-P_j)²

多个基因座的联合排除概率E计算按照Jamieson&Taylor(1997)的算法：

E＝1-(1-E_x1)(1-E_x2)(1-E_x3)...(1-E_xi)

本发明中11个基因座联合的单亲非排除概率为0.03142182、双亲非排除概率为0.00181567、父母对的非排除概率为0.00002322。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明所述的试剂盒使用了大熊猫真实的等位基因作为分型标准物，并且优化了鉴定过程中的某些参数，可以更加准确地对圈养大熊猫种群进行亲子鉴定和遗传监测，完善系谱，整顿血缘，还可以为今后大熊猫的分子进化、野外大熊猫的群体迁移、行为生态等方面的研究提供非常有用的分子标记。这对于珍稀物种的保种、育种计划的制定和实施，具有非常重要的理论和现实意义。等位基因的命名是按照ISFG等位基因命名法则进行的，也为形成学术规范、易化各单位的交流奠定了基础。

附图说明

图1为某3只大熊猫个体在Ame-14基因座上的分型结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。即：本领域技术人员在本发明所述内容之上对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

各个基因座等位基因的扩增

材料包括：①大熊猫DNA样品：圈养大熊猫DNA样品110个。按照常规方法从大熊猫组织和血液中提取DNA，调节浓度至0.5g/L，-20℃保存；

②表3所示引物。

步骤为：挑选出相应的DNA样品，然后用不加荧光标记的引物做PCR扩增。PCR在GeneAmp9700型PCR仪上进行。反应总体系为50L：50ng模版DNA，5L 10×PCR缓冲液，1.5mM MgCl₂，200M dNTP，引物各1M及1.5U Taq DNA聚合酶(Fermentas公司)。反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性40s，退火温度复性50s，72℃延伸55s，共35个循环；末循环72℃延伸10min。

PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，嗅化乙啶(10mg/mL)染色后，用BIO-RAD凝胶成像装置扫描分析。

含有与预期目标条带分子量大小一致的PCR产物，经2％琼脂糖凝胶(含有嗅化乙啶10mg/mL)中电泳，100V恒压电泳30min后，使用OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA片段：(1)在紫外灯下切下含有目的片段的凝胶；(2)加入等体积Bindingbuffer(假设凝胶1g/mL，则0.2g凝胶加入0.2mL Binding buffer，55℃～65℃，7min直到凝胶全溶，2～3min可以上下颠倒和旋涡振荡)；(3)溶解后的溶液加入一个收集管，8000～10000rpm离心1min，倒掉管中废液；(4)加入300L Binding buffer，13200rpm离心1min；(5)加入700L SPW，静置3min，13200rpm离心1min；(6)重复步骤(5)一次，(7)13200rpm再离心一次；(8)加入30～50L DNA Elution buffer，并将吸附柱放入一个干净的EP管中静置3min，13200rpm离心1min；(9)重复步骤(8)一次，最后将所回收的目标DNA定容到30L。

实施例2

等位基因质粒的构建及序列的鉴定

材料包括：①菌株和质粒：

大肠杆菌JM109，购至华美生物有限公司。基因型为：recAsupE44endA1hsdR17gyrA96relA1thiΔ(lac-proAB)F’[traD36proAB⁺lac^qlacZΔM15]；

②克隆载体pGEM-T，Promega公司出品，购自上海今迈生物科技有限公司。

步骤为：将PCR产物与pGEM-T载体相连，连接反应条件：22℃，12小时。连接产物转化大肠杆菌(JM109)感受态细胞，涂布于含50μg/mL氨苄青霉素、200mg/mLIPTG及20mg/mL X-Gal的LB平板(Luria-Bertani Medium)，过夜培养，通过蓝白斑筛选阳性克隆。

将阳性克隆划线生长，提取质粒。电泳检测后进行双向测序，测序引物分别为T7、SP6。用Bioedit软件处理测序结果。

实施例3

微卫星等位基因标准物的制备

材料包括：①Taq Gold酶，美国应用生物系统公司出品，购自成都金线生物科技有限公司；

②GS-350 Standard Size(ROX)，美国应用生物系统公司出品，购自成都金线生物科技有限公司；

③在5’端加上ROX荧光标记的引物b；

④POP4凝胶。美国应用生物系统公司出品，购自成都金线生物科技有限公司。

用在5’端加上ROX荧光标记的引物b对相应的质粒做PCR扩增。反应总体系为50L：50ng模版DNA，5L 10×PCR缓冲液，1.5mM MgCl₂，200M dNTP，引物各1M及1.5U Taq DNA聚合酶(Fermentas公司)。反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性40s，退火温度复性50s，72℃延伸55s，共35个循环；末循环72℃延伸10min。

PCR产物经2％琼脂糖凝胶(含有嗅化乙啶10mg/mL)中电泳，100V恒压电泳30min后，使用OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA片段(方法同实施例1)。用紫外分光光度计测定产物浓度，然后按比例将各基因座的等位基因产物混合在一起，制备成各基因座的等位基因Ladder。

其中标准物的混合：

用紫外分光光度计测定产物浓度，然后根据实际情况按比例将各基因座的等位基因产物混合在一起，制备成终浓度均为100ng/L、总体积为200L的等位基因Ladder。

例如，在Panda-22基因座，有4个等位基因(12、13、14、15)。紫外分光光度计测定的PCR产物浓度分别为：500ng/L、480ng/L、450ng/L和400ng/L。在这种情况下，各等位基因产物的混合比例如下：

等位基因12 40L

等位基因13 41.6L

等位基因14 44.4L

等位基因15 50L

高纯水 24L

合计 200L

实施例4

微卫星数据库的重新分型与标准化以及实验结果

材料包括：在5’端加上HEX荧光标记的引物a

步骤为：用在5’端加上HEX荧光标记的引物a对数据库中的110个圈养大熊猫DNA样品重新分型。PCR反应条件为：DNA 500ng(1L)，引物4pmol(1L)，10×Buffer 1.0L，Mg²⁺1.5L，dNTP 100mol/L(1L)，Taq Gold聚合酶1U(0.2L)，加双蒸水至10L。95℃预变性10min，然后94℃15s，退火温度15s，72℃30s，(循环10次)/89℃15s，退火温度15s，72℃30s(循环20次)/72℃30min，4℃。

在ABI 3100型测序仪上做基因扫描，以ROX标记的等位基因Ladder为分型标准物(实施例3)。将新获得的分型数据与原数据库进行比较核对，消除系统误差。若分型结果有差异，则重新PCR，并借助已知的谱系信息纠正分型错误。统计各微卫星标记的等位基因的数目，根据基因频率分布估计各基因座在群体中的基因杂合度和多态信息含量。

图1显示了3只大熊猫个体在Ame-14基因座上的分型结果。图中Green峰型为实际检测到的分型产物，Red峰型为等位基因Ladder。以等位基因Ladder为标准，可准确识别出分型产物的实际长度。

综上所述，本发明所述试剂盒能非常准确地对大熊猫进行微卫星分型，并最终获得准确的大熊猫亲子鉴定结果。