CN111370063B - 一种基于Pacbio数据的MSI微卫星不稳定性检测方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种基于Pacbio数据的MSI微卫星不稳定性检测方法，包括以下步骤：步骤一：测序错误的校正，利用ccs软件将Pacbio测序结果的subreads校正为CCS序列，min‑passes>＝10；步骤二，检测MSI‑PCR上下游引物的位置，并提取产物序列；步骤三，根据MSI核心区域旁邻20bp的特异性序列，进一步提取产物序列中的核心序列；步骤四，旁邻特异性序列是反向比对的，需要对核心序列进行反向互补转化；步骤五，根据给定的microsatellite motif，检测产物序列或核心序列中motif的重复次数以及motif之间的嵌合序列；步骤六，筛选重复次数>＝3的motif，保留它们之间的嵌合序列，作为MSI序列；步骤七，统计全部MSI序列的频次和频率，过滤频率小于5％的MSI序列；考虑到肿瘤的异质性，肿瘤组织样本可以放宽过滤阈值。
Description
技术领域
本发明涉及数据处理技术领域，涉及人类微卫星不稳定性状态MSI的检测，利用Pacbio测序数据分析人类MSI的状态。
背景技术
PacBio平台(PacBio核酸测序平台)采用的是单分子实时测序(SingleMoleculeReal-Time)。PacBio平台的测序基于两个关键技术，第一，Pacific Biosciences公司发明的一种直径只有几十纳米的纳米孔，该纳米孔内只能容许单分子核酸在DNA聚合酶作用下进行反应，检测纳米孔中合成过程的A、T、C、G这四种荧光标记的脱氧核苷酸，即可实现核酸测序；第二，利用共聚焦显微镜实时、快速地对集成在SMRT cell上的无数的纳米孔同时进行记录。PacBio核酸测序平台，其平均读长可达10-40k，且测序不受AT和CG含量的影响，能够对高GC含量或低GC含量的区域进行测序，相比二代测序有较大优势。此外，Pacbio技术可以对一段DNA进行循环测序，从而拿到准确度高的测序结果，解决了三代测序碱基准确性低的问题。
微卫星(microsatellite)是指DNA基因组中小于10个核苷酸的简单重复序列，遍布于整个人类基因组，一般为2-6个碱基重复。这些高度重复序列在机体自我复制时容易出现碱基错配或跳读的现象，因此需要机体的错配修复系统来进行校正。错配修复系统是指一系列可以矫正碱基错配的蛋白，可维持基因组的稳定及降低自发性突变；当错配修复系统发生失调，则发生在微卫星区域高发的体细胞突变不能被校正，进而形成微卫星重复单位的减少或增加而造成微卫星长度改变，形成新的微卫星等位基因，造成微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)。
MSI的发生显著提高了基因的随机突变率，是基因组不稳定的重要指标，并与林奇综合征(Lynch Syndrome)等遗传病相关。MSI的状态也是多种癌症类型的独立预后因素，可指导临床用药及治疗方案的选择，在结直肠癌和子宫内膜癌患者中表现尤为明显。
MSI-PCR通过对肿瘤组织和正常组织中选定的微卫星位点进行PCR扩增及凝胶电泳,通过比较两组电泳结果的差异来确定MSI的状态。然而这种方式只能看到MSI的长度差异，准确的microsatellite重复类型和重复次数无法统计。而且基因组中有数以万计的微卫星位点,不同的位点对于检测MSI的敏感性和准确性也各不相同，其中包含重复次数极高MSI，这类MSI的PCR产物长度远超过一代和二代测序技术的测序长度，它们MSI状态的鉴定成为难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于Pacbio数据的MSI微卫星不稳定性检测方法，以解决长片段MSI状态无法精确鉴定的问题。
为了实现上述目的，本发明提出了一种基于Pacbio数据的MSI微卫星不稳定性检测方法，包括以下步骤：
步骤一，测序错误的校正，利用ccs软件将Pacbio测序数据校正为CCS序列；为保证校正后的测序错误率低于0.1％，设置参数min-passes>＝10。
步骤二，检测MSI-PCR上下游引物的位置，并提取MSI-PCR产物序列；为保证步骤一获取的CCS序列的可靠性，需要检测CCS序列中是否包含引物序列，通过bwa aln软件默认参数将引物序列比对到CCS序列上，检测引物位置，根据引物位置提取产物序列，过滤不含有引物序列的CCS序列。
步骤三，根据MSI核心区域上下游20bp特异性序列，进一步提取核心序列；所述核心序列是MSI-PCR产物中microsatellite motif重复序列和motif之间的嵌合序列；通过核心序列两侧相邻的20bp特异性序列，利用bwa aln软件默认参数将特异性序列比对到步骤二获得的MSI-PCR产物序列上，检测特异性序列位置，根据特异性序列位置提取核心序列，过滤不含有特异性序列的MSI-PCR产物序列。
步骤四，如果步骤三旁邻特20bp异性序列是反向比对的，需要对所述核心序列进行反向互补转化为正向序列。
步骤五，根据给定的microsatellite motif，检测产物序列或核心序列中motif的重复次数以及motif之间的嵌合序列；检测microsatellite motif重复序列的重复次数，通过匹配核心序列中存在的motif，统计motif的重复次数以及motif之间的嵌合序列。
步骤六，筛选重复次数>＝3的motif，保留它们之间的嵌合序列，作为MSI序列；
步骤七，统计全部MSI序列的频次和频率，过滤频率小于5％的MSI序列；考虑到肿瘤组织的异质性，肿瘤组织样本可以放宽过滤阈值，可大于5％。
基于以上方法，本发明还提出了一种基于Pacbio数据的MSI微卫星不稳定性检测系统，其包括：
测序校正模块，其利用ccs软件将Pacbio测序数据校正为CCS序列；
产物序列提取模块，其用于检测MSI-PCR上下游引物的位置，并提取MSI-PCR产物序列；
核心序列提取模块，其用于根据MSI核心区域上下游20bp特异性序列，进一步提取核心序列；
反向序列转化模块，其用于对所述核心序列进行反向互补转化；
统计模块，其用于根据给定的microsatellite motif，检测产物序列或核心序列中motif的重复次数以及motif之间的嵌合序列；
筛选模块，其用于筛选重复次数>＝3的motif，保留它们之间的嵌合序列，作为MSI序列；过滤模块，其用于统计全部MSI序列的频次和频率，过滤频率小于阈值的MSI序列。
本发明提出的基于Pacbio数据的MSI微卫星不稳定性检测方法，针对MSI长度<＝20kb的序列，都可以通过Pacbio测序结果，分析出准确的MSI序列状态，解决了相关技术中MSI检测敏感性低，检测长度受限的问题。
附图说明
图1是根据本发明实施例的用于Pacbio的数据处理的示意图。
图2是本发明基于Pacbio数据的MSI微卫星不稳定性检测系统的示意图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
本发明的一个方面，提供了一种PacBio测序数据的处理方法，该方法包括：
步骤一，测序错误的校正，由于Pacbio测序数据存在15％左右的测序错误，测序错误会影响数据的比对和MSI的识别，需要利用ccs软件将Pacbio测序数据校正为CCS序列，为保证校正后的测序错误率低于0.1％，设置参数min-passes>＝10；
步骤二，检测MSI-PCR上下游引物的位置，提取MSI-PCR产物序列；为保证步骤一获取的CCS序列的可靠性，需要检测CCS序列中是否包含引物序列，通过bwa aln软件默认参数将引物序列比对到CCS序列上，检测引物位置，根据引物位置提取产物序列，过滤不含有引物序列的CCS序列；
步骤三，根据MSI核心区域上下游20bp特异性序列，进一步提取核心序列；核心序列是MSI-PCR产物中microsatellite motif重复序列和motif之间的嵌合序列。通过核心序列两侧相邻的20bp特异性序列，利用bwa aln软件默认参数将特异性序列比对到步骤二获得的MSI-PCR产物序列上，检测特异性序列位置，根据特异性序列位置提取核心序列，过滤不含有特异性序列的MSI-PCR产物序列；
步骤四，反向序列的转化，如果步骤三核心序列两侧相邻的20bp特异性序列的比对方向为负，则需要将提取的核心序列进行反向互补，转化为正向序列；
本发明的另一个方面，提供了一种检测核心序列中MSI类型和数目的数据处理方法，该方法包括：
步骤一，检测microsatellite motif重复序列的重复次数，通过匹配核心序列中存在的motif，统计motif的重复次数以及motif之间的嵌合序列；
步骤二，MSI序列的筛选，筛选重复次数>＝3的motif，保留它们之间的嵌合序列，作为MSI序列；
步骤三，MSI序列的过滤，由于PCR错位，测序错误等原因，MSI序列中依然存在假阳性的结果，需要统计全部MSI序列的频率，过滤频率小于阈值的MSI序列。所述阈值优选为5％；考虑到肿瘤组织的异质性，肿瘤组织样本可以放宽过滤阈值。
本发明提供的基于Pacbio数据的MSI微卫星不稳定性检测系统，其包括：
测序校正模块，其利用ccs软件将Pacbio测序数据校正为CCS序列；
产物序列提取模块，其用于检测MSI-PCR上下游引物的位置，并提取MSI-PCR产物序列；
核心序列提取模块，其用于根据MSI核心区域上下游20bp特异性序列，进一步提取核心序列；
反向序列转化模块，其用于对所述核心序列进行反向互补转化；
统计模块，其用于根据给定的microsatellite motif，检测产物序列或核心序列中motif的重复次数以及motif之间的嵌合序列；
筛选模块，其用于筛选重复次数>＝3的motif，保留它们之间的嵌合序列，作为MSI序列；过滤模块，其用于统计全部MSI序列的频次和频率，过滤频率小于阈值的MSI序列。
实施例1，人类HTT基因CAG，CCG motif检测
本实施例测序数据包括1个MSI-PCR的50M Pacbio测序数据。
(1)利用ccs软件合并Pacbio测序数据，共获得5347条CCS序列
(2)通过bwa aln比对引物序列，提取MSI-PCR产物序列，共获得5104条MSI-PCR产物序列
(3)通过bwa aln比对核心序列两侧相邻的20bp特异性序列，提取核心序列，共获得5101条核心序列
(4)特异性序列比对方向为负的核心序列，转化为反向互补序列
(5)匹配CAG，CCG类型的重复序列位置，统计重复次数。
(6)筛选重复次数>＝3的motif，保留它们之间的嵌合序列，作为MSI序列。
(7)统计MSI序列的频次和频率，结果如下：
过滤频率<＝5％的结果，保留结果如下：
基于上述结果，本发明可以有效检测多种类型的嵌合MSI motif，且能准确预测杂合基因型。
实施例2，人类TBP基因CAG，CAA motif检测
本实施案例测序数据包括1个MSI-PCR的80M Pacbio测序数据。
(1)利用ccs软件合并Pacbio测序数据，共获得6290条CCS序列
(2)通过bwa aln比对引物序列，提取MSI-PCR产物序列，共获得6005条MSI-PCR产物序列
(3)通过bwa aln比对核心序列两侧相邻的20bp特异性序列，提取核心序列，共获得5992条核心序列
(4)特异性序列比对方向为负的核心序列，转化为反向互补序列
(5)匹配CAG，CCG类型的重复序列，统计重复次数
(6)筛选重复次数>＝3的motif，保留它们之间的嵌合序列，作为MSI序列。
(7)统计MSI序列的频次和频率，结果如下：
过滤频率<＝5％的结果，保留结果如下：
基于上述结果，本发明可以有效检测多种类型的嵌合MSI motif，且能准确预测杂合基因型
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
Claims (6)
1.一种基于Pacbio数据的MSI微卫星不稳定性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，测序错误的校正，利用ccs软件将Pacbio测序数据校正为CCS序列；
步骤二，检测MSI-PCR上下游引物的位置，并提取MSI-PCR产物序列；
步骤三，根据MSI核心区域上下游20bp特异性序列，进一步提取核心序列；
步骤四，旁邻特异性序列是反向比对的，需要对所述核心序列进行反向互补转化；
步骤五，根据给定的microsatellite motif，检测产物序列或核心序列中motif的重复次数以及motif之间的嵌合序列；其中，检测microsatellite motif重复序列的重复次数，通过匹配核心序列中存在的motif，统计motif的重复次数以及motif之间的嵌合序列；
步骤六，筛选重复次数>＝3的motif，保留它们之间的嵌合序列，作为MSI序列；
步骤七，统计全部MSI序列的频次和频率，过滤频率小于阈值的MSI序列；所述阈值为5％；或，若为肿瘤组织样本，则阈值的取值范围为大于5％。
2.如权利要求1所述的基于Pacbio数据的MSI微卫星不稳定性检测方法，其特征在于，步骤一中，为保证校正后的测序错误率低于0.1％，设置参数min-passes>＝10。
3.如权利要求1所述的基于Pacbio数据的MSI微卫星不稳定性检测方法，其特征在于，步骤二中，为保证步骤一获取的CCS序列的可靠性，需要检测CCS序列中是否包含引物序列，通过bwa aln软件默认参数将引物序列比对到CCS序列上，检测引物位置，根据引物位置提取产物序列，过滤不含有引物序列的CCS序列。
4.如权利要求1所述的基于Pacbio数据的MSI微卫星不稳定性检测方法，其特征在于，步骤三中，所述核心序列是MSI-PCR产物中microsatellite motif重复序列和motif之间的嵌合序列；通过核心序列两侧相邻的20bp特异性序列，利用bwa aln软件默认参数将特异性序列比对到步骤二获得的MSI-PCR产物序列上，检测特异性序列位置，根据特异性序列位置提取核心序列，过滤不含有特异性序列的MSI-PCR产物序列。
5.如权利要求1所述的基于Pacbio数据的MSI微卫星不稳定性检测方法，其特征在于，步骤四中，若步骤三中核心序列两侧相邻的20bp特异性序列的比对方向为负，则需要将提取的核心序列进行反向互补，转化为正向序列。
6.一种基于Pacbio数据的MSI微卫星不稳定性检测系统，其特征在于，采用如权利要求1-5之任一项所述的基于Pacbio数据的MSI微卫星不稳定性检测方法，所述系统包括：
测序校正模块，其利用ccs软件将Pacbio测序数据校正为CCS序列；
产物序列提取模块，其用于检测MSI-PCR上下游引物的位置，并提取MSI-PCR产物序列；
核心序列提取模块，其用于根据MSI核心区域上下游20bp特异性序列，进一步提取核心序列；
反向序列转化模块，其用于对所述核心序列进行反向互补转化；
统计模块，其用于根据给定的microsatellite motif，检测产物序列或核心序列中motif的重复次数以及motif之间的嵌合序列；
筛选模块，其用于筛选重复次数>＝3的motif，保留它们之间的嵌合序列，作为MSI序列；
过滤模块，其用于统计全部MSI序列的频次和频率，过滤频率小于阈值的MSI序列。
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| CN111370063A (zh) | 2020-07-03 |
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Denomination of invention: A method and system for MSI microsatellite instability detection based on Pacbio data Effective date of registration: 20220831 Granted publication date: 20210910 Pledgee: Shanghai Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Xuhui sub branch Pledgor: SHANGHAI OE BIOTECH CO.,LTD. Registration number: Y2022310000222 |
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Granted publication date: 20210910 Pledgee: Shanghai Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Xuhui sub branch Pledgor: SHANGHAI OE BIOTECH CO.,LTD. Registration number: Y2022310000222 |