CN111065736A - 针对颗粒状角膜变性症的基因治疗药物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与下述靶序列杂交的引导RNA分子，所述靶序列包含与颗粒状角膜变性症有关的转化生长因子β诱导(TGFBI)基因的突变位点。
Description
技术领域
本发明涉及针对颗粒状角膜变性症的基因治疗药物。
背景技术
角膜的透明性对于维持视力极为重要，若角膜浑浊则视力会显著降低。关于角膜已知有各种遗传性疾病。例如，若罹患角膜变性症，则会在角膜中产生白色的沉降物，浑浊随着年龄增长而逐渐增多，渐渐无法看见前方。角膜变性症之中，就日本人而言发病率最高的疾病是颗粒状角膜变性症。对于罹患颗粒状角膜变性症的患者而言，原本为透明的角膜随着年龄的增长而浑浊增强，并且，在60岁左右视力开始大幅度降低。
作为这样的角膜浑浊疾病，已知有作为常染色体显性的遗传性疾病的颗粒状角膜营养不良(Granular corneal dystrophy(GCD))。GCD是由位于染色体5q31上的转化生长因子β诱导(TGFBI)基因中的点突变引起的，其导致角膜基质中产生多个不规则形状的颗粒状不透明物。作为TGFBI相关的角膜营养不良之一的颗粒状角膜营养不良2型(Granularcorneal dystrophy type 2(GCD2))是由于TGFBI蛋白的第124位氨基酸即精氨酸被组氨酸取代而产生的。推测在韩国大约每870人中有1人罹患GCD2，其患者数为5万人以上。
作为角膜浑浊疾病的治疗方法，已知有：角膜移植；通过使用了氟化氩气体的准分子激光(波长为193nm)的角膜表层切除术来除去角膜浑浊。近年来采用的角膜移植大致分成对角膜上皮层、前弹力层、角膜基质层、后弹力层、角膜内皮层的全部五层进行移植的全层角膜移植(Penetrating Keratoplasty(PKP))、和对表面的三层进行替换的深板层角膜移植(Deep Anterior Lamellar Keratoplasty(DALK))这两类。二者的移植成绩均是优异的，具有在数年内能够维持除去浑浊后的状态的优点。然而，侵入性高，存在伴随移植而发生并发症的情况，也有复发的风险。
利用准分子激光的角膜切除也具有各种优点，可以举出例如与角膜移植相比侵入程度较低、能够重复进行手术、并且能够延长发展至角膜移植的期间等。然而，由于角膜变薄，因此存在屈光发生变化，变成远视的情况。另外，存在伴有术后不适感的情况，且与角膜移植同样地也存在复发性的问题。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Mannis MJ and Holland EJ.Cornea-fundamentals,diagnosisand management-Fourth edition,volume1,P781-785,Elsevier
发明内容
发明所要解决的课题
目前，尚未确立能够治愈GCD2的治疗方法。另外，角膜移植、利用准分子激光的角膜切除存在许多如上述那样的有待改善的缺点。
鉴于上述情况，本发明的课题为，利用较之以往而言侵入更低、且治疗后症状不复发的新型方法来解决颗粒状角膜营养不良等角膜的遗传性疾病、尤其是GCD2。
用于解决课题的手段
为了实现根本性治疗，需要将与TGFBI蛋白的第124位的组氨酸对应的基因序列的突变修复为正常的基因序列(图1)。已知以往为了进行基因修饰，以针对胚胎干细胞的发育工程为中心实施了下述方法，所述方法通过向细胞内导入在两端包含与基因导入位点同源的序列的外源基因，从而对偶然发生的基因同源重组进行利用，但其深受细胞染色质的状态和DNA甲基化的状态的影响(Feng Liang等，“Studies on the influence of cytosinemethylation on DNA recombination and end-joining in mammalian cells.”,J BiolChem.1995 Oct 6；270(40):23838-44(http://www.jbc.org/content/270/40/23838.full.pdf))。因此，通常就染色质结构处于凝缩状态的分化后的体细胞而言，利用基因同源重组来导入基因是非常困难的，事实上，还没有通过上述方法在角膜基质细胞进行基因导入的报道。
近年来，随着利用锌指核酸酶(ZFN)、TALEN、CRISPR/Cas9等被称为基因组编辑技术的新型基因修饰技术的出现，得以容易地对靶基因序列进行切割。利用这些基因组编辑工具得到的基因组DNA的双链断裂(DSB)区可以通过非同源性末端接合(Non-HomologousEnd Joining(NHEJ))和同源定向修复(HDR)这两种修复功能中的任一者得到修复，通过向细胞内导入具有与切割位点同源的序列的模板核酸、并诱导HDR，从而能够对切割位点的基因序列进行取代。HDR技术是以基因组上的特定序列作为靶标、能够自由地编辑基因序列的划时代的技术。
然而，为了实现高效率、高特异性、且重现性好的基因组编辑技术，基因组编辑工具的高效率的细胞内导入、和基因组编辑工具的精密设计是必需的。
特别地，就作为RNA诱导型的基因组编辑工具CRISPR/Cas9而言，在利用通常使用的、作为来源于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的RNA诱导型核酸酶的Cas9(SpCas9)的情况下，使用被称为引导RNA(gRNA)的、具有识别20个碱基的靶序列所需的序列的约120个碱基左右的RNA与SpCas9蛋白的复合体，对与gRNA互补性结合的任意的DNA序列进行双链切割，但若在紧接20个碱基的靶序列之后不存在被称为PAM序列(前间隔序列邻近基序)的NGG这3个碱基，则无法进行切割。
另外，由于利用SpCas9的双链切割是在该PAM序列的3～4个碱基的上游发生的，因此在已确定所要切割的位点的情况下，若在其下游没有PAM序列，则无法使用SpCas9实现该位点的双链切割。此外，已知gRNA的碱基序列中的GC含量为40～80％的范围，并且GC含有率高的情况下切割效率良好。另外，也报道了由脱靶效应导致的非特异性切割，存在相对于靶序列具有3个以下碱基错配的序列被切割的可能性，因此，在设计gRNA时需要尽可能地减少会成为错配的序列。
通常使用质粒载体将CRISPR/Cas9基因组编辑工具导入细胞内时，作为使gRNA表达的启动子，通常使用U6启动子。由于该U6启动子的转录起始位点不是嘌呤碱基(G或A)时无法以充分的表达水平来表达gRNA，因此靶序列的设计受到限制。
另一方面，使用了HDR技术的靶基因序列的编辑通常可使用单链低聚DNA(ssODN)、双链DNA(dsDNA)、质粒等作为HDR模板供体而进行，但已知其效率非常低(20％以下)，模板供体的同源臂序列的设计也成为通过HDR进行基因组编辑的重要因素。
为了解决上述课题，本申请的发明人反复进行了深入研究。首先，利用CRISPR/Cas9体系作为基因组编辑技术，设计了利用通常的设计方法所无法实现的、以突变TGFBI基因作为靶标的特殊gRNA，作为HDR模板供体，成功开发了可防止由再切割导致的影响、且能够实现容易地确认TGFBI基因的正常化和基因修复的全长为100nt的ssODN。结果，本申请的发明人发现了下述方法，从而完成了本发明：所述方法针对来源于角膜变性症患者的细胞的TGFBI蛋白的位于第124位氨基酸的突变，高效率、高特异性、且重现性良好地对突变基因进行修复，并将其修复为正常的TGFBI氨基酸序列。
即，本发明包括以下的发明：
(1)对于对象的颗粒状角膜变性症进行治疗的方法，其包括下述工序：
为了修复与颗粒状角膜变性症有关的转化生长因子β诱导(TGFBI)基因的突变，使对象的角膜基质细胞与Cas9及引导RNA接触。
(2)如(1)所述的方法，其中，TGFBI基因的突变为点突变。
(3)如(1)或(2)所述的方法，其中，颗粒状角膜变性症为颗粒状角膜营养不良2型(GCD2)。
(4)如(2)所述的方法，其中，点突变为TGFBI蛋白的第124位处的氨基酸取代。
(5)如(4)所述的方法，其中，氨基酸取代选自由R124H、R124C及R124L组成的组。
(6)如(1)～(5)中任一项所述的方法，其中，引导RNA包含引导序列，所述引导序列能与由与TGFBI基因的前间隔序列邻近基序(PAM)序列的上游侧相邻的22个碱基的序列构成的靶序列杂交。
(7)如(6)所述的方法，其中，PAM序列由CGG构成。
(8)如(6)或(7)所述的方法，其中，引导序列包含与靶序列互补的、由至少17～18个碱基构成的区域。
(9)如(6)～(8)中任一项所述的方法，其中，引导序列由以腺嘌呤或鸟嘌呤起始的22个碱基的序列构成。
(10)如(9)所述的方法，其中，引导序列具有序列号1的碱基序列。
(11)如(6)～(10)中任一项所述的方法，其中，引导序列与反式激活crRNA(tracrRNA)序列结合。
(12)如(1)～(11)中任一项所述的方法，其中，引导RNA的表达由U6启动子驱动。
(13)如(12)所述的方法，其中，引导RNA和U6启动子位于相同或不同的载体上。
(14)如(13)所述的方法，其中，引导RNA与U6启动子以能在相同的载体上发挥作用的方式连接。
(15)如(1)～(14)中任一项所述的方法，其中，TGFBI基因的突变的修正介由被Cas9切割后的序列的同源定向修复(HDR)而进行。
(16)如(15)所述的方法，其中，使用单链低聚DNA(ssODN)作为HDR的模板供体。
(17)如(16)所述的方法，其中，ssODN具有将点突变取代为相当于野生型的氨基酸的碱基的敲入序列。
(18)如(17)所述的方法，其中，相当于野生型的氨基酸的碱基为CGT或CGC。
(19)如(18)所述的方法，其中，敲入序列具有限制性内切酶位点。
(20)如(19)所述的方法，其中，相当于野生型的氨基酸的碱基为CGT，限制性内切酶位点为BsiWI位点。
(21)如(17)～(20)中任一项所述的方法，其中，ssODN还在敲入序列的两端具有与切割位点的两端同源的50个碱基的同源臂。
(22)如(1)～(21)中任一项所述的方法，其中，在与细胞的接触时，Cas9与gRNA形成核糖核蛋白(RNP)复合体。
(23)引导RNA分子，其与包含与颗粒状角膜变性症有关的TGFBI基因的突变位点的靶序列杂交。
(24)如(23)所述的引导RNA分子，其中，TGFBI基因的突变为点突变。
(25)如(23)或(24)所述的引导RNA分子，其中，颗粒状角膜变性症为GCD2。
(26)如(23)～(25)中任一项所述的引导RNA分子，其中，点突变为TGFBI蛋白的第124位处的氨基酸取代。
(27)如(26)所述的引导RNA分子，其中，氨基酸取代选自由R124H、R124C及R124L组成的组。
(28)如(23)～(28)中任一项所述的引导RNA分子，其包含引导序列，所述引导序列能与由与TGFBI基因的PAM序列的上游侧相邻的22个碱基的序列构成的靶序列杂交。
(29)如(28)所述的引导RNA分子，其中，PAM序列由CGG构成。
(30)如(28)或(29)所述的引导RNA分子，其中，引导序列包含与靶序列互补的、由至少17～18个碱基构成的区域。
(31)如(28)～(30)中任一项所述的引导RNA分子，其中，引导序列由以腺嘌呤或鸟嘌呤起始的22个碱基的序列构成。
(32)如(28)～(31)中任一项所述的引导RNA分子，其中，引导序列具有序列号1的碱基序列。
(33)如(28)～(32)中任一项所述的引导RNA分子，其中，引导序列与tracr RNA序列结合。
(34)核酸，其编码(23)～(33)中任一项所述的引导RNA分子。
(35)载体，其表达(23)～(33)中任一项所述的引导RNA分子。
(36)如(35)所述的载体，其中，引导RNA的表达由U6启动子驱动。
(37)如(36)所述的载体，其中，引导RNA和U6启动子位于相同或不同的载体上。
(38)如(36)所述的载体，其中，引导RNA与U6启动子以能在相同的载体上发挥作用的方式连接。
(39)试剂盒，其包含(35)～(38)中任一项所述的载体、和作为HDR的模板供体的ssODN分子～。
(40)如(39)所述的试剂盒，其中，ssODN具有将点突变取代为相当于野生型的氨基酸的碱基的敲入序列。
(41)如(40)所述的试剂盒，其中，相当于野生型的氨基酸的碱基为CGT或CGC。
(42)如(40)或(41)所述的试剂盒，其中，敲入序列具有限制性内切酶位点。
(43)如(42)所述的试剂盒，其中，相当于野生型的氨基酸的碱基为CGT，限制性内切酶位点为BsiWI位点。
(44)如(39)～(43)中任一项所述的试剂盒，其中，ssODN还在敲入序列的两端具有与切割位点的两端同源的50个碱基的同源臂。
(45)如(39)～(44)中任一项所述的试剂盒，其中，ssODN分子具有序列号2的碱基序列。
(46)试剂盒，其包含(23)～(33)中任一项所述的引导RNA分子、和Cas9蛋白。
(47)如(46)所述的试剂盒，其中，引导RNA分子与Cas9蛋白形成核糖核蛋白(RNP)复合体。
(48)医药组合物，其含有以下中的任一者以上：
(23)～(33)中任一项所述的引导RNA分子；
编码(34)所述的引导RNA分子的核酸；或者
具有序列号2的碱基序列的、作为HDR的模板供体的ssODN分子。
发明效果
本申请的发明人特别是为了对与突变的TGFBI基因的第124位氨基酸对应的基因序列进行切割，利用存在于该切割位点的4bp下游的CGG序列作为PAM序列，开发了具有突变序列特异性核酸序列的22nt的gRNA。另外，虽然通常以20nt的长度设计用于SpCas9的gRNA，但在对与第124位氨基酸对应的基因序列进行切割的情况下，由于PAM序列的限制，gRNA的转录起始位点的序列成为T，存在引起gRNA的表达量和切割效率的降低的问题。此外，就按照该以往的20nt的长度进行设计而得到的gRNA而言，由于存在许多成为3nt错配的脱靶的靶序列，因此认为也存在对非特异性序列进行切割的问题。因此，现有技术中，无法使用CRISPR/Cas9体系来高效率、高特异性地对该基因序列进行切割。
附图说明
[图1]图1以与野生型比对的形式示出了角膜变性症的TGFBI基因的突变例(野生型/野生型：野生型的氨基酸序列为序列号3，碱基序列为序列号4；野生型/R124H：杂合突变型的氨基酸序列为序列号5，碱基序列为序列号6)。该图中，TGFBI基因的与第124位氨基酸对应的基因发生了突变。
[图2]图2示出了hTGFBI R124H gRNA、和导入了BsiWI位点(C/GTACG)的hTGFBIR124H修复ssODN的各序列及它们附近的序列。
[图3]图3示出了突变TGFBI基因特异性CRISPR/Cas9靶向(targeting)质粒载体的结构的示意图。
[图4]图4示出了基于使用了BsiWI的PCR-RFLP进行敲入的确认结果。
[图5]图5示出了敲入后的序列的基因分析结果。
[图6]图6示出了利用敲入在63个克隆之中的13个克隆(20.6％)中确认到单等位基因的编辑、在26个克隆(41.3％)中确认到双等位基因的编辑的结果。
[图7]图7a示出了成为脱靶的候选的基因组序列的分析结果。图7b示出了成为脱靶候选的基因组序列。图7c示出了针对脱靶序列通过PCR法对基因组序列进行扩增、使用T7核酸内切酶I法进行分析的结果。
具体实施方式
(颗粒状角膜变性症的治疗方法)
一个方式中，本发明提供通过基因组编辑的机制对TGFBI基因的突变进行修复来治疗颗粒状角膜变性症的方法。本发明中，旨在对与颗粒状角膜变性症相关的所有TGFBI基因的突变、例如点突变进行修复。
作为颗粒状角膜变性症之一的颗粒状角膜营养不良2型(GCD2)中，TGFBI蛋白的位于第124位的精氨酸被组氨酸等其他氨基酸取代。已知除了上述R124H的点突变以外，引起GCD2的点突变还有R124C、R124L等。
理论上，通过使用基因组编辑工具、将TGFBI基因中的与点突变对应的碱基序列的突变取代为正常的碱基序列，能够治疗颗粒状角膜变性症。然而，为了实现高效率、高特异性、且重现性好的基因组编辑技术，进而可靠地治疗颗粒状角膜变性症，基因组编辑工具的高效率的细胞内导入、和基因组编辑工具的精密设计是必需的。
基因组编辑工具之中，特别针对RNA诱导型的CRISPR/Cas9，以利用通常使用的、作为来源于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的RNA诱导型核酸酶的Cas9(SpCas9)的情况为例进行说明。就这样的RNA诱导型的CRISPR/Cas9而言，使用被称为引导RNA(gRNA)的具有识别20个碱基的靶序列所需的序列的约120个碱基左右的RNA与SpCas9蛋白的复合体，对与gRNA互补性结合的任意的DNA序列进行双链切割。
本发明中，为了对与颗粒状角膜变性症相关的TGFBI基因中的靶序列进行切割，使从罹患颗粒状角膜变性症的对象中得到的角膜基质细胞与Cas蛋白及gRNA接触。Cas蛋白和gRNA可以分别添加，但为了抑制脱靶效应，优选以核糖核蛋白(RNP)复合体的状态使用。
本发明中使用的Cas蛋白只要隶属于CRISPR体系则没有限定，优选Cas9。作为Cas9，可以举出例如来源于化脓性链球菌的Cas9(SpCas9)、来源于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的Cas9(StCas9)等。其中，由于靶位点的切割存在PAM序列的限制，因此优选通常可用于基因组编辑的SpCas9。Cas蛋白及gRNA向细胞内的递送可以介由编码它们的载体，使用本领域技术人员已知的方法例如标准的转染法、电穿孔法、慢病毒的转导等。用于表达Cas的载体及用于表达gRNA的载体可以是相同的载体，也可以是彼此不同的载体。另外，也可以形成重组Cas9蛋白、gRNA的复合体(RNP、核糖核蛋白)，通过本领域技术人员已知的方法即转染法、电穿孔法等直接将RNP递送至细胞内。
角膜基质细胞是存在于对于保持角膜的透明性而言重要的角膜基质层内的扁平细胞。各个细胞具有突起，相邻的角膜基质细胞介由该突起而接触，呈现网眼状的结构。在颗粒状角膜变性症的角膜基质细胞中，由于突变TGFBI蛋白蓄积，因此透明性受损。角膜基质细胞可以通过在深板层角膜移植等外科处置时除去角膜上皮、然后从间质中采集并施以胶原酶处理而得到。
就向受检者的角膜基质细胞的基因导入而言，利用本领域技术人员已知的方法例如标准的转染法、电穿孔法、使用了腺相关病毒等病毒载体的方法。角膜是能够利用裸DNA传递(Naked DNA delivery)法、在不使用特殊的导入试剂的情况下将DNA导入细胞内的组织，也可以利用DNA的直接注入进行胞内传递(Brain Res Bull.2010Feb 15；81(2-3):256-261)。另外，在形成重组Cas9蛋白与gRNA的复合体后，可以使用本领域技术人员已知的方法即转染法、电穿孔法来递送至细胞内。
对象不限于人、猴、恒河猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等灵长类，包括例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类、兔等实验动物、猪、牛、山羊、绵羊等偶蹄类、马等奇蹄类、狗、猫等宠物。然而，对象优选为人角膜变性症患者。
作为DNA切割酶的Cas9可以作为DNA核酸内切酶发挥功能，在靶标DNA存在的位点对DNA进行切割。gRNA在其5’末端具有与靶标DNA互补的序列，并介由该互补序列与靶标DNA结合，由此具有将Cas9导向靶标DNA的功能。需要说明的是，Cas9蛋白与gRNA在室温条件下经10分钟左右形成复合体，并立即发挥切割靶标DNA的能力。
为了高效率地进行靶序列的双链切割，gRNA的设计是重要的。例如，需要在紧邻20个碱基的靶序列之后存在被称为PAM序列(前间隔序列邻近基序)的NGG这3个碱基。另外，由于利用SpCas9的双链切割在该PAM序列的3～4个碱基的上游处发生，因此在已确定所要切割的位点的情况下，若在其下游没有PAM序列，则无法使用SpCas9实现该位点的双链切割。在待切割的部位是与TGFBI基因的第124位氨基酸对应的基因序列的情况下，可以利用存在于该基因序列的4个碱基下游的CGG序列作为PAM序列。
在设计gRNA时，本领域技术人员可以从40～80％的范围中适当选择碱基序列中的GC含量。从提高切割效率的观点考虑，优选GC的含有率高，例如优选50％以上。
还以极力减少由脱靶效应导致的非特异性切割的方式来设计gRNA。例如，碱基长度可以是通常采用的20个碱基，但存在发现许多脱靶候选的情况。在这种情况下，通过使碱基长度增大至22个，能够大幅减少成为脱靶的序列，从而可提供具有下述高特异性的gRNA，所述gRNA在人基因组上不存在3个以下碱基错配的脱靶序列。
为了使充分量的gRNA表达，需要选择适合对其进行驱动的启动子。作为这样的启动子，通常可以使用RNA聚合酶III依赖型的U6启动子或T7启动子等，也需要根据所使用的启动子设计gRNA。例如，在使用U6启动子的情况下，若转录起始位点不是嘌呤碱基(G或A)，则不能以充分的表达水平来表达gRNA，因此在U6启动子的存在下使gRNA表达的情况下，gRNA优选为以腺嘌呤或鸟嘌呤起始的碱基序列。
gRNA通常可以在与合适的启动子一同配置于1个或多个质粒载体的状态下被导入细胞内。在这种情况下，引导RNA与启动子可以以能在相同的载体上发挥作用的方式连接，或者也可以存在于不同的载体上。
就引导序列而言，为了能与靶序列杂交，以包含与靶序列互补的、由至少17～18个碱基构成的区域的方式被设计。在本说明书中，靶序列表示包含TGFBI基因的突变位点的区域、例如与PAM序列的上游侧相邻的22个碱基的序列。
在更优选的方式中，gRNA被设计为具有序列号1的碱基序列：5’-acucagcuguacacggaccaca-3’。这样的gRNA可以进行化学合成。
为了收集(recruit)Cas蛋白，可以使gRNA进一步与反式激活crRNA(tracr RNA)序列结合。
通过对包含突变位点的靶序列的双链进行切割，然后向切割部位敲入包含正常序列的供体DNA，能够修复突变位点。供体DNA可以与Cas9 mRNA及gRNA同时导入至细胞内。由于在形成双链断裂(DSB)时供体存在，从而能够实现同源定向修复(HDR)。
存在各种敲入的方法，优选介由修正精度高的同源重组(HR)进行的敲入。通过在编码正常序列的供体DNA的存在下进行同源重组，包含突变位点的染色体上的遗传信息被取代为来源于供体的新信息。供体DNA可以是ssODN、dsDNA或质粒中的任何，在对R124H这样的单核苷酸多态性进行取代的情况下，优选利用包含正常序列的ssODN对突变部位进行修复。
用于对点突变进行修复的供体DNA具有：1)能将点突变取代为相当于野生型的氨基酸的碱基的敲入序列；和2)与待取代的序列的两端相邻的序列具有相同的“左臂”和“右臂”的同源臂。同源臂的碱基长度优选为50个碱基左右，但这并非意在排除长度为40个左右或60个左右的碱基长度，本领域技术人员可以对同源臂的长度进行适当变更。
任选地，供体DNA还具有限制性内切酶位点。通过在供体DNA中设置限制性内切酶位点，能够使基因修饰效率的确认变得简便。以对位于TGFBI蛋白的第124位的点突变进行修复的情况为例进行说明，相当于野生型的氨基酸的碱基为CGC，例如，通过在敲入序列中含有CGT来代替CGC，从而能够导入作为限制性内切酶位点的BsiWI位点(C/GTACG)。
可以将限制性内切酶位点以外的必需序列例如报告基因、耐药基因插入于供体DNA中。例如，以读码框(in-frame)的方式使报告基因与正常序列的C末端连接时，正常序列的检测变得容易。作为报告基因，可以举出：编码绿色荧光蛋白(GFP)、人源化海肾绿色荧光蛋白(hrGFP)、增强绿色荧光蛋白(eGFP)等荧光蛋白的基因；编码萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶等生物发光蛋白的基因；等等。
序列号2表示的ssODN具有作为限制性内切酶位点的BsiWI部和各臂为50个碱基的同源臂，作为同源重组修复HDR模板供体能够防止由再切割导致的影响，且能够实现容易确认TGFBI基因的正常化和基因修复。
(引导RNA及其用途)
一个方式中，本发明还提供与包含TGFBI基因的突变位点的靶序列杂交的、引导RNA分子及/或编码其的核酸、或者它们的用途。引导RNA分子所具有的引导序列等的详细内容如上文所述。
其他方式中，本发明提供含有编码引导RNA分子的核酸等的载体。由本发明提供的载体可以是环状的载体，也可以是直链状的载体。优选的是，由本发明提供的载体为环状载体。作为本发明的载体，可以举出质粒载体、粘粒载体、病毒载体、人工染色体载体等。作为人工染色体载体，可以举出酵母人工染色体载体(YAC)、细菌人工染色体载体(BAC)、P1人工染色体载体(PAC)、小鼠人工染色体载体(MAC)、人人工染色体载体(HAC)。
对编码引导RNA的载体和用于表达Cas核酸内切酶的载体可以是相同的载体，也可以是彼此不同的载体。另外，这些载体与编码ssODN等供体DNA的载体也可以相同或不同。
一个方式中，本发明提供包含1个或多个载体的试剂盒，所述1个或多个载体编码：上述引导RNA分子或编码其的核酸、及/或模板供体分子(例如ssODN)或编码其的核酸。本发明的试剂盒可以优选用于治疗颗粒状角膜变性症。另外，也可以用于下述诊断技术：针对突变TGFBI基因进行基因组编辑，然后通过PCR等对包含该序列的区域进行扩增，利用经由HDR进行了基因导入的BsiWI限制性内切酶切割序列、实施由BsiWI进行的消化，由此对修复后的TGFBI基因进行检测。
其他方式中，本发明提供含有上述引导RNA分子或编码其的核酸、及/或模板供体分子(例如ssODN)或编码其的核酸的医药组合物。本发明的医药组合物可以优选用于治疗颗粒状角膜变性症。
以下，举出实施例、比较例来进一步具体地说明本发明，但本发明不限于此。
实施例
考虑如上所述的gRNA的设计上的注意事项，设计了本专利发明的gRNA(序列号1)。例如，由于使碱基长度为通常采用的20个碱基时，发现了许多脱靶候选，因此，使碱基长度增大至22个，大幅度减少了成为脱靶的序列。序列号1的gRNA的GC含有率为50％以上，与spCas9形成复合体，是对靶序列进行切割时理想的值。
另外，作为HDR模板供体，设计了在两端具有与切割区域同源的50bp的同源臂的ssODN(5’-GAGACCCTGGGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCTGTACACGGACCGTACGGAGAAGCTGAGGCCTGAGATGGAGGGGCCCGGCAGCTTCACCATCT-3’(序列号2))。另外，就本HDR模板供体而言，将向TGFBI基因突变位点导入的碱基序列设计为能够导入与野生型TGFBI的精氨酸(CGC)不同的密码子(CGT)，从而能够使基因序列正常化、基因修饰效率的确认简便化(BsiWI限制性内切酶位点的导入)，并防止基因序列正常化后的再切割(图2)。
将突变TGFBI基因特异性gRNA的序列(序列号1)导入能够同时表达gRNA和SpCas9-2A-GFP基因的pX458载体(Addgene公司制：商品目录编号为48138)中，制备了突变TGFBI基因特异性CRISPR/Cas9靶向质粒载体(图3)。质粒的DNA碱基序列为序列号7，下述的引导RNA的RNA碱基序列为序列号。
pX458-hTGFBI(R124H)gRNA，RNA碱基序列(全长)：
5-ACUCAGCUGUACACGGACCACAguuuuagagcuaGAAAuagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu-3’
然后，针对来源于角膜变性症病人的角膜基质细胞，将上述质粒载体与ssODN HDR模板供体(序列号2)一同进行基因导入，1星期后，以GFP基因的表达为指标对基因导入细胞进行细胞分离。对得到的细胞进行培养并增殖后，通过RFLP(Restriction FragmentLength Polymorphism，限制性内切酶片段长度多态性)法及基因序列的分析确认了基因组编辑效率。
结果，通过导入突变TGFBI基因特异性CRISPR/Cas9靶向质粒载体及HDR模板ssODN，成功地将来源于人角膜变性症患者的角膜基质细胞中的TGFBI基因的突变修复为正常的序列(图4、5)。
通过PCR对与TGFBI基因R124H突变位点对应的基因序列进行扩增，并实施RFLP法、基因序列分析，从而对基因组编辑效率进行了确认。TGFBI突变位点的基于PCR的基因序列分析中使用的PCR引物序列如下所示。
正向：5’-GTTGAGTTCACGTAGACAGGC-3’(序列号9)
反向：5’-GACTCCCATTCATCATGCCCA-3’(序列号10)
结果，作为对照的TGFBI野生型角膜基质细胞中检测到461bp的条带，相对于此，在实施了基因组编辑的来源于人角膜变性症患者的角膜基质细胞中，通过基因组编辑而导入BsiWI限制性内切酶位点、并利用BsiWI进行消化，从而被切割成288bp和173bp的条带。针对导入了基因的细胞的全部89个克隆进行了该分析，结果在63个克隆之中，13个克隆(20.6％)中被确认到单等位基因的编辑，在26个克隆(41.3％)中确认到双等位基因的编辑。由该结果可知，通过利用本发明，能够以合计为61.9％的极高的基因组编辑效率将来源于人角膜变性症患者的角膜基质细胞中的TGFBI基因的突变修复为正常(图6)。
此外，与利用传统技术设计的gRNA相比，利用本发明能够减少成为脱靶的序列候选的数量。已报道了通常gRNA对与其靶序列有3个碱基不同的序列不再具有切割活性(Nature Biotechnology 31,822-826(2013))，针对所设计的gRNA进行了脱靶序列的分析，结果表明，不存在相对于所设计的gRNA具有1～3个碱基错配的序列(图7a)。另一方面，在3个部位的染色体区域内(20号染色体24871179～24871203、2号染色体98321072～98321097、8号染色体1150445～1150469)确认到4个、5个碱基错配的序列(图7a、b)。通过PCR对包含该序列的基因组区域进行扩增，使用通常的T7核酸内切酶I法进行了分析。
脱靶分析中使用的PCR引物全部如下所示。
OTS1
5’-ATGTCAGAAGTCCCGCTGTG-3’(序列号11)
5’-TGATGGGGTCAGAGGGCATA-3’(序列号12)
OTS2
5’-CTTCCTGCTCTGTGTTTAGCCA-3’(序列号13)
5’-ACCTCCAAGTTGAGCAGTGTC-3’(序列号14)
OTS3
5’-GCAGCAAAGCACTCAAGAGG-3’(序列号15)
5’-CAAACTTCTGCCTGGGCATC-3’(序列号16)
T7核酸内切酶I可以识别来源于脱靶切割的PCR扩增产物与野生型产物的双链错配，对杂合双链的错配部分进行切割。结果，在全部PCR产物中未检测到基于T7核酸内切酶I的切割。即，针对任意序列均未确认到由脱靶效应导致的非特异性切割(图7c)
上述结果显示，本发明涉及的突变TGFBI基因特异性gRNA实际上能够减少由脱靶效应导致的切割。
Claims (26)
1.引导RNA分子，其与下述靶序列杂交，所述靶序列包含与颗粒状角膜变性症有关的转化生长因子β诱导(TGFBI)基因的突变位点。
2.如权利要求1所述的引导RNA分子，其中，TGFBI基因的突变为点突变。
3.如权利要求2所述的引导RNA分子，其中，点突变为TGFBI蛋白的第124位处的氨基酸取代。
4.如权利要求3所述的引导RNA分子，其中，氨基酸取代选自由R124H、R124C及R124L组成的组。
5.如权利要求1～4中任一项所述的引导RNA分子，其中，颗粒状角膜变性症为颗粒状角膜营养不良2型(GCD2)。
6.如权利要求1～5中任一项所述的引导RNA分子，其包含引导序列，所述引导序列能与由与TGFBI基因的前间隔序列邻近基序(PAM)序列的上游侧相邻的22个碱基的序列构成的靶序列杂交。
7.如权利要求6所述的引导RNA分子，其中，PAM序列由CGG构成。
8.如权利要求6或7所述的引导RNA分子，其中，引导序列包含与靶序列互补的、由至少17～18个碱基构成的区域。
9.如权利要求6～8中任一项所述的引导RNA分子，其中，引导序列由以腺嘌呤或鸟嘌呤起始的22个碱基的序列构成。
10.如权利要求6～9中任一项所述的引导RNA分子，其中，引导序列具有序列号1的碱基序列。
11.如权利要求6～10中任一项所述的引导RNA分子，其中，引导序列与反式激活crRNA(tracrRNA)序列结合。
12.核酸，其编码权利要求1～11中任一项所述的引导RNA分子。
13.载体，其表达权利要求1～11中任一项所述的引导RNA分子。
14.如权利要求13所述的载体，其中，引导RNA的表达由U6启动子驱动。
15.如权利要求14所述的载体，其中，引导RNA和U6启动子位于相同或不同的载体上。
16.如权利要求14所述的载体，其中，引导RNA与U6启动子以能在相同的载体上发挥作用的方式连接。
17.试剂盒，其包含权利要求13～16中任一项所述的载体、和作为HDR的模板供体的ssODN分子～。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其中，ssODN具有将点突变取代为相当于野生型的氨基酸的碱基的敲入序列。
19.如权利要求18所述的试剂盒，其中，相当于野生型的氨基酸的碱基为CGT或CGC。
20.如权利要求18或19所述的试剂盒，其中，敲入序列具有限制性内切酶位点。
21.如权利要求20所述的试剂盒，其中，相当于野生型的氨基酸的碱基为CGT，限制性内切酶位点为BsiWI位点。
22.如17～21中任一项所述的试剂盒，其中，ssODN还在敲入序列的两端具有与切割位点的两端同源的50个碱基的同源臂。
23.如权利要求17～22中任一项所述的试剂盒，其中，ssODN分子具有序列号2的碱基序列。
24.试剂盒，其包含权利要求1～11中任一项所述的引导RNA分子、和Cas9蛋白。
25.如权利要求24所述的试剂盒，其中，引导RNA分子与Cas9蛋白形成核糖核蛋白(RNP)复合体。
26.医药组合物，其含有：
权利要求1～11中任一项所述的引导RNA分子或权利要求12所述的核酸；及/或
具有序列号2的碱基序列的、作为HDR的模板供体的ssODN分子。
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