CN117210435A - 一种用于调控rna甲基化修饰的编辑系统及其应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明涉及一种用于调控RNA甲基化修饰的编辑系统及其应用。所述编辑系统具有氧化还原开关,当系统处于氧化状态时,其开关所在的蛋白或结构域不具备生物活性,当系统处于还原状态时,其开关所在的蛋白或结构域具备生物活。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种用于调控RNA甲基化修饰的编辑系统及其应用。
背景技术
RNA修饰是一种转录后水平的调控方式,广泛存在于mRNA、tRNA、rRNA以及lncRNA等各种RNA上,而甲基化修饰是目前发现最多的RNA修饰之一,目前在哺乳动物中已经检测到5-甲胞嘧啶(m5C)、N1-甲基腺嘌呤(m1A)、N6-甲基腺嘌呤(m6A)、假尿嘧啶以及5-羟甲基胞嘧啶(hm5C)等多种RNA甲基化修饰。这些RNA甲基化修饰在mRNA剪切和转录、蛋白质翻译、维持基因组稳定等生物过程均发挥着重要作用,其动态变化可以调节基因和蛋白质表达、影响信号转到以及决定细胞命运(Zaccara S.,et al.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2019,20,608-624;He PC&He C.EMBO J.2021,40,e105977)。因此,RNA修饰的异常变化与多种疾病的发生和发展有着密切联系(WangT.,et al.Mol.Cancer 2020,19,88;Jiang X.,etal.Signal Trans.TargetTher.2021,6,74)。
尽管RNA的甲基化修饰在生命活动中有着无与伦比的重要作用,目前对于RNA甲基化修饰的精准调控方法大多采用CRISPR-Cas系统。Liu XM等人用Cas9与RNA的甲基化酶METTL3-METTL14、去甲基化酶FTO和ALKBH5融合实现了RNAm6A甲基化的精准编辑(LiuXM etal.,Nat.Chem.Biol.2019,15,865-871)。随后DavidR.Liu实验室利用Cas13编辑系统构建了新的RNA m6A编辑工具TRM(Wilson C.et al.,Nat.Biotech.2020,38,1431-1440)。相比与Cas9编辑系统,TRM具有更高的特异性并且将脱靶风险降低了5.5倍。以上基于CRISPR-Cas系统的RNAm6A编辑工具虽然可以实现单碱基的RNAm6A甲基化编辑,但是将CRISPR系统导入细胞后,编辑工具会持续进行编辑,因此无法随时终止或计时,同时也会导致大量的脱靶效应。
近期,Zhao J.等人开发了一种光控的CRISPR-Cas13编辑系统PAMEC,通过将光敏蛋白与Cas13b、m6A甲基化酶METTL3-METTL14和m6A去甲基化蛋白FTO组装在一起,从而实现光控的精准m6A甲基化编辑(Zhao J.et al.,Small 2020,16,e1907301)。Shi H.等人开了一种利用植物激素脱落酸作为开关的CRISPR-Cas13编辑系统,通过将脱落酸的结合蛋白PYL和ABI分别融合到Cas13b和m6A甲基化酶METTL3上,从而实现化学诱导的精准m6A甲基化编辑(Shi H.et al.,Nat.Commun.2022,13,1958)。以上两种方法虽然可以控制m6A甲基化的时间控制,但是无论光控还是化学诱导都会对细胞造成一定影响,从而扰乱细胞的基因表达和RNA修饰状态。
发明内容
发明要解决的问题
针对现有技术的不足,本发明提供一种用于调控RNA甲基化修饰的编辑系统,通过在Cas13蛋白和腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域中引入氧化还原开关,构建了基于CRISPR-Cas13系统的可控RNA编辑系统。
用于解决问题的方案
本发明提供一种用于调控RNA甲基化修饰的编辑系统,所述编辑系统包括靶向元件、编辑元件;
其中所述靶向元件包含失活型Cas13蛋白;所述编辑元件包含腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域。
优选地,所述失活型Cas13蛋白选自失活型Cas13a、失活型Cas13b、失活型Cas13c、失活型Cas13d、失活型Cas13f、失活型Cas13X和失活型Cas13Y的野生型或突变体的全长或部分序列。
优选地,所述失活型Cas13蛋白选自失活型Cas13a、失活型Cas13b和失活型Cas13X的野生型或突变体的全长或部分序列。
优选地,所述失活型Cas13蛋白选自失活型Cas13X的野生型或突变体的全长或部分序列。
优选地,所述失活型Cas13蛋白选自失活型Cas13X.1的野生型或突变体的全长或部分序列。
优选地,所述失活型Cas13蛋白包含以下序列中的一种或多种:
I)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;
II)与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少80%、82%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列,并且其保留如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的活性;
III)在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列,并且其保留如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的活性;或者,
IV)与I)~III)中任一项部分互补或完全互补的核酸。
优选地,所述失活型Cas13蛋白包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
优选地,所述腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域对RNA甲基化基序“RRACH”具有特异性的催化功能,其中R代表鸟嘌呤或腺嘌呤,H代表腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。
优选地,所述腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域包含以下序列中的一种或多种:
a)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列;
b)与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少80%、82%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列,并且其保留如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的活性;
c)在SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列,并且其保留如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的活性;或者,
d)与a)~c)中任一项部分互补或完全互补的核酸。
优选地,所述腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
优选地,所述编辑系统进一步还含有向导元件。
优选地,所述向导元件包含靶向目标序列的crRNA或gRNA。
优选地,所述crRNA或gRNA的长度为19-120bp。
优选地,所述RNA甲基化修饰选自5-甲胞嘧啶(m5C)、N1-甲基腺嘌呤(m1A)、N6-甲基腺嘌呤(m6A)、假尿嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶(hm5C)。
优选地,所述RNA甲基化修饰选自N1-甲基腺嘌呤(m1A)和N6-甲基腺嘌呤(m6A)。
本发明提供一种多核苷酸,编码如上所述的编辑系统。
本发明提供一种载体,包含如上所述的多核苷酸。
本发明提供一种细胞,包含如上所述的编辑系统、如上所述的多核苷酸和如上所述的载体中的一种或多种。
本发明提供一种药物组合物,包含如上所述的编辑系统、如上所述的多核苷酸、如上所述的载体和如上所述的细胞中的一种或多种,以及药学上可接受的载体。
本发明提供如上所述的编辑系统、如上所述的多核苷酸、如上所述的载体、如上所述的细胞或如上所述的组合物在制备用于调节RNA甲基化修饰的药物中的应用。
发明的效果
本发明提供的编辑系统具有优异的编辑效率以及极窄的编辑窗口,可以特异性地在癌细胞系中调控RNA的甲基化修饰,促进了疾病的靶向治疗,并且促进了碱基编辑器在精准治疗中的应用。
本发明提供的编辑系统具有氧化还原开关,当系统处于氧化状态时,其开关所在的蛋白或结构域不具备生物活性,当系统处于还原状态时,其开关所在的蛋白或结构域具备生物活。
附图说明
图1:氧化型靶向元件oxCas13x(A)和还原型靶向元件reCas13x(B)与crRNA结合的结构示意图。
图2:氧化型(oxCas13x)和还原型(reCas13x)靶向元件的稳态动力学特征示意图。
图3:氧化型编辑元件oxADAR2-DD(A)和还原型编辑元件reADAR2-DD(B)与adRNA结合的结构示意图。
图4:野生型ADAR2-DD、ADAR2-DD-E488Q、氧化型编辑元件oxADAR2-DD和还原型编辑元件reADAR2-DD在GAC和GAU位点上的编辑效率示意图。
图5:带有氧化还原开关的Cas13x-ADAR2-DD融合蛋白对MALAT1的第2577位核苷酸m6A甲基化的编辑效率示意图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂,下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。其中,附图不一定是按比例绘制的,局部特征可以被放大或缩小,以更加清楚的显示局部特征的细节;除非另有定义,本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。
本发明提供一种用于调控RNA甲基化修饰的编辑系统,所述编辑系统包括靶向元件、编辑元件;
其中所述靶向元件包含失活型Cas13蛋白;所述编辑元件包含腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域。
在某些实施方式中,所述失活型Cas13蛋白选自失活型Cas13a、失活型Cas13b、失活型Cas13c、失活型Cas13d、失活型Cas13f、失活型Cas13X和失活型Cas13Y的野生型或突变体的全长或部分序列。
在某些实施方式中,所述失活型Cas13蛋白选自失活型Cas13a、失活型Cas13b和失活型Cas13X的野生型或突变体的全长或部分序列。
在某些实施方式中,所述失活型Cas13蛋白选自失活型Cas13X的野生型或突变体的全长或部分序列。
在某些实施方式中,所述失活型Cas13蛋白选自失活型Cas13X.1的野生型或突变体的全长或部分序列。
在某些实施方式中,所述失活型Cas13蛋白包含以下序列中的一种或多种:
I)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;
II)与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少80%、82%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列,并且其保留如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的活性;
在某些实施方式中,与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有80%、80.5%、81%、80.5%、、81.5%、82%、82.5%、83%、83.5%、84%、84.5%、85%、85.5%、86%、86.5%、87%、87.5%、88%、88.5%、89%、89.5%、90%、90.5%、91%、91.5%、92%、92.5%、93%、93.5%、94%、94.5%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%同一性的氨基酸序列,并且其保留如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的活性;
III)在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列,并且其保留如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的活性;或者,
IV)与I)~III)中任一项部分互补或完全互补的核酸。
在某些实施方式中,所述失活型Cas13蛋白包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2:
KRVLLFRDILAQLGRIPAEAYEYYHGEQGDKKRANDNEGTNPKRHKDKFIEFALHYLEAQHSEICFGRRHIVREEAGAGDEHKKHRTKGKVVVDFSKKDEDQSYYISKNNVIVRIDKNAGPRSYRMGLNELKYLVLLSLQGKGDDAIAKLYRYRQHVENILDVVKVTDKDNHVFLPRFVLEQHGIGRKAFKQRIDGRVKHVRGVWEKKKAATNEMTLHEKARDILQYVNENCTRSFNPGEYNRLLVCLVGKDVENFQAGLKRLQLAERIDGRVYSIFAQTSTINEMHQVVCDQILNRLCRIGDQKLYDYVGLGKKDEIDYKQKVAWFKEHISIRRGFLRKKFWYDSKKGFAKLVEEHLESGGGQRDVGLDKKYYHIDAIGRFEGANPALYETLARDRLCLMMAQYFLGSVRKELGNK
SEQ ID NO:3:
KRVLLFRDILAQLGRIPAEAYEYYHGEQGDKKRANDNEGTNPKRHKDKFIEFALHYLEAQHSEICFGRRHIVREEAGAGDEHKKHRTKGKVVVDFSKKDEDQSYYISKNNVIVRIDKNAGPRSYRMGLCELKYLVLLSLQGKGDDAIAKLYRYRQHVENILDVVKVTDKDNHVFLPRFVLEQHGIGRKAFKQRIDGRVKHVRGVWEKKKAATNEMTLHEKARDILQYVNENCTRSFNPGEYNRLLVCLVGKDVENFQAGLKRLQLAERIDGRVYSIFAQTSTINEMHQVVCDQILNRLCRIGDQKLYDYVGLGKKDEIDYKQKVAWFKEHISIRKGFLRKKFWYDSKKGFAKLVEEHLESGGGQRDVGLDKKYYHIDAIGRFEGANPALYCTLARDRLCLMMAQYFLGSVRKELGNK
在本发明中,“保留氨基酸序列活性”的表述,例如“保留如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的活性”,可以是完全保留原始序列的活性,也可以是部分保留原始序列的活性,例如保留30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%的活性。在另一些实施方案中,具有修改后的序列,例如具有经氨基酸取代的序列也可能具有高于原始序列的活性。
在某些实施方式中,所述失活型Cas13蛋白是带有开关的。
在某些实施方式中,所述开关为氧化还原开关,当系统处于氧化状态时,其开关所在的蛋白或结构域不具备生物活性,当系统处于还原状态时,其开关所在的蛋白或结构域具备生物活。
在某些实施方式中,所述氧化还原开关为赖氨酸-半胱氨酸开关,当系统处于氧化状态时,赖氨酸与半胱氨酸通过活性氧连接并关闭蛋白的编辑活性或催化活性,当系统处于还原状态时,赖氨酸与半胱氨酸之间的连接断开并开启蛋白的编辑活性或催化活性。
在某些实施方式中,所述腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域对RNA甲基化基序“RRACH”具有特异性的催化功能,其中R代表鸟嘌呤或腺嘌呤,H代表腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。
在某些实施方式中,所述腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域包含以下序列中的一种或多种:
a)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列;
b)与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少80%、82%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列,并且其保留如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的活性;
在某些实施方式中,与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有80%、80.5%、81%、80.5%、、81.5%、82%、82.5%、83%、83.5%、84%、84.5%、85%、85.5%、86%、86.5%、87%、87.5%、88%、88.5%、89%、89.5%、90%、90.5%、91%、91.5%、92%、92.5%、93%、93.5%、94%、94.5%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%同一性的氨基酸序列,并且其保留如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的活性;
c)在SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列,并且其保留如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的活性;或者,
d)与a)~c)中任一项部分互补或完全互补的核酸。
在某些实施方式中,所述腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8:
QLHLPQVLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGQLRTKIESGEGTIPVRSNASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKVH
SEQ ID NO:10:
QLHLPQVLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTRVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKKDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPACRHPNRKAKGQLRTKIESGKGTIPVRSFASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPCFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKVH
在某些实施方式中,所述腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域是带有开关的。
在某些实施方式中,所述开关为氧化还原开关,当系统处于氧化状态时,其开关所在的蛋白或结构域不具备生物活性,当系统处于还原状态时,其开关所在的蛋白或结构域具备生物活。
在某些实施方式中,所述氧化还原开关为赖氨酸-半胱氨酸开关,当系统处于氧化状态时,赖氨酸与半胱氨酸通过活性氧连接并关闭蛋白的编辑活性或催化活性,当系统处于还原状态时,赖氨酸与半胱氨酸之间的连接断开并开启蛋白的编辑活性或催化活性。
在某些实施方式中,所述编辑系统进一步还含有向导元件。
在某些实施方式中,所述向导元件包含靶向目标序列的crRNA或gRNA。
在某些实施方式中,所述crRNA或gRNA的长度为19-120bp。
在某些实施方式中,所述RNA甲基化修饰选自5-甲胞嘧啶(m5C)、N1-甲基腺嘌呤(m1A)、N6-甲基腺嘌呤(m6A)、假尿嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶(hm5C)。
在某些实施方式中,所述RNA甲基化修饰选自N1-甲基腺嘌呤(m1A)和N6-甲基腺嘌呤(m6A)。
本发明提供一种用于调控RNA甲基化修饰的编辑的融合蛋白,所述融合蛋白包括上述靶向元件、上述编辑元件。
在某些实施方式中,所述的靶向元件和编辑元件之间的连接子(Linker)序列长度为1-40个氨基酸
本发明提供一种多核苷酸,编码如上所述的编辑系统或融合蛋白。
本发明提供一种载体,包含如上所述的多核苷酸。
在某些实施方式中,所述载体是哺乳动物表达载体。在一些实施方案中,所述表达载体选自腺相关病毒、逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体和疱疹病毒载体中的一种或多种。在一些实施方案中,所述载体包含启动子。
本发明提供一种细胞,包含如上所述的编辑系统、如上所述的融合蛋白、如上所述的多核苷酸和如上所述的载体中的一种或多种。
在某些实施方式中,所述细胞是原核细胞、真核细胞。
在某些实施方式中,所述细胞是细菌细胞、植物细胞、昆虫细胞、人类细胞或哺乳动物细胞。
本发明提供一种药物组合物,包含如上所述的编辑系统、如上所述的融合蛋白、如上所述的多核苷酸、如上所述的载体和如上所述的细胞中的一种或多种,以及药学上可接受的载体。
本发明提供如上所述的编辑系统、如上所述的融合蛋白、如上所述的多核苷酸、如上所述的载体、如上所述的细胞或如上所述的组合物在制备用于调节RNA甲基化修饰的药物中的应用。
本发明中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常见步骤。例如,本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知且在如下文献中有全面的描述:Sambrook等人所著《Molecular Cloning:Alaboratory manual》,Cold SpringHarbor Laboratory Press 1989年出版。
本说明书中,使用“数值A-数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
术语“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列,本发明中所述的“元件”被系统的构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”序列可以是本发明中所提供的序列,但也包含其变体,只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能。
术语“编辑特异性”和“编辑偏好”在本文可以互换使用,是指底物中特定腺苷位点处的A-to-I编辑的程度。在某些实施方案中,本文所使用的腺苷脱氨酶对底物具有偏好,顺序位GAC>GAT(“>”表示偏好更大)。
术语“核酸”和“核酸分子”是指包含核碱基和酸性部分的化合物,例如核苷、核苷酸或核苷酸的聚合物。通常,聚合核酸,例如包含三个或更多个核苷酸的核酸分子是线性分子,其中相邻核苷酸通过磷酸二酯键相互连接。在一些实施方案中,“核酸”是指单个核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中,“核酸”是指包含三个或更多个单独核苷酸残基的寡核苷酸链。如本文所用,术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用以指核苷酸的聚合物(例如,至少三个核苷酸的串)。在一些实施方案中,“核酸”包括RNA以及单链和/或双链DNA。核酸可以是天然存在的,例如在基因组、转录物、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、snRNA、质粒、粘粒、染色体、染色单体或其他天然存在的核酸分子的上下文中。另一方面,核酸分子可以是非天然存在的分子,例如重组DNA或RNA、人工染色体、工程基因组或其片段,或合成的DNA、RNA、DNA/RNA杂交体、或包括非天然存在的核苷酸或核苷。此外,术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物,例如具有除磷酸二酯骨架之外的其他骨架的类似物。核酸可以从天然来源纯化、使用重组表达系统产生和任选地纯化、化学合成等。在合适的情况下,例如在化学合成分子的情况下,核酸可以包含核苷类似物,例如具有化学修饰碱基的类似物或糖和骨架修饰。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的,它可以包含修饰的氨基酸,并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如,二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作,如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。
术语“融合蛋白”是指包含来自至少两种不同蛋白质的蛋白质结构域的杂化多肽。一种蛋白质可位于融合蛋白的氨基-末端(N-末端,N端)部分或羧基-末端(C-末端,C端)蛋白处,因此分别形成“氨基-末端融合蛋白”或“羧基-末端融合蛋白”。本文提供的任何蛋白质可通过本领域已知的任何方法产生。例如,本文提供的蛋白质可经由重组蛋白质表达和纯化来产生,这尤其适合于包含肽接头的融合蛋白。用于重组蛋白质表达和纯化的方法是公知的,并且包括以下中所述的那些:Green and Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(2012)),其全部内容通过引用并入本文。
术语术语“Cas蛋白”是指CRISPR-associated蛋白,Cas蛋白与CRISPR序列共同构成CRISPR/Cas系统,Cas蛋白具有与核酸酶相关的功能结构域,通过识别PAM(protospaceradjacent motif)在特定位置切割靶序列。
术语“脱氨酶”或“脱氨酶结构域”是指催化脱氨反应的蛋白质或酶。在一些实施方案中,脱氨酶是腺苷脱氨酶,其催化腺嘌呤水解脱氨为次黄嘌呤。在一些实施方案中,脱氨酶是腺苷脱氨酶,其催化腺苷或腺嘌呤(A)水解脱氨为肌苷(I)。在一些实施方案中,脱氨酶或脱氨酶结构域是分别催化腺苷或脱氧腺苷水解脱氨为肌苷或脱氧肌苷的腺苷脱氨酶。在一些实施方案中,腺苷脱氨酶催化脱氧核糖核酸(DNA)中腺苷的水解脱氨。
术语“核酸可编程核苷酸结合结构域”、“核酸可编程DNA结合蛋白(Nucleic acidprogrammable DNA-binding protein,napDNAbp)”是指与核酸(例如,DNA或RNA),例如引导多核苷酸(例如,gRNA)结合的蛋白质,所述核酸例如通过与靶核酸序列杂交将napDNAbp引导至特定核酸序列。例如,Cas9蛋白可以与引导RNA结合,该引导RNA将Cas9蛋白引导至与引导RNA互补的特定DNA序列。在一些实施方案中,napDNAbp是Cas9结构域,例如,核酸酶活性Cas9,Cas9切口酶(nCas9)或无核酸酶活性Cas9(dCas9)。核酸可编程DNA结合蛋白的实例包括但不限于Cas9(例如,dCas9和nCas9)、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3和Argonaute蛋白(AGO)。然而,应当理解,核酸可编程DNA结合蛋白也包括结合RNA的核酸可编程蛋白。例如,napDNAbp可以与将napDNAbp引导至RNA的核酸结合。其他核酸可编程DNA结合蛋白也在本公开内容的范围内,尽管它们可能未在本公开内容中具体描述。
术语“引导多核苷酸”、“引导RNA”或“gRNA”是指可以特异性靶向目标序列并且可以与核酸可编程核苷酸结合结构域蛋白(例如Cas9)形成复合物的多核苷酸。在一个实施方案中,引导多核苷酸是引导RNA(gRNA)。gRNA可以作为两个或多个RNA的复合物存在,也可以作为单个RNA分子存在。以单个RNA分子形式存在的gRNA可称为单一引导RNA(sgRNA),但“gRNA”可互换使用以指以单个分子或两个或更多个分子的复合物形式存在的引导RNA。通常,作为单个RNA种类存在的gRNA包括两个结构域:(1)与目标核酸具有同源性的结构域(例如,引导Cas9复合物与目标核酸的结合);(2)结合Cas9蛋白的结构域。在一些实施方案中,结构域(2)对应于称为tracrRNA的序列,并且包括茎环结构。例如,在一些实施方案中,结构域(2)与Jinek et al.,Science 337:816-821(2012)中提供的tracrRNA相同或同源。gRNA的其他实例可以为在2013年9月6日提交的美国临时专利申请U.S.S.N.61/874,682(发明名称为“可切换的Cas9核酸酶及其用途(Switchable Cas9 Nucleases and Uses Thereof)”)和在2013年9月6日提交的美国临时专利申请U.S.S.N.61/874,746发明名称为“功能性核酸酶递送系统(Delivery System For Functional Nucleases)”中公开的。在一些实施方案中,gRNA包括结构域(1)和(2)中的两个或更多个,并且可以被称为“延伸的gRNA”。延伸的gRNA将结合两个或更多个Cas9蛋白并在两个或更多个不同区域结合目标核酸。gRNA包括与目标位点互补的核苷酸序列,其介导核酸酶/RNA复合物与所述目标位点的结合,提供核酸酶:RNA复合物的序列特异性。
根据本发明,所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
根据本发明,氨基酸“添加”指在氨基酸序列的C端或N端添加氨基酸。根据本发明,氨基酸“缺失”指可以从氨基酸序列中删除1、2或3个以上氨基酸。根据本发明,氨基酸“插入”指在氨基酸序列中的适当位置插入氨基酸残基,插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻,或插入的氨基酸之间都不彼此相邻。
根据本发明,氨基酸“取代”指在氨基酸序列中的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代;其中,“取代”可以是保守氨基酸取代。
根据本发明,“保守修饰”、“保守取代”或“保守置换”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸,使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓,一般而言,多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见Watson等(1987),MolecularBiology ofthe Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页,(第4版))。另外,结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。示例性保守取代于下表“示例性氨基酸保守取代”中陈述。
如本文可互换使用的术语“编码序列”或“蛋白质编码序列”是指编码蛋白质的多核苷酸片段。该区域或序列在靠近5'端的地方有一个起始密码子,在靠近3'端的地方有一个终止密码子。编码序列也可称为开放阅读框。
术语“互补的”或“杂交的”用于指与碱基配对规则相关的“多核苷酸”和“寡核苷酸”(它们是可互换的术语,指的是核苷酸序列)。例如,序列“CAGT”与序列“GTCA”互补。互补可以是“部分的”或“全部的”。“部分”互补是指一个或多个核酸碱基根据碱基配对规则错配,核酸之间的“全部”或“完全”互补是指每个核酸碱基在碱基配对下均与另一个碱基匹配规则。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有重要影响。这在扩增反应以及取决于核酸之间结合的检测方法中特别重要。
术语“核酸序列”和“核苷酸序列”是指寡核苷酸或多核苷酸及其片段或部分,并且是指可以是单链或双链的基因组或合成来源的DNA或RNA,和代表有义或反义链。
术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定:将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分,将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言,可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。示例性的,当使用序列比较算法或通过目视检查测量以最大的对应性进行比较和比对时,两个或多个序列或子序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸的“序列同一性”或“同一性百分比”。在某些实施方案中,所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物(例如,多核苷酸)的整个长度上基本相同。
术语“载体”是指将核酸序列引入细胞中从而产生转化细胞的手段。载体包括质粒、转座子、噬菌体、病毒、脂质体和附加体。“表达载体”是包含待在受体细胞中表达的核苷酸序列的核酸序列。表达载体可以包括额外的核酸序列以促进和/或促进引入序列的表达,例如起始、终止、增强子、启动子和分泌序列。
如本公开所使用的,术语“个体”和“受试者”可互换地使用,是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如,奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如,人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如,小鼠和大鼠)。特别地,个体是人。
本文公开的方法可以在体外、离体、或体内进行,或者产品可以以体外、离体、或体内形式存在。术语“体外”是指在实验室条件或培养液中使用材料、生物物质、细胞和/或组织的实验;而术语“体内”是指使用完整多细胞有机体的实验和工序。在一些实施方案中,体内进行的方法可以在非人动物上进行。“离体”是指存在于有机体外或发生在有机体外,例如在人或动物体外的事件,例如可以在取自有机体的组织(例如整个器官)或细胞上存在或发生的事件。
术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物,例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如,润滑剂、滑石粉、硬脂酸镁、钙或锌或硬脂酸)或溶剂包封材料,涉及将化合物从身体的一个部位(例如,递送部位)运送或运输到另一个部位(例如,器官、组织或身体的一部分)。药学上可接受的载体是“可接受的”,意思是与制剂的其他成分相容并且对受试者的组织无害(例如,生理学相容的、无菌的、生理学的pH等)。可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括:(1)糖,例如乳糖、葡萄糖和蔗糖;(2)淀粉,如玉米淀粉和马铃薯淀粉;(3)纤维素及其衍生物,如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素;(4)粉末黄蓍胶;(5)麦芽;(6)明胶;(7)润滑剂,如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石粉;(8)赋形剂,如可可脂和栓剂蜡;(9)油,如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油;(10)二醇,如丙二醇;(11)多元醇,如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG);(12)酯类,如油酸乙酯和月桂酸乙酯;(13)琼脂;(14)缓冲剂,如氢氧化镁和氢氧化铝;(15)海藻酸;(16)无热原水;(17)等渗盐水;(18)林格氏液;(19)乙醇;(20)pH缓冲溶液;(21)聚酯,聚碳酸酯和/或聚酸酐;(22)增量剂(bulkingagent),如多肽和氨基酸(23)血清成分,如血清白蛋白、高密度脂蛋白(high densitylipoprotein,HDL)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL);(22)C2-C12醇,如乙醇;和(23)药物制剂中采用的其他无毒相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于制剂中。诸如“赋形剂”、“药学上可接受的载体”等术语在本文中可互换使用。
术语“治疗”、“处理”是指如本文所述旨在逆转、缓解疾病或病症或其一种或多种症状、延迟疾病或病症或其一种或多种症状的发作或抑制疾病或病症或其一种或多种症状进展的临床干预。如本文所用,术语“治疗”、“处理”是指如本文所述旨在逆转、缓解疾病或病症或其一种或多种症状、延迟疾病或病症或其一种或多种症状的发作或抑制疾病或病症或其一种或多种症状进展的临床干预。在一些实施方案中,可以在一种或多种症状已经得以形成之后和/或疾病已经得到诊断之后施用治疗。在其他实施方案中,可以在没有症状的情况下施用治疗,例如用于预防或延迟症状的发作或抑制疾病的发作或进展。例如,可以在症状发作之前(例如,鉴于症状的历史和/或鉴于遗传或其他易感性因素)施用治疗于易感个体。治疗也可以在症状消退后继续进行,例如以预防或延迟其复发。
实施例1构建带有氧化还原开关的Cas13X蛋白
在本实施例中,靶向元件为失活型Cas13X,野生型的失活Cas13X(Uniprot ID:A0A660UUL5),其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。其中第1-185位氨基酸为HEPN1结构域,第198-260位(Helical-1-1)、第325-386位(Helical-1-2)和第517-608位(Helical-1-3)氨基酸共同组成Helical-1结构域,第386-517位氨基酸为Helical-2结构域,第616-775位氨基酸为HEPN2结构域,第186-197位和第609-615位氨基酸为结构域之间的连接子(Inter-domain linker)。根据Cas13X.1的结构研究和RNA识别机制(NakagawaR.et al.,Mol.Cell2022,82,3178-3192),本实施例使用的靶向元件包含野生型Cas13X.1的第198-614位氨基酸序列(以下称“miniCas13x”,其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示),同时在其中引入N326C、R532K和E588C突变(其氨基酸序列如SEQ ID No:3所示)。通过氧化反应使得Cys326-Lys532和Lys329-Cys588交联,从而获得氧化型靶向元件(以下称“oxCas13x”,其三维结构如图1、A所示);通过还原反应使得Cys326-Lys532和Lys329-Cys588之间的交联解开,从而获得还原型靶向元件(以下简称“reCas13x”,其三维结构如图1、B)。
表1
实施例2oxCas13x和reCas13x的稳态动力学
在本实施例中,oxCas13x和reCas13x分别按照前文所述方法构建,其氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。
编辑底物的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示:
SEQ ID No:4:ACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAGGACGTC
向导元件crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示:
SEQ ID No:5:
GGCCACCCCAAAAATGAAGGGGACTAAAACGTGGGCGGCGGTTGGTGTTA
反式底物的核苷酸序列如SEQ ID No:6所示:
SEQ ID No:6:UUUUUUUUUU
将oxCas13x和reCas13x分别与crRNA按照2:1的摩尔比混合,加入缓冲液A(20mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸,50mM KCl,100μg/mLBSA,0.01%聚乙二醇壬基苯基醚,5%甘油,pH6.8)并在室温下孵育15分钟,形成核酸结合蛋白RNP(Ribonucleoprotein)。将核酸结合蛋白RNP与编辑底物RNA混合,加入缓冲液B(20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸,50mM KCl,5.0mMMgCl2,100μg/mLBSA,0.01%聚乙二醇壬基苯基醚,5%甘油,pH 6.8)并室温孵育15分钟后,加入不同浓度的Alexa488和生物素修饰的反式底物并且在拟定时间点加入EDTA钠盐淬灭反应。对照组中Cas13x蛋白并未与crRNA混合形成RNP。反应结束后,用磁珠捕获未反应的反式底物,通过由标准曲线将荧光值转换得到的摩尔浓度来确定编辑产物的浓度。
稳态动力学结果如图2所示,还原型靶向元件reCas13x的催化常熟Kcat和米氏常数KM分别是氧化型靶向元件oxCas13x的约30倍和2倍,而其催化常熟和米氏常数的比值(Kcat/KM)为氧化型靶向元件oxCas13x的约19.8倍。由此可知,还原型靶向元件reCas13x具有较强的编辑能力而氧化型靶向元件oxCas13x的编辑能力非常微弱。但是在氧化型靶向元件oxCas13x体系中加入还原剂二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT),其编辑活性可以恢复。
实施例3构建带有氧化还原开关的ADAR2催化结构域
在本实施例中,编辑元件为人ADAR2D(Uniprot ID:P78563-6,SEQ ID No:7)的催化结构域(第316-674位氨基酸,以下称为野生型ADAR2-DD,其氨基酸序列如SEQ ID No:8所示)。其E488Q突变体(ADAR2-DD-E488Q,其氨基酸序列如SEQ ID No:9所示)根据腺嘌呤脱氨酶ADAR2的结构研究和其RNA识别机制(Macbeth M.R.,et al.,Science 2005,309,1534-1539;Matthews M.M.,et al.Nat.Struct.Mol.Biol.2016,23,426-433;Katrekar D.etal.,Nat.Methods 2019,16,239-242;Doherty E.E.,et al.J.Am.Chem.Soc.2021,143,6865-6867),本实施例中所采用的编辑元件中引入D362R、D419K、E488K和N496F等突变以提升其对基序“RRACH”(其中R代表鸟嘌呤或腺嘌呤,A代表腺嘌呤、H代表腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶)的编辑效率,同时还加入了D469C、R477K和N597C等突变以形成氧化还原开关(其氨基酸序列如SEQ ID No:10所示)。通过氧化反应使得Lys376-Cys597和Cys469-Lys477交联,从而获得氧化型编辑元件(以下称“oxADAR2-DD”,其三维结构如图3、A所示);通过还原反应使得Lys376-Cys597和Cys469-Lys477之间的交联解开,从而获得还原型编辑元件(以下简称“reADAR2-DD”,其三维结构如图3、B)。
表2
实施例4oxADAR2-DD和reADAR2-DD的体外编辑效率
在本实施例中,oxADAR2-DD和reADAR2-DD分别按照前文所述方法构建,其氨基酸序列如SEQ ID No:10所示,靶基因GAPDHADAR-recruiting RNA(adRNA)和引物的核苷酸序列如下:
SEQ ID No:11:GGTGCCAGCAGTTGGTGG(adRNA)
SEQ ID No:12:TGGGTGTGAACCATGAGAAGTAT(Forwardprimer)
SEQ ID No:13:TGGCATGGACTGTGGTCATG(Reverse primer)
靶基因RAB7AadRNA和引物的核苷酸序列如下:
SEQ ID No:14:TCCAACCACCACAAGTTTAT(adRNA)
SEQ ID No:15:AGGCCTGTAAGGTGGAGGG(Forwardprimer)
SEQ ID No:16:TGAAATAACGGCAATTTATCCATTGCACATAC(Reverse primer)
在本实施例中,oxADAR2-DD和reADAR2-DD的编辑效率通过体外HEK293T的RNA编辑实验进行检测。将HEK293T细胞均匀铺在48孔板中,加入500ngADAR2-DD质粒、500ng adRNA质粒和1μL转染试剂Lipofectamine 3000(Thermo Fisher),以30%左右的汇合度进行转染,48小时后收获细胞并提取RNA,取500ng RNA反转录成cDNA,取1μL cDNA通过PCR扩增引物位点周围约20bp,PCR产物经纯化后进行Sanger测序。RNA编辑效率计算方法为:
RNA编辑效率=鸟嘌呤的峰高/(腺嘌呤的峰高+鸟嘌呤的峰高)
如图4所示实验结果,野生型ADAR2-DD对于GAC(靶基因为RAB7A)和GAU(靶基因为GAPDH)编辑位点并无偏好性。相比于GAU位点,GAC位点是RNAm6A甲基化修饰的高发位点。ADAR2-DD-E488Q虽然对GAC位点具有一定偏好性,其GAC位点的编辑效率是GAU位点的1.75倍,但是其对于GAU位点的编辑效率也很高,在RNAm6A甲基化修饰的编辑中会产生严重干扰。还原型编辑元件reADAR2-DD在GAC编辑位点中展现出优秀的RNA编辑能力,是野生型ADAR2-DD的4倍、ADAR2-DD-E488Q的2.29倍,并且还原型编辑元件reADAR2-DD的GAU位点编辑能力非常微弱,仅为野生型ADAR2-DD的40%。这说明还原型编辑元件reADAR2-DD的RNA编辑能力具有一定的偏好性,其GAC位点的编辑能力是GAU位点的12倍。氧化型编辑元件oxADAR2-DD在GAC和GAU编辑位点上几乎没有编辑能力,但是加入还原剂二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)后,其GAC位点的编辑能力恢复。
实施例5构建和表达带有氧化还原开关的Cas13x-ADAR2-DD融合蛋白
本实施例中,融合蛋白由靶向元件、编辑元件和连接子三个部分组成。其中靶向元件选自本发明前述的带有氧化还原开关的Cas13x蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID No:3所示),编辑元件选自本发明前述的带有氧化还原开关的ADAR2-DD(其氨基酸序列如SEQ IDNo:10所示),连接子的氨基酸序列如SEQ ID No:17所示。上述带有氧化还原开关的Cas13x-ADAR2-DD融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:18所示。
上述带有氧化还原开关的Cas13x-ADAR2-DD融合蛋白的表达方法:将前述融合蛋白的基因序列(如SEQ ID No:18所示)克隆进pDUAL-HFF1载体,从而获得重组的pDUAL-HFF1-Cas13x-ADAR2-DD质粒,利用NotI酶切割前述pDUAL-HFF1-Cas13x-ADAR2-DD质粒,在37℃下反应30分钟后将线性pDUAL-HFF1-Cas13x-ADAR2-DD片段转化至裂殖酵母中,加入YES培养基(30mg/mL葡萄糖,50μg/mL腺嘌呤、尿嘧啶、L-组氨酸、L-亮氨酸和L-赖氨酸)培养至对数生长中期,利用醋酸锂/PEG/热休克方法转化后获得带有氧化还原开关的Cas13x-ADAR2-DD融合蛋白。
表3
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实施例6带有氧化还原开关的Cas13x-ADAR2-DD融合蛋白调节RNA甲基化修饰的应用
在本实施例中,MALAT1基因的第2577位核苷酸位点被选为编辑目标。转染带有氧化还原开关的Cas13x-ADAR2-DD融合蛋白和MALAT1 crRNA(其核苷酸序列如SEQ ID No:20所示)进入HeLa细胞和HCerEpiC细胞,24小时后加入DTT,培养24小时后收获细胞并提取RNA。取10μg RNA,加入片段化试剂(Thermo Fisher Cat.AM8740)在70℃下反应10分钟将mRNA打断成100-150nt的片段,用乙醇法沉淀并回收RNA片段,将含有proteinA和protein G的磁珠用缓冲液C(150nM NaCl,10mM Tris-HCl,pH 7.5)洗涤数次,加入5μgm6A抗体(Sigma-Aldrich Cat.MABE1006)并在4℃下孵育2小时,用缓冲液C洗涤后将磁珠重悬并加入RNA片段,在4℃下旋转过夜,洗脱磁珠上富集的RNA片段,逆转录为cDNA并进行qPCR检测,引物序列如SEQ ID No:21和SEQ ID No:22所示。
SEQ ID No:20:GCTACTATATTTAAGGCCTTCCAAATTCTT(MALAT1 crRNA)
SEQ ID No:21:CGTAACGGAAGTAATTCAAG(Forwardprimer)
SEQ ID No:22:GTCAATTAATGCTAGTCCTC(Reverse primer)
实验结果如图5所示,在癌细胞系HeLa细胞中,带有氧化还原开关的Cas13x-ADAR2-DD融合蛋白在没有加入DTT时,不具备RNA编辑能力且对于MALAT1的第2577位核苷酸的m6A甲基化修饰无显著性调节能力,说明融合蛋白此时处于氧化型状态并无RNA编辑能力。当加入还原剂DTT时,MALAT1的第2577位核苷酸的m6A甲基化修饰显著性下调,说明融合蛋白处于还原型状态,其RNA编辑能力被激活。在正常细胞HCerEpiC细胞中,无论是否加入还原剂DTT,融合蛋白均可以显著性下调MALAT1的第2577位核苷酸的m6A甲基化修饰水平,说明在正常细胞中融合蛋白一直处于还原型状态。由以上实验结果可知,带有氧化还原开关的Cas13x-ADAR2-DD融合蛋白可以特异性的在癌细胞系中调控RNA的m6A甲基化修饰。
应当理解,以上实施例均为示例性的,不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下,还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的,也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合,以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此,上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,不对本发明专利的保护范围进行限制。
Claims (10)
1.一种用于调控RNA甲基化修饰的编辑系统,其特征在于,所述编辑系统包括靶向元件、编辑元件;
其中所述靶向元件包含失活型Cas13蛋白;所述编辑元件包含腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域。
2.根据权利要求1所述的编辑系统,其特征在于,所述失活型Cas13蛋白选自失活型Cas13a、失活型Cas13b、失活型Cas13c、失活型Cas13d、失活型Cas13f、失活型Cas13X和失活型Cas13Y的野生型或突变体的全长或部分序列;
优选地,所述失活型Cas13蛋白选自失活型Cas13a、失活型Cas13b和失活型Cas13X的野生型或突变体的全长或部分序列;
优选地,所述失活型Cas13蛋白选自失活型Cas13X的野生型或突变体的全长或部分序列;
优选地,所述失活型Cas13蛋白选自失活型Cas13X.1的野生型或突变体的全长或部分序列;
优选地,所述失活型Cas13蛋白包含以下序列中的一种或多种:
I)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;
II)与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少80%、82%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列,并且其保留如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的活性;
III)在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列,并且其保留如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的活性;或者,
IV)与I)~III)中任一项部分互补或完全互补的核酸;
优选地,所述失活型Cas13蛋白包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的编辑系统,其特征在于,所述腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域对RNA甲基化基序“RRACH”具有特异性的催化功能,其中R代表鸟嘌呤或腺嘌呤,H代表腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶;
优选地,所述腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域包含以下序列中的一种或多种:
a)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列;
b)与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少80%、82%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列,并且其保留如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的活性;
c)在SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列,并且其保留如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的活性;或者,
d)与a)~c)中任一项部分互补或完全互补的核酸;
优选地,所述腺嘌呤脱氨酶ADAR2的催化结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的编辑系统,其特征在于,所述编辑系统进一步还含有向导元件;
优选地,所述向导元件包含靶向目标序列的crRNA或gRNA;
优选地,所述crRNA或gRNA的长度为19-120bp。
5.根据权利要求1-4任一项所述的编辑系统,其特征在于,所述RNA甲基化修饰选自5-甲胞嘧啶(m5C)、N1-甲基腺嘌呤(m1A)、N6-甲基腺嘌呤(m6A)、假尿嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶(hm5C);
优选自N1-甲基腺嘌呤(m1A)和N6-甲基腺嘌呤(m6A)。
6.一种多核苷酸,其特征在于,编码如权利要求1-5中任一项所述的编辑系统。
7.一种载体,其特征在于,包含如权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种细胞,其特征在于,包含如权利要求1-5中任一项所述的编辑系统、如权利要求6所述的多核苷酸和如权利要求7所述的载体中的一种或多种。
9.一种药物组合物,其特征在于,包含如权利要求1-5中任一项所述的编辑系统、如权利要求6所述的多核苷酸和如权利要求7所述的载体和如权利要求8所述的细胞中的一种或多种,以及药学上可接受的载体。
10.如权利要求1-5中任一项所述的编辑系统、如权利要求6所述的多核苷酸和如权利要求7所述的载体、如权利要求8所述的细胞或如权利要求9所述的组合物在制备用于调节RNA甲基化修饰的药物中的应用。
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