CN108642189B

CN108642189B - 大熊猫微卫星多态位点、鉴定方法和引物序列

Info

Publication number: CN108642189B
Application number: CN201810578072.2A
Authority: CN
Inventors: 方盛国; 万秋红; 林剑青; 夏金全; 光宣敏
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-06-05
Filing date: 2018-06-05
Publication date: 2019-09-06
Anticipated expiration: 2038-06-05
Also published as: CN108642189A

Abstract

本发明公开了大熊猫微卫星多态位点、鉴定方法和引物序列。本发明筛选出的21对大熊猫微卫星多态位点特异引物序列，其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.42所示。鉴定大熊猫微卫星多态位点的方法利用大熊猫基因组筛选出微卫星位点并设计高质量引物；将大熊猫基因组测序read数据比对到大熊猫参考基因组鉴定INDEL，将INDEL鉴定结果与微卫星位点筛选结合，筛选出具有多态性的微卫星位点及高质量引物。本发明所提供的21对微卫星引物，均为多态性位点，具有较强的分辨能力。利用这套微卫星引物，可经济、快速、正确地进行大熊猫个体鉴定和亲子关系鉴定，有助于对大熊猫种群进行家族谱系重建和信息完善，为制定科学的大熊猫保护方案提供数据支持。

Description

大熊猫微卫星多态位点、鉴定方法和引物序列

技术领域

本发明属于大熊猫微卫星多态位点鉴定领域，具体涉及大熊猫卫星多态位点、鉴定方法及特异引物序列。

技术背景

大熊猫是我国特有的濒危物种，是国家一级保护动物。大熊猫是一种古老的动物，曾经广泛分布于我国广大地区及东南亚地区，然而，随着人类文明对熊猫栖息地的严重破坏，大熊猫这一曾经广泛分布的物种也不得不退缩至现今的四川、陕西和甘肃三省，分布于秦岭、岷山、邛崃山、大相岭、小相岭和凉山等6个山系中，并各自或彼此间形成独特的进化历史。从上个世纪70年代末开始，我国各级有关部门逐步加大对大熊猫野外栖息地的保护力度，但由于各山系内部诸如铁路、公路、农田和人居等因素的干扰，大熊猫被分割为20多个极小种群，其仍然面临严重威胁。

微卫星DNA是基因组中的短串联重复序列，又称为简单重复序列，由核心区和两侧的侧翼序列构成。核心序列是包含2-6个核苷酸的重复单元，重复次数可为5-100次，核心序列的重复数越大，微卫星的变异性越大，其等位基因数目就越多。侧翼序列则使微卫星序列特异地锚定于基因组中的某一位置。由于微卫星DNA具有位点数量多、在基因组中分布均匀、多态信息含量高、在单个微卫星位点可以做共显性等位基因分析、易于分析等特点，它已成为分子生态、分子进化、遗传育种以及保护遗传学等研究领域中最为重要的分子标记之一。近年来，随着对濒危动物保护遗传学研究日益受到重视，微卫星分子标记被用于个体身份鉴定、亲自关系鉴定、物种的进化历史、种群的扩散模式、种群遗传机构和遗传分化等保护遗传学问题。这些研究所得的数据为制定物种保护策略的提供可靠依据，证实了微卫星分子标记在保护遗传学研究所起的重要作用，微卫星位点多态性的高低在一定程度上反映了物种所面临的生存困境。尽管如此，目前的微卫星分子标记在使用上仍然有一些不足。例如，虽然有研究发现微卫星DNA侧翼序列在近缘物种间具有一定的保守性，然而对一些珍稀物种，尤其是在进化上地位特殊的物种来说，当缺乏相关近缘物种微卫星序列信息参考的情况下，则需要进行微卫星微点的筛选和特异引物的开发。而且，濒危物种普遍具有较低的遗传多样性，因此获得多态性的微卫星位点的显得更困难而且更重要。幸运的是，越来越多的物种的参考基因组已经完成测序并发布，这为我们在全基因组水平上大批量得获取微卫星数据提供方便。然而，前人使用物种参考基因组筛选微卫星的方法，存在两方面的缺陷：1、引物设计特异性较差，容易产生非特异性扩增；2、筛选的位点多态性较低,后续需要花费较多的时间和成本进行进一步筛选。本发明利用已经公开的大熊猫参考基因组序列，通过多轮比对筛选，确保引物具有较高特异性；同时使用可公开获取的基因组测序原始序列进行比对筛选，使用一个个体的基因组数据，便可获得多态性更高的大熊猫微卫星位点信息并设计特异引物。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了大熊猫微卫星多态位点、鉴定方法和引物序列。

本发明公开了一种大熊猫微卫星多态位点的鉴定方法，包括如下步骤：

1)利用大熊猫参考基因组筛选出微卫星位点，并经过多轮的引物设计和筛选流程，针对大熊猫微卫星位点序列设计PCR扩增引物；

2)并将大熊猫基因组测序read数据比对到大熊猫参考基因组，鉴定大熊猫基因组上的INDEL位点；

3)根据大熊猫INDEL鉴定结果与大熊猫微卫星鉴定结果，筛选出具有多态性的大熊猫微卫星位点及相应的PCR扩增引物。

优选的，所述利用大熊猫参考基因组筛选微卫星位点的过程具体为：

鉴定大熊猫基因组上的微卫星(SSR)序列，对于重复单元为2-6bp的微卫星序列的基序(motif)需满足如下要求：

对于二碱基的基序，要求其重复次数大于或等于6次；对于三碱基、四碱基、五碱基和六碱基的基序，其重复单元的重复次数要求大于或等于4次；

由此鉴定大熊猫基因组上的微卫星序列，并提取微卫星核心序列左右两侧各150bp的侧翼序列。

优选的，所述的步骤1)中，对于筛选得到的PCR扩增引物对，如果PCR扩增引物对中的任何一条引物包含核心序列，则过滤掉该PCR扩增引物对及其对应的微卫星位点。

更进一步的，所述的步骤1)还包括如下步骤：

通过blastn将经过筛选得到的候选微卫星点序列的引物序列比对回大熊猫参考基因组，blastn参数为：-F F-b 10000-v 10000；

对于比对到大熊猫参考基因组的引物对序列，要求5’端的错配不超过3个碱基，3’端的错配不超过1个碱基；对不满足条件的引物对序列进行过滤；

挑选位于同一条scaffold上的引物序列，且要求这些引物对的正向引物和反向引物不存在overlap；

保留在大熊猫基因组上存在唯一位置的引物对序列；如果引物对序列在基因组上有多个位置信息且这些引物产生的最终产物序列长度与之前微卫星产物长度的差大于2000bp，那么这样的引物对序列也保留下来。

更进一步的，所述的步骤1)还包括如下步骤：

根据得到的引物位置信息，提取其在大熊猫基因组上的产物序列，并将这些产物序列用SSRIT重新进行微卫星预测，如果基于某一个位置的产物序列有多种微卫星序列，则过滤掉这类引物序列，从而得到的结果是每个引物都能扩增产生唯一类型的微卫星序列。

优选的，所述的步骤2)具体为：将大熊猫基因组测序read数据通过SOAP软件比对到大熊猫参考基因组，比对参数如下：-min 100–max 900–gap 30–mis 3，得到SOAP比对的结果文件；将上一步比对的结果文件作为输入，使用SOAPInDel软件，得到该个体的INDEL位点信息。

优选的，所述的步骤3)之后还包括步骤4)，所述的步骤4)为利用实验方法对引物有效性和微卫星位点多态性进行鉴定和筛选；

所述的实验方法为利用PCR技术检测，检验引物的灵敏度和特异性，保留扩增条带单一、清晰、明亮且条带大小符合预期的微卫星位点及相应的PCR扩增引物；利用单链构象多态性技术或荧光扫描技术中的一种或两种技术分析位点的多态性，保留多态的微卫星位点及相应的PCR扩增引物。

本发明所提供的21对微卫星引物，均为多态性位点，具有较强的分辨能力。利用这套微卫星引物，可经济、快速、正确地进行大熊猫个体鉴定和亲子关系鉴定，有助于对大熊猫种群进行家族谱系重建和信息完善，为制定科学的大熊猫保护方案提供数据支持。

附图说明

图1显示的是第一对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图2显示的是第二对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图3显示的是第三对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图4显示的是第四对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图5显示的是第五对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图6显示的是第六对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图7显示的是第七对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图8显示的是第八对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图9显示的是第九对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图10显示的是第十对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图11显示的是第十一对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图12显示的是第十二对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图13显示的是第十三对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图14显示的是第十四对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图15显示的是第十五对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图16显示的是第十六对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图17显示的是第十七对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图18显示的是第十八对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图19显示的是第十九对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图20显示的是第二十对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图21显示的是第二十一对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

具体实施方式

本发明提供的大熊猫微卫星多态位点的鉴定方法，包括如下步骤：

所述利用大熊猫参考基因组筛选微卫星位点的过程具体为：

所述的步骤1)中，对于筛选得到的PCR扩增引物对，如果PCR扩增引物对中的任何一条引物包含核心序列，则过滤掉该PCR扩增引物对及其对应的微卫星位点。

所述的步骤1)还包括如下步骤：

2)并将大熊猫基因组测序read数据比对到大熊猫参考基因组，鉴定大熊猫基因组上的INDEL位点；将大熊猫基因组测序read数据通过SOAP软件比对到大熊猫参考基因组，比对参数如下：-min 100–max 900–gap 30–mis 3，得到SOAP比对的结果文件；将上一步比对的结果文件作为输入，使用SOAPInDel软件，得到该个体的INDEL位点信息。

大熊猫微卫星序列PCR扩增是在上述一种用于鉴定大熊猫微卫星多态位点的方法所得到引物对中，选择26对五碱基重复位点引物和1对六碱基重复位点引物进行扩增。每对引物均在10μL PCR体系中，并在特定的PCR扩增条件下对随机选择的大熊猫个体基因组DNA进行PCR扩增。

使用琼脂糖凝胶(1％)电泳对PCR扩增产物进行检测，出现单一且清晰的目的条带的引物及相应的条件则通过此步骤初步筛选，用于后续研究。

在此步骤中，发现在26对五碱基重复微卫星位点引物和1对六碱基重复微卫星位点引物中，有6对五碱基重复微卫星位点引物未能扩增出单一且清晰明亮的条带，因此舍去；其余20对五碱基重复微卫星位点引物和1对六碱基重复微卫星位点引物均可扩增出清晰明亮条带。

本发明筛选出的21对大熊猫微卫星多态位点特异引物序列，其序列如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.42所示。21对大熊猫微卫星多态位点特异引物序列对应的21个大熊猫微卫星多态位点，从位点一至位点二十一的序列依次如SEQ ID NO.43～SEQ ID NO.63所示。位点与特异引物序列的关系、产物参考长度，退火温度和等位基因数目见表1。

表1

下面结合实例来对本发明作进一步说明：

1、样品准备：大熊猫血液和组织样品来自中国大熊猫保护研究中心。

2、DNA提取：酚氯仿法提取血液和组织DNA。

3、引物合成：上游引物5’端具有荧光修饰，下游引物则是普通引物。

4、PCR扩增：10μL PCR体系是：

所述的特定的PCR扩增条件是：第一步，94℃预变性2分钟；第二步，94℃变性30秒；第三步，在退火温度下退火30秒；第四步，72℃复性30秒；第五步，重复第二步～第四步，40个循环；第六步，72℃延伸10分钟。其中，引物的退火温度通过梯度PCR确定。

5、利用ABI3730基因分析仪对PCR扩增产物进行分型，通过Genemapper 4.1软件对原始数据进行等位基因分析。

6、读取峰图，如图1-图21所示，21个位点均为多态性位点，证明了本发明提供的大熊猫微卫星多态位点的鉴定方法及在此基因上筛选的大熊猫微卫星多态位点特异引物序列的有效性。

具体的，本发明采用的荧光扫描技术是：

1)选择上述21对PCR扩增条带单一清晰的引物，合成5’端具有荧光修饰的上游引物，荧光种类为FAM、HEX、TET三种荧光修饰的任意一种。

2)利用下游引物和上述具有荧光标记的上游引物，运用上述一种大熊猫微卫星序列PCR扩增方法，对来自中国大熊猫保护研究中心的20个大熊猫基因组DNA样品为模板进行群体PCR扩增。

3)利用ABI3730基因分析仪对PCR扩增产物进行分型，通过Genemapper 4.1软件对原始数据进行等位基因分析。

结果发现，上述21个位点均为多态性位点，各位点的等位基因数目为2-4，平均等位基因数目为2.381。本发明所提供的21对微卫星引物，均为多态性位点，具有较强的分辨能力。利用这套微卫星引物，可经济、快速、正确地进行大熊猫个体鉴定和亲子关系鉴定，有助于对大熊猫种群进行家族谱系重建和信息完善，为制定科学的大熊猫保护方案提供数据支持。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 大熊猫微卫星多态位点、鉴定方法和引物序列

<160> 63

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcgtgctgg gctgaagaga gaag 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccccatcaca atgtctgcag ctg 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatgggccac cttgacatgt acat 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actgaagacc caggagagag cttt 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aacaaaaacc cccaaaccaa accc 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtcggtagc tatgaagtgt tggg 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accacagcca agggttgtat tgtt 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gggttgtgag ttgaagccct acat 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctcaaggcag ttgttcccac tctt 24

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tccatattgg aaaaccctac actggaa 27

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tggtggtaat gaaatccctc agct 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cttctatcct cagtgaagcc gtcc 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cttactttca catctgggcc ctcc 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acatgcaatg aaacagggac cact 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttaactgggg gtgtactgga tggt 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

taagggtgct attctcgcca ttcc 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctcggagggc atctgttgga ttaa 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccatgagcgt ggggcctatt taaa 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cctcaactcc ttcccctgca aaat 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggtgtcgtca agtacatggg tctc 24

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gagacaggct atcttacatt gggct 25

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aattgtagca gggtctcatg gctg 24

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tatctctaag tgccctgggg tcag 24

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cggactcgtt cctagtgtgt gg 22

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tcgttgaacg ccacatcaaa aact 24

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ttcaggattc tgggcactac tgga 24

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tcgagggctt gcgactttat ttca 24

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

agagctggat tggagaaagc ttga 24

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tgctcgaaag gaaactacca ggaa 24

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ccaaggtcat ggaggcacat ttta 24

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tttggagagg cggaaagagc tttt 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ttttgctgcg aggaggtgat agtc 24

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ggcgtcccag tacgtaactc tcta 24

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

atacactttg gaggcacctg gatg 24

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gatattctct ctccctctcc cctg 24

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ttccattttg agccaaaagt tacttagt 28

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

catctgagca cttgaaagcc agt 23

<210> 38

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gtcactacag caatcatata accctgt 27

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ctcaggatcg tgagtttaag cccc 24

<210> 40

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ggttgtctta tttcctgtgc atttggt 27

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

tccagctaaa caaactgccc ttct 24

<210> 42

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

ctactggtca gctgcaagga cttg 24

<210> 43

<211> 325

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 43

cttctgtgca gccaggaagg atgctccctg cagggccaca gagaactcgg gcaggagctt 60

ggaactcggg cctctggctt ggttctgccc aacctctgcc ccaggaccac tgtttgcctg 120

gcctcgtgct gggctgaaga gagaagccag ccctgtccct gtccctgtcc ctgtccctgg 180

agaggctgtc actccctgag tgctagcaga gagctcaggg cagctgcaga cattgtgatg 240

ggggcggggc cagtcagtgg ctcccaggag gctctggcgg ggacactgag tcagcagtag 300

acggacagct gggctctggg ctcct 325

<210> 44

<211> 321

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 44

ctgatatagg gaagggggtg taaatttggg caaggaagct ccttttagca tttgaaattc 60

tcaaaaatgg tctcaactgt aagccaacat agggaccaag ggcaggctct cccaagatgg 120

gccaccttga catgtacatt attttgagct aaacaaaaca aaacaaaaca gaagatgcag 180

gaaaagctct ctcctgggtc ttcagtttac attggaaagg agagcctgta ccaggaagag 240

agctattttt ttttttaaga ttttatttat ttatttgaca gagagagaga cagccagcaa 300

gagatggaaa cacaggcagg g 321

<210> 45

<211> 331

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 45

acaaatgtta gagagaaagt cccttggaaa aaaatgtcca agtgaattga gatttatttg 60

aaagaatgaa agccacaact atgttagcaa tcccttatag cttttgtgga taaaaacaac 120

aacaaaaacc cccaaaccaa acccaagcag aacaaaacaa aacaaaacaa aacaaaacaa 180

aaaaacaacc caacacttca tagctaccga ccaatttttc tataattgtg gcaaaggtct 240

aggaaaacat tttctaactc ttctgtttgg ggtatttgct tggaattgtt tctgggaaga 300

aaatgtcctt ttaacaattc tgagtacttt a 331

<210> 46

<211> 321

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 46

gtgccccccc cgccccccac ctaatccaac ctgccccagc cacaggctgt aaaggaggac 60

acaggggaca gcctctgctc caagaagttg tgccagcagc agagctgggc ctggggtaaa 120

aaccacagcc aagggttgta ttgtttttac tcttttcttt tcttttcttt ttttaaacag 180

gctccatacc cagcacagag cccaatgtag ggcttcaact cacaaccctg agagcaagac 240

ctgagctgag atcaagagtc tgatgcttaa ccgactgagc cacccaggac ctactttact 300

ttttcttttg aaatatgatc t 321

<210> 47

<211> 326

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 47

atatttttaa gttgaagaaa attcttgaat ttctcttata tagtcatatg aatattcccc 60

agtggcctca gatcatcaca ttcttatatg tttcatgtct caaggcagtt gttcccactc 120

ttagtaacgt attaacatca actgtgaggt ttagattaga ttagattaga ttagactatt 180

tccagtgtag ggttttccaa tatggaggtt ttaaaatatg gattagagta atgatactat 240

cctcacttat actgaatata ctttttgagt ggaagagaaa tgagtagtta caacaagcat 300

gctgacaaat tcacttaact aatgcc 326

<210> 48

<211> 321

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 48

ggagaatggc tgagaacttt ttctgttttt atgatgttaa ttagcgttct tttacttcca 60

ctcaaagaat tccctttagc atttcctgtt agataggttg gtggtaatga aatccctcag 120

cttttgtttg ttcagaaaag tctttattta caccccaccc caccccaccc ccattttttc 180

cctgaaggac ggcttcactg aggatagaag ccttggttga cagtcatttt ctcttcctct 240

tttgagtatg tcatcccctt ctctcctggc ccgaaaagtt tctgttgaga aatctgtcac 300

tagttccctt gtgtgcaact t 321

<210> 49

<211> 331

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 49

gtctcctctt ctttaagcaa aacgtttttt aagctttttt tttaagtttt tttttttttt 60

ttagtttttt tacatattta caatagttgc tttgaaatct ttgtctgctt actttcacat 120

ctgggccctc caaaaggcaa tttcttttac ttgttttgtt ttgttttgtt ttgttttgtt 180

ttttcccctt gtgtatgggt cagtggtccc tgtttcattg catgtacaat aatattttgg 240

tcgaaaactt ggaattttca ataatatatt ttaacatctc aggagactat tctctgtccc 300

taactgtagt ggtttgtggg atgtgattgt t 331

<210> 50

<211> 326

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 50

aaactatggg cttgaattgc aataacatcg ttaagcgagc cccagataag accgtgttcg 60

tattatatag aaatggaatg gttaactggg ggtgtactgg atggtgacta atataacaaa 120

aaaaaattat aaaaaaaaaa aagaaaaaga aatggaatgg aatggaatgg aatggttgga 180

atggcgagaa tagcaccctt agtttctttt gccttttgct ttgcaattgg gccacgatgt 240

cccagcataa tccagatttg caacaacacc gctgtgtgtt ttattgccca gggccatagt 300

ccttaacctg gctgcacatt cgaatc 326

<210> 51

<211> 321

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 51

ccgggggtgc tcgaagggaa ctacaacata aagcccctca gagaggcact gttataaggc 60

ctaatgtaag ggaggcgctc ggagggcatc tgttggatta atacatctct gtggtttgtc 120

aatttcactg gttattacat aatttaaaac tttattttat tttattttat tgttttttaa 180

ataggcccca cgctcatggt agagcccaat gaggggcttg aactcacaac cctgagatca 240

aaacctgagc tgagattaag agtcggctgt ttaaccgact gagataccca agtgccccaa 300

acattatttt aatattaaaa t 321

<210> 52

<211> 321

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 52

gaatcactgc cctgtgtggt ggggactggc tccttaggca tgcctgcccg gagggccagg 60

agaaggggct gctctctgaa ctaaccatac ccacacagac aggatgtggc ctcactgtac 120

ctcaactcct tcccctgcaa aatggcggtg ctgccctgcc ctgccctgcc cacctagggt 180

caggtgaagc ccaagtaggg tcacagcatg gcatggcttt gaagagaccc atgtacttga 240

cgacaccggg aggagcatga tgactgccga tgttctgcgc agccctggcc gacaagtgcc 300

agccagcggc tgtcttctct c 321

<210> 53

<211> 321

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 53

actggtgaca caaaccagac ctgagcccag ctctccccta aatctcctaa atctggagct 60

atttacaatg agctccatgc acttcatgat cacttagaga caggctatct tacattgggc 120

ttaatttaat tgtcttctca gtaaagcagc acaaaacaaa acaaaacaaa ccccaagaac 180

cacctctccc ccatacatcc acctttccct taagaacagc catgagaccc tgctacaatt 240

atctgtaacc aacaagtacg taaacctgag aatatcctta gattaatgtg caagaggcct 300

ttgattttag cctgtcagaa t 321

<210> 54

<211> 321

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 54

acagagacat gcacagcaca gctcccaccc tgcagggtta ggggaaaaaa ggaactgcta 60

tctctaagtg ccctggggtc agagctgggg tttgtgcttg cccgaacagc cacagtcact 120

actaggcaga gagagaatac agaccttcag aaccaaacca aaccaaacca accaactccg 180

gccccacaca ctaggaacga gtccgggtgt gctggggaga cagcctcctg tgccgccctt 240

cggagctgcc agtgaaggtg atgcattggc cggcactagg aacacgctgc tcccacagct 300

gggtgcgctt ccagaagccc c 321

<210> 55

<211> 321

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 55

cagtagggcg gggctgcggg cctggggctt aaggagggca ggtgctggga tgagcactgg 60

gtgttacacg caactaatga atcgttgaac gccacatcaa aaactaatga tgtactgtat 120

gctggctaac tgaacataat aataaaaagc ataaaataaa ataaaataaa aatgctggac 180

aaaacaacaa aacaaaaaca ccaaagtcca gtagtgccca gaatcctgaa tgcccaccat 240

tcatagacac atctctgttc ctttggtgta tgttagagcc tgttacactc cgcatgacat 300

acggcattta gaatgtactt c 321

<210> 56

<211> 321

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 56

ttgattcaat acatatcaca cgggcaatgt agactagcat aaaataaatg cggaaaaatc 60

gagggcttgc gactttattt caaccaggac agggccccca gagtgacctc cccactctgc 120

cccttctgcc agctgccttg attgcaatgt gcccagccca gcccagccca ggacttcact 180

catatttcaa gctttctcca atccagctct ctaatcagtt aagtggagaa aataaataag 240

tgccccaata aaatgcatgc taacattcat tgtgctagct catagtgctt gcgaaggaca 300

ggagtaatat tacagtcatt t 321

<210> 57

<211> 321

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 57

ggttgtggtg catttgcagg tagcagcgag gaaaagaaac tcaccccata aaagtgaagg 60

tgatgctgag gtcatcgtgg cagatgctat cattgccaca attctgctcg aaaggaaact 120

accaggaaaa aaaaaaaaaa agaatatgat gaaaggaaag gaaaggaaag aatgaaatga 180

tgtgaaatga aacaataaaa taaaatatta aaataaaatt atgtgaaatg aaataaaatg 240

tgcctccatg accttggccc ctgcaggacc ccagctggag gactcaccaa agctgtaaag 300

tgtctctgag cgtccacagc c 321

<210> 58

<211> 321

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 58

ttccctaaga ggtgagaaag gtgatttcag atagagccaa gaacaacaaa ggaagtttgg 60

agaggcggaa agagctttta tgaaactcca ttcagtgagg agctaatgta aacatgatga 120

ctgtggttga taacattgtg ttgtagaatt aaacaaaaca aaacaaaaca cctcgctcag 180

ttctgctgac tatcacctcc tcgcagcaaa acaccgattc tctgcccttt ttccctgctt 240

agtttttctc tgtagaactt acactcccta agttgtatta tgtagttatt tgtttattga 300

tttatttgcc cattcatcag c 321

<210> 59

<211> 321

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 59

gacctgagct gaaggcagac tcttacctga ctgagccacc caggcgtccc agtacgtaac 60

tctctatagc agatgtccag caggaaaata aaactgactt tgtattaata tgttttcaga 120

ggtcaagtgc tgttgttttg ttttgggttc tgttttgttt tgttttgttt ggtccatcca 180

ggtgcctcca aagtgtatgg ggcaggggtg gggggcgggt gataacttct cagcccccaa 240

cttgcaaaag tgtaacctag ttttgtttcc tgacctcaaa tcctaccaaa ctttgcgaga 300

gggttggatc ttttttcctc t 321

<210> 60

<211> 321

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 60

atcaggtcat gatctcgggg ttgtgagatc aagcccagag tgtgctctgt gctggatgtg 60

gagtctgctt gatattctct ctccctctcc cctgcccctc ccctgctcac tcacatgctt 120

gcgctcacac gtgctcgctc tctccaaaat aaacaaaaca aaacaaaaca accttcctac 180

ctggacattt aaaaatgtat tactaagtaa cttttggctc aaaatggaaa ttcaatacaa 240

aattgaagaa ctttttcaaa attacagtaa tgaaataaaa cttaacagaa tccatgaaat 300

taatgtacaa ataatcccat t 321

<210> 61

<211> 321

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 61

tgtatcacca ttttttttaa catatatgta tcagacacta caatagctta ttatatgaat 60

taggatgact tttttttttt ttagtttagt ttatctagtt ggtgcgaaac aaagcaaatg 120

ttctgctaca tctgagcact tgaaagccag taacataaca taacataaca gtaacataaa 180

aatgcattaa aaataatcta ctacctaact taactttaaa aatctataaa acattgtttt 240

atggtgttta ttgtttttca tacagggtta tatgattgct gtagtgaccc aaagaactgg 300

aaagatgaag tctatgatgg a 321

<210> 62

<211> 336

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 62

ccaaggtatg aatttaaact gatatggtaa aggacgcttg tgtggctcag tgagttaagc 60

atctgactct tgatttcctc tcaattcttg atctcaggat cgtgagttta agccccacct 120

tgggttccat gctgggcatg gagcctgctt aaataaaata aaataaaata aaataaaata 180

aaataatatg gtaaacaaat gcaaatattc tctgagagta tattttcatc tttggcttaa 240

agaagttcta caagtaaagt atcaaggtca ctgaataatt tgtcaaagat aaccaaatgc 300

acaggaaata agacaacctg aataagaatc agcaaa 336

<210> 63

<211> 321

<212> DNA

<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)

<400> 63

ctcttaaagt aggacaaagc cataaaataa acatgtgaga accagcactg gatatgtcca 60

gctaaacaaa ctgcccttct atttagtttt ggactcgaaa tttcatttta acaccctccc 120

tttctttttt tctctaaaga agggaagacc aaacaaaaca aaacaaaaca aaaaaacccc 180

aaaatgaaca attacagtag attctaaaga aaaatagagc gagaacattt tgttaagaga 240

tattcccaca tggaaaagta caaaaattgg gcaagtcctt gcagctgacc agtagaactt 300

ggaagaagaa acagggactg a 321

Claims

1.一种大熊猫微卫星多态位点的扩增引物对组合物，其特征在于包括下述21对引物对，引物对的引物序列如下：

引物对一：上游引物如SEQ ID NO.1所示；

下游引物如SEQ ID NO.2所示；

引物对二：上游引物如SEQ ID NO.3所示；

下游引物如SEQ ID NO.4所示；

引物对三：上游引物如SEQ ID NO.5所示；

下游引物如SEQ ID NO.6所示；

引物对四：上游引物如SEQ ID NO.7所示；

下游引物如SEQ ID NO.8所示；

引物对五：上游引物如SEQ ID NO.9所示；

下游引物如SEQ ID NO.10所示；

引物对六：上游引物如SEQ ID NO.11所示；

下游引物如SEQ ID NO.12所示；

引物对七：上游引物如SEQ ID NO.13所示；

下游引物如SEQ ID NO.14所示；

引物对八：上游引物如SEQ ID NO.15所示；

下游引物如SEQ ID NO.16所示；

引物对九：上游引物如SEQ ID NO.17所示；

下游引物如SEQ ID NO.18所示；

引物对十：上游引物如SEQ ID NO.19所示；

下游引物如SEQ ID NO.20所示；

引物对十一：上游引物如SEQ ID NO.21所示；

下游引物如SEQ ID NO.22所示；

引物对十二：上游引物如SEQ ID NO.23所示；

下游引物如SEQ ID NO.24所示；

引物对十三：上游引物如SEQ ID NO.25所示；

下游引物如SEQ ID NO.26所示；

引物对十四：上游引物如SEQ ID NO.27所示；

下游引物如SEQ ID NO.28所示；

引物对十五：上游引物如SEQ ID NO.29所示；

下游引物如SEQ ID NO.30所示；

引物对十六：上游引物如SEQ ID NO.31所示；

下游引物如SEQ ID NO.32所示；

引物对十七：上游引物如SEQ ID NO.33所示；

下游引物如SEQ ID NO.34所示；

引物对十八：上游引物如SEQ ID NO.35所示；

下游引物如SEQ ID NO.36所示；

引物对十九：上游引物如SEQ ID NO.37所示；

下游引物如SEQ ID NO.38所示；

引物对二十：上游引物如SEQ ID NO.39所示；

下游引物如SEQ ID NO.40所示；

引物对二十一：上游引物如SEQ ID NO.41所示；

下游引物如SEQ ID NO.42所示。

2.一种大熊猫微卫星多态位点分子标记组合，其特征在于包括下述21个微卫星位点，位点序列如下：

微卫星位点一：序列如SEQ ID NO.43；

微卫星位点二：序列如SEQ ID NO.44；

微卫星位点三：序列如SEQ ID NO.45；

微卫星位点四：序列如SEQ ID NO.46；

微卫星位点五：序列如SEQ ID NO.47；

微卫星位点六：序列如SEQ ID NO.48；

微卫星位点七：序列如SEQ ID NO.49；

微卫星位点八：序列如SEQ ID NO.50；

微卫星位点九：序列如SEQ ID NO.51；

微卫星位点十：序列如SEQ ID NO.52；

微卫星位点十一：序列如SEQ ID NO.53；

微卫星位点十二：序列如SEQ ID NO.54；

微卫星位点十三：序列如SEQ ID NO.55；

微卫星位点十四：序列如SEQ ID NO.56；

微卫星位点十五：序列如SEQ ID NO.57；

微卫星位点十六：序列如SEQ ID NO.58；

微卫星位点十七：序列如SEQ ID NO.59；

微卫星位点十八：序列如SEQ ID NO.60；

微卫星位点十九：序列如SEQ ID NO.61；

微卫星位点二十：序列如SEQ ID NO.62；

微卫星位点二十一：序列如SEQ ID NO.63。