CN105916983A

CN105916983A - 用于高效且特异性靶向包含高度重复基序的dna序列的稀有切割核酸内切酶的设计

Info

Publication number: CN105916983A
Application number: CN201480066491.8A
Authority: CN
Inventors: P·杜察特乌; A·朱雷拉特
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2013-10-25
Filing date: 2014-10-24
Publication date: 2016-08-31
Also published as: KR20160068971A; KR102251168B1; IL245298A0; JP7083595B2; AU2014338910B2; AU2014338910A1; EP3060658A1; WO2015059265A1; US20160273002A1; JP2016535594A; EP3060658B1; CA2927965A1; US10508289B2; IL245298B

Abstract

本发明涉及遗传编辑工具及遗传工程方法的领域。本发明涉及被设计来缩小染色体中高度重复基序的稀有切割核酸内切酶的工程化，所述高度重复基序是某些遗传性疾病的病因，特别是所谓的“三联体重复疾病”，诸如亨廷顿病。本发明包括用于缩小重复基序的方法，用于缩小经历重复病症的基因中重复基序的稀有切割核酸内切酶，编码所述稀有切割核酸内切酶的多核苷酸和载体以及所得到的药物组合物。

Description

用于高效且特异性靶向包含高度重复基序的DNA序列的稀有切割核酸内切酶的设计

发明领域

本发明的发明领域为遗传编辑工具及其用途。本发明涉及被设计来缩小染色体中的高度重复基序(motive)的稀有切割核酸内切酶的工程化，所述高度重复基序是某些遗传性疾病的病因，特别是所谓的“三联体重复疾病”，诸如亨廷顿病。本发明包括用于缩小重复基序的方法、用于缩小经历重复病症的基因中重复基序的稀有切割核酸内切酶、编码其的多核苷酸和载体以及所得的药物组合物。

发明背景

自20世纪90年代初以来，不稳定的核苷酸(微卫星)重复(repeat)(特别是三核苷酸重复)的扩展被鉴定为是某些人类疾病内在的新型突变机制。多年来，几种另外的发育和神经肌肉病症被鉴定为由三核苷酸重复以及不稳定的四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和更长重复的插入或复制(duplication)引起的(Mirkin 2007)。多核苷酸重复的此种插入或复制可诱导蛋白质的功能损失、RNA毒性的功能获得或蛋白质毒性的功能获得，从而导致病症。此类病症的实例包括亨廷顿病、遗传性共济失调、脆性X综合征、强直性肌营养不良(常见的遗传性肌营养不良)、一组显性遗传性共济失调和最近发现C9ORF72基因中不稳定六核苷酸重复为额颞叶痴呆/肌萎缩侧索硬化症的常见原因(DeJesus-Hernandez,Mackenzie等2011；Renton,Majounie等2011)(综述参见(Nelson,Orr等2013))。

针对大多数重复扩展型病症的治疗选择极其有限。设想用于各种神经退行性疾病的最吸引人的治疗策略之一是基因疗法。事实上，已经开发了关闭重复扩展的表达的几种策略。具体地，使用RNA干扰技术在细胞内沉默突变基因已被实现用于阻止蛋白质或RNA的毒性功能(Wang,Liu等2005；Machida,Okada等2006；DiFiglia,Sena-Esteves等2007)。然而，RNA干扰的设计基本上不允许区分正常与重复扩展序列，并且诱导突变基因和野生型基因的同时下降(Caplen,Taylor等2002)。然而，亨廷顿蛋白广泛表达并且是神经元功能和在脑中的存活所需的(Duyao,Auerbach等1995；Dragatsis,Levine等2000)。因此，特异性减少突变基因的表达而使野生型蛋白质的表达不受影响是重要的。

最近，锌指蛋白被设计来结合亨廷顿基因的多-三核苷酸重复，所述基因造成亨廷顿病。锌指与适当的接头拼接(concatenate)成长链以获得用于相较于较短的重复优先抑制重复扩展的亨廷顿基因的最佳构型。该策略允许相较于野生型基因，更高效地抑制突变基因的表达。然而，一直不清楚抑制是否会足以降低基因疗法的蛋白质水平(Garriga-Canut,Agustin-Pavon等，国际申请：WO2013/130824)。

先前的研究(Richard,Dujon等1999)已经表明，诱导重复序列内的切割事件与三核苷酸重复阵列的缩小相关，这可通过两个不同的机制来解释：(1)断裂的两个末端可用于侵入模板，但它们可在模板内的任意位置侵入，因为它们具有与模板同源的重复序列；或(2)只有一个末端侵入模板并且新合成的链被从它的模板取代，但可与含有重复的另一个末端退火(Richard,Dujon等1999)。然而，由于基因组内存在高频率的重复序列，因此被设计来特异性针对所述重复序列的工程化DNA结合核酸酶可能在整个人基因组的几个位置上诱导位点外诱变(off-site mutagenesis)。因此，十分希望的是仅在所需基因组位置上在重复序列中产生切割的能力。

为了克服上述限制，本发明人已开发了通过使用DNA结合核酸酶来减少扩展的多核苷酸重复的数目的基因治疗策略，同时维持基因组的完整性和经校正基因的功能性。该策略主要依赖于DNA结合核酸酶的设计连同特异性靶向与三联体重复病症相关的重复序列的基因组序列的选择。

发明概述

在一般方面，本发明涉及用于缩小多核苷酸重复(优选在经历重复病症的特定基因中)的稀有切割核酸内切酶。具体地，对稀有切割核酸内切酶进行工程化以特异性切割重复序列，其特征在于所述稀有切割核酸内切酶识别包含与重复序列相邻的区域的靶序列。本发明涉及工程化用于诱导特定区域中高度重复基序内的缩小的稀有切割核酸内切酶的方法。优选地，所述稀有切割核酸内切酶靶向包含与重复序列相邻的区域的序列，使得稀有切割核酸内切酶特异性结合所选靶序列并切割该重复序列。重复序列的切割诱导修复过程，进行该修复过程以缩小特定基因内的重复序列，从而使扩展的重复序列减少至接近野生型构型。优选地，所述稀有切割核酸内切酶为特异性切割重复序列的Cas9-指导RNA复合物，其特征在于该指导RNA与包含与重复序列相邻的区域的靶序列杂交。优选地，所述稀有切割核酸内切酶是模块化DNA结合核酸酶，其包含与核酸内切酶的催化域融合的DNA结合域(诸如TALE、MBBBD、锌指(ZF)域)。所述DNA结合核酸酶可作为单体或二聚体起作用。二聚体DNA结合核酸酶包含第一DNA结合域和第二DNA结合域，所述第一DNA结合域能够与重复序列相邻的序列结合并与核酸酶催化域融合，所述第二DNA结合域能够结合重复序列并与核酸酶催化域融合(参见图1)。作为二聚体起作用的所述核酸酶催化域优选是FokI催化域。本发明的稀有切割核酸内切酶特别适合用于通过缩小高度重复基序区域治疗或预防重复疾病(诸如亨廷顿病)。

附图和表的简述：

图1：经工程化以特异性切割重复序列的TALE核酸酶的示意图。

图2：经工程化以特异性切割重复序列的二聚体TALE-核酸酶的用途的示意图。将一个TALE-核酸酶半域工程化以识别包含与重复序列相邻的区域的靶序列，并将另一个TALE-核酸酶半域工程化以识别重复序列内的靶序列，诸如二聚体TALE-核酸酶切割该重复序列。重复序列的切割诱导修复过程，诸如导致缩小重复的单链退火(SSA)过程。

图3：经工程化以特异性切割重复序列的单体TALE-核酸酶的用途的示意图。经工程化以特异性切割重复序列的单体TALE-核酸酶识别包含与该重复序列相邻的区域的靶序列。重复序列的切割诱导修复过程，诸如导致缩小重复的单链退火(SSA)过程。

图4：经工程化以特异性切割重复序列的Cas9-指导RNA复合物的用途的示意图。该指导RNA经工程化以特异性识别包含与重复序列相邻的区域的靶序列，使得Cas9-指导RNA复合物切割该重复序列。重复序列的切割诱导修复过程，诸如导致缩小重复的单链退火(SSA)过程。

表1：被两个TALEN对靶向的序列的列表。由TALEN靶向的侧接重复序列的16bp序列(省略位置T0)被加下划线。

表2：在37℃下，TALEN在如先前描述的我们的酵母SSA测定(国际PCT申请WO 2004/067736和于Epinat,Arnould等2003；Chames,Epinat等2005；Arnould,Chames等2006；Smith,Grizot等2006中)中的活性。–代表不可检测的活性，+表示弱活性以及++代表高活性。n.a.表示无可获得的数据。

发明描述

除非本文中具体定义，否则所使用的全部技术和科学术语具有与由基因治疗、生物化学、遗传学和分子生物学领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

除非另有所指，否则本发明的实施将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，所述技术在本领域技术人员的能力之内。此类技术在文献中得以全面解释。参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library ofCongress,USA)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版(Sambrook等，2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Mullis等美国专利号4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins编辑1984)；Transcription AndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑1984)；Culture OfAnimal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；ImmobilizedCells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical GuideTo Molecular Cloning(1984)；系列Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson和M.Simon，主编，Academic Press,Inc.,New York)，具体地，第154和155卷(Wu等编辑)和第185卷，"Gene ExpressionTechnology"(D.Goeddel，编辑)；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编辑，1987,Cold SpringHarbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(Mayer和Walker，编辑，Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编辑，1986)和Manipulating the MouseEmbryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。

用于缩小多核苷酸重复的工程化稀有切割核酸内切酶

本发明涉及能够特异性识别和切割重复序列的稀有切割核酸内切酶。为了避免位点外靶向，本发明人工程化稀有切割核酸内切酶以特异性切割重复序列，其特征在于所述稀有切割核酸内切酶识别包含与该重复序列相邻的区域的靶序列。重复序列的裂解诱导进行来缩小多核苷酸重复(优选存在于经历重复病症的基因中)的修复过程。在具体的实施方案中，本发明涉及工程化特异性切割重复序列的稀有切割核酸内切酶的方法。具体地，所述方法包括以下步骤：(a)选择包含与重复序列相邻的区域的靶序列；(b)工程化能够识别所述靶序列并切割该重复序列的稀有切割核酸内切酶。

根据本发明的靶序列可存在于染色体、附加体、细胞器基因组(诸如线粒体或叶绿体基因组)或遗传物质中，所述遗传物质可独立于遗传物质的主体(诸如感染性病毒基因组、质粒、附加体、转座子)而存在。靶核酸序列可存在于基因的编码序列内、转录的非编码序列(诸如，例如，前导序列、尾随序列或内含子)内或编码序列的上游或下游的非转录序列内。核酸靶序列由所述靶的一条链的5’至3’序列界定。具体地，靶序列包含重复序列的一部分和与其相邻的序列。

重复序列可以是三核苷酸重复，但也可以是四核苷酸、五核苷酸或六核苷酸。作为非限制性实例，所述重复序列可以是(CGC)n,(GAA)n,(CTG)n,(CCTG)n,(CGG)n,(ATTCT)n,(CAG)n，其中n可包括1-20000，优选10-15000，优选大20的数(综述参见：(Orr和Zoghbi2007))。所述靶序列包含重复序列的一部分，其包含至少3个，优选至少4、5、6、7、8、9、10个核苷酸。

与重复序列相邻的区域需要足够长以被稀有切割核酸内切酶特异性识别。与重复序列相邻的区域包含至少5个核苷酸，优选至少6、7、8、9、10、11、12、15个核苷酸。在更优选的实施方案中，所述相邻序列包含5-10个核苷酸。相邻序列可在相对重复序列的5’或3’区域中。所述靶序列优选在其中不稳定重复的扩展可引起神经学病症的基因序列内。作为非限制性实例，所述基因序列可选自：包含(CGG)n重复单位的脆性X智力低下基因1(FMR1,MIM号：309550,NG_007529.1)的5’非翻译区(UTR)序列；包含(CCG)n重复单位的脆性X智力低下基因2(FMR2,MIM号300806,NG_016313.1)的5’UTR序列、包含(GAA)n重复单位的弗里德赖希共济失调1基因(FRDA,MIM号：606829,NG_008845.2)的第一内含子；包含(CTG)n重复单位的营养不良性肌强直-蛋白激酶基因(DMPK,MIM号605377,NG_009784.1)的3’UTR；包含(CCTG)n重复单位的锌指(Zing finger)9基因(ZNF9,MIM号：602668,NG_011902.1)的第一内含子；包含(CAG)n重复单位的共济失调蛋白(Ataxin)8(ATXN8,MIM号：613289,GenBank:DQ641254.1)；包含(CTG)n重复单位的共济失调蛋白8相反链(ATXN8OS,MIM号：603680,NR_002717.2)，包含(CAGT)n重复单位的共济失调蛋白10基因(ATXN10,MIM号：611150,NG_016212.1)的内含子9；包含(CAG)n重复单位的蛋白磷酸酶2调节亚单位Bβ基因(PPP2R2B,MIM号：604325,NG_011570.1)的5’UTR序列；包含(CAG)n重复单位的亨廷顿基因(HTT,MIM号：613004,NG_009378.1)的N-末端；包含(CAG)n重复单位的共济失调蛋白1(ATXN1,MIM号：601556,NG_011571.1)；包含(CAG)n重复的共济失调蛋白2(ATXN2；MIM号：601517,NG_011572.1)；包含(CAG)n重复单位的共济失调蛋白3(ATXN3,MIM号：607047,NG_008198.1)；包含(CAG)n重复单位的钙通道电压依赖性P/Q型α-1A亚单位基因(CACNA1A,MIM号：601011,NC_000019.9)的外显子47；包含(CAG)n重复单位的ataxin 7(ATXN7,MIM号：607640,NG_008227.1)；包含(CAG)n和/或(CAA)n重复单位的TATA框结合蛋白基因(TBP,MIM号：60075,NG_008165.1)；包含(CAG)n重复单位的脊椎和雄激素受体基因(AR,MIM号：313700,NG_009014.2)的外显子1；包含(CAG)n重复单位的的atrophin 1基因(ATN1,MIM号：607462,NG_008047.1)及其同源物。

在更优选的实施方案中，所述靶序列选自编码亨廷顿蛋白的序列(SEQ ID NO:1)内，优选编码亨廷顿蛋白的N-末端部分的序列(SEQID NO:2)内，更优选靶序列选自序列SEQ ID NO:3内。

“稀有切割核酸内切酶”意指能够催化DNA或RNA分子(优选DNA分子)内的核酸之间的键的水解(切割)的任何野生型酶或变体酶。稀有切割核酸内切酶是高度特异性的，识别长度范围在10至45个碱基对(bp)、通常长度范围在10至35个碱基对的核酸靶位点。根据本发明的核酸内切酶识别并切割特定多核苷酸序列(还称为“靶系列”)处的核酸。稀有切割核酸内切酶可识别和产生特定多核苷酸序列处的单链或双链断裂。

根据本发明的稀有切割核酸内切酶可以是Cas9核酸内切酶。最近，已基于来自II型原核生物CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复)适应性免疫系统(综述参见(Sorek,Lawrence等2013))的RNA指导的Cas9核酸酶(Gasiunas,Barrangous等2012；Jinek,Chylinski等2012；Cong,Ran等2013；Mali,Yang等2013)开发了新的基因组工程化工具。CRISPR相关(Cas)系统首先在细菌中被发现，并起到防御外来DNA(病毒或质粒DNA)的作用。CRISPR-介导的基因组工程化首先进行通常侧接短序列基序(称为原间隔子(proto-spacer)邻近基序(PAM))的靶序列的选择。在靶序列选择后，工程化与该靶序列互补的特定crRNA。CRISPR II型系统中所需的反式激活crRNA(tracrRNA)与crRNA配对并结合于所提供的Cas9蛋白。Cas9用作促进tracRNA与cRNA碱基配对的分子锚(Deltcheva,Chylinski等2011)。在该三元复合物中，双tracrRNA:crRNA结构用作将核酸内切酶Cas9导向关联靶序列的指导RNA。在本发明中，指导RNA可与包含与重复序列相邻的区域的靶序列杂交。由Cas9-tracrRNA:crRNA复合物进行的靶识别通过就靶序列与crRNA之间的同源性扫描靶序列来启动。除了靶序列-crRNA互补性以外，DNA靶向还需要与原间隔子相邻的短基序(原间隔子邻近基序-PAM)的存在。在双RNA与靶序列之间配对后，Cas9随后在PAM基序的上游3个碱基引入平端双链断裂(Garneau,Dupuis等2010)。根据本发明，在双-RNA(指导RNA)与包含与重复序列相邻的区域的靶序列杂交后，Cas9切割重复序列(参见图4)。

稀有切割核酸内切酶还可以是归巢核酸内切酶，也称为兆核酸酶。此类归巢核酸内切酶在本领域中是众所周知的(Stoddard 2005)。归巢核酸内切酶识别DNA靶序列并产生单链断裂或双链断裂。归巢核酸内切酶是高度特异性的，识别长度范围在12至45个碱基对(bp)、通常长度范围在14至40bp的DNA靶位点。根据本发明的归巢核酸内切酶可以例如对应于LAGLIDADG核酸内切酶、HNH核酸内切酶或GIY-YIG核酸内切酶。根据本发明的优选归巢核酸内切酶可以是I-CreI变体。“变体”核酸内切酶(即在自然界中非天然存在的并通过遗传工程或通过随机诱变获得的核酸内切酶)可结合与被野生型核酸内切酶识别的DNA序列不同的DNA序列(参见国际申请WO2006/097854)。

所述稀有切割核酸内切酶可以是模块化DNA结合核酸酶或嵌合核酸内切酶。嵌合核酸内切酶或模块化DNA结合核酸酶意指包含核酸内切酶的至少一个催化域和至少一个DNA结合域或规定核酸靶序列的蛋白质的任何融合蛋白。

所述DNA结合域一般为由独立折叠的多肽蛋白域(其含有至少一个识别双链或单链多核苷酸的基序)形成的RNA结合域或DNA结合域。所述核酸结合域优选识别称为靶序列的特定核酸序列。许多此类多肽已在本领域中被描述为具有结合特定核酸序列的能力。此类结合域通常包含(作为非限制性实例)螺旋-转角螺旋域、亮氨酸拉链域、有翼螺旋域、螺旋-环-螺旋域、HMG-盒域、免疫球蛋白域、B3域或工程化锌指域。

根据本发明的优选实施方案，DNA结合域来源于转录激活因子样效应子(TALE)，其中序列特异性由一系列源自黄单胞菌属(Xanthomonas)或青枯菌属(Ralstonia)细菌蛋白质的33-35个氨基酸重复驱动。这些重复基本上相异在于规定与碱基对的相互作用的2个氨基酸位置(Boch,Scholze等2009；Moscou和Bogdanove 2009)。DNA靶中的每一个碱基对被单个重复接触，特异性由重复的两个变异氨基酸(所谓的重复可变二肽，RVD)导致。TALE结合域还可包含负责靶序列的第一胸腺嘧啶碱基(T₀)的需要的N-末端转运域和含有细胞核定位信号(NLS)的C-末端域。TALE核酸结合域一般对应于包含多个TALE重复序列的工程化核心TALE支架，每一个重复包含特异于TALE识别位点的每一个核苷酸碱基的RVD。在本发明中，所述核心支架的每一个TALE重复序列由30至42个氨基酸、更优选33或34个氨基酸组成，其中位于位置12和13上的两个关键氨基酸(所谓的重复可变二肽，RVD)介导识别所述TALE结合位点序列的一个核苷酸；等价的两个关键氨基酸可位于除了位置12和13之外的位置，尤其在长度大于33或34个氨基酸的TALE重复序列中。优选地，与不同核苷酸的识别相关的RVD为HD(用于识别C)、NG(用于识别T)、NI(用于识别A)、NN(用于识别G或A)。在另一个实施方案中，可将关键氨基酸12和13突变成其它氨基酸残基以调节它们对于核苷酸A、T、C和G的特异性，并且特别是增强该特异性。其它氨基酸残基是指20个天然氨基酸残基或非天然氨基酸衍生物中的任一个。

TALE核酸结合域通常包含8至30个TALE重复序列。更优选地，本发明的所述核心支架包含8至20个TALE重复序列；又更优选为15个TALE重复序列。它还包含由位于所述一组TALE重复序列的C-末端的20个氨基酸，即另外的C-末端半-TALE重复序列组成的另外的单个截短的TALE重复序列。根据本发明的TALE核酸结合域优选包含选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核酸序列。在另一个实施方案中，所述工程化TALE结合域包含与选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核酸序列具有至少80％，更优选90％，又更优选95％同一性的核酸序列。

其它工程化DNA结合域为模块化碱基-每个-碱基(base-per-base)特异性核酸结合域(MBBBD)(PCT/US2013/051783)。可以例如从新鉴定的蛋白质(即来自内共生体真菌BurkholderiaRhizoxinica的最近测序的基因组的EAV36_BURRH、E5AW43_BURRH、E5AW45_BURRH和E5AW46_BURRH蛋白(Lackner,Moebius等2011))工程化所述MBBBD。MBBBD蛋白包含为碱基特异性的约31至33个氨基酸的模块。这些模块显示与黄单胞菌属(Xanthomonas)TALE共同重复具有小于40％的同一性，然而它们呈现更大的多肽序列可变性。当将它们组装在一起时，这些模块化多肽仍可以与黄单胞菌属TAL-核酸酶十分相似的方式靶向特定的核酸序列。

根据本发明的优选实施方案，所述DNA结合域是包含10至30个模块、优选16至20个模块的工程化MBBBD结合域。来自上述伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)和黄单胞菌属的蛋白质(模块，N-末端和C-末端)的不同域用于对具有针对特定核酸序列的结合性质的新蛋白质或支架进行工程化。具体地，工程化MBBBD的另外的N-末端和C-末端域可来源于天然TALE，像作为非限制性实例的AvrBs3、PthXo1、AvrHah1、PthA、Tal1c。

“TALE-核酸酶”或“MBBBD-核酸酶”是指由通常来源于转录激活因子样效应蛋白(TALE)或MBBBD结合域的DNA结合域与核酸内切酶催化域的融合产生的工程化蛋白质。此种催化域优选为核酸酶域，更优选具有核酸内切酶活性的域，像例如I-TevI、ColE7、NucA和Fok-I。在具体实施方案中，所述核酸酶是单体TALE-核酸酶或MBBBD-核酸酶。单体核酸酶为进行特异性识别和切割不需要二聚化的核酸酶，诸如工程化DNA结合域与WO2012138927中描述的I-TevI的催化域的融合(参见图3)。在另一个具体实施方案中，所述稀有切割核酸内切酶为二聚体TALE-核酸酶或MBBBD-核酸酶，优选包含融合至FokI的DNA结合域(参见图1)。所述二聚体核酸酶包含第一DNA结合核酸酶和第二DNA结合核酸酶，所述第一DNA结合核酸酶能够结合包含与重复序列相邻的区域的靶序列，所述第二DNA结合核酸酶能够结合重复序列内的靶序列，使得二聚体核酸酶诱导重复序列内的切割事件(参见图2)。TALE-核酸酶已被描述并用于刺激基因靶向和基因修饰(Boch,Scholze等2009；Moscou和Bogdanove 2009；Christian,Cermak等2010)。此类工程化TALE-核酸酶可在商标名TALEN^TM(Cellectis,8rue de la Croix Jarry,75013Paris,France)下商购获得。

在另一个方面，本发明还涉及此处公开的稀有切割核酸内切酶，优选可通过上述方法获得的稀有切割核酸内切酶。在优选实施方案中，本发明涉及与选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少70％，优选80％、85％、90％、95％同一性的稀有切割核酸内切酶。

多核苷酸、载体：

本发明还涉及编码上述根据本发明的稀有切割核酸内切酶的多核苷酸、载体。在优选实施方案中，本发明涉及包含选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:16的核酸序列的多核苷酸。在优选实施方案中，所述多核苷酸与选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:16的核酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％序列同一性。

所述多核苷酸可存在于表达盒或表达载体(例如，用于引入细菌宿主细胞的质粒，或用于转染昆虫宿主细胞的病毒载体诸如杆状病毒载体，或用于转染哺乳动物宿主细胞的质粒或病毒载体诸如慢病毒)。

在具体实施方案中，可在一个包含编码核糖体跳过序列(ribosomal skip sequence)的核酸序列诸如编码2A肽的序列的多核苷酸或载体中包含不同的核酸序列。在小RNA病毒的口蹄疫病毒亚群中鉴定的2A肽引起从一个密码子至下一个密码子的核糖体“跳过”而不在由所述密码子编码的两个氨基酸之间形成肽键(参见(Donnelly和Elliott，2001；Donnelly,Luke等2001；Atkins,Wills等2007；Doronina,Wu等2008))。“密码子”意指mRNA上(或DNA分子的有义链上)上的通过核糖体翻译成一个氨基酸残基的3个核苷酸。因此，当多肽被读框内的2A寡肽分隔时，可从mRNA内的单个连续开放阅读框合成两条多肽。此类核糖体跳过机制在本领域中是众所周知的，并且已知通过几个载体用于表达由单个信使RNA编码的几个蛋白质。

本领域技术人员将认识到的是，鉴于遗传密码的简并性，在这些多核苷酸分子中可能存在相当多的序列变异。优选地，将本发明的核酸序列进行密码子优化以用于在哺乳动物细胞中表达，优选用于在人细胞中表达。密码子优化是指目标序列中给定的物种的高度表达的基因中通常罕见的密码子与此类物种的高度表达的基因中的一般常见的密码子(此类密码子与将被交换的密码子编码相同的氨基酸)的交换。

用于缩小经历重复病症的重复序列的方法

在另一个方面，本发明还涉及用于将经历重复病症的基因序列内的重复序列缩小进活细胞的方法。该方法包括以下步骤：(a)选择包含与重复序列相邻的区域的靶序列；(b)提供至少一种能够结合所述靶序列并切割重复序列的稀有切割核酸内切酶；(c)将所述稀有切割核酸内切酶引入所述细胞并且(d)将所述稀有切割核酸内切酶与基因序列接触，使得所述稀有切割核酸内切酶切割重复序列，从而诱导进行来缩小所述重复序列的修复过程。在优选实施方案中，所述修复过程是单链退火(SSA)。单链退火(SSA)是当在以相同方向取向的两个重复序列之间产生切割时启动的过程。在断裂附近产生延伸至重复序列的单链区域，以便互补链可相互退火。该退火的中间体可通过消化掉单链尾并在退火过程中填充缺口来进行加工。在具体实施方案中，所述方法包括在细胞内表达能够结合根据本发明的靶序列的稀有切割核酸内切酶。在更具体的实施方案中，所述方法包括用至少一种编码如上所述的稀有切割核酸内切酶的多核苷酸转化细胞，并将所述多核苷酸表达进所述细胞。

上述方法包括将稀有切割核酸内切酶引入细胞。作为非限制性实例，可将所述稀有切割核酸内切酶作为由一个质粒载体编码的转基因引入。所述质粒载体还可含有提供用于鉴定和/或选择接受所述载体的细胞的选择标记。

可作为将编码所述多肽的多核苷酸引入细胞的结果，在细胞中原位合成多肽。或者，可在细胞外部产生所述多肽，随后将所述多肽引入该细胞。用于将多核苷酸构建体引入细胞的方法在本领域中是已知的，并且作为非限定性实例包括其中将多核苷酸构建体整合进细胞的基因组的稳定转化法、其中将多核苷酸构建体不整合进细胞的基因组的瞬时转化法以及病毒介导法。可通过例如重组病毒载体(例如，逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等将所述多核苷酸引入细胞。例如，瞬时转化法包括例如显微注射、电穿孔或粒子轰击。为了在细胞中表达，可将所述多核苷酸包含在载体、更具体地质粒或病毒中。

本发明还涉及易于通过上述段落中所述的方法获得的分离的细胞或细胞系。具体地，所述分离的细胞包含至少一种如上所述的稀有切割核酸内切酶。在另一个实施方案中，所述分离的细胞包含减小的重复扩展序列。在优选实施方案中，所述分离的细胞是哺乳动物细胞。

应用

在另一个方面，根据本发明的所述稀有切割核酸内切酶可用于治疗或预防由不稳定的重复扩展引起的疾病，优选作为非限制性实例：脆性X综合征(FRAXA)、脆性XE综合征(FRAXE)、弗里德赖希共济失调(FRDA)、强直性肌营养不良(DM1)、脆性X相关震颤共济失调综合征(FXTAS)、CAG重复扩展疾病诸如脊髓延髓肌肉萎缩症(SBMA)、亨廷顿病(HD)、脊髓小脑性共济失调1型、齿状红核苍白球(dentatorubal-pallidoluysian)萎缩症、Machado-Joseph病、脊髓小脑性共济失调2、脊髓小脑性共济失调6和脊髓小脑性共济失调7。本发明的所述稀有切割核酸内切酶优选用于治疗亨廷顿病。可使用例如病毒载体向受试者直接施用所述稀有切割核酸内切酶(体内)。可通过全身性施用(例如静脉内、腹膜内、肌内、皮下或颅内输注)或局部施用来施用所述稀有切割核酸内切酶。或者，可将所述稀有切割核酸内切酶用于体外处理细胞，随后通常在选择已整合了载体的细胞后向受试者施用经修饰的细胞(离体)。

本发明还涉及包含特异于重复序列的根据本发明的稀有切割核酸内切酶的药物组合物。根据本发明的药物组合物可用于缩小细胞内的特定重复序列。根据待施用的特定组合物以及根据用于施用组合物的特定方法来部分确定药学上可接受的载体。因此，存在可获得的各种各样的药物组合物的适合制剂。

本发明的方法和组合物还可用于设计和实现体外和体内模型，例如重复病症的动物模型，所述模型允许研究这些病症。合适的体外模型的非限制性实例包括来自任何生物的细胞或细胞系，包括成纤维细胞。用作动物模型的合适动物的非限制性实例包括无脊椎动物(秀丽隐杆线虫(C.elegans)、果蝇(Drsophilia))、啮齿类动物(例如，大鼠或小鼠)、灵长类动物(例如，非人灵长类动物)。

定义

在上述描述中，许多术语被广泛使用。以下定义被提供来帮助理解本发明的实施方案。

如本文中所用，“一个(a)”或“一个(an)”可意指一个或不止一个。

如本文中所用，术语“大约”表示包括用于测定值的方法的固有误差变化或实验之间存在的变化的值。

-本文中按照单字母代码来指定多肽序列中的氨基酸残基，其中，例如，Q意指Gln或谷氨酰胺残基，R意指Arg或精氨酸残基以及D意指Asp或天冬氨酸残基。

-氨基酸取代意指另一个氨基酸对一个氨基酸的替代，例如肽序列中谷氨酰胺残基对精氨酸残基的替代是一种氨基酸取代。

-如下指定核苷酸：一字母代码用于指定核苷的碱基：a为腺嘌呤，t为胸腺嘧啶，c为胞嘧啶，以及g为鸟嘌呤。对于简并核苷酸，r表示g或a(嘌呤核苷酸)，k表示g或t，s表示g或c，w表示a或t，m表示a或c，y表示t或c(嘧啶核苷酸)，d表示g、a或t，v表示g、a或c，b表示g、t或c，h表示a、t或c，以及n表示g、a、t或c。

-如本文中所用，“核酸”或“核酸分子”是指核苷酸和/或多核苷酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、由聚合酶链式反应(PCR)产生的片段，以及通过连接、切断、核酸内切酶作用和核酸酶外切酶作用的任一种产生的片段。核酸分子可由为天然存在的核苷酸(诸如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的对映体形式)的单体或两者的组合的组成。经修饰的核苷酸可在糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分中有改变。糖修饰包括，例如，卤素、烷基、胺基和叠氮基对一个或多个羟基的替代，或糖可被官能化为醚或酯。此外，可用空间上和电子上相似的结构，诸如氮杂-糖和碳环糖类似物替换整个糖部分。碱基部分中修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶，或其它众所周知的杂环取代物。可通过磷酸二酯键或此类键的类似物连接核酸单体。核酸可以是单链或双链。

-“基因”意指遗传的基本单位，其由以线性方式沿染色体排列的DNA的区段组成，其编码特定的蛋白质或蛋白质的区段。基因通常包括启动子、5'非翻译区、一个或多个编码序列(外显子)、任选地内含子、3'非翻译区。基因还可包含终止子、增强子和/或沉默子。

-术语“切割”是指多核苷酸共价主链的断裂。切割可通过各种方法起始，包括、但不限于磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链切割和双链切割两者都是可能的，双链切割可作为两个不同的单链切割事件的结果发生。双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交体切割可导致平末端或交错末端的产生。

-“催化域”旨在指酶的含有所述酶的活性部位的蛋白质域或模块，活性部位旨在指在该部位发生底物催化的所述酶的部分。按照它们催化的反应分类和命名酶以及它们的催化域。酶学委员会编号(EC编号)为酶基于它们催化的化学反应的数值分类10方案。

-根据本发明，“同源的”意指，相对于氨基酸的第一序列，与所述第一氨基酸序列具有至少60％或至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％同源性并且具有类似生物学活性的任何氨基酸序列。

序列同源性可由本领域技术人员通过本领域中常用的任何方法来鉴定。各种比对算法和/或程序可用于计算两个序列之间的同一性，其包括可作为GCG序列分析包(University of Wisconsin,Madison,Wis.)的部分获得的并且可利用例如默认设置来进行使用的FASTA或BLAST。

-“同一性”是指两个核酸分子或多肽之间的序列同一性。同一性可通过比较可为了比较目的而被对齐的每条序列中的位置来确定。当被比较的序列中的位置被相同碱基占据时，则所述分子在该位置被鉴定为是同一的。核酸或氨基酸序列之间的相似性或同一性的程度是由核酸序列所共有的位置上的相同或匹配核苷酸的数目的函数。各种比对算法和/或程序可用于计算两个序列之间的同一性，包括可作为GCG序列分析包(University of Wisconsin,Madison,Wis.)的部分获得的并且可利用例如默认设置来进行使用的FASTA或BLAST。

-“杂交序列”意指可在标准低严格条件下与其他寡核苷酸之一杂交的寡核苷酸的序列部分。此类条件可以是例如通过使用缓冲液(含有25％甲酰胺,4×SSC,50mM NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液；pH 7.0,5×Denhardt’s,1mM EDTA,1mg/ml DNA+20-200ng/ml待测试的探针(约20-200ng/ml))在室温下进行2小时。如文献中所提供的，这也可通过在室温下使用序列内的互补碱基的数目和G-C的含量，通过杂交的标准计算来预测。优选地，杂交序列按照两个核酸链之间的互补性(依赖于链之间的Watson-Crick碱基配对(即腺嘌呤与胸腺嘧啶(A-T)核苷酸之间以及鸟嘌呤与胞嘧啶(G-C)核苷酸之间的固有碱基配对))彼此互补。等同于Watson-Crick碱基配对的精确碱基配对包括标准核苷与经修饰的核苷之间的碱基配对以及经修饰的核苷之间的碱基配对，其中所述经修饰的核苷能够按照Watson-Crick配体取代适当的标准核苷。单链寡核苷酸的互补序列可以是在反应条件下支持两条单链寡核苷酸之间的特异性和稳定的杂交的任何长度。

-“递送载体”旨指可在本发明中用于与细胞接触(即“接触”)或将本发明中所需要的试剂/化学物质和分子(蛋白质或核酸)递送至细胞或亚细胞区室内部的任何递送载体。它包括、但不限于脂质体递送载体、病毒递送载体、药物递送载体、化学载体、聚合物载体、脂质复合物(lipoplex)、多聚物复合物(polyplex)、树状聚合物、微泡(超声对比剂)、纳米颗粒、乳剂或其它适当的转移载体。这些递送载体允许递送分子、化学品、大分子(基因、蛋白质)或其它载体诸如由Diatos开发的质粒、肽。在这些情况下，递送载体是分子运载体。“递送载体”也指进行转染的递送方法。

-术语“载体”是指能够将转运已与其连接的另一个核酸的核酸分子。本发明中的“载体”包括、但不限于，病毒载体、质粒、RNA载体或线性或环状DNA或RNA分子，其可由染色体、非染色体、半合成或合成核酸组成。优选载体是能够自主复制(附加型载体)和/或表达与它们连接的核酸(表达载体)的那些载体。许多合适的载体对于本领域技术人员来说是已知的并且可商购获得。

-病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒诸如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如，狂犬病和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒)、正链RNA病毒诸如小RNA病毒和α病毒，以及双链DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒1型和2型、EB病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘、鸡痘和金丝雀痘)。其它病毒包括例如诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病肉瘤、哺乳动物C-型、B-型病毒、D-型病毒、HTLV-BLV群、慢病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,InFundamental Virology，第3版，B.N.Fields,等，编辑，Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996)。

-细胞旨在指任何原核或真核生物活细胞，用于体外培养的来源于这些生物的细胞系，来自动物或植物来源的原代细胞。

-“原代细胞”旨在指从活组织(即活检材料)直接获取并被建立用于体外生长的细胞，其已经历极少的群体倍增，从而相较于连续致瘤或人工永生化的细胞系，更加能够代表它们所源自的组织的主要功能组分和特征。这些细胞从而代表针对它们所指的体内状态的更具价值的模型。

在本发明的框架内，“真核细胞”是指真菌、植物或动物细胞或来源于下面所列的生物并被建立用于体外培养的细胞系。

更优选，动物细胞为以下属的细胞：智人(Homo)、鼠(Rattus)、小鼠(Mus)、野猪(Sus)、牛(Bos)、斑马鱼(Danio)、犬(Canis)、猫(Felis)、马(Equus)、鳟鲑鱼(Salmo)、大麻哈鱼(Oncorhynchus)、鸡(Gallus)、火鸡(Meleagris)、果蝇(Drosophila)、隐杆线虫(Caenorhabditis)；更优选地、动物细胞为以下种的细胞：智人(Homosapiens)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、小家鼠(Mus musculus)、野猪(Sus scrofa)、黄牛(Bos taurus)、斑马鱼(Danio rerio)、灰狼(Canis lupus)、家猫(Felis catus)、马(Equus caballus)、大西洋鲑(Salmo salar)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、原鸡(Gallusgallus)、野生火鸡(Meleagris gallopavo)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)。

在本发明中，细胞可以是哺乳动物细胞、鱼细胞、昆虫细胞或来源于这些生物用于体外培养的细胞系或直接从活组织获取并被建立用于体外培养的原代细胞。作为非限制性实例，细胞系可选自CHO-K1细胞、HEK293细胞、Caco2细胞、U2-OS细胞、NIH 3T3细胞、NSO细胞、SP2细胞、CHO-S细胞、DG44细胞、K-562细胞，U-937细胞、MRC5细胞、IMR90细胞、Jurkat细胞、HepG2细胞、HeLa细胞、HT-1080细胞、HCT-116细胞、Hu-h7细胞、Huvec细胞、Molt4细胞。还包括在本发明的范围内的细胞是干细胞和诱导多能干细胞(iPS)。

所有这些细胞系可通过本发明的方法来修饰以提供细胞系模型。

-如本文中所用，“受试者”包括动物界的所有成员，包括非人灵长类动物和人。

实施例：

TALE主链中的RVD阵列集合的克隆

用于这些实验的两个TALE主链(pCLS9303和pCLS9312，SEQID NO:4和5)在C末端与N末端域之间含有两个BsmBI限制性位点。使用II型限制性酶BsmBI(用于接受质粒)以及BbvI和SfaNI(用于插入的RVD阵列)将靶向侧接重复三核苷酸(SEQ ID NO:6至7)的区域的单个重复阵列亚克隆入pCLS9303中，产生pCLS9984和pCLS16715(SEQ ID NO:9编码的SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:11编码的SEQ ID NO:10)。使用II型限制性酶BsmBI(用于接受质粒)以及BbvI和SfaNI(用于插入的RVD阵列)将靶向侧接重复三核苷酸(SEQ ID NO:14)的区域的单个重复阵列亚克隆入pCLS9312，产生pCLS9996(SEQ ID NO:16编码的SEQ ID NO:15)。通过DNA测序评估每一个单个克隆的单克隆性DNA序列。

酵母中TALE-核酸酶的活性

如先前所述(国际PCT申请WO 2004/067736和于Epinat,Arnould等2003；Chames,Epinat等2005；Arnould,Chames等2006；Smith,Grizot等2006中)，构建两个含有TALEN^TM DNA靶序列的酵母靶报告质粒。在先前所述的我们的酵母SSA测定(国际PCT申请WO 2004/067736和于Epinat,Arnould等2003；Chames,Epinat等2005；Arnould,Chames等2006；Smith,Grizot等2006中)中，在37℃和30℃下，对两个靶(SEQ ID NO:12至13，表1)测试TALEN^TM对(pCLS9984/pCLS9996和pCLS16715/pCLS9996)。TALEN^TM在酵母中对它们的靶的切割活性水平示于表2中。

表1:被2个TALEN对靶向的序列的列表。

由TALEN^TM靶向的侧接重复序列的16bp序列(省略位置T0)被加下划线。

表2：在37℃和30℃下，TALEN^TM在如先前所述的我们的酵母SSA测定(国际PCT申请WO 2004/067736和于Epinat,Arnould等2003；Chames,Epinat等2005；Arnould,Chames等2006；Smith,Grizot等2006；Smith,Grizot等2006中)中的活性。

在37℃	pCLS9984/pCLS9996	pCLS16715/pCLS9996
			TiFLAN	+++	-
TiFLAN2_T01.1	+	+++
			在30℃	pCLS9984/pCLS9996	pCLS16715/pCLS9996
TiFLAN	+++	-
			TiFLAN2_T01.1	-	++

–代表不可检测的活性，+表示弱活性，++表示高活性。n.a.表示无可获得的数据。

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Claims

1.一种稀有切割核酸内切酶，其用于在细胞中缩小经历重复病症的基因中的多核苷酸重复，所述稀有切割核酸内切酶被工程化来特异性切割重复序列，其特征在于所述稀有切割核酸内切酶识别包含与所述重复序列相邻的区域的靶序列。

2.权利要求1的稀有切割核酸内切酶，其中所述稀有切割核酸内切酶识别横跨与所述序列重复相邻的至少10个核酸碱基和所述重复序列内的至少5个核酸碱基的靶序列。

3.权利要求1的稀有切割核酸内切酶，其中所述稀有切割核酸内切酶为嵌合核酸内切酶，其包含识别包含与所述重复序列相邻的区域的靶区域的结合域和在所述重复序列内切割的核酸内切酶域。

4.权利要求3的稀有切割核酸内切酶，其中所述结合域是工程化的TALE、MBBBD或ZF结合域。

5.权利要求4的方法，其中所述核酸内切酶域选自I-TevI、NucA、ColE7或Fok-1。

6.权利要求1的稀有切割核酸内切酶，其中所述稀有切割核酸内切酶为Cas9并且其中所述靶序列的识别是通过能够与所述靶序列杂交的引导RNA获得的。

7.权利要求1的稀有切割核酸内切酶，其中所述靶序列在选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3的序列内。

8.权利要求7的稀有切割核酸内切酶，其具有SEQ ID NO:8、10和15的至少80％，优选85％、90％、95％的氨基酸序列。

9.权利要求1至8的任一项的稀有切割核酸内切酶，其用于治疗或预防重复疾病。

10.权利要求1至8的任一项的稀有切割核酸内切酶，其用于治疗或预防所述亨廷顿病。

11.一种多核苷酸，其编码权利要求1至10的任一项的所述稀有切割核酸内切酶。

12.一种载体，其包含权利要求11的多核苷酸。

13.一种药物组合物，其包含权利要求1至10的任一项的至少一种稀有切割核酸内切酶，或权利要求11或12的多核苷酸。

14.一种缩小经历重复病症的基因序列内的重复序列进入活细胞的方法：

(a)选择包含与所述重复序列相邻的区域的靶序列；

(b)提供能够结合所述靶序列并切割所述重复序列的稀有切割核酸内切酶；

(c)将所述稀有切割核酸内切酶引入所述细胞；

使得所述DNA结合核酸酶诱导重复序列内的切割和诱导进行来缩小所述重复序列的修复过程。

15.权利要求14的方法，其中进行来缩小所述重复序列的修复过程是SSA(单链退火)。

16.一种缩小权利要求15的细胞的基因序列内的重复序列的方法，其中所述稀有切割核酸内切酶是权利要求1至10的任一项的稀有切割核酸内切酶。

17.一种分离的细胞，其包含权利要求9至12的任一项的至少一种稀有切割核酸内切酶，或权利要求13的一种多核苷酸。

18.权利要求17的分离的细胞，其为哺乳动物细胞。