JP2022530534A - ゲノム編集による２つの最も高頻度に見られるｕｓｈ２ａ突然変異の修正 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ゲノム工学操作による、遺伝性網膜ジストロフィー、特に症候群型アッシャー症候群２型、及び非症候群型網膜色素変性症の治療処置の分野に関する。現在、ＵＳＨ２Ａ遺伝子内の突然変異によって引き起こされる、この疾患に利用可能な処置は全くない。特定のガイドＲＮＡ配列、ＣＲＩＳＰＲ技術、及び修復鋳型としてのドナー核酸配列を含む、部位特異的な遺伝子工学操作システムを含んでいる、本発明に記載のインビトロ又はインビボでの方法を使用することによって、本発明者らは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の修正されたｉＰＳＣを成功裡に作製することができた。本発明はまた、特定のガイドＲＮＡ配列、ＣＲＩＳＰＲ技術、及び修復鋳型としてのドナー核酸配列を含んでいる、それを必要とする個体の、細胞のゲノム内の、例えば光受容体細胞のゲノム内の、２つの最も高頻度で見られるＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異を修正するためのシステムに関する。
Description
発明の分野
本発明は、ゲノム編集による治療処置の分野に関する。
本発明は、ゲノム編集による治療処置の分野に関する。
特に、本発明は、患者の細胞のゲノム内の２つの最も高頻度に見られるＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異をインビトロで又はエクスビボで修正するための方法、並びに、遺伝性網膜ジストロフィーのための治療法としてのその使用に関する。具体的には、孤立性常染色体劣性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症を処置するため。
本発明はさらに、眼細胞のゲノム内のＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異をインビボで修正するためのシステム、及び、遺伝性網膜ジストロフィー、特に孤立性常染色体劣性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症の処置におけるその使用に関する。
発明の背景
遺伝性網膜ジストロフィー（ＩＲＤ）は、神経変性障害の一群であり、これにより、不可逆的な盲目に至り、世界中でおよそ１/２０００人の個体が罹患している（６及び３５）。遺伝性網膜ジストロフィーは、孤立性網膜表現型を有する非症候群型、又は、眼の他の別の器官も罹患している症候群型に分類され得る。
遺伝性網膜ジストロフィー（ＩＲＤ）は、神経変性障害の一群であり、これにより、不可逆的な盲目に至り、世界中でおよそ１/２０００人の個体が罹患している（６及び３５）。遺伝性網膜ジストロフィーは、孤立性網膜表現型を有する非症候群型、又は、眼の他の別の器官も罹患している症候群型に分類され得る。
症候群性網膜ジストロフィーの最も一般的な病型は、アッシャー症候群（ＵＳＨ）であり、これには難聴、網膜色素変性症（ＲＰ）及び場合によって前庭機能障害を伴う。アッシャー症候群は、臨床的かつ遺伝子的に不均質であり、遺伝性盲ろうの最も一般的な原因であり、有病率はおよそ１/６０００人の個体である（１６）。疾患の重症度及び進行に応じて、疾患の３つの臨床型が区別され得る：アッシャー症候群型１型（ＵＳＨ１）、アッシャー症候群２型（ＵＳＨ２）、及びアッシャー症候群３型（ＵＳＨ３）。
アッシャー症候群２型が最も一般的な病型であり、それは先天性の中等度から重度の難聴、及び思春期後の網膜色素変性症の発症によって特徴付けられる（２３）。８５％以下のアッシャー症候群２型患者は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子に突然変異を有する（３８）。さらに、世界の有病率が１/４０００人の個体である、常染色体劣性網膜色素変性症（ａｒＲＰ）症例の２３％も、ＵＳＨ２Ａの突然変異に起因し（２２）、これによりＵＳＨ２Ａは、孤立性及び症候群性の網膜色素変性症の両方の原因である主要な遺伝子となる（２６及び５）。
ＵＳＨ２Ａにおいて４９０個を超える突然変異が同定され、これらは遺伝子全体に分布している（１２）。これらの突然変異の大半は散在している。しかしながら、２つの反復した突然変異、すなわちｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ（又はｐ．Ｃｙｓ７５９Ｐｈｅ）及びｃ．２２９９ｄｅｌＧ（又はｐ．Ｇｌｕ７６７Ｓｅｒｆｓ＊２１）が存在し、これらはエキソン１３内の互いに２２ｂｐの場所に位置している。これらの突然変異は、２つの最も高頻度に見られるＵＳＨ２Ａ突然変異であり、それらは一緒に、アッシャー症候群２型及び常染色体劣性網膜色素変性症の症例のほぼ半分の主原因である。興味深いことに、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ突然変異は、機能低下型対立遺伝子として記載されている。ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔが、ホモ接合型又はヘテロ接合型の状態で存在する場合、それにより孤立性常染色体劣性網膜色素変性症に至る。これとは対照的に、ｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異がホモ接合型状態で、又はｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ以外の突然変異を有する複合ヘテロ接合型として存在する場合、それによりアッシャー症候群２型に至る。
現在、ＵＳＨ２Ａ内に突然変異を有する患者には利用可能な処置はない。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用した遺伝子増大療法は、ハプロ不全又は機能欠失型突然変異によって引き起こされる、単一遺伝子性の遺伝性網膜ジストロフィーのための有望な処置である（１０、１３、１９及び３０）。しかしながら、ＡＡＶベクターの主な限界は、大きな遺伝子の導入を妨げる、そのクローニング能（＜４．７ｋｂ）である。この限界は、９ｋｂのクローニング能を有するレンチウイルスベクターに基づいたウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）を使用することによって、アッシャー症候群１Ｂ型に関与するＭＹＯ７Ａについては克服された（４０）。
しかしながら、ＵＳＨ２Ａのコード配列のサイズの大きさ（１５，６０６ｂｐ；Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿２０６９３３）により、この遺伝子については、ＥＩＡＶにより媒介される導入でさえも利用できない。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムなどのゲノム編集戦略を使用した遺伝子修正は、遺伝性網膜ジストロフィーの処置のための有望な代替選択肢である。ゲノム編集により、遺伝子の置換の代わりに、疾患を引き起こす突然変異の標的化された修正が可能となる（４、７及び１１）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、インビボ及びエクスビボでのゲノム編集治療に主に使用される（３１、３９及び４１）、細菌の適応免疫系（８、１４、及び２０）である。該システムは、２つの主な成分を含む：Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び単一のガイドＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）。Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡ配列及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、すなわちｇＲＮＡ配列の３’末端に見られる３ヌクレオチド配列（ＳｐＣａｓ９の場合ＮＧＧ）によって駆動される、ＤＮＡ内の特定の遺伝子座における、二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導するだろう（１７）。ＤＮＡの切断後、標的遺伝子座は典型的には、ＤＮＡ修復のための２つの主要な経路の１つを受けるだろう（２５）。エラーしがちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路では、二本鎖切断の２つの末端が無作為にライゲートされ、所望の領域に挿入欠失（インデル）が残る（３）。あるいは、ドナー鋳型を使用した相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用することにより、所望の領域においてゲノムを正確に編集することができる（８）。
患者特異的な人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）技術とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を一緒に連動させることにより、再生療法及び患者の個別化医療の窓を開拓した。患者自身の細胞の修正により、移植療法のための自己ｉＰＳＣから誘導された網膜細胞を生成することができた。このように、患者は、移植片拒絶のリスクを伴うことなく、免疫抑制剤の処方計画を避けることができた（２１）。
しかしながら、本発明者らの知る限りでは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子内のｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧの両方の突然変異の効率的な修正を実証した研究は全くない。
それ故、２つの前記のＵＳＨ２Ａ突然変異の１つを呈している、アッシャー症候群２型又は常染色体劣性網膜色素変性症のいずれかを患っている患者を効率的に処置するための新規な遺伝子療法戦略を開発する必要性が依然としてある。
発明の要約
出願人は、前記の必要性に対処する方法を同定した。
出願人は、前記の必要性に対処する方法を同定した。
したがって、本発明の第一の目的は、２つの最も高頻度に見られるＵＳＨ２Ａ突然変異をインビトロで又はエクスビボで修正するための方法に関する。
特に、本発明の第一の目的は、したがって、
（ｉ）（ａ）配列番号１、配列番号２、及び配列番号７からなる群より選択された少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つのガイド核酸（ｇＲＮＡ）を細胞に与えること；
（ｂ）少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼ、特に少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、特に少なくとも１つの高効率のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｅＳｐＣａｓ９（１．１））を該細胞に与えること；及び
（ｃ）突然変異したＵＳＨ２Ａ遺伝子の修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸、特に一本鎖オリゴデオキシ核酸（ｓｓＯＤＮ）の形態のものを該細胞にさらに与えること
による、部位特異的ゲノム編集システムを該細胞に与える工程；
（ｉｉ）工程(ｉ)で得られた細胞を培養することにより、前記の少なくとも１つのドナー核酸が、細胞ゲノム内に組み込まれて、２つの最も高頻度に見られるＵＳＨ２Ａの突然変異の中の少なくとも１つが修正される工程
を含む、個体の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のゲノム内の、両方共にエキソン１３にある、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧの突然変異の中から選択される、少なくとも１つのＵＳＨ２Ａ突然変異をインビトロで又はエクスビボで修正するための方法に関する。
（ｉ）（ａ）配列番号１、配列番号２、及び配列番号７からなる群より選択された少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つのガイド核酸（ｇＲＮＡ）を細胞に与えること；
（ｂ）少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼ、特に少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、特に少なくとも１つの高効率のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｅＳｐＣａｓ９（１．１））を該細胞に与えること；及び
（ｃ）突然変異したＵＳＨ２Ａ遺伝子の修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸、特に一本鎖オリゴデオキシ核酸（ｓｓＯＤＮ）の形態のものを該細胞にさらに与えること
による、部位特異的ゲノム編集システムを該細胞に与える工程；
（ｉｉ）工程(ｉ)で得られた細胞を培養することにより、前記の少なくとも１つのドナー核酸が、細胞ゲノム内に組み込まれて、２つの最も高頻度に見られるＵＳＨ２Ａの突然変異の中の少なくとも１つが修正される工程
を含む、個体の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のゲノム内の、両方共にエキソン１３にある、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧの突然変異の中から選択される、少なくとも１つのＵＳＨ２Ａ突然変異をインビトロで又はエクスビボで修正するための方法に関する。
特定の実施態様では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異の一方又は両方を有するゲノムを有する個体から事前に回収された細胞のインビトロでの処理から誘導される。
特に、前記個体は、遺伝性網膜ジストロフィーを患っている、特に網膜色素変性症を患っている、より特定すると孤立性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症を患っている個体である。
本発明の別の目的は、上記に定義されているような本発明に記載の方法によって得ることのできる、遺伝子的に改変された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、特にｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ又はｃ．２２９９ｄｅｌＧの突然変異が修正されたｉＰＳＣに関する。
本発明の別の目的は、上記に定義されているような本発明に記載の方法によって得ることのできる、遺伝子的に改変された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、特にｃ．２２７６Ｇ＞Ｔの突然変異が修正されたｉＰＳＣに関する。
別の目的は、上記に定義されているような本発明に記載の方法によって得ることのできる、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔの突然変異及びｃ．２２９９ｄｅｌＧの突然変異が修正された遺伝子的に改変された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に関する。
本発明のさらなる目的は、本発明の遺伝子的に改変されたｉＰＳＣから分化した少なくとも１つの細胞を、薬学的に許容される媒体中に含んでいる、医薬組成物に関する。
本発明の別の目的は、医薬品としてのその使用のための、本発明に記載の遺伝子的に改変された細胞又は医薬組成物に関する。
本発明のさらなる目的は、遺伝性網膜ジストロフィー、特に網膜色素変性症、より特定すると、孤立性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症の処置に使用するための、本発明に記載の遺伝子的に改変された細胞又は医薬組成物に関する。
本発明の別の目的は、
（ｉ）配列番号１、配列番号２、及び配列番号７からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列を含んでいる、少なくとも１つのガイド核酸；
（ｉｉ）少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼ、特に少なくともＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、特に少なくとも１つの高効率のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｅＳｐＣａｓ９（１．１））；
（ｉｉｉ）ＵＳＨ２Ａ遺伝子の修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸、特に一本鎖オリゴデオキシ核酸（ｓｓＯＤＮ）の形態のもの、及び
（ｉｖ）場合により、少なくとも（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の成分を含んでいる、少なくとも１つの送達ビヒクル
を含んでいる、それを必要とする個体の、細胞のゲノム内の、例えば光受容体細胞のゲノム内の、１つ以上のＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異を修正するための、部位特異的遺伝子工学操作システムに関する。
（ｉ）配列番号１、配列番号２、及び配列番号７からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列を含んでいる、少なくとも１つのガイド核酸；
（ｉｉ）少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼ、特に少なくともＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、特に少なくとも１つの高効率のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｅＳｐＣａｓ９（１．１））；
（ｉｉｉ）ＵＳＨ２Ａ遺伝子の修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸、特に一本鎖オリゴデオキシ核酸（ｓｓＯＤＮ）の形態のもの、及び
（ｉｖ）場合により、少なくとも（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の成分を含んでいる、少なくとも１つの送達ビヒクル
を含んでいる、それを必要とする個体の、細胞のゲノム内の、例えば光受容体細胞のゲノム内の、１つ以上のＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異を修正するための、部位特異的遺伝子工学操作システムに関する。
特定の実施態様では、それを必要とする個体は、遺伝性網膜ジストロフィーを患っている、特に網膜色素変性症を患っている、より特定すると孤立性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症を患っている個体である。
発明の詳細な説明
本発明者らは、細胞のゲノム内の、特に人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のゲノム内の、より特定すると２つの異なる個体に由来するｉＰＳＣのゲノム内の、２つの最も高頻度に見られるＵＳＨ２Ａ突然変異を成功裡に修正しようとした。上記のように、２つの最も高頻度に見られるＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異であるｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ（又はｐ．Ｃｙｓ７５９Ｐｈｅ）及びｃ．２２９９ｄｅｌＧ（又はｐ．Ｇｌｕ７６７Ｓｅｒｆｓ＊２１）。
本発明者らは、細胞のゲノム内の、特に人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のゲノム内の、より特定すると２つの異なる個体に由来するｉＰＳＣのゲノム内の、２つの最も高頻度に見られるＵＳＨ２Ａ突然変異を成功裡に修正しようとした。上記のように、２つの最も高頻度に見られるＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異であるｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ（又はｐ．Ｃｙｓ７５９Ｐｈｅ）及びｃ．２２９９ｄｅｌＧ（又はｐ．Ｇｌｕ７６７Ｓｅｒｆｓ＊２１）。
アッシャー症候群２型を呈する第一の患者（ホモ接合型突然変異ｃ．２２９９ｄｅｌＧ）及び常染色体劣性網膜色素変性症を呈する第二の患者（ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧについて複合ヘテロ接合型）。
以下の実験部に実証されているように、本発明者らは、ＵＳＨ２症候群を呈する患者に由来するｉＰＳＣ細胞株において、ＵＳＨ２Ａについての最も高頻度に見られる突然変異（ｃ．２２９９ｄｅｌＧ）の高効率の修正を成し遂げ、常染色体劣性網膜色素変性症を呈する別の患者のｉＰＳＣにおける、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ突然変異を修正することができた。
さらに、作製されたＵＳＨ２Ａ遺伝子の修正されたｉＰＳＣは、典型的なｉＰＳＣの特徴を示した。
最後に、本発明者らは、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧの突然変異の両方について、本発明に従って修正されたｉＰＳＣ細胞の、網膜オルガノイドへの分化が、オルガノイドに、境界のきちんと定められた層状構造、及び健康な網膜オルガノイドに類似した刷子縁を与えることを実証した。修正されていない網膜オルガノイドは、刷子縁がより短いか又は存在しない、あまり境界のきちんと定められていない層状構造を有していた。
本発明に記載のｉＰＳＣの投与に基づいた処置は、症候群性網膜色素変性症（アッシャー症候群２型）及び／又は孤立性常染色体劣性網膜色素変性症（現在、利用可能な処置はない）を呈する多くの患者に適用可能な細胞療法及び遺伝子療法のための新規ツールを提供する。
１つ以上のＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異をエクスビボで又はインビトロで修正するための方法
上記に示されているように、本発明の第一の目的は、２つの最も高頻度で見られるＵＳＨ２Ａ突然変異のうち少なくとも１つをインビトロで又はエクスビボで修正するための方法に関する。
上記に示されているように、本発明の第一の目的は、２つの最も高頻度で見られるＵＳＨ２Ａ突然変異のうち少なくとも１つをインビトロで又はエクスビボで修正するための方法に関する。
特に、本発明の第一の目的は、
（ｉ）（ａ）配列番号１、配列番号２、及び配列番号７からなる群より選択された少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つのガイド核酸（ｇＲＮＡ）を細胞に与えること；
（ｂ）少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼ、特に少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、特に少なくとも１つの高効率のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｅＳｐＣａｓ９（１．１））を該細胞に与えること；及び
（ｃ）突然変異したＵＳＨ２Ａ遺伝子の修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸、特に一本鎖オリゴデオキシ核酸（ｓｓＯＤＮ）の形態のものを該細胞にさらに与えること
による、部位特異的遺伝子工学操作システムを該細胞に与える工程；
（ｉｉ）工程(ｉ)で得られた細胞を培養することにより、前記の少なくとも１つのドナー核酸が、細胞ゲノム内に組み込まれて、１つ以上のＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異が修正される工程
を含む、個体の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のゲノム内の、両方共にエキソン１３にある、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧの突然変異の中から選択される、２つのＵＳＨ２Ａ突然変異のうち少なくとも１つをインビトロで又はエクスビボで修正するための方法に関する。
（ｉ）（ａ）配列番号１、配列番号２、及び配列番号７からなる群より選択された少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つのガイド核酸（ｇＲＮＡ）を細胞に与えること；
（ｂ）少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼ、特に少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、特に少なくとも１つの高効率のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｅＳｐＣａｓ９（１．１））を該細胞に与えること；及び
（ｃ）突然変異したＵＳＨ２Ａ遺伝子の修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸、特に一本鎖オリゴデオキシ核酸（ｓｓＯＤＮ）の形態のものを該細胞にさらに与えること
による、部位特異的遺伝子工学操作システムを該細胞に与える工程；
（ｉｉ）工程(ｉ)で得られた細胞を培養することにより、前記の少なくとも１つのドナー核酸が、細胞ゲノム内に組み込まれて、１つ以上のＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異が修正される工程
を含む、個体の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のゲノム内の、両方共にエキソン１３にある、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧの突然変異の中から選択される、２つのＵＳＨ２Ａ突然変異のうち少なくとも１つをインビトロで又はエクスビボで修正するための方法に関する。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）に類似した多能性幹細胞様状態を示す、遺伝子的に初期化された成体細胞である。それらは、ヒト体内に存在することは知られていないが、胚性幹細胞と類似した品質を示す、人工的に作製された幹細胞である。このような細胞の作製は、Ying WANG et al.（４７）並びにLapillonne H. et al.（４８）及びJ. DIAS et al.（４９）に考察されているように、当技術分野において周知である。
ｉＰＳＣは典型的には、多能性に関連した特定のセットの遺伝子産物「すなわち初期化因子群」を、所与の細胞型に導入することによって誘導され、これは当業者には周知でありる。
例えば、ｉＰＳＣは、ヒト線維芽細胞から作製されてもよい。
ｉＰＳＣの作製は、誘導に使用される転写因子に決定的に依存している。
ｉＰＳＣは成体組織から直接誘導され得るので、それらは胚の必要性を迂回するだけでなく、患者に適合した様式で作製されることができ、このことは、各個体が、その個体自身の多能性幹細胞株を有することができることを意味する。
したがって、特定の実施態様では、本発明に記載のｉＰＳＣは、２つの最も高頻度に見られるＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異の一方又は両方を有するゲノムを有する個体から事前に回収された細胞のインビトロでの処理から誘導される。
特定の実施態様では、１つ以上のＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異を有するゲノムを有する個体は、孤立性網膜ジストロフィーを患っている、特に網膜色素変性症を患っている、より特定すると孤立性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症を患っている個体である。
本明細書に記載のようなｉＰＳＣは好ましくは精製されている。試料は、以下に定義されているような眼の細胞に適用される。
ｉＰＳＣを精製するための多くの方法が、当技術分野において公知である。
本明細書において使用する「精製されたｉＰＳＣ」又は「精製された眼細胞」は、列挙された細胞が、精製された試料中の細胞の少なくとも５０％；より好ましくは精製された試料中の細胞の少なくとも５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上を構成することを意味する。
細胞の選択及び／又は細胞の精製は、実質的に純粋な細胞集団を得るために、陽性及び陰性の両方の選択法を使用することによって実施され得る。
１つの態様では、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）は、フローサイトメトリーとも呼ばれるが、これを使用して、様々な細胞集団を選別及び分析することができる。ｉＰＳＣに特異的な細胞マーカーを有する細胞に、細胞マーカーに結合する抗体又は典型的には抗体混合物を用いてタグを付ける。様々なマーカーに指向される各抗体を、検出可能な分子、特に他の抗体に結合した他の蛍光色素から識別することのできる蛍光色素にコンジュゲートさせる。染色された細胞流を、蛍光色素を励起する光源に通し、細胞からの発光スペクトルは、特定の標識された抗体の存在を検出する。様々な蛍光色素の同時検出によって、異なる細胞マーカーのセットを示す細胞が同定され、集団中の他の細胞から単離される。側方散乱（ＳＳＣ）、前方散乱（ＦＳＣ）及び生体色素染色（例えば、ヨウ化プロピジウムを用いた）などであるがこれらに限定されない、他のＦＡＣＳパラメーターも、サイズ及び生存率に基づいた細胞の選択を可能とする。
別の態様では、免疫磁気標識を使用して、様々な細胞集団を選別することができる。この方法は、抗体又はレクチンを介した、細胞に対する小さな磁性粒子の付着に基づく。細胞混合集団を磁場に置くと、ビーズの付着した細胞は、磁石によって誘引され、よって、未標識の細胞から分離され得る。
特定の実施態様では、事前に回収されｉＰＳＣが誘導される細胞は、自己細胞であり得、すなわち、ＵＳＨ２Ａ遺伝子内に１つ以上の突然変異を有し、かつ本明細書に開示された方法によって修正された細胞のその後の投与が企画される、個体から回収された細胞であり得る。
「自己」は、同じ患者又は個体に由来するか又は派生することを指す。「自己移植片」は、被験者自身の細胞又は器官の収集及び再注入又は移植を指す。排他的又は補助的な自己細胞の使用は、宿主に戻される細胞の投与の多くの有害な作用、特に宿主反応を排除又は低減することができる。
この場合、特定の実施態様では、ｉＰＳＣが誘導される最初の細胞は、１つ以上のＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異を有するゲノムを有する個体から、特に遺伝性網膜ジストロフィーを患っている、特に網膜色素変性症を患っている、より特定すると孤立性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症を患っている個体から事前に回収される。
別の実施態様では、ｉＰＳＣの最初の集団は、同種異系ドナーから、又は複数の同種異系ドナーから誘導され得る。ドナーは、互いに関連していても関連していなくてもよく、移植の状況では、レシピエント（又は個体）に関連していても関連していなくてもよい。
本明細書においてすでに明記されているように、本明細書に記載のような本発明による細胞のゲノム、特にｉＰＳＣのゲノムは、１つ以上のＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異、すなわちｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧの突然変異について遺伝子的に修正されている。
ＵＳＨ２Ａ遺伝子は、１番染色体に位置し、７２個のエキソンを含んでいる、常染色体劣性遺伝子である。
ＵＳＨ２Ａ遺伝子は、アシェリン（usherin）と呼ばれるタンパク質をコードしている。アシェリンは、基底膜の重要な成分であり、これは多くの組織内の細胞を分離かつ支持している薄いシート様の構造である。アシェリンは、内耳の感覚育毛細胞に、及び眼底を裏打ちする組織である網膜の感光性光受容体に見られる。アシェリンの機能は十分に確立されていないが、研究は、それが、内耳及び網膜における細胞の発生及び維持に重要な役割を果たしている一群のタンパク質（タンパク質複合体）の一部であることを示唆する。
上記されているように、ＵＳＨ２Ａは、特に網膜色素変性症を患っている、より特定すると孤立性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症を患っている個体における、遺伝性網膜ジストロフィーの原因である主な遺伝子である。エキソン１３内で互いに２２ｂｐの位置にある、ＵＳＨ２Ａにおいて同定された２つの最も高頻度に見られる突然変異は、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ（又はｐ．Ｃｙｓ７５９Ｐｈｅ）及びｃ．２２９９ｄｅｌＧ（又はｐ．Ｇｌｕ７６７Ｓｅｒｆｓ＊２１）である。
ＵＳＨ２を患っている個体は、ｃ．２２９９ｄｅｌＧの少なくとも１つのコピーを含有し得る。
常染色体劣性網膜色素変性症を患っている個体は、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔの少なくとも１つのコピーを含有し得る。
突然変異がＵＳＨ２Ａ遺伝子の両方の対立遺伝子上に存在する場合、該突然変異は、ホモ接合型としての特性があるとする。
例えば、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のホモ接合型ｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の両方の対立遺伝子が、ｃ．２２９９ｄｅｌＧの突然変異を含有していることを意味する。
逆に、突然変異が対立遺伝子毎に異なる場合、該突然変異はヘテロ接合型としての特性があるとする。
例えば、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のヘテロ接合型ｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異は、一方の対立遺伝子がｃ．２２９９ｄｅｌＧの突然変異を含有し、他方の対立遺伝子は含有していないことを意味する。
常染色体劣性網膜色素変性症を患っている個体は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のヘテロ接合型ｃ．２２９９ｄｅｌＧ及びｃ．２２７６Ｇ＞Ｔの突然変異を含有し得る。
本明細書に記載のような細胞のゲノム内の１つ以上のＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異をインビトロで又はエクスビボで修正するための方法の工程（ｉ）（ａ）は、該細胞に、配列番号１、配列番号２及び配列番号７からなる群より選択された少なくとも１つの核酸配列を含んでいる少なくとも１つのガイド核酸（ｇＲＮＡ）を与えることとして定義される。
ｇＲＮＡは、標的特異的な短い一本鎖ＲＮＡ配列である。ｇＲＮＡと一般的に称されるが、それは、２つのＲＮＡ分子の融合物である：すなわち、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）（これらは、標的ＤＮＡに結合する際に等しく効果的である）。
ｇＲＮＡは通常、８０ヌクレオチドの定常領域と、ワトソンクリック塩基対形成を介して、ＤＮＡ標的に結合する短い２０ヌクレオチドの標的特異的な配列（ｇＲＮＡ配列の５’にある）を含む。
ｇＲＮＡは人工的であり、天然には存在しない。
上記に示されているようなｇＲＮＡの配列は、それらの標的化ＤＮＡ配列に対して相補的であるＲＮＡ配列である。
配列番号７の少なくとも１つの核酸配列を含んでいるｇＲＮＡが、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ突然変異を含んでいる対立遺伝子において同定されたＳＮＰ（一塩基多型）に対して相補的である配列を組み込むように、本発明者らによって設計され、クローニングされた。同定されたＳＮＰは、対立遺伝子１におけるｃ．２２７６Ｇ＞Ｔに対してシスにあるｃ．２２５６Ｔ＞Ｃである。このｇＲＮＡは、ミスセンス変異対立遺伝子を認識することができる。
このＳＮＰは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ突然変異を有する患者の７５％のゲノムに存在している。それ故、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ対立遺伝子を有する患者の大半は、同じ対立遺伝子内にＳＮＰも有する。
この同定されたＳＮＰに対して相補的な配列を含んでいるｇＲＮＡの設計は、標的化された対立遺伝子の認識を大いに改善した。
特定の実施態様では、少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１、配列番号２及び配列番号７からなる群より選択された少なくとも１つの核酸配列からなる。
上記に定義されているように、本明細書に記載のような方法の工程（ｉ）（ｂ）は、少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼ、特に少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、特に少なくとも１つの高効率のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｅＳｐＣａｓ９（１．１））を該細胞に与えることとして定義される。
本発明に記載のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、標的部位特異性に欠けている、すなわち、該ヌクレアーゼは、単独では、本明細書に記載の細胞のゲノム内の特定の標的部位を認識することができない。
特定の標的部位内のＤＮＡを特異的に切断するために、このようなヌクレアーゼは、選択された標的部位に結合し、二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する、上記のようなガイド核酸（ｇＲＮＡ）に会合していることが必要である。
本発明によると、上記されているように、選択された標的部位は、該細胞のゲノム内に含まれるＵＳＨ２Ａ遺伝子のエキソン１３に位置する。
ガイド核酸（ｇＲＮＡ）によって標的部位に誘導される場合、本明細書に記載のようなヌクレアーゼは、該標的部位内に二本鎖切断を導入することができる。
特定の実施態様では、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、特に少なくとも１つの高効率のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｅＳｐＣａｓ９（１．１））である。
上記に定義されているように、本明細書に記載のような方法の工程（ｉ）（ｃ）は、突然変異したＵＳＨ２Ａ遺伝子の修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸、特に一本鎖オリゴデオキシ核酸（ｓｓＯＤＮ）の形態のものを該細胞に与えることとして定義される。
実際に、本発明に記載の方法の目的は、細胞のゲノム内の２つの最も高頻度に見られるＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異の少なくとも１つを修正することである。
一旦、ＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、特にｅＳｐＣａｓ９（１．１）が、工程（ｉ）（ｂ）の終了時にＵＳＨ２Ａ遺伝子のＤＮＡ鎖を切断したら、該細胞は、該細胞の天然的な自己修復能を使用するだろう。
修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸の存在は、細胞を代替的な修復経路の方向に、すなわち、相同組換え修復（ＨＤＲ）の方向に向けることである。
これを達成するために、特にｓｓＯＤＮの形態の、修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸は、細胞のゲノム内に導入されなければならない、所望の配列を有する。今回の場合、修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸は、突然変異していないＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する。
特定の数の細胞が、この鋳型を、壊れた配列を相同的組換えを介して修復するために使用し、これにより、所望の修正がゲノム内に取り込まれるだろう。
修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸は、細胞の他方の対立遺伝子内の姉妹染色分体、外因性プラスミド/ベクター、又は一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）からなる群より選択され得る。特定の実施態様では、修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である。
ｓｓＯＤＮは、ゲノム内の二本鎖を切断する時に相同組換え修復（ＨＤＲ）を指令するための有効かつ強力な鋳型であることが示されている（Strouse, Bialk, Niamat, Rivera-torres, & Kmiec, 2014）（３６）。以前の研究は、標的化されていない鎖に対して相補的である非対称なｓｓＯＤＮが、相同組換え修復を増強することを実証した。
特定の実施態様では、修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸、特にｓｓＯＤＮは、ｇＲＮＡによって標的化されない鎖に対して相補的である。
特定の実施態様では、修復鋳型としての役目を果たすドナー核酸、特にｓｓＯＤＮは非対称である。
非対称又は対称に設計されたドナー核酸は、ＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓ９ヌクレアーゼのヌクレアーゼ標的部位のいずれかの側上に、異なる数のヌクレオチドを含む核酸である。
特に、本発明に適した非対称なｓｓＯＤＮは、７１ヌクレオチドを含有している近位配列（それは、ヌクレアーゼ標的部位の前の配列である）と４９ヌクレオチドを含有している遠位配列（それは、ヌクレアーゼ標的部位の後の配列である）とを含んでいる非対称なｓｓＯＤＮ、２１ヌクレオチドを含有している近位配列と３６ヌクレオチドを含有している遠位配列とを含んでいる非対称なｓｓＯＤＮ、２１ヌクレオチドを含有している近位配列と４９ヌクレオチドを含有している遠位配列とを含んでいる非対称なｓｓＯＤＮ、２１ヌクレオチドを含有している近位配列と８９ヌクレオチドを含有している遠位配列とを含んでいる非対称なｓｓＯＤＮ、７１ヌクレオチドを含有している近位配列と２６ヌクレオチドを含有している遠位配列とを含んでいる非対称なｓｓＯＤＮ、７１ヌクレオチドを含有している近位配列と１６ヌクレオチドを含有している遠位配列とを含んでいる非対称なｓｓＯＤＮ、７１ヌクレオチドを含有している近位配列と３６ヌクレオチドを含有している遠位配列とを含んでいる非対称なｓｓＯＤＮ、９１ヌクレオチドを含有している近位配列と３６ヌクレオチドを含有している遠位配列とを含んでいる非対称なｓｓＯＤＮ、又は、１１４ヌクレオチドを含有している近位配列と８３ヌクレオチドを含有している遠位配列とを含んでいる非対称なｓｓＯＤＮから選択され得る。
特定の実施態様では、本発明の非対称なｓｓＯＤＮは、９１ヌクレオチドを含有している近位配列と３６ヌクレオチドを含有している遠位配列とを含む。
例えば、以下の実験部に定義されるｓｓＯＤＮ（実施例１参照）は、非対称的に設計され、ＰＡＭ近位領域に９１ヌクレオチドを含有し、ＰＡＭ遠位領域に３６ヌクレオチドを含有している。
特定の実施態様では、修復鋳型としての役目を果たすドナー核酸、特にｓｓＯＤＮは、一端に、好ましくは両端に（すなわち５'及び３'に）、少なくとも１つの修飾された末端塩基を含む。特に、修復鋳型としての役目を果たすドナー核酸、特にｓｓＯＤＮは、両端のそれぞれに２つの修飾された末端塩基を含む。
好ましくは、修復鋳型としての役目を果たすドナー核酸、特にｓｓＯＤＮは、一端に、好ましくは両端に、少なくとも１つのホスホロチオエートで修飾された末端塩基を含む。特に、修復鋳型としての役目を果たすドナー核酸、特にｓｓＯＤＮは、両末端のそれぞれに２つのホスホロチオエートで修飾された末端塩基を含む。
これらの修飾された末端塩基は、ドナー核酸（群）の安定性の増強を可能とする。
好ましくは、修飾は、修復鋳型としての役目を果たすドナー核酸、特にｓｓＯＤＮの配列の最初の２つのヌクレオチドに、及び該配列の最後の２つのヌクレオチドに存在する。
好ましい実施態様では、少なくとも１つのドナー核酸は、非対称であり、一端に、好ましくは両端に、少なくとも１つの修飾された末端塩基を含んでいる、特に少なくとも１つ、好ましくは２つのホスホロチオエートで修飾された末端塩基を、両端のそれぞれに含んでいる、ｇＲＮＡによって標的化されない鎖に対して相補的である、少なくとも１つのｓｓＯＤＮである。
この特定の設計のｓｓＯＤＮの使用は、相同組換え修復によって媒介される突然変異の修正を増加させることが示されている。さらに、ｓｓＯＤＮの両端に付加された修飾は、相同組換え修復事象を遂行するｓｓＯＤＮの安定化を助ける。
特定の実施態様では、突然変異したＵＳＨ２Ａ遺伝子のための修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸は、ＵＳＨ２Ａの参照配列（１５，６０６ｂｐ；Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿２０６９３３）を使用して設計される。
特定の実施態様では、修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のエキソン１３の一部を含む。
特に、修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸は、１つ又は２つの突然変異部位を含む、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のエキソン１３の配列の少なくとも一部を含む。
特定の実施態様では、修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸は、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列を含む。特定の実施態様では、修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸は、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列からなる。
本明細書に記載のような方法の工程（ｉ）（ａ）、（ｉ）（ｂ）及び（ｉ）（ｃ）は、独立して同時に実現されても、又は互いに別々に実現されてもよい。好ましい実施態様では、工程（ｉ）（ａ）の少なくとも１つのガイド核酸（ｇＲＮＡ）、工程（ｉ）（ｂ）の少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼ、特にｅＳｐＣａｓ９（１．１）、及び工程（ｉ）（ｃ）の突然変異したＵＳＨ２Ａ遺伝子のための修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸は、該細胞に同時に与えられる。
タンパク質及び核酸分子を細胞内にインビトロで、エクスビボで、又はインビボで導入する方法は、当技術分野において周知である。通常はベクター内に存在する核酸、又はタンパク質を細胞内に導入する伝統的な方法としては、マイクロインジェクション法、電気穿孔法、及び超音波法が挙げられる。物理的、力学的、及び生化学的アプローチに基づいた他の技術、例えばマグネトフェクション、光学的注入、オプトポレーション、光学的トランスフェクション、及びレーザーフェクションなども記述され得る（４２）。
本明細書に記載のような、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質（Ｃａｓ）は、特にＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である。
特定の実施態様では、少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼは、高効率のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、特にｅＳｐＣａｓ９（１．１）である。
ｅＳｐＣａｓ９（１．１）は、Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ突然変異を有し、かつ標的ではないＤＮＡ鎖に対するタンパク質の親和性を低下させ、これにより、ミスマッチを含有しているらせんの安定性は低下するように作製された、特異性の増強されたＣａｓ９ヌクレアーゼである（４３）。それは、オフターゲットにおいては有意に減少するが、頑強なオンターゲット活性を維持している、ヒト細胞内のＤＮＡ切断を評価することが示された。
ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは特に、標的化のためにタンパク質－ＤＮＡの相互作用を使用する他のシステムの代わりに、工学操作されたＲＮＡと標的ＤＮＡ部位との間の単純な塩基対形成の原則を使用したシステムである。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、侵入するプラスミド及びウイルスから防御するために細菌において進化した適応免疫系に由来する。
１つの実施態様によると、それは、侵入する短い核酸配列がＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に取り込まれる機序からなる。それらはその後、転写され、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされ、これはトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と一緒に、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質と複合体を形成し、核酸間のワトソンクリック塩基対形成を通したＣａｓヌクレアーゼによるＤＮＡの切断の特異性を指令する。ｃｒＲＮＡは、「プロトスペーサー」配列として知られる可変配列を有する。ｃｒＲＮＡのプロトスペーサーをコードする部分は、相補的な標的ＤＮＡ配列が「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）として知られる短い配列に隣接している場合、その相補的な標的ＤＮＡ配列を切断するようにＣａｓ９に指令する。ＣＲＩＳＰＲに取り込まれたプロトスペーサー配列は切断されない。なぜなら、それらは、ＰＡＭ配列の隣に存在しないからである（４４及び４５参照）。
この実施態様によると、本明細書に記載のようなガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合物に相当し、これはｇＲＮＡとして知られる。本文書において使用されるガイドＲＮＡすなわちｇＲＮＡという用語は、この具体的な形態を示す。
１つの実施態様によると、本発明の方法は、配列番号１、配列番号２、及び配列番号７からなる群より選択され、好ましくは配列番号７である、少なくとも１つの核酸配列を含んでいる少なくとも１つのガイド核酸（ｇＲＮＡ）、少なくとも１つの高効率のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９、好ましくはｅＳｐＣａｓ９（１．１）、及び、好ましくは一端に、好ましくは両端に、少なくとも１つ、好ましくは２つの修飾された末端塩基を含んでいる、非対称で一本鎖のオリゴデオキシ核酸（ｓｓＯＤＮ）を含んでいる、少なくとも１つのガイド核酸（ｇＲＮＡ）を具備し得る。
上記に定義されているように、本明細書に記載のような方法の工程（ｉｉ）は、工程(ｉ)で得られた細胞を培養することにより、前記の少なくとも１つのドナー核酸が、細胞ゲノム内に組み込まれて、１つ以上のＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異が修正される工程として定義される。
したがって、工程（ｉｉ）の終了時に、細胞のゲノムは、修正されたＵＳＨ２Ａ遺伝子を含有し、このことは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子が、機能的なｍＲＮＡに転写され得、さらに機能的なタンパク質へと翻訳され得ることを意味する。
機能的なｍＲＮＡは、その活性が、突然変異を全く含有していないＵＳＨ２Ａ遺伝子から転写されたｍＲＮＡの活性と少なくとも同等である、ｍＲＮＡである。
機能的なタンパク質は、その活性が、突然変異を全く含有していないＵＳＨ２Ａ遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質の活性と少なくとも同等である、タンパク質である。
遺伝子的に改変された人工多能性幹細胞
本発明はまた、上記に定義されているような本発明に記載の方法によって得ることのできる、遺伝子的に改変された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に関する。
本発明はまた、上記に定義されているような本発明に記載の方法によって得ることのできる、遺伝子的に改変された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に関する。
特に、本発明は、上記に定義されているような本発明に記載の方法によって得ることのできる、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ突然変異及び／又はｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異が修正されている、遺伝子的に改変された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に関する。
特に、本発明は、上記に定義されているような本発明に記載の方法によって得ることのできる、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ突然変異が修正されている、遺伝子的に改変された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に関する。
特に、本発明は、上記に定義されているような本発明に記載の方法によって得ることのできる、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ突然変異及びｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異が修正されている、遺伝子的に改変された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に関する。
いくつかの実施態様では、（ｉ）１つ以上のガイド核酸（ｇＲＮＡ）、（ｉｉ）少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、特に少なくともＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、特に少なくとも１つの高効率のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９であるｅＳｐＣａｓ９（１．１）、（ｉｉｉ）少なくとも１つのドナー核酸、特にｓｓＯＤＮの形態のもの、及び（ｉｖ）場合により（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の成分を含んでいる少なくとも１つの送達ビヒクルを含んでいる、本明細書に開示されているような、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の１つ以上の突然変異を修正するためのシステムは、それを必要とする個体への、すなわち、ＵＳＨ２Ａ遺伝子に１つ以上の突然変異を有するゲノムを有する個体への、局所投与に適切であり得る。該システムのそれを必要とする該個体への局所投与により、該システムは、それを必要とする該個体の１つ以上の細胞に投与されるだろう。
本発明に従って得ることのできるｉＰＳＣから分化した細胞の投与に基づいた処置は、遺伝性網膜ジストロフィーを患っている、特に網膜色素変性症を患っている、より特定すると孤立性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症を患っている多くの患者の処置のための細胞療法に使用され得る。
医薬組成物
本発明はまた、上記に定義されているような本発明に従って遺伝子的に改変されたｉＰＳＣから分化させた少なくとも１つの細胞を、薬学的に許容される媒体中に含んでいる医薬組成物にも関する。
本発明はまた、上記に定義されているような本発明に従って遺伝子的に改変されたｉＰＳＣから分化させた少なくとも１つの細胞を、薬学的に許容される媒体中に含んでいる医薬組成物にも関する。
本明細書に記載のような薬学的に許容される媒体は特に、哺乳動物個体への投与に適している。
「薬学的に許容される媒体」は、医薬組成物の製剤化において、特に眼に投与される予定の医薬組成物の製剤化において当業者には公知である、標準的な薬学的に許容される媒体のいずれかを含む。
本発明によると、本発明に従って遺伝子的に改変されたｉＰＳＣから分化させた少なくとも１つの細胞は、本発明に記載のように調製された遺伝子的に改変されたｉＰＳＣを、それが特定の細胞に分化するまで培養した後に得られる細胞である。培養及び細胞分化は、適切な条件下で行なわれ、１つ以上の系統特異的な分化因子を含む。
これらの分化因子は当業者には周知であり、必要とされる最終的な細胞に従って選択される。
特に、本発明に従って遺伝子的に改変されたｉＰＳＣから分化させた少なくとも１つの細胞は、少なくとも１つの光受容体細胞又は光受容体前駆体である。
光受容体細胞は、感光性の眼細胞である。
哺乳動物の眼には、現在知られている３種類の光受容体細胞が存在する：杆体、錐体、及び内因的に感光性の網膜神経節細胞。２つの古典的な光受容体細胞は、杆体及び錐体であり、各々が、視覚世界の表現を形成する視覚系によって使用される情報すなわち視界に寄与する。杆体は、錐体より狭く、網膜のいたる所に違ったふうに分布しているが、光情報伝達を支持する各々における化学プロセスは、類似している。第三のクラスの哺乳動物光受容体細胞である内因的に感光性の網膜神経節細胞は、１９９０年代の間に発見された
特定の実施態様では、本発明に記載の遺伝子的に改変されたｉＰＳＣから分化した少なくとも１つの細胞は、杆体前駆細胞である。
１つの実施態様では、本明細書に記載のような細胞は、上記に定義されているような、しかし本明細書に記載のように改変されていない、他の細胞と組み合わせて組成物中に使用されてもよい。
１つの実施態様では、本明細書に記載のような細胞は、投与された細胞の治療効果を増強する他の薬剤及び化合物と組み合わせて組成物中に使用されてもよい。
別の実施態様では、本明細書に記載のような細胞は、本明細書に記載のような細胞の分化を増強する治療用化合物と共に組成物で投与されてもよい。これらの治療用化合物は、内因性である細胞、及び／又は、治療法の一部としての個体に投与される細胞の、分化及び動員を誘導する効果を有する。
医薬品としてのそれらの使用のための遺伝子的に改変された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）
本発明の別の目的は、医薬品としてのその使用のための、本発明に記載の遺伝子的に改変された細胞、又は本発明に記載の医薬組成物である。
本発明の別の目的は、医薬品としてのその使用のための、本発明に記載の遺伝子的に改変された細胞、又は本発明に記載の医薬組成物である。
医薬品として使用されるために、本発明に記載の遺伝子的に改変された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、特定の分化した細胞となるように培養されるべきである。
本発明に記載の医薬品に使用され得る分化した細胞を得るために、遺伝子的に改変された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は適切な条件下で培養されるべきである。培養培地は、１つ以上の系統特異的な分化因子を含むべきである。これらの分化因子は、当業者には周知であり、必要とされる最終的な細胞に応じて選択される。
特に、本発明に記載の遺伝子的に改変されたｉＰＳＣから得られた分化した細胞は、少なくとも１つの光受容体細胞又は光受容体前駆体である。
本発明に記載の細胞は、周知の方法によって投与され得る。本明細書に記載のような細胞は、局所投与に、特に網膜下投与に最善に適している。
治療効果を達成するために必要とされる細胞数は、特定の目的のための慣用的な手順に従って経験的に決定されるだろう。
一般的には、治療目的のために細胞を投与するために、細胞は、薬理学的に有効な用量で投与される。
「薬理学的に有効な量」又は「薬理学的に有効な用量」によって、特に、障害若しくは疾患の１つ以上の症状若しくは徴候を低減若しくは排除することを含む、障害若しくは疾患の容態を処置するために、所望の生理学的な効果を生じるに十分な量、又は、所望の結果を達成することのできる量を意味する。
例示的には、アッシャー症候群を患っている患者への細胞の投与は、投与前の患者におけるアシェリンタンパク質の量と比較して、患者におけるＵＳＨ２Ａ遺伝子によってコードされるアシェリンタンパク質の量が増加している場合、治療利点を与える。
注入される細胞数は、性別、年齢、体重、疾患又は障害の種類、障害のステージ、細胞集団中の所望の細胞の比率（例えば細胞集団の純度）、及び治療利点を生じるのに必要とされる細胞数などの因子が考慮されるだろう。
以前に記述されているような、本明細書に記載のような医薬組成物は、本明細書に記載のような細胞の、それを必要とする個体への投与のために使用され得る。
細胞の投与は、１回の投与又は連続投与を通してであり得る。連続投与を伴う場合、様々な細胞数及び／又は様々な細胞集団が各投与に使用され得る。
例示的には、初回投与は、即座の治療利点並びにより延長された効果をもたらす、本明細書に記載のような細胞又は細胞集団であり得るが、２回目の投与は、初回投与の治療効果を延ばす延長効果を与える、本明細書に記載のような細胞を含む。
本発明のさらなる目的は、遺伝性網膜ジストロフィー、特に網膜色素変性症、より特定すると孤立性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症の処置に使用するための、本発明に記載の遺伝子的に改変された細胞、又は本発明に記載の医薬組成物に関する。
本明細書に記載のように、本発明に記載の遺伝子的に改変された細胞及び／又は本発明に記載の医薬組成物の、それを必要とする個体への投与を含む、遺伝性網膜ジストロフィー、特に網膜色素変性症、より特定すると孤立性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症の処置のための方法も記載され得る。
遺伝性網膜ジストロフィー、特に網膜色素変性症、より特定すると孤立性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症の処置のための医薬品の製造のための、本明細書に記載のような本発明に従って遺伝子的に改変された細胞の、それを必要とする個体における使用も記載され得る。
１つ以上のＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異を修正するための部位特異的な遺伝子工学操作システム
本発明はまた、２つの最も高頻度に見られるＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異のうち少なくとも１つを修正するための部位特異的な遺伝子工学操作システムに関する。
本発明はまた、２つの最も高頻度に見られるＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異のうち少なくとも１つを修正するための部位特異的な遺伝子工学操作システムに関する。
特に、本発明はまた、
（ｉ）配列番号１、配列番号２、及び配列番号７からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列を含んでいる、少なくとも１つのガイド核酸（ｇＲＮＡ）；
（ｉｉ）少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼ、特に少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、特に少なくとも１つの高効率のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｅＳｐＣａｓ９（１．１））；
（ｉｉｉ）ＵＳＨ２Ａ遺伝子のための修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸、特に一本鎖オリゴデオキシ核酸（ｓｓＯＤＮ）の形態のもの、及び
（ｉｖ）場合により、少なくとも（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の成分を含んでいる、少なくとも１つの送達ビヒクル
を含んでいる、それを必要とする個体の、細胞のゲノム内の、例えば光受容体細胞のゲノム内の、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧの突然変異の中から選択される２つのＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異のうち少なくとも１つを修正するための、部位特異的な遺伝子工学操作システムに関する。
（ｉ）配列番号１、配列番号２、及び配列番号７からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列を含んでいる、少なくとも１つのガイド核酸（ｇＲＮＡ）；
（ｉｉ）少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼ、特に少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、特に少なくとも１つの高効率のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｅＳｐＣａｓ９（１．１））；
（ｉｉｉ）ＵＳＨ２Ａ遺伝子のための修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸、特に一本鎖オリゴデオキシ核酸（ｓｓＯＤＮ）の形態のもの、及び
（ｉｖ）場合により、少なくとも（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の成分を含んでいる、少なくとも１つの送達ビヒクル
を含んでいる、それを必要とする個体の、細胞のゲノム内の、例えば光受容体細胞のゲノム内の、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧの突然変異の中から選択される２つのＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異のうち少なくとも１つを修正するための、部位特異的な遺伝子工学操作システムに関する。
本発明による及び本明細書に記載のシステムの投与に基づいた処置は、遺伝性網膜ジストロフィーを患っている、特に網膜色素変性症を患っている、より特定すると孤立性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症（現在、利用可能な処置はない）を患っている多数の患者を処置するための遺伝子療法に使用され得る。
本発明に記載のシステムを構成する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の成分は、本文書に以前に詳述されている通りであり得る。
上記されているように、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異によって引き起こされる遺伝性網膜ジストロフィー（ＩＲＤ）は、眼及びその個々の細胞に深刻な影響を及ぼし得る。
したがって、１つ以上のＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異を修正するためのシステムは、特に、眼細胞、特に光受容体細胞のゲノムに向けられる。
特定の実施態様では、細胞、特に光受容体細胞のゲノム内の１つ以上のＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異を修正するためのシステムはさらに場合により、少なくとも（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の成分を含んでいる少なくとも１つの送達ビヒクルを含み得る。
本発明に記載のシステムが、遺伝子療法の処置の一部として使用される場合、送達ビヒクルは、処置される予定の個体に、該システムの様々な成分を投与するために使用され得る。
特定の実施態様では、少なくとも１つの送達ビヒクルは、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターからなる群より選択される。
ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス（２型及び５型）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）、及びレンチウイルスなどの、成功を収めた遺伝子療法システムである。全てのウイルスベクターゲノムは、それらのゲノムのいくつかの領域を欠失させることにより改変され、これにより、それらの複製に異常をきたすようになり、それにより、患者への投与がより安全となる。過去数年間の間に、それらの天然の標的細胞ではない、いくつかの他の特定の細胞に導入遺伝子を導入することができる、特異的な受容体を有するいくつかのウイルスベクターが設計されている（再標的化）。
いくつかの実施態様では、当業者は、（ｉ）、（ｉｉ）及び／又は（ｉｉｉ）の成分のための送達ビヒクルとして１つを超えるウイルスベクターを使用することを好むだろう。これらのウイルスベクターは、同一であっても異なっていてもよい。
特定の実施態様では、少なくとも１つの送達ビヒクルは、少なくとも１つのウイルスベクターである。特に、少なくとも１つのウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、及びエプシュタインバーウイルスベクターからなる群より選択され、特にアデノ随伴ウイルスベクターから選択される。
非ウイルスベクターは主に、ウイルス起源ではない化学的システムを含み、これは一般的には、陽イオンリポソーム及びポリマーなどの化学的方法を含む。これらのベクターの効率は時に、遺伝子導入においてウイルスシステムよりも低い場合があるが、ウイルスシステムと比較してそれらのコスト効率、入手し易さ、及びより重要なことには免疫系の誘導がより少ないこと、及びトランスジェニックＤＮＡのサイズに制限がないことにより、それらは、遺伝子送達にとってより有効なものとなる。
本発明に従って使用され得るウイルス及び非ウイルスベクターは、当業者には周知であり、例えば、Nayerossadat et al.（５０）に記載されている。
あるいは、別の実施態様では、本発明に記載の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の成分は、送達ビヒクルを必要とすることなく、他の手段を通して、処置される予定の個体に投与されてもよい。
本発明のさらなる目的は、遺伝性網膜ジストロフィーの処置に、特に遺伝性網膜ジストロフィーの処置に、特に網膜色素変性症、より特定すると孤立性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症の処置に使用するための、本発明による及び本明細書に記載のシステムに関する。
本発明に記載のシステムが、遺伝性網膜ジストロフィーの処置に使用される場合、それは特に、薬学的に許容される媒体をさらに含んでいる医薬組成物の形態で投与され得る。
本発明に記載の細胞の、特に光受容体細胞のゲノム内の、２つの最も頻繁に見られるＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異、すなわちｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧのうち少なくとも１つを修正するためのシステムと薬学的に許容される媒体とを含んでいる医薬組成物は、本文書で以前に詳述されている通りであり得る。
したがって、当業者は、本発明に記載の２つの最も頻繁に見られるＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異のうち少なくとも１つを修正するためのシステムは、医薬組成物の調製に直接使用することはできないが、このような組成物を調製するプラットフォームとしての役目を果たすであろうことを理解している。
実際に、医薬組成物を調製する役目を果たすであろうのは、そのゲノムが修復されている、本発明に記載のシステムを使用して得られた、遺伝子的に改変された細胞、特に遺伝子的に改変された光受容体細胞前駆体である。
特定の実施態様では、医薬組成物は、処置される予定の個体への局所投与に適し、したがって、処置される予定の個体の眼に投与するのに適している。
眼への薬物送達は、その独特な解剖学的構造及び生理機能に因り、薬理学者及び薬物送達科学者にとっての大きな課題であった。立体障壁（角膜、強膜、及び網膜（血液房水関門及び血液網膜関門を含む）という様々な層）、動的障壁（脈絡膜及び結膜の血流、リンパ液による排除、及び涙液による希釈）、及び排出ポンプは併せて、単独の薬物の又は剤形の形の薬物の、特に眼球後区への送達にかなりの課題を課す。
眼への医薬組成物の３つの主な送達法は、局所的、眼に局所的に（すなわち、結膜下、硝子体内、眼球後、前房内）、及び全身性である。これらの方法のそれぞれが、その利点及びその課題を有する。したがって、本発明に記載のシステムを含んでいる医薬組成物は、これらの送達法に適応させるべきである。
最も適切な投与法は、処置される予定の眼の領域に依存する。したがって、本発明に記載の投与剤形及び薬学的に許容される媒体も、処置される予定の眼の領域に投与するのに適している必要がある。
例えば、本発明に記載の光受容体細胞のゲノム内の１つ以上のＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異を修正するためのシステムは、網膜下投与に適し得る。現在までに、網膜下送達は、網膜色素変性症などの疾患における、幹細胞を含む、遺伝子療法及び細胞療法のための眼への薬物送達のより正確かつ効率的な経路として、科学者及び臨床医によって広く適用されている。
特に、網膜下注射は、網膜下空間内の標的化細胞に対してより直接的な効果を及ぼす。
これらの眼内投与剤形は当業者には周知であり、例えば、Peng et al.（５１）に記載されている。
本発明は、本明細書の実施例によってさらに説明されるが、いずれにしてもこれらに限定されない。
実施例
実施例１：エキソン１３内の最も頻繁に見られるＵＳＨ２Ａ突然変異を修正するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９戦略の設計
本研究では、本発明者らは、両方共にエキソン１３内に存在し、互いから２２ｂｐに位置する、ＵＳＨ２Ａにおける２つの最も高頻度に見られる突然変異（ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧ）を修正することを目指した。
実施例１：エキソン１３内の最も頻繁に見られるＵＳＨ２Ａ突然変異を修正するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９戦略の設計
本研究では、本発明者らは、両方共にエキソン１３内に存在し、互いから２２ｂｐに位置する、ＵＳＨ２Ａにおける２つの最も高頻度に見られる突然変異（ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧ）を修正することを目指した。
両方の突然変異を囲む４つの異なるｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ１～４）を、ＳｐＣａｓ９の認識のための必要条件である、正準なＮＧＧ ＰＡＭ部位の存在に従って設計した：ｇＲＮＡ１（配列番号１）、ｇＲＮＡ２（配列番号２）、ｇＲＮＡ３（配列番号３）及びｇＲＮＡ４（配列番号４）（図１Ａ）。
４つ全てのｇＲＮＡを、「増強された特異性」のＣａｓ９プラスミド（ｅＳｐＣａｓ９（１．１）、アドジーン社７１８１４番）にクローニングした。このプラスミドは、ｇＲＮＡと、２ＡペプチドによってｅＳｐＣａｓ９（１．１）のＣ末端に連結されている高感度緑色蛍光タンパク質を含むｅＳｐＣａｓ９（１．１）とを共発現している。野生型Ｃａｓ９のこの変異体は、ヒト細胞内のＤＮＡの切断を誘導することが示され、頑強なオンターゲットに対する活性を維持しつつ、オフターゲットにおいては有意に減少した（３４）。ｅＳｐＣａｓ９（１．１）プラスミド内のｇＲＮＡの発現は、転写を開始する際にＧを「好む」ヒトＵ６プロモーターによって駆動されるので、４つ全てのｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ配列の５’末端に余分の「Ｇ」を含めて設計されクローニングされた。
選択されたｇＲＮＡの切断効率を決定するために、ｇＲＮＡを含有しているｅＳｐＣａｓ９（１．１）プラスミドを個々に、リポフェクタミン３０００を使用してＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ血清アルブミン（ＦＢＳ）（ギブコ社）と１％のペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＳ）（ギブコ社）の補充されたＤＭＥＭ/Ｆ１２（ギブコ社）中に維持した。
ｇＲＮＡの検証のために、３×１０５個のＨＥＫ２９３細胞に、製造業者の推奨に従って、リポフェクタミン３０００（インビトロジェン社）を使用して各々１．５μgのプラスミド構築物を別々にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、細胞をゲノムＤＮＡの抽出のために収集した。
４つのｇＲＮＡが標的部位において切断を誘導する能力は、Ｔ７－エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）アッセイによって評価された。標的遺伝子座を、高い忠実度のＬＡ ＴＡＬＡＲＡポリメラーゼを使用して、ＵＳＨ２Ａの特定の標的化エキソン１３を用いて３０サイクル増幅した。その後、ＰＣＲ産物を、９５℃で５分間加熱することによって変性させ、以下の計画によって再度アニーリングした：－２℃/秒で８５℃まで下降させ、－０．１℃/秒で２５℃まで下降させる。その後、０．５μlのＴ７エンドヌクレアーゼ１（ニューイングランドバイオラボ社）を混合液に加え、３７℃で１５分間インキュベートした。１μlのプロテイナーゼＫの添加、及び混合液を３７℃で５分間インキュベートすることによって、反応を停止した。消化された生成物を、アガロースゲル電気泳動を使用して分析した。
Ｔ７Ｅ１アッセイの結果は、たった１つのｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ２）が、ＤＮＡ内に二本鎖切断を誘導することができたことを実証した（図１Ｂ）。
近年の研究は、「増強された特異性」のＣａｓ９を使用した場合、ｇＲＮＡ内の余分の「Ｇ」の存在が、Ｃａｓ９のオンターゲット活性を妨害する可能性があることを示唆した（Kato-inui, Takahashi, Hsu, & Miyaoka, 2018）（１５）。この理由から、４つ全てのｇＲＮＡを、余分な「Ｇ」を用いずに再度設計し、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）プラスミドにクローニングした。余分な「Ｇ」を含まないｇＲＮＡを含有している新規プラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、Ｔ７Ｅ１アッセイを実施して、それらの活性を評価した。
Ｔ７Ｅ１アッセイは、ｇＲＮＡ１において及びここでもｇＲＮＡ２においても切断活性を実証したが、ｇＲＮＡ３及びｇＲＮＡ４では活性は全く検出できなかった（図１Ｃ）。
ｇＲＮＡ１の切断活性は、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）プラスミド内の余分な「Ｇ」の有無に起因したかどうかを確認するために、本発明者らは、余分な「Ｇ」を有するｇＲＮＡ１を、野生型Ｃａｓ９プラスミド（ｐＸ４５８、アドジーン社１０６０９７番）にクローニングし、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に対してＴ７Ｅ１アッセイを再度実施した。
結果を鑑みて、両方共に余分な「Ｇ」を含まないｇＲＮＡ１及びｇＲＮＡ２が、それぞれ、ミスセンス変異体であるｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧの突然変異の修正のために選択された。
これらの結果は、ｇＲＮＡ１及び２が、ｇＲＮＡ３及び４よりも高い認識効率を提示し、したがって、本発明により適していることを実証する。
ＨＥＫ２９３細胞内の２つのｇＲＮＡの活性の検証後、一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）の形態の修復鋳型を、相同組換え修復による２つの突然変異の修正のために設計した。
以前の研究は、標的化されていない鎖に対して相補的である非対称なｓｓＯＤＮが、相同組換え修復を増強することを実証し（２９）、それ故、ｓｓＯＤＮは、この基準に従って、ＵＳＨ２Ａの参照配列（１５，６０６ｂｐ；Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿２０６９３３）を使用して設計された。
（２９）に従って、ＰＡＭ近位領域内に９１ヌクレオチドを含有し、ＰＡＭ遠位領域内に３６ヌクレオチドを含有しているｓｓＯＤＮが、非対称に設計された。さらに、ｓｓＯＤＮは、ｇＲＮＡによって標的化されない鎖に対して相補的であるように設計された。ＰＡＭ配列のサイレント変化を鋳型に組み込むことにより、Ｃａｓ９が相同組換え修復後に再度切断することを防いだ。相同組換え修復を増強するためのホスホロチオエートで修飾されたｓｓＯＤＮは、ＧＥＮＥＷＩＺ社から購入した（２９）。
この方法に従って、２つのｓｓＯＤＮが設計された：ｇＲＮＡ１用のｓｓＯＤＮ１（配列番号５）（ここではｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ突然変異の修正のための変化が導入された）、及びｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異を修正するためのｇＲＮＡ２用のｓｓＯＤＮ２（配列番号６）。
さらに、相同組換え修復後にＣａｓ９による標的ＤＮＡの再切断を回避するために、
ＰＡＭサイレント突然変異が、両方のｓｓＯＤＮ配列に導入された（２４）。ｓｓＯＤＮ１についてのＰＡＭサイレント突然変異は、ＵＳＨ２Ａ参照配列内に存在するＮｃｏＩ制限酵素部位を破壊した。逆に、ｓｓＯＤＮ２についてのＰＡＭサイレント突然変異は、標的化配列にＭｓｃＩ部位を導入した。これらの２つのＰＡＭサイレント突然変異は、相同組換え修復事象の遺伝子型判定を容易にした。ｓｓＯＤＮの安定性を増強するために、ホスホロチオエートにより修飾された末端塩基がｓｓＯＤＮの両末端に付加された。
ＰＡＭサイレント突然変異が、両方のｓｓＯＤＮ配列に導入された（２４）。ｓｓＯＤＮ１についてのＰＡＭサイレント突然変異は、ＵＳＨ２Ａ参照配列内に存在するＮｃｏＩ制限酵素部位を破壊した。逆に、ｓｓＯＤＮ２についてのＰＡＭサイレント突然変異は、標的化配列にＭｓｃＩ部位を導入した。これらの２つのＰＡＭサイレント突然変異は、相同組換え修復事象の遺伝子型判定を容易にした。ｓｓＯＤＮの安定性を増強するために、ホスホロチオエートにより修飾された末端塩基がｓｓＯＤＮの両末端に付加された。
実施例２：ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９により媒介される患者のｉＰＳＣ内のｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異の修正
患者のｉＰＳＣ内の最も高頻度に見られるＵＳＨ２Ａ突然変異を修正することを目指して、ホモ接合型突然変異ｃ．２２９９ｄｅｌＧに起因するＵＳＨ２症候群を呈する患者に由来するｉＰＳＣ細胞株（ＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－ｉＰＳＣ）を、この目的に使用した（３２）。
患者のｉＰＳＣ内の最も高頻度に見られるＵＳＨ２Ａ突然変異を修正することを目指して、ホモ接合型突然変異ｃ．２２９９ｄｅｌＧに起因するＵＳＨ２症候群を呈する患者に由来するｉＰＳＣ細胞株（ＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－ｉＰＳＣ）を、この目的に使用した（３２）。
まず、患者の皮膚生検が、インフォームドコンセントの後に、無菌条件下で、遺伝性感覚障害リファレンスセンター（Centre of Reference for Genetic Sensory Disorders）（ＣＨＲＵモンペリエ）において実施された。地域及び国の倫理委員会は、承認番号２０１４－Ａ００５４９－３８の下で生物医学的研究の承認を与えた。ヒト線維芽細胞を、１０％の補充されていないウシ胎児血清（ロンザ社、ベルビエ、ベルギー）、１％グルタマックス（ギブコ社、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ヴィルボン・シュル・イヴェット、フランス）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ（ロンザ社）及び２％のＡｍｎｉｏＭａｘ－Ｃ１００サプリメント（ギブコ社）の補充されたＡｍｎｉｏＭＡＸ Ｃ１００基礎培地中で３７℃で５％ＣＯ２下で培養した。
次に、組み込まれていないｉＰＳＣを作製するために、対応する患者に由来する線維芽細胞に、製造業者の推奨に従って、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及び／又はｃ－ＭＹＣを発現している３つのセンダイウイルスに基づいた初期化ベクター（ＣｙｔｏＴｕｎｅ２．０－ＫＯＳ、－ｈｃ－ＭＹＣ、－ｈＫＬＦ４）を含有している、ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ２．０センダイ初期化キット（ライフテクノロジーズ社）を形質導入した。以下の培地：グルタマックス（ギブコ社）を含有し、１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）、１％非必須アミノ酸（ギブコ社）及び５５mMのβ－メルカプトエタノール（ギブコ社）の補充された高グルコースＤＭＥＭを、１日１回７日間リフレッシュした。７日目に、形質導入された線維芽細胞を、マトリゲルでコーティングされた培養皿に置いた。８日目に、培地を、ＴｅＳＲ－Ｅ７基礎培地（ステムセルテクノロジーズ社、グルノーブル、フランス）へと変更した。１５日目から、出現しているｉＰＳＣコロニーを、メスを使用して機械で継代させ、エッセンシャル８（Ｅ８）培地（ギブコ社）中で５％ＣＯ２の下で３７℃で培養した。培養培地は毎日リフレッシュし、細胞を、バーゼン液（ギブコ社）を使用して週２回継代した。
得られたＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－ｉＰＳＣ細胞株に、ｓｓＯＤＮ２と組み合わせて、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）－ｇＲＮＡ２プラスミドをヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションから４８時間後、ｉＰＳＣを、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）－単一細胞を選別し、９６ウェルプレートに再度播種した。その後、生き残ったｉＰＳＣコロニー（２８８個中５個）をさらなる培養、特徴付け、及び相同組換え修復事象のスクリーニングのために増幅した。
ＭｓｃＩ部位を作出する、ｓｓＯＤＮ２に導入されたＰＡＭサイレント突然変異に因り、本発明者らはまず、抽出されたＤＮＡ内の標的領域のＰＣＲによる増幅及び制限酵素による消化によって、相同組換え修復事象についてクローンをスクリーニングした。ＭｓｃＩによるＰＣＲ産物の消化は、５個の生き残ったクローンのうち４個が、Ｃａｓ９により誘導された二本鎖切断を修復するためにｓｓＯＤＮ２を使用したことを示した（図２Ａ）。
相同組換え修復事象の確認は、ＰＣＲ産物のサンガーシークエンス及びクローニングによって成し遂げられた（図２Ｂ）。
分析された４つの陽性クローンの中で、１つのクローン（Ｂ１Ｆ１１）が、Ｃａｓ９により誘導された挿入欠失が観察された第二の対立遺伝子（Ａ２）と比べて、一方の対立遺伝子（Ａ１）におけるＰＡＭサイレント突然変異及び修正されたｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異の存在によって決定されるような、ヘテロ接合型修正を示した（図２Ｃ）。残りの３つの陽性クローン（Ｂ３Ｂ８、Ｂ３Ｂ１、及びＢ２Ｈ４）は、ｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異のホモ接合型修正、並びに、ＰＡＭサイレント突然変異のホモ接合型導入を実証した（図２Ｃ）。
両方の対立遺伝子のＰＣＲ増幅を妨げる、ＵＳＨ２Ａのエキソン１３内のあらゆる大きなＣａｓ９により誘導される欠失（１）を除外するために、本発明者らは、修復されたクローンのｇＤＮＡ内のＵＳＨ２Ａのコピー数多型（ＣＮＶ）を推定するために、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイを設計した（D’haene, Vandesompele, & Hellemans, 2010）（９）。
ＲＮＡは、QiaShredder及びRNeasyミニキット（キアゲン社）を使用して、製造業者の説明書に従って単離された。単離されたＲＮＡは、リボヌクレアーゼ非含有デオキシリボヌクレアーゼ（キアゲン社）で処理され、０．５μgが、Superscript III逆転写酵素キット（ライフテクノロジーズ社）を使用して逆転写された。コピー数多型の研究のために、２５０ngのｇＤＮＡを実験のために使用し、結果は、ＴＥＲＴ又はＴＲＭＴ１０Ｃに対して正規化された。ＵＳＨ２Ａの発現の研究のために、１回の反応あたり５ngのｃＤＮＡを使用し、結果は、ＧＡＰＤＨに対して正規化された。反応は、ライトサイクラー（登録商標）４８０ＩＩサーマルサイクラー（ロシュ社）でライトサイクラー（登録商標）４８０サイバーグリーンＩマスターミックスを使用して行なわれた。結果は、ライトサイクラーＶ４８０ソフトウェア及びマイクロソフト社のエクセルプログラムを使用して分析された。
ｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異部位を囲むプライマーセットが設計された。正方向プライマーは、Ｂ１Ｆ１１クローンが対立遺伝子２において挿入欠失を呈した領域内にハイブリダイズするように直接設計された。
ｑＰＣＲの結果は、全てのホモ接合型クローン（Ｂ３Ｂ８、Ｂ３Ｂ１、及びＢ２Ｈ４）が、陰性対照（Ｃ－、ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９により誘導されるゲノム編集を伴わない、ＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－ｉＰＳＣクローン）と比較して、ＵＳＨ２Ａのコピー数多型に類似した相対値を提示したことを示した。これとは対照的に、ヘテロ接合型の修正されたＢ１Ｆ１１クローンは、ＵＳＨ２Ａのコピー数多型の半分の相対値を提示した（図２Ｄ）。
これらの全ての結果をまとめると、本発明者らは、ＵＳＨ２症候群を呈する患者に由来するｉＰＳＣ細胞株において、ＵＳＨ２Ａの最も高頻度に見られる突然変異の高い効率（５個の生き残ったクローンのうち４個）の修正を達成した。
実施例３：患者のｉＰＳＣにおける、ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９により媒介されるｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ突然変異の修正
常染色体劣性網膜色素変性症（ａｒＲＰ）におけるＵＳＨ２Ａの最も高頻度に見られる突然変異を修正するために、本発明者らは、複合型ヘテロ接合型突然変異（ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧ）に起因する、非症候群型網膜色素変性症を呈する患者に由来するｉＰＳＣ細胞株（ＵＳＨ２Ａ－ＲＰ－ｉＰＳＣ）を使用した（３１）。
常染色体劣性網膜色素変性症（ａｒＲＰ）におけるＵＳＨ２Ａの最も高頻度に見られる突然変異を修正するために、本発明者らは、複合型ヘテロ接合型突然変異（ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧ）に起因する、非症候群型網膜色素変性症を呈する患者に由来するｉＰＳＣ細胞株（ＵＳＨ２Ａ－ＲＰ－ｉＰＳＣ）を使用した（３１）。
この細胞株は、実施例２に記載のものと同じプロトコールに従って、すなわち、患者の皮膚生検を実施し、続いて線維芽細胞を培養し、組み込まれていないｉＰＳＣを作製することによって調製された。
この細胞株では、本発明者らは、すでに検証されたｇＲＮＡ１をｓｓＯＤＮ１と組み合わせて使用することによって、機能低下型ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔミスセンス変異体を修正することを目指した。この目的のために、ＵＳＨ２Ａ－ＲＰ－ｉＰＳＣ細胞株に、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）－ｇＲＮＡ１及びｓｓＯＤＮ１をヌクレオフェクトし、ＧＦＰ－単一細胞の選別を、ヌクレオフェクションから４８時間後に実施した。
ＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－ｉＰＳＣ細胞株とは対照的に、ＵＳＨ２Ａ－ＲＰ－ｉＰＳＣ細胞株に由来する６８個のクローン（２８８個のうち）が生き残った。その後、生き残ったクローンを増幅し、ＰＣＲにより増幅された標的領域のＮｃｏＩによる消化によって、相同組換え修復事象について最初にスクリーニングした。ＮｃｏＩにより消化された１４個のクローンの代表的なゲルが図３Ａに示されている。励みになることには、１つ（Ｍ３Ｄ１１）を除く全てのクローンが、宿主ＤＮＡにｓｓＯＤＮ１を組み込んだようであった。なぜなら、それらはＮｃｏＩによって切断できなかったからである。
有望な結果に鑑みて、本発明者らは、６８個全ての生き残ったクローンをシークエンスした。驚くべきことには、シークエンス結果は、制限酵素による消化の結果とは一致しなかった。初回のシークエンス分析は、６８個全てのクローンについて、標的ではない対立遺伝子、すなわち対立遺伝子２（Ａ２）のみが改変されたことを示唆した。これらの結果は、標的領域のサブクローニング及び再シークエンスによってさらに確認された（図３Ｂ）。
クローンの５９％（６８個中４０個）において、ＰＡＭサイレント突然変異は、対立遺伝子２にのみ導入された。クローンの３２％（６８個中２２個）において、本発明者らは、対立遺伝子２のみにＣａｓ９により誘導された挿入欠失を検出した。クローンの７％（６８個中５個）において、本発明者らは、対立遺伝子１が、対立遺伝子２を修復するために使用されたと判定した。なぜなら、ｉ）いずれの対立遺伝子にもＰＡＭサイレント突然変異の兆候は全くなかった、ｉｉ）ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ突然変異が、両方の対立遺伝子に存在していた、及びｉｉｉ）ｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異は、どちらの対立遺伝子にも存在してなかったからである。最後に、１．５％（６８個中１個）のクローンが、ＤＮＡ内にＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９により誘導された改変を全く示さなかった。
６８個のクローンのクローニング及びシークエンスは、本発明者らが修正を目指したｃ．２２７６Ｇ＞Ｔミスセンス変異体に対してシスにある、対立遺伝子１における一塩基多型（ｒｓ１１１０３３２８１；ｃ．２２５６Ｔ＞Ｃ）の存在を明らかとした。
一塩基多型が、ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９による改変前にも存在していたかどうかを調べるために、本発明者らは、ＵＳＨ２Ａ－ＲＰ－ｉＰＳＣ親株の標的領域を増幅し、サブクローニングし、シークエンスし、そして、対立遺伝子１におけるｃ．２２７６Ｇ＞Ｔに対してシスにある、ｃ．２２５６Ｔ＞Ｃを検出した（図３Ｃ）。
対立遺伝子１における一塩基多型の存在は、本発明者らが、ＮｃｏＩによるＰＣＲ産物の消化後に疑陽性を得た理由を説明した。なぜなら、一塩基多型は、対立遺伝子１においてＮｃｏＩ部位の位置にあり、対立遺伝子２は、Ｃａｓ９により改変されて、ＮｃｏＩの認識部位を妨害していたからである。
これらの結果は、ｇＲＮＡ配列と標的遺伝子座との間の１つのミスマッチにより、遺伝子座が認識されなくなる可能性があり、よって、全く修正されない可能性があることを実証する。
対立遺伝子１における一塩基多型の存在に因り、本発明者らは、ｇＲＮＡ１が、ミスセンス変異体の対立遺伝子１を認識するように、配列（ｇＲＮＡ１Ｓ）（配列番号７）内に一塩基多型を組み込むように、ｇＲＮＡ１を再設計し、クローニングした（図３Ｄ）。
本発明者らは、ｓｓＯＤＮ１と一緒に、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）－ｇＲＮＡ１Ｓプラスミドを、ＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－ｉＰＳＣ株にヌクレオフェクトし、ＥＧＦＰ陽性細胞を単一細胞選別した。生き残ったクローン（２８８個中３６個）を増幅させ、相同組換え修復事象についてスクリーニングした。シークエンスの結果は、ｇＲＮＡ１とは対照的に、ｇＲＮＡ１Ｓは、一塩基多型配列を含有している標的化されている対立遺伝子１だけでなく、対立遺伝子２も認識し切断を誘導することができたことを示した（図３Ｅ）。
クローニング及びシークエンス後のｇＲＮＡ１Ｓを用いてのＣａｓ９により誘導される改変の例は、図３Ｆに見られる。
クローンの５％（３６個中２個）及び１４％（３６個中５個）において、本発明者らは、それぞれ、対立遺伝子１と対立遺伝子２、又は対立遺伝子１のみへの、ＰＡＭサイレント突然変異の排他的導入による部分的な修復を検出した（図４Ｃ）。クローンの１４％（３６個中５個）において、ｉ）一塩基多型が存在しないこと、ｉｉ）ＰＡＭサイレント突然変異が存在しないこと、ｉｉｉ）対立遺伝子１におけるｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ突然変異の修正、及びｉｖ）対立遺伝子１及び対立遺伝子２の両方における、ｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異の存在によって示唆されるように、対立遺伝子２は、Ｃａｓ９により誘導される対立遺伝子１の切断を修復するために使用された。クローンの２８％（３６個中１０個）及び１９％（３６個中７個）において、本発明者らは、それぞれ、標的化された対立遺伝子１、又は標的化されていない対立遺伝子２において、挿入欠失を認めた。クローンの１７％（３６個中６個）において、Ｃａｓ９により誘導される改変は検出できなかった。最後に、クローンの３％（３６個中１個）において、本発明者らは、対立遺伝子１におけるミスセンスｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ変異体の修正、及び対立遺伝子２にのみにおけるｃ．２２９９ｄｅｌＧの存在を検出した（図３Ｇ）。しかしながら、本発明者らは、ｇＲＮＡ１Ｓもまた、このクローンの両方の対立遺伝子を認識したと考える。なぜならＰＡＭサイレント突然変異もホモ接合型であったからである。
要するに、本発明者らは、常染色体劣性網膜色素変性症を呈する患者のｉＰＳＣ内の機能低下型ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ突然変異の修正を成功裡に達成した。
実施例４：ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９により修復されたｉＰＳＣの特徴付け
本発明者らは次いで、作製されたＣＲＩＳＰＲにより修正されたｉＰＳＣクローンが、遺伝子標的化プロセスによって影響を受けなかった、それらの親のｉＰＳＣ株（３１）の多能性特徴を維持しているかどうかを調べた。
本発明者らは次いで、作製されたＣＲＩＳＰＲにより修正されたｉＰＳＣクローンが、遺伝子標的化プロセスによって影響を受けなかった、それらの親のｉＰＳＣ株（３１）の多能性特徴を維持しているかどうかを調べた。
この目的のために、本発明者らは、詳細な分析のために、修正されたクローンＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－ｉＰＳＣ－Ｂ３Ｂ１（ｃ．２２９９ｄｅｌＧのホモ接合型修正）及びＵＳＨ２Ａ－ＲＰ－ｉＰＳＣ－ＭＳ３Ｆ７（ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔのヘミ接合型修正）を選択した。
修正された両方の細胞株が、明確な境界によって囲まれた緻密に充填された細胞を含んでいる、ｉＰＳＣクローンの典型的な形態を示した（図４Ａ）。ヌクレオフェクションによって又は単一細胞培養によって誘導される可能性のあるあらゆる主要な染色体再編成を除外するために、本発明者らは、ｉＣＳ－デジタルＴＭ Ｐｌｕｒｉ試験（Assou, Bouckenheimer, & Vos, 2018)）によってそれらのゲノム完全性を評価した（２）。結果は、両方の修正された株が、正常なゲノム安定性を保持していたことを示した（図４Ｂ）。
ｉＰＳＣの多能性の研究のために、及びインビトロでの識別のための染色のために、細胞を、４％パラホルムアルデヒドを使用して固定し、０．１％トリトンＸ－１００（シグマアルドリッチ社）で透過性処理した。非特異的結合は、１％ウシ血清アルブミンおよび１０％ロバ血清（ミリポア社）で遮断された。ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ３/４、及びＳＯＸ２（多能性について）、並びに、ＳＭＡ、ＡＦＰ、及びネスチン（３つの胚葉の特徴付けについて）に対する一次抗体を、１：２００の希釈率で使用し、４℃で一晩インキュベートした。蛍光にコンジュゲートさせた二次抗体（ジャクソンイムノリサーチ社）を室温で１時間インキュベートした。核を、０．２μg/mlのビスベンズイミド（シグマアルドリッチ社）で染色した。細胞を、ツァイス社のアポトーム２正立広視野顕微鏡を使用して観察した。
免疫蛍光分析は、ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９により修正されたクローンが、ＯＣＴ３/４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧなどの典型的な多能性マーカーの発現を保持していたことを明らかとした（図４Ｃ）。
さらに、これらの細胞株が３つの胚葉を生じる能力は、胚様体（ＥＢ）アッセイによって決定された。
どちらの細胞株も、内胚葉についてはＨＮＦ４α、中胚葉については平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、外胚葉についてはグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の免疫染色によって評価されるように、３つの胚葉へと分化することができた（図４Ｄ）。
ｉＰＳＣから３つの胚葉への分化については、ｉＰＳＣをアキュターゼ（ステムセルテクノロジーズ社）を用いて解離し、超低接着皿上の、Ｙ２７６３２ＳｔｅｍＭＡＣＳを含有しているエッセンシャル８培地中に２日間かけて播種した。３日目に、培地を、２０％ノックアウト血清代替物（ギブコ社）、１％のペニシリン－ストレプトマイシン（ギブコ社）、１％のグルタマックス、５５mMのβ－メルカプトエタノール、及び１％の非必須アミノ酸の補充された、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ギブコ社）に交換した。７日目に、胚様体を、マトリゲルでコーティングされたウェル上に播種し、さらに１０日間培養し、その後、免疫蛍光染色を行なった。
要するに、本発明者らは、典型的なｉＰＳＣの特徴を示す、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の修正されたｉＰＳＣを成功裡に作製した。
実施例５：ＣＲＩＳＰＲにより修正されたｉＰＳＣにおけるＵＳＨ２ＡのｍＲＮＡ発現レベルの評価
突然変異ｉＰＳＣ細胞株と、遺伝子の修正された細胞において、ＵＳＨ２Ａ発現に関する差があるかどうかを決定するために、本発明者らは、ｍＲＮＡレベルでＵＳＨ２Ａの発現を評価した。
突然変異ｉＰＳＣ細胞株と、遺伝子の修正された細胞において、ＵＳＨ２Ａ発現に関する差があるかどうかを決定するために、本発明者らは、ｍＲＮＡレベルでＵＳＨ２Ａの発現を評価した。
ＵＳＨ２Ａは、２つのアイソフォーム、すなわち２１個のエキソンを有する短いアイソフォームと、７２個のエキソンを有する長いアイソフォームを有することが知られている（３７）。どちらのアイソフォームも、網膜内に存在するが、長いアイソフォームが、光受容体において優勢な形態である（１８）。この理由のために、本発明者らは、長いアイソフォームを排他的に認識するであろうエキソン３９、並びに、長いアイソフォームと短いアイソフォームを認識するであろうエキソン１３を標的化するプライマーを設計し、以前に記載されたプロトコールに従って、ｑＰＣＲによってＵＳＨ２ＡのｍＲＮＡレベルを評価した。
まず、ホモ接合型状態でｃ．２２９９ｄｅｌＧを有するＵＳＨ２患者のｉＰＳＣは、野生型ＵＳＨ２Ａのレベルの６倍である、長いアイソフォームの発現レベルを示す（図５Ａ）。さらに、ＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－ｉＰＳＣ－Ｂ３Ｂ１株におけるｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異のホモ接合型修正は、ＵＳＨ２ＡのｍＲＮＡ発現レベルを、野生型のレベルに戻るまで回復させた。この同じプロファイルが、長いアイソフォームと短いアイソフォームの両方の無差別な増幅後に観察され（図５Ｂ）、これにより、これらの現象が確認された。
これらの結果は、ｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異が、ＵＳＨ２ＡのｍＲＮＡレベルの蓄積に対して特別な効果を及ぼすことを示唆した。第二に、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔミスセンス突然変異及びｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異において複合ヘテロ接合型である、常染色体劣性網膜色素変性患者のｉＰＳＣは、野生型細胞のレベルと同等である、長いアイソフォームのＵＳＨ２ＡのｍＲＮＡレベルを示した（図５Ｃ）。
さらに、ｃ．２２７７Ｇ＞Ｔ突然変異を修正し、ｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異をヘミ接合型状態に残したことにより、野生型又は修正されていないｉＰＳＣと比較して、ＵＳＨ２ＡのｍＲＮＡレベルは３倍増加する。この同じプロファイルが、長いアイソフォームと短いアイソフォームの両方の無差別な増幅後に観察され（図５Ｄ）、これにより、ＵＳＨ２ＡのｍＲＮＡレベルに対するｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異の特別な効果が確認された。
実施例６：ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９により媒介されるｃ．２２９９ｄｅｌＧの突然変異の修正後の、患者のｉＰＳＣから派生した網膜オルガノイドの構造の評価
本発明者らは、実施例２と同じ方法で得られた、ホモ接合型突然変異ｃ．２２９９ｄｅｌＧに因りＵＳＨ２症候群を呈する患者に由来するｉＰＳＣ細胞株（ＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－ｉＰＳＣ）を使用した。
本発明者らは、実施例２と同じ方法で得られた、ホモ接合型突然変異ｃ．２２９９ｄｅｌＧに因りＵＳＨ２症候群を呈する患者に由来するｉＰＳＣ細胞株（ＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－ｉＰＳＣ）を使用した。
ＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－ｉＰＳＣ細胞株に、実施例２に記載のように、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）－ｇＲＮＡ２プラスミドを、ｓｓＯＤＮ２と組み合わせてヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションから４８時間後、ｉＰＳＣを、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってＧＦＰ－単一細胞を選別し、９６ウェルプレートに再播種した。
生き残ったｉＰＳＣコロニーを成熟させ、網膜オルガノイドへと分化させた。
ｉＰＳＣを、以下のプロトコールを使用して網膜オルガノイドへと分化させた。ｉＰＳＣを、エッセンシャル８培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）中で培養した。細胞が６０～８０％の集密度となった場合、培地をエッセンシャル６培地（Ｅ６）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に変更し、これを０日目と考えた。１日目に、Ｅ６培地をリフレッシュした。２日目に、Ｅ６培地を、Ｎ－２サプリメントの補充されたＥ６（Ｅ６－Ｎ２）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に変更した。Ｅ６－Ｎ２培地を２８日間、週３回リフレッシュした。２８日目に、未熟な網膜オルガノイドをメスを用いて手作業で解体し、塩基性線維芽細胞増殖因子（β－ＦＧＦ）及びＢ－２７サプリメントの補充された、ＢＶＡ培地（ＤＭＥＭ－Ｆ１２、非必須アミノ酸及び０．１％のペニシリン－ストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社））中で１週間培養した。培地を週３回リフレッシュした。３５日目に、Ｂ－２７の補充されたＢＶＡ＋ウシ胎児血清＋グルタマックス（１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）とグルタマックスを含むＢＶＡ培地）に変更された。この培地を、週３回リフレッシュした。培養８５日目に、網膜オルガノイドを、ビタミンＡ（ＶｉｔＡ）を含まないＢ－２７で補充されたＢＶＡ＋ＦＣＳ＋グルタマックス培地中で培養した。培地は、処理されるまで、週３回リフレッシュした。
同じ増殖法及び分化法を、ｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異を提示しない、野生型（ＷＴ）ｉＰＳＣ株（４６に記載のように作製）、及び本発明に従ってヌクレオフェクトされていない、すなわち、ｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異について修正されていない、ＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－ｉＰＳＣ株において使用した。
３つの異なる種類の網膜オルガノイドが、培養２００日後に得られた：野生型オルガノイド（陽性対照）、ＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－ｉＰＳＣに由来するオルガノイド（又はＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－オルガノイド）（修正されていない）及びＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９により修正されたＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－ｉＰＳＣに由来するオルガノイド（又はＣＩＲＳＰＲ/Ｃａｓ９により修正されたＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－オルガノイド）。これにより、本発明者らは、ｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異及びアッシャー症候群２型に関連した可能性ある異常を研究及び特徴付けすることが可能となった。
３つの細胞株は、網膜オルガノイドへと分化した。それにも関わらず、成熟し構造化したオルガノイドの周知の特色である、オルガノイドの積層及びオルガノイドを囲む刷子縁のサイズには差があった。野生型及びＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９により修正されたＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－オルガノイドは、修正されていないＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－オルガノイドにおける明確な境界のない積層及び５０μmの刷子縁と比較して、境界の明確な積層及び１００μmの刷子縁を呈した（図６）。
要するに、これらの結果は、網膜オルガノイドにおけるＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９によるｃ．２２９９ｄｅｌＧ突然変異の修正が、ＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－オルガノイドにおいて観察された光受容体の積層及び成熟において観察された異常を修正することを示す。
実施例７：ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９により媒介されるｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ突然変異の修正後の、患者のｉＰＳＣから派生した網膜オルガノイドの構造の評価
ここで、本発明者らは、実施例３と同じような方法で得られた、複合型ヘテロ接合型突然変異（ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧ）に起因する非症候群型網膜色素変性症を呈する患者に由来するｉＰＳＣ細胞株（ＵＳＨ２Ａ－ＲＰ－ｉＰＳＣ）を使用した。
ここで、本発明者らは、実施例３と同じような方法で得られた、複合型ヘテロ接合型突然変異（ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧ）に起因する非症候群型網膜色素変性症を呈する患者に由来するｉＰＳＣ細胞株（ＵＳＨ２Ａ－ＲＰ－ｉＰＳＣ）を使用した。
ＵＳＨ２Ａ－ＲＰ－ｉＰＳＣ細胞株に、実施例３に記載のように、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）－ｇＲＮＡ１ＳプラスミドをｓｓＯＤＮ１と組み合わせてヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションから４８時間後、ｉＰＳＣを、ＧＦＰ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって単一細胞を選別し、９６ウェルプレートに再度播種した。
生き残ったｉＰＳＣコロニーを成熟させ、網膜オルガノイドへと分化させた。
ｉＰＳＣを、実施例６に上記されているように、僅かな改変を加えて、網膜オルガノイドへと分化させた。４２日目に、ＢＶＡ＋ウシ胎児血清＋グルタマックス培地にタウリンを補充した。６５日目に、ＢＶＡ＋ウシ胎児血清＋グルタマックス（＋タウリン）培地に、ビタミンＡ及びレチノイン酸（ＲＡ）を含まないＢ－２７を補充した。８５日目に、網膜オルガノイドを、Ｎ－２の補充されたＢＶＡ＋ウシ胎児血清＋グルタマックス（－ビタミンＡ、＋タウリン、＋レチノイン酸）中で培養した。１２０日目に、オルガノイドを、ＢＶＡ＋ウシ胎児血清＋グルタマックス（－ビタミンＡ、＋タウリン、＋Ｎ－２、－レチノイン酸）中で培養した。培地は、処理するまで週３回リフレッシュした。
同じ増殖法及び分化法を、突然変異を全く有さない、野生型（ＷＴ）ｉＰＳＣ株（４６に記載のように作製）、及び本発明に従ってヌクレオフェクトされていない、すなわち、突然変異について修正されていない、ＵＳＨ２Ａ－ＵＳＨ－ｉＰＳＣ株において使用した。
３つの異なる種類の網膜オルガノイドが、１５０日間培養した後に得られた：野生型オルガノイド（陽性対照）、ＵＳＨ２Ａ－ＲＰ－ｉＰＳＣに由来するオルガノイド（又はＵＳＨ２Ａ－ＲＰ－オルガノイド）（修正されていない）、及びＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９により修正されたＵＳＨ２Ａ－ＲＰ－ｉＰＳＣに由来するオルガノイド（又はＣＩＲＳＰＲ/Ｃａｓ９により修正されたＵＳＨ２Ａ－ＲＰ－オルガノイド）。これにより、本発明者らは、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ突然変異及び網膜色素変性症（ＲＰ）に関連した可能性ある異常を研究及び特徴付けることが可能となった。
３つの細胞株は、網膜オルガノイドへと分化した。それにも関わらず、成熟し構造化したオルガノイドの周知の特色である、オルガノイドの積層には、及びオルガノイドを囲む刷子縁の有無には差があった。野生型及びＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９により修正されたＵＳＨ２Ａ－ＲＰ－オルガノイドは、明確な境界の積層構造、及びオルガノイドの全表面を囲む刷子縁を呈した。これとは対照的に、ＵＳＨ２Ａ－ＲＰ－オルガノイドは、あまり境界が明確ではない積層を示し、オルガノイドを囲む刷子縁を呈さなかった（図７）。
要するに、これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による修正によって元に戻る、ＵＳＨ２Ａ－ＲＰ－オルガノイドの場合、成熟した網膜に特徴的な積層構造及び刷子縁の形成は遅くなることを示す。
配列表
参考文献
Claims (21)
- （ｉ）（ａ）配列番号１、配列番号２、及び配列番号７からなる群より選択された少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つのガイド核酸（ｇＲＮＡ）を細胞に与えること；
（ｂ）少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼ、特に少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、特に少なくとも１つの高効率のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｅＳｐＣａｓ９（１．１））を該細胞に与えること；及び
（ｃ）突然変異したＵＳＨ２Ａ遺伝子の修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸、特に一本鎖オリゴデオキシ核酸（ｓｓＯＤＮ）の形態のものを該細胞にさらに与えること
による、部位特異的遺伝子工学操作システムを該細胞に与える工程；
（ｉｉ）工程(ｉ)で得られた細胞を培養することにより、前記の少なくとも１つのドナー核酸が、細胞ゲノム内に組み込まれて、１つ以上のＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異が修正される工程
を含む、個体の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のゲノム内の、両方共にエキソン１３にある、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２９９ｄｅｌＧの突然変異の中から選択される、少なくとも１つのＵＳＨ２Ａ突然変異をインビトロで又はエクスビボで修正するための方法。 - ｉＰＳＣが、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異の一方又は両方を有するゲノムを有する個体から事前に回収された細胞のインビトロでの処理から誘導される、請求項１の方法。
- ＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異の一方又は両方を有するゲノムを有する個体が、孤立性網膜ジストロフィーを患っている、特に網膜色素変性症を患っている、より特定すると孤立性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症を患っている個体である、請求項２記載の方法。
- 少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号７からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列からなる、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
- 修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸が、ｇＲＮＡによって標的化されない鎖に対して相補的である、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
- 修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸が、非対称である、請求項１～５のいずれか一項記載の方法。
- 修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸が、一端に、好ましくは両端に、少なくとも１つの修飾された末端塩基、好ましくはホスホロチオエートにより修飾された末端塩基を含む、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
- 修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸が、ｇＲＮＡによって標的化されない鎖に対して相補的であり、非対称であり、両端に２つのホスホロチオエートにより修飾された末端塩基を含む、一本鎖オリゴデオキシ核酸である、請求項１～７のいずれか一項記載の方法。
- 修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸が、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択された少なくとも１つの核酸配列を含み、特に配列番号５及び配列番号６からなる群より選択された少なくとも１つの核酸配列からなる、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
- 請求項１～９のいずれか一項記載の方法によって得ることのできる、遺伝子的に改変された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、特に、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔの突然変異が修正されているｉＰＳＣ。
- 請求項１０記載の遺伝子的に改変されたｉＰＳＣから分化させた少なくとも１つの細胞を、薬学的に許容される媒体中に含んでいる、医薬組成物。
- 医薬品としてのその使用のための、請求項１０記載の遺伝子的に改変された細胞、又は請求項１１記載の医薬組成物。
- 遺伝性網膜ジストロフィー、特に網膜色素変性症、より特定すると孤立性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症の処置に使用するための、請求項１０記載の遺伝子的に改変された細胞、又は請求項１１記載の医薬組成物。
- （ｉ）配列番号１、配列番号２、及び配列番号７からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列を含んでいる、少なくとも１つのガイド核酸；
（ｉｉ）少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼ、特に少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、特に少なくとも１つの高効率のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｅＳｐＣａｓ９（１．１））；
（ｉｉｉ）ＵＳＨ２Ａ遺伝子の修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸、特に一本鎖オリゴデオキシ核酸（ｓｓＯＤＮ）の形態のもの、及び
（ｉｖ）場合により、少なくとも（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の成分を含んでいる、少なくとも１つの送達ビヒクル
を含んでいる、それを必要とする個体の、細胞のゲノム内の、例えば光受容体細胞のゲノム内の、ｃ．２２７６Ｇ＞Ｔ及びｃ．２２７９ｄｅｌＧの突然変異の中から選択される少なくとも１つのＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異を修正するための、部位特異的な遺伝子工学操作システム。 - それを必要とする個体が、遺伝性網膜ジストロフィーを患っている、特に網膜色素変性症を患っている、より特定すると孤立性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症を患っている個体である、請求項１４のシステム。
- 少なくとも１つのガイド核酸が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号７からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列からなる、請求項１４又は１５記載のシステム。
- 修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸が、ｇＲＮＡによって標的化されない鎖に対して相補的であり、非対称であり、一端に、好ましくは両端に、少なくとも１つの、好ましくは２つのホスホロチオエートにより修飾された末端塩基を含む、一本鎖オリゴデオキシ核酸である、請求項１４～１６のいずれか一項記載のシステム。
- 修復鋳型としての役目を果たす少なくとも１つのドナー核酸が、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列を含み、特に配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列からなる、請求項１４～１７のいずれか一項記載のシステム。
- 少なくとも１つの送達ビヒクルが、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターからなる群より選択される、請求項１４～１８のいずれか一項記載のシステム。
- ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、及びエプシュタインバーウイルスベクターからなる群より選択され、特にアデノ随伴ウイルスベクターから選択される、請求項１９記載のシステム。
- 遺伝性網膜ジストロフィーの処置に、特に網膜色素変性症の処置に、より特定すると孤立性網膜色素変性症、又はアッシャー症候群２型の一部としての難聴を伴う網膜色素変性症の処置に使用するための、請求項１４～２０のいずれか一項記載のシステム。
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| CARLA FUSTER-GARCIA ET AL.: "USH2A Gene Editing Using the CRISPR System.", MOL. THER. NUCLEIC ACIDS, vol. 8, JPN6022051026, 15 September 2017 (2017-09-15), pages 529 - 541, XP055572855, ISSN: 0005099438, DOI: 10.1016/j.omtn.2017.08.003 * |
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