CN108588239B

CN108588239B - 朱鹮微卫星多态位点、鉴定方法及特异引物序列

Info

Publication number: CN108588239B
Application number: CN201810578019.2A
Authority: CN
Inventors: 方盛国; 万秋红; 孙力; 夏金全
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-06-05
Filing date: 2018-06-05
Publication date: 2019-09-13
Anticipated expiration: 2038-06-05
Also published as: CN108588239A

Abstract

本发明提供了一种朱鹮微卫星多态位点、鉴定方法及特异引物序列。筛选出的12对朱鹮微卫星多态位点特异引物序列，其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.24所示。鉴定朱鹮微卫星多态位点的方法利用朱鹮基因组筛选出微卫星位点并设计高质量引物；将朱鹮基因组测序read数据比对到朱鹮参考基因组鉴定INDEL位点；根据INDEL位点和微卫星位点信息，筛选出具有多态性的微卫星位点及高质量引物。本发明所提供的12对微卫星引物，均为多态性位点，具有较强的分辨能力。利用这套微卫星引物，可经济、快速、正确地进行朱鹮个体鉴定和亲子关系鉴定，有助于对朱鹮种群进行家族谱系重建和信息完善，为制定科学的朱鹮保护方案提供数据支持。

Description

朱鹮微卫星多态位点、鉴定方法及特异引物序列

技术领域

本发明属于朱鹮微卫星多态位点鉴定领域，具体涉及朱鹮微卫星多态位点、鉴定方法及特异引物序列。

背景技术

微卫星指DNA短串联重复序列(simple sequence repeat,SSR)，由核心序列与两侧的侧翼序列构成。核心序列室2-6个核苷酸，通常微卫星核心序列的重复数与该位点的等位基因数有很强的正相关，核心序列重复数越大，其变异性越大，则该微卫星微点的等位基因数目就越多。微卫星具有数量多，在基因组内分布均匀，多态性信息丰富，易于检测等特点，在单个微卫星位点上可做共显性的等位基因分析。目前微卫星技术已经被作为优良的遗传标记而得到广泛应用。同时，随着DNA提取技术的不断提高，以微量DNA材料为标本开展的相关研究越来越受到人们的重视。以PCR为基础的微卫星分析，其最大优点是对模板DNA的要求较低，纳克量或部分断裂的DNA都能得到有效的分析，因此微卫星标记越来越多的应用于那些缺乏遗传关系信息的濒危动物的研究。近年来，随着对濒危动物保护遗传学研究的日益重视和加强，微卫星分子标记已被用来解释濒危物种的进化历史、种群遗传结构分析、辅助种群调查、亲缘关系鉴定和近缘物种及杂交个体鉴别等保护生物学所特别关注的论题。这些研究所得的遗传数据提供了制定物种保护的可靠依据，证实了微卫星分子标记在保护遗传学研究中所占据的重要位置。

然而，虽然微卫星分子标记因其众多优点而在濒危动物遗传保护研究中得到越来越多的应用，并极大地提高了保护工作的有效性。但微卫星分子标记在使用上仍有不足之处。例如，虽然有研究发现微卫星DNA侧翼序列在近缘物种间具有一定的保守性，然而对一些珍稀物种，当缺乏相关近缘物种微卫星序列信息参考的情况下，则需要进行微卫星微点的筛选和特异引物的开发。而且，濒危物种普遍具有较低的遗传多样性，因此获得多态性的微卫星位点显得更困难而且更重要。

朱鹮，世界濒危物种及国家一级重点保护动物，隶属鸟纲鹈形目鹮科朱鹮属，是一种中等体型的涉禽，曾经广泛分布于东亚的中国、俄罗斯远东地区、朝鲜半岛和日本等地。19世纪末20世纪初，由于人类活动等原因朱鹮种群数量大幅减少，俄罗斯、朝鲜半岛和日本的野生个体相继绝迹，直到1981年科研人员在我国陕西省洋县秦岭山中重新发现了7只野生朱鹮，这7只个体也成为了当前全球范围内所有已知个体的奠基者。但是，目前这些朱鹮的遗传多样性如何？野生种群与圈养种群之间是否产生了遗传分化？人工种群的繁殖策略是否合理？采用什么样的繁殖策略才能最大限度地保护人工种群的遗传多样性？能否对部分圈养种群进行野外放归等问题仍然不得而知，这在

一定程度上限制了物种完善的保护策略与保护计划的制定。

因此，鉴定朱鹮微卫星多态位点，筛选朱鹮微卫星特异引物，才能针对上述的一些问题开展研究，为政府主管部门制定朱鹮的保护和管理策略提供科学依据。幸运的是，越来越多的物种的参考基因组已经完成测序并发布，这为我们在全基因组水平上大批量得获取微卫星数据提供方便。前人使用物种参考基因组筛选微卫星的方法，存在两方面的缺陷：1、引物设计特异性较差，容易产生非特异性扩增；2、筛选的位点多态性较低,后续需要花费较多的时间和成本进行进一步筛选。本发明利用已经公开的朱鹮参考基因组序列，通过多轮比对筛选，确保引物具有较高特异性；同时使用结合可公开获取的基因组测序原始序列进行比对筛选，使用一个个体的基因组数据，便可获得多态性更高的朱鹮微卫星位点信息并设计特异引物。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种朱鹮微卫星多态位点的鉴定方法及引物序列。

本发明公开了一种朱鹮微卫星多态位点的鉴定方法，包括如下步骤：

1)利用朱鹮参考基因组筛选出微卫星位点，并经过多轮的引物设计和筛选流程，针对朱鹮微卫星位点序列设计PCR扩增引物；

2)并将朱鹮基因组测序read数据比对到朱鹮参考基因组，鉴定朱鹮基因组上的INDEL位点；

3)根据朱鹮INDEL鉴定结果与朱鹮微卫星鉴定结果，筛选出具有多态性的朱鹮微卫星位点及相应的PCR扩增引物。

优选的，所述利用朱鹮参考基因组筛选微卫星位点的过程具体为：

鉴定朱鹮基因组上的微卫星(SSR)序列，对于重复单元为2-6bp的微卫星序列的基序(motif)需满足如下要求：

对于二碱基的基序，要求其重复次数大于或等于6次；对于三碱基、四碱基、五碱基和六碱基的基序，其重复单元的重复次数要求大于或等于4次；

由此鉴定朱鹮基因组上的微卫星序列，并提取微卫星核心序列左右两侧各150bp的侧翼序列。

优选的，所述的步骤1)中，对于筛选得到的PCR扩增引物对，如果PCR扩增引物对中的任何一条引物包含核心序列，则过滤掉该PCR扩增引物对及其对应的微卫星位点。

更进一步的，所述的步骤1)还包括如下步骤：

通过blastn将经过筛选得到的候选微卫星点序列的引物序列比对回朱鹮参考基因组，blastn参数为：-F F-b 10000-v 10000；

对于比对到朱鹮参考基因组的引物对序列，要求5’端的错配不超过3个碱基，3’端的错配不超过1个碱基；对不满足条件的引物对序列进行过滤；

挑选位于同一条scaffold上的引物序列，且要求这些引物对的正向引物和反向引物不存在overlap；

保留在朱鹮基因组上存在唯一位置的引物对序列；如果引物对序列在基因组上有多个位置信息且这些引物产生的最终产物序列长度与之前微卫星产物长度的差大于2000bp，那么这样的引物对序列也保留下来。

更进一步的，所述的步骤1)还包括如下步骤：

根据得到的引物位置信息，提取其在朱鹮基因组上的产物序列，并将这些产物序列用SSRIT重新进行微卫星预测，如果基于某一个位置的产物序列有多种微卫星序列，则过滤掉这类引物序列，从而得到的结果是每个引物都能扩增产生唯一类型的微卫星序列。

优选的，所述的步骤2)具体为：将朱鹮基因组测序read数据通过SOAP软件比对到朱鹮参考基因组，比对参数如下：-min 100–max 900–gap 30–mis 3，得到SOAP比对的结果文件；将上一步比对的结果文件作为输入，使用SOAPInDel软件，得到该个体的INDEL位点信息。

优选的，所述的步骤3)之后还包括步骤4)，所述的步骤4)为利用实验方法对引物有效性和微卫星位点多态性进行鉴定和筛选；

所述的实验方法为利用PCR技术检测，检验引物的灵敏度和特异性，保留扩增条带单一、清晰、明亮且条带大小符合预期的微卫星位点及相应的PCR扩增引物；利用单链构象多态性技术或荧光扫描技术中的一种或两种技术分析位点的多态性，保留多态的微卫星位点及相应的PCR扩增引物。

本发明所提供的12对微卫星引物，均为多态性位点，具有较强的分辨能力。利用这套微卫星引物，可经济、快速、正确地进行朱鹮个体鉴定和亲子关系鉴定，有助于对朱鹮种群进行家族谱系重建和信息完善，为制定科学的朱鹮保护方案提供数据支持。

附图说明

图1显示的是第一对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图2显示的是第二对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图3显示的是第三对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图4显示的是第四对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图5显示的是第五对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图6显示的是第六对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图7显示的是第七对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图8显示的是第八对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图9显示的是第九对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图10显示的是第十对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图11显示的是第十一对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图12显示的是第十二对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

具体实施方式

本发明提供了一种用于鉴定朱鹮微卫星多态位点的方法，及在此基础上，运用PCR、SSCP和荧光扫描技术筛选出的12对特异引物序列和对应的位点。

所述的多轮的引物设计和筛选流程具体为：

鉴定朱鹮基因组上的微卫星序列，对于重复单元为2-6bp的微卫星序列的基序需满足如下要求：

更进一步的，所述的步骤1)还包括如下步骤：

通过blastn将经过筛选得到的候选微卫星点序列的引物序列比对回朱鹮参考基因组，blastn参数为：-F F -b 10000 -v 10000；

更进一步的，所述的步骤1)还包括如下步骤：

2)并将朱鹮基因组测序read数据比对到朱鹮参考基因组，鉴定朱鹮基因组上的INDEL位点；所述的步骤2)具体为：将朱鹮基因组测序read数据通过SOAP软件比对到朱鹮参考基因组，比对参数如下：-min 100 –max 900 –gap 30 –mis 3，得到SOAP比对的结果文件；将上一步比对的结果文件作为输入，使用SOAPInDel软件，得到该个体的INDEL位点信息。

在上述方法所得到引物对中，随机挑选25对引物进行合成，其中三碱基、四碱基和五碱基重复的SSR序列的引物分别为9、13和3对，每对引物均在10μLPCR体系中，并在特定的PCR扩增条件下对随机选择的20个朱鹮个体基因组DNA进行PCR扩增。

所述的10μl PCR体系是：

所述的特定的PCR扩增条件是：第一步，95℃预变性5分钟；第二步，95℃变性30秒；第三步，在退火温度下退火30秒；第四步，72℃复性30秒；第五步，重复第二步～第四步，34个循环；第六步，72℃延伸5分钟。其中，引物的退火温度通过梯度PCR确定。

使用琼脂糖凝胶(1％)电泳对PCR扩增产物进行检测，出现单一且清晰的目的条带的引物及相应的条件则通过此步骤初步筛选，用于后续研究。

在此步骤中，发现25对引物均可扩增出单一清晰的条带。

对上述25中引物的扩增产物进行SSCP分型，以初步确定25个位点的多态性，其具体流程是:

1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板，将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；

2)制备12％的变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；

3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装满0.5×TBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0.5×TBE，预电泳20min；

4)样品电泳，吸取8ul PCR产物，加入4ul 2×loading buffer，快速离心混合，95℃变性7min后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4℃，30W，电泳8-11h；

5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；

6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗胶4次；

7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；

8)读取条带，确定基因型。

结果发现，13对引物扩增效果不好或为单态，剩余的12对引物均可扩增出较为清晰的杂合条带。

本发明筛选出的12对朱鹮卫星多态位点特异引物序列，其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.24所示。12对朱鹮微卫星多态位点特异引物序列对应的12个朱鹮微卫星多态位点，从位点一至位点十二的序列依次如SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.36所示。位点与特异引物序列的关系，等位基因数目见表1.

表1

下面利用本发明提供的12对特异引物序列，对来自中国浙江省湖州市德清县下渚湖湿地朱鹮繁育基地的朱鹮基因组DNA样品进行扩增的荧光扫描，以验证本发明提供的12对特异引物序列的扩增效果和多态性。

样品准备：朱鹮血液样品来自中国浙江省湖州市德清县下渚湖湿地朱鹮繁育基地。

DNA提取：利用酚氯仿法从朱鹮血液样品中提取DNA.

引物合成：上游引物5’端具有荧光修饰，下游引物则是普通引物。

PCR扩增：

所述的10μL PCR体系是：

利用ABI3730基因分析仪对PCR扩增产物进行分型，通过Genemapper 4.1软件对原始数据进行等位基因分析。

读取峰图，12个微卫星多态位点杂合子三色荧光测序峰图如图1-12所示，12个位点均为多态性位点，证明了本发明提供的朱鹮微卫星多态位点的鉴定方法及特异引物序列的有效性。

使用荧光扫描技术，对上述12个在SSCP分型实验中显示具有多态性的位点进行进一步确认，其具体流程是：

1)选择上述12对PCR扩增条带单一清晰且SSCP实验中条带清晰的引物，合成5’端具有荧光修饰的上游引物，荧光种类为FAM、HEX、TAMRA三种荧光修饰的任意一种。

2)利用下游引物和上述具有荧光标记的上游引物，运用上述一种朱鹮SSR序列PCR扩增方法，以德清朱鹮种群10只亲代朱鹮的基因组DNA样品为模板进行群体PCR克隆。

3)利用ABI3730基因分析仪对PCR扩增产物进行分型，通过Genemapper 4.1软件对原始数据进行等位基因分析。

结果发现，在上述12个位点均呈现多态性。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 朱鹮微卫星多态位点、鉴定方法及特异引物序列

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcccaataa aactctttgc gcag 24

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggctgagta ggaagaggag gatt 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

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<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

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<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

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<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acccattcag tcacattaca tggga 25

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

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<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

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<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

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<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

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<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agattctctc ttgagctggt tttggg 26

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

accaaatgtg tgtcaaaaat acatggt 27

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

agccagaatg ttgaagccat aagg 24

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcatttgaat ttgtgcaaaa tcaccca 27

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ttctccatcc ttggtgctga acag 24

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

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<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aggtggaatg aaaagtaact gtttgga 27

<210> 25

<211> 322

<212> DNA

<213> 朱鹮(Nipponia nippon)

<400> 25

tagctttttg ttttattttt aatcaaaaca agaatagtag aagcaggaaa gaaaaaccat 60

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<210> 26

<211> 313

<212> DNA

<213> 朱鹮(Nipponia nippon)

<400> 26

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<210> 27

<211> 319

<212> DNA

<213> 朱鹮(Nipponia nippon)

<400> 27

acaggacaaa actaccataa aatggctgca aaaaccaaaa cctaaacaga tatcctcatc 60

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<210> 28

<211> 316

<212> DNA

<213> 朱鹮(Nipponia nippon)

<400> 28

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<210> 29

<211> 325

<212> DNA

<213> 朱鹮(Nipponia nippon)

<400> 29

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<210> 30

<211> 317

<212> DNA

<213> 朱鹮(Nipponia nippon)

<400> 30

ataatatttt tcttaactac tttcttttga acaaactcaa agagatcttt tcaagacata 60

catctccagc tttattgcat tttccttacg actgcttctc aagcactggg gtttcttttt 120

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<210> 31

<211> 325

<212> DNA

<213> 朱鹮(Nipponia nippon)

<400> 31

ttttgattat actttttagt tgaaactaac attatcaaca gagagggatc cttcagtgat 60

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<210> 32

<211> 321

<212> DNA

<213> 朱鹮(Nipponia nippon)

<400> 32

tttccaggtt ggtaactgca gtacttcgag tgttgtggct gtgtgaataa aatattacca 60

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ttaaatcttc tttacaatgt t 321

<210> 33

<211> 333

<212> DNA

<213> 朱鹮(Nipponia nippon)

<400> 33

aaaatacttt caaatcacaa catcatcctg atccagccca cctgaattat ccataactgc 60

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aacatctatt aaaaaacgaa aaagaaatac caaacaaaca aacaaacaaa caaacaaaca 180

aaccccaaaa ccagctcaag agagaatctt gactggggcc tcagttgtga acaatgtggt 240

ataggtggcc acgtttaagt tcatacacat aggctggttc cccagtcatg cctgcacacc 300

gcaggctcct ccagattctg aaatttaatt cct 333

<210> 34

<211> 321

<212> DNA

<213> 朱鹮(Nipponia nippon)

<400> 34

tactaacttc aattacagta ggtgaaaagc aaatttttat aaacatgtta ttcttaaaac 60

agaaattacc aaatgtgtgt caaaaataca tggtatgtct agaaaaaaat gaagagtatg 120

gtgtattatt ttattatatg gatttttaat tatctatcta tctatctatc cctcggatag 180

ataattacta ttattagaaa ctaataatag aattgaaaac acagtaatct ttacaaattt 240

atagggcatt aaaaattgtt ttccttatgg cttcaacatt ctggcttcta taacattgac 300

gtatatgtac acataccagt c 321

<210> 35

<211> 331

<212> DNA

<213> 朱鹮(Nipponia nippon)

<400> 35

aaaaagtaga aaacttgaac ctgtaagttt gaaagatttc tttacaagta tctctgttgc 60

agctctgtgt agtatatagt ttcttcaaaa agagaaagca tttgaatttg tgcaaaatca 120

cccatgttgt ttaaatggat gctaattggg atgatatgat atgatatgat atgatatgat 180

tgatatagct gttcagcacc aaggatggag aaaatagaat tgtattgaat ggaggattcc 240

actccgggct gtaactggag acatctgctg cattgtggag tggctgctct gccacttctg 300

atttttcaga aggaacttag tgtatttttc c 331

<210> 36

<211> 326

<212> DNA

<213> 朱鹮(Nipponia nippon)

<400> 36

tcaagcttca aacaactcag aaaatatatc tgttcggatg tctgtagtct tgtcagccat 60

atgttatgat ctgaaagaag acttgttaat agccatccag aaagaggata cttcagcctg 120

tgtttaaaga ggtaggcaac agcaaataag aaacaaaaca aaacaaaaca aaacaaacaa 180

caacaaaaca atccaaacag ttacttttca ttccacctga agaaaaaaca atccaaccaa 240

tgattatttt actgtcaggg atttatataa acggatcttc tgtggaatta aatttttctt 300

ggggtttgta tatttaagct agaagt 326

Claims

1.一种朱鹮微卫星多态位点的扩增引物对组合物，其特征在于包括下述12对引物对，引物对的引物序列如下：

引物对一：上游引物如SEQ ID NO.1所示；

下游引物如SEQ ID NO.2所示；

引物对二：上游引物如SEQ ID NO.3所示；

下游引物如SEQ ID NO.4所示；

引物对三：上游引物如SEQ ID NO.5所示；

下游引物如SEQ ID NO.6所示；

引物对四：上游引物如SEQ ID NO.7所示；

下游引物如SEQ ID NO.8所示；

引物对五：上游引物如SEQ ID NO.9所示；

下游引物如SEQ ID NO.10所示；

引物对六：上游引物如SEQ ID NO.11所示；

下游引物如SEQ ID NO.12所示；

引物对七：上游引物如SEQ ID NO.13所示；

下游引物如SEQ ID NO.14所示；

引物对八：上游引物如SEQ ID NO.15所示；

下游引物如SEQ ID NO.16所示；

引物对九：上游引物如SEQ ID NO.17所示；

下游引物如SEQ ID NO.18所示；

引物对十：上游引物如SEQ ID NO.19所示；

下游引物如SEQ ID NO.20所示；

引物对十一：上游引物如SEQ ID NO.21所示；

下游引物如SEQ ID NO.22所示；

引物对十二：上游引物如SEQ ID NO.23所示；

下游引物如SEQ ID NO.24所示。

2.一种朱鹮微卫星多态位点分子标记组合，其特征在于包括下述12个微卫星位点，位点序列如下：

引物对一对应的微卫星位点序列如SEQ ID NO.25所示；

引物对二对应的微卫星位点序列如SEQ ID NO.26所示；

引物对三对应的微卫星位点序列如SEQ ID NO.27所示；

引物对四对应的微卫星位点序列如SEQ ID NO.28所示；

引物对五对应的微卫星位点序列如SEQ ID NO.29所示；

引物对六对应的微卫星位点序列如SEQ ID NO.30所示；

引物对七对应的微卫星位点序列如SEQ ID NO.31所示；

引物对八对应的微卫星位点序列如SEQ ID NO.32所示；

引物对九对应的微卫星位点序列如SEQ ID NO.33所示；

引物对十对应的微卫星位点序列如SEQ ID NO.34所示；

引物对十一对应的微卫星位点序列如SEQ ID NO.35所示；

引物对十二对应的微卫星位点序列如SEQ ID NO.36所示。