CN111836892A - 用于治疗2a型乌谢尔综合征的材料和方法 - Google Patents

用于治疗2a型乌谢尔综合征的材料和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111836892A
CN111836892A CN201880089894.2A CN201880089894A CN111836892A CN 111836892 A CN111836892 A CN 111836892A CN 201880089894 A CN201880089894 A CN 201880089894A CN 111836892 A CN111836892 A CN 111836892A
Authority
CN
China
Prior art keywords
exon
grna
sgrna
mutation
ivs40
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880089894.2A
Other languages
English (en)
Inventor
A·肯塔兹瓦
A·诺马
A·斯卡里亚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CRISPR Therapeutics AG
Casebia Therapeutics LLP
Bayer Healthcare LLC
Original Assignee
CRISPR Therapeutics AG
Bayer Healthcare LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CRISPR Therapeutics AG, Bayer Healthcare LLC filed Critical CRISPR Therapeutics AG
Publication of CN111836892A publication Critical patent/CN111836892A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Abstract

本申请提供了用于离体和体内治疗2A型乌谢尔综合征患者的材料和方法；用于编辑人细胞中的USH2A基因的材料和方法；用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的材料和方法；用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的材料和方法；以及用于缺失细胞的USH2A基因内包含IVS40突变的序列的方法。本申请还提供了一种或多种gRNA或sgRNA，其用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因。本申请提供了用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的治疗剂。本申请还提供了用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的试剂盒。

Description

用于治疗2A型乌谢尔综合征的材料和方法
领域
本申请提供了用于治疗2A型乌谢尔综合征的材料和方法。
相关申请
本申请要求于2017年12月21日提交的美国临时申请号62/609,333；以及于2018年10月16日提交的美国临时申请号62/746,226的权益，所述美国临时申请全部整体通过引用并入本文。
通过引用并入的序列表
本申请含有以计算机可读形式的序列表(文件名：170646PCT_ST25：11,398,978字节--ASCII文本文件；于2018年12月19日创建)，其整体通过引用并入并构成本公开内容的部分。
背景
乌谢尔综合征是影响听力和视力两者的状况。乌谢尔综合征的主要症状是听力丧失和称为色素性视网膜炎的眼病症，其引起夜盲症以及通过视网膜的进行性变性的周边视力丧失。许多患有乌谢尔综合征的人也具有严重的平衡问题。
当前不存在用于乌谢尔综合征的适当治疗，其可以有效地阻止或减慢与疾病相关的视力丧失的进展，并且仍然迫切需要开发用于乌谢尔综合征的安全有效治疗。
发明概述
本公开内容呈现了改善(如果没有消除的话)2A型乌谢尔综合征的新型方法。该新型方法靶向USH2A基因中的突变，例如IVS40突变，使用导致用作由含有该突变的基因编码的剪接供体位点的序列破坏的方法。剪接供体部位引起不正确的剪接。此外，在一些情况下，治疗可以用少数治疗来完成，并且在一些情况下，可以用单次治疗来完成。所得到的疗法可以改善与IVS40突变相关的2A型乌谢尔综合征，或者在一些情况下，可以消除与IVS40突变相关的2A型乌谢尔综合征。
本文提供的是用于编辑人细胞中的USH2A基因的方法，所述方法包括：将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶引入人细胞内，从而实现在USH2A基因或编码USH2A基因的调节序列的DNA序列内或附近的一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致校正，从而产生编辑的人细胞。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：将一种或多种DNA核酸内切酶引入人细胞内，从而实现在USH2A基因的内含子40内或附近的一个或多个SSB或DSB，其导致校正，从而产生编辑的人细胞。
本文还提供的是用于编辑人细胞中的USH2A基因的方法，所述方法包括：将一种或多种DNA核酸内切酶引入人细胞内，从而实现在USH2A基因或编码USH2A基因的调节序列的DNA序列内或附近的一个或多个SSB或DSB，其导致USH2A基因的表达或功能的调节，从而产生编辑的人细胞。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：将一种或多种DNA核酸内切酶引入人细胞内，从而实现在USH2A基因的内含子40内或附近的一个或多个SSB或DSB，其导致USH2A基因的表达或功能的调节，从而产生编辑的人细胞。
本文还提供的是用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法。该方法包括：编辑患者的细胞中含有IVS40突变的USH2A基因。
本文还提供的是一种或多种向导核糖核酸(gRNA)，其用于编辑来自2A型乌谢尔综合征患者的细胞中含有IVS40突变的USH2A基因。一种或多种gRNA包含间隔区序列，其选自序列表的SEQ ID NO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328、5443和5446-5461中的核酸序列。
本文还提供的是用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的治疗剂，该治疗剂包含至少一种或多种gRNA，其用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因。所述一种或多种gRNA包含间隔区序列，其选自序列表的SEQ ID NO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328、5443和5446-5461中的核酸序列。
本文还提供的是用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的治疗剂，该治疗剂通过包括以下的方法形成：引入一种或多种DNA核酸内切酶；引入一种或多种gRNA或者一种或多种单分子向导RNA(sgRNA)，其用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因；并且任选地引入一种或多种供体模板。所述一种或多种gRNA或sgRNA包含间隔区序列，其选自序列表的SEQ ID NO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328、5443和5446-5461中的核酸序列。
本文还提供的是用于在体内治疗2A型乌谢尔综合征患者的试剂盒。该试剂盒包含用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的一种或多种gRNA或sgRNA，一种或多种DNA核酸内切酶；以及任选地一种或多种供体模板。一种或多种gRNA或sgRNA包含间隔区序列，其选自序列表的SEQ ID NO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328、5443和5446-5461中的核酸序列。
本文还提供的是包含SEQ ID NO：5321的gRNA或sgRNA。
本文还提供的是包含SEQ ID NO：5323的gRNA或sgRNA。
本文还提供的是包含SEQ ID NO：5325的gRNA或sgRNA。
本文还提供的是包含SEQ ID NO：5327的gRNA或sgRNA。
本文还提供的是包含SEQ ID NO：5328的gRNA或sgRNA。
本文还提供的是包含SEQ ID NO：5321和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA。
本文还提供的是包含SEQ ID NO：5323和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA。
本文还提供的是包含SEQ ID NO：5325和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA。
本文还提供的是包含SEQ ID NO：5327和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA。
本文还提供的是包含SEQ ID NO：5328和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5321的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5323的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5325的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5327的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5328的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5321和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5323和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5325和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5327和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5328和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5321。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5323。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5325。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5327。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5328。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5321和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5323和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5325和SEQ ID NO：5267-5269中任一个。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5327和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5328和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5295的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5279的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5294的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5300的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5295的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5300的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5290的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5300的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5277的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5300的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5295，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5279。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5294，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5300。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5295，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5300。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5290，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5300。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5277，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5300。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5452的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5449的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5453的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5449的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5455的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5457的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5452的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5451的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
本文还提供的是用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法。该方法包括：使用包含SEQ ID NO：5448的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5449的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5452，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5449。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5453，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5449。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5455，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5457。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5452，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5451。
本文还提供的是用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法。该方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5448，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5449。
应理解，本说明书中描述的本发明并不限于本概述中所概述的实例。本文描述且例示了各种其它方面。本概述并不预期限制权利要求的范围。
附图简述
通过参考附图，可以更好地理解本说明书中公开且描述的用于治疗乌谢尔综合征的材料和方法的各个方面，在所述附图中：
图1A-B描绘了II型CRISPR/Cas系统。
图1A描绘了包括gRNA的II型CRISPR/Cas系统。
图1B描绘了包括sgRNA的II型CRISPR/Cas系统。
图2A-F显示了关于57种sgRNA序列中的每一种的单向导RNA(sgRNA)序列，靶DNA序列以及sgRNA所结合的靶DNA序列的反向链。
图2A-B显示了关于57种sgRNA序列中的每一种的单向导RNA(sgRNA)序列。
图2C-D显示了关于57种sgRNA序列中的每一种的靶DNA序列。
图2E-F显示了关于57种sgRNA序列中的每一种，sgRNA所结合的靶DNA序列的反向链。
图2G-I显示了关于sgRNA序列的单向导RNA(sgRNA)序列，靶DNA序列以及sgRNA所结合的靶DNA序列的反向链。
图2G显示了关于sgRNA序列的单向导RNA(sgRNA)序列。
图2H显示了关于sgRNA序列的靶DNA序列。
图2I显示了关于sgRNA序列，sgRNA所结合的靶DNA序列的反向链。
图2J-L显示了关于16种sgRNA序列中的每一种的单向导RNA(sgRNA)序列，靶DNA序列以及sgRNA所结合的靶DNA序列的反向链。
图2J显示了关于16种sgRNA序列中的每一种的单向导RNA(sgRNA)序列。
图2K显示了关于16种sgRNA序列中的每一种的靶DNA序列。
图2L显示了关于16种sgRNA序列中的每一种，sgRNA所结合的靶DNA序列的反向链。
图3显示了描绘位于USH2A基因的内含子40中的IVS40突变，编辑USH2A基因的内含子40中的IVS40突变的结果，以及不编辑USH2A基因的内含子40中的IVS40突变的结果的图解。
图4A-B显示了经由同源定向修复(HDR)引入基因组DNA内的IVS40突变；所述IVS40突变是人USH2A基因的内含子40中的单核苷酸突变(A至G)。
图4A显示了经由HDR引入基因组DNA内的IVS40突变。
图4B显示在人USH2A基因的内含子40中作为单核苷酸突变(A至G)的IVS40突变。
图5A-B描绘了几种靶向USH2A IVS40突变的sgRNA的结合区域，以及关于靶向USH2A IVS40突变的sgRNA中的每一种的中靶和脱靶编辑效率。
图5A描绘了USH2A基因的IVS40突变周围的几个sgRNA间隔区区域的结合区域(SEQID NO：5321、5323、5325、5327和5328)。指向的端部是基因组DNA中与PAM序列邻近的区域。
图5B显示了关于图5A中描绘靶向USH2A IVS40突变的sgRNA中的每一种的中靶和脱靶编辑效率。
图6A-C显示了关于sgRNA的相对于IVS40突变的位置，相对于IVS40核苷酸的位置，以及中靶编辑效率，所述sgRNA：(1)与SpCas9或SaCas9相关，并且(2)与IVS40突变重叠，在IVS40突变的上游结合，或在IVS40突变的下游结合。关于相对于IVS40核苷酸的位置，-8-(+11)指示sgRNA在IVS40突变上游8个核苷酸至IVS40下游11个核苷酸的位置之间结合。关于相对于IVS40核苷酸的位置，-571-590指示sgRNA在IVS40突变上游571个核苷酸至IVS40上游590个核苷酸的位置之间结合。关于相对于IVS40核苷酸的位置，+744-763指示sgRNA在IVS40突变下游744个核苷酸至IVS40下游763个核苷酸的位置之间结合。
图6A-B显示了关于52种sgRNA中的每一种的相对于IVS40突变的位置，相对于IVS40核苷酸的位置，以及中靶编辑效率，所述sgRNA与SpCas9相关，并且(1)与IVS40突变重叠，(2)在IVS40突变的上游结合，或(3)在IVS40突变的下游结合。
图6C显示了关于16种sgRNA中的每一种的相对于IVS40突变的位置，相对于IVS40核苷酸的位置，以及中靶编辑效率，所述sgRNA与SaCas9相关，并且(1)在IVS40突变的上游结合，或(2)在IVS40突变的下游结合。
图7A-F显示了在IVS40突变上游的第一sgRNA的结合，以及在IVS40突变下游的第二sgRNA的结合，以及来自使用双重sgRNA的5种可能的编辑结果。
图7A描绘了在IVS40突变上游的第一sgRNA的结合，以及在IVS40突变下游的第二sgRNA的结合。
图7B描述了包含IVS40突变的未编辑的基因组DNA。
图7C描绘了通过(1)在IVS40突变上游结合的第一sgRNA；或(2)在IVS40突变下游结合的第二sgRNA，对基因组DNA的编辑。
图7D描述了通过(1)在IVS40突变上游结合的第一sgRNA；以及(2)在IVS40突变下游结合的第二sgRNA两者，对基因组DNA的编辑，但编辑并不导致缺失。
图7E描绘了通过(1)在IVS40突变上游结合的第一sgRNA；以及(2)在IVS40突变下游结合的第二sgRNA两者，对基因组DNA的编辑，并且编辑导致缺失。
图7F描述了通过(1)在IVS40突变上游结合的第一sgRNA；以及(2)在IVS40突变下游结合的第二sgRNA两者，对基因组DNA的编辑，但编辑并不导致缺失。相反，编辑导致倒转。
图8是关于使用ddPCR执行缺失的定量分析的方案。
图9A-B显示了关于所选择的不同双重sgRNA的缺失频率和所得到的缺失大小。图9A-B中包括的构成每种双重sgRNA的sgRNA与SpCas9相关。
图9A是显示了关于所选择的不同双重sgRNA的缺失频率和所得到的缺失大小的表。
图9B是显示了关于所选择的不同双重sgRNA的缺失频率和所得到的缺失大小的图。
图10描绘了pAAV-U6质粒，其可以进行工程改造以编码与SaCas9相关的sgRNA。
图11A-B显示了关于所选择的不同双重sgRNA的缺失频率和所得到的缺失大小。图11A-B中包括的构成每种双重sgRNA的sgRNA与SaCas9相关。
图11A是显示了关于所选择的不同双重sgRNA的缺失频率和所得到的缺失大小的表。
图11B是显示了关于所选择的不同双重sgRNA的缺失频率和所得到的缺失大小的图。
图12A-C显示了剪接报告质粒pET01；两种不同的USH2A DNA插入物的示意图；以及由HEK 293 SpCas9阳性细胞的mRNA扩增的RT-PCR产物的凝胶图像，所述HEK 293 SpCas9阳性细胞用2种不同的剪接报告质粒之一、以及4种不同的靶向USH2A IVS40突变的sgRNAs之一进行转染。
图12A描绘了剪接报告质粒pET01。
图12B描绘了两种不同的USH2A DNA插入物(突变型内含子40的部分或野生型内含子40的部分)和插入物周围的载体元件。还描绘了相应的RNA剪接产物(突变型剪接产物或野生型剪接产物)。
图12C显示了由HEK 293 SpCas9阳性细胞的mRNA扩增的RT-PCR产物的凝胶图像，所述HEK 293 SpCas9阳性细胞用2种不同的剪接报告质粒(包含突变型内含子40的部分的质粒或包含野生型内含子40的部分的质粒)之一、以及4种不同的靶向USH2A IVS40突变的sgRNAs(包含5321、5323、5325或5327的sgRNA)之一进行转染。
图13A-C显示了用于蓝色荧光蛋白(BFP)剪接报道物测定的构建体，以及基因组编辑可以对该构建体和来自其的BFP基因表达具有的可能作用。
图13A描绘了使用磷酸甘油酸激酶启动子表达BFP的构建体。BFP基因包含在BFPORF上游的USH2A基因的内含子40的野生型序列的部分。预计BFP表达。
图13B描绘了使用磷酸甘油酸激酶启动子表达BFP的构建体。BFP基因包含在BFPORF上游的USH2A基因的内含子40的IVS40突变序列的部分。不预计BFP表达。
图13C描绘了在基因组编辑前、处于第一构型，以及在基因组编辑后、处于第二构型的来自图13B的构建体。在基因组编辑后，预计BFP表达。
图14显示了在经受BFP剪接报道物测定后表达BFP的活细胞的百分比。显示了关于使用单个sgRNA和双重sgRNA的编辑策略的数据。sgRNA与SpCas9配对。
图15显示了在经受BFP剪接报道物测定后表达BFP的活细胞的百分比。显示了关于使用双重sgRNA的编辑策略的数据。这些sgRNA对与SaCas9配对。
图16显示了在经受BFP剪接报道物测定后表达BFP的GFP阳性细胞的百分比。显示了关于使用单个sgRNA和双重sgRNA的编辑策略的数据。这些sgRNA与SpCas9或SaCas9配对。还显示了用于编辑的阴性对照。
图17A-B显示了用于USH2A转录物的ddPCR测定中的引物和探针结合的位点。
图17A显示了由IVS40突变型USH2A基因转录的mRNA的序列。还显示的是引物和探针与相应的cDNA结合的位置。
图17B显示了由野生型USH2A基因(或编辑的USH2A基因)转录的mRNA的序列。还显示的是引物和探针与相应的cDNA结合的位置。
图18显示了根据本公开内容，已经受基因组编辑的IVS40突变型细胞中的校正的和未校正的转录物的百分比。显示了关于使用单个sgRNA和双重sgRNA的编辑策略的数据。这些sgRNA与SpCas9配对。还显示了阴性对照。
序列表简述
SEQ ID NO：1-612是Cas核酸内切酶直向同源物序列。
SEQ ID NO：613-4696是微小RNA序列。
SEQ ID NO：4697-5265是AAV血清型序列。
SEQ ID NO：5266是人USH2A核苷酸序列。
SEQ ID NO：5267-5269显示了SpCas9所复合的样品sgRNA主链序列。
SEQ ID NO：5270是关于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9核酸内切酶的样品向导RNA(gRNA)。
SEQ ID NO：5271显示了如按其结构分类的归巢核酸内切酶的已知家族。
SEQ ID NO：5272-5319是用化脓性链球菌Cas9核酸内切酶，靶向在USH2A基因的内含子40内或附近的IVS40突变上游和下游的区域的20 bp间隔区序列。
SEQ ID NO：5320是用化脓性链球菌Cas9核酸内切酶，靶向USH2A基因或其它DNA序列内或附近的20 bp间隔区序列，所述其它DNA序列编码USH2A基因的调节序列。
SEQ ID NO：5321是用化脓性链球菌Cas9核酸内切酶，靶向在USH2A基因的内含子40内或附近的IVS40突变上游和下游的区域的20 bp间隔区序列。
SEQ ID NO：5322是用化脓性链球菌Cas9核酸内切酶，靶向USH2A基因或其它DNA序列内或附近的20 bp间隔区序列，所述其它DNA序列编码USH2A基因的调节序列。
SEQ ID NO：5323是用化脓性链球菌Cas9核酸内切酶，靶向在USH2A基因的内含子40内或附近的IVS40突变上游和下游的区域的20 bp间隔区序列。
SEQ ID NO：5324是用化脓性链球菌Cas9核酸内切酶，靶向USH2A基因或其它DNA序列内或附近的20 bp间隔区序列，所述其它DNA序列编码USH2A基因的调节序列。
SEQ ID NO：5325是用化脓性链球菌Cas9核酸内切酶，靶向在USH2A基因的内含子40内或附近的IVS40突变上游和下游的区域的20 bp间隔区序列。
SEQ ID NO：5326是用化脓性链球菌Cas9核酸内切酶，靶向USH2A基因或其它DNA序列内或附近的20 bp间隔区序列，所述其它DNA序列编码USH2A基因的调节序列。
SEQ ID NO：5327-5328是用化脓性链球菌Cas9核酸内切酶，靶向在USH2A基因的内含子40内或附近的IVS40突变上游和下游的区域的20 bp间隔区序列。
SEQ ID NO：5329-5385是关于57种sgRNA序列中的每一种，代表靶DNA序列的序列。
SEQ ID NO：5386-5442是关于57种sgRNA序列中的每一种，代表sgRNA所结合的靶DNA序列的反向链的序列。
SEQ ID NO：5443是用化脓性链球菌Cas9核酸内切酶，靶向在IVS40突变下游的区域的18 bp间隔区序列。
SEQ ID NO：5444是关于18 bp sgRNA序列，代表靶DNA序列的序列。
SEQ ID NO：5445是关于18 bp sgRNA序列，代表sgRNA所结合的靶DNA序列的反向链的序列。
SEQ ID NO：5446-5461是用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9核酸内切酶，靶向在USH2A基因的内含子40内或附近的IVS40突变上游和下游的区域的20 bp间隔区序列。
SEQ ID NO：5462-5477是关于16种sgRNA序列中的每一种，代表靶DNA序列的序列。
SEQ ID NO：5478-5493是关于16种sgRNA序列中的每一种，代表sgRNA所结合的靶DNA序列的反向链的序列。
SEQ ID NO：5494是单链HDR供体序列。
SEQ ID NO：5495-5506是PCR引物序列。
SEQ ID NO：5507-5523是表达sgRNA的质粒序列。
SEQ ID NO：5524是关于pET01的序列，其包含USH2A的野生型内含子40的部分。
SEQ ID NO：5525是关于pET01的序列，其包含USH2A的突变型内含子40的部分。
SEQ ID NO：5526-5537显示了SaCas9所复合的样品sgRNA主链序列。
SEQ ID NO：5538-5549是表达sgRNA的质粒序列。sgRNA与SpCas9相关。
SEQ ID NO：5550-5557是表达sgRNA的质粒序列。sgRNA与SaCas9相关。
SEQ ID NO：5558和5559是用于扩增由USH2A转录物产生的cDNA区段的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO：5560和5561是用于检测校正的或未校正的USH2A cDNA序列的寡核苷酸探针。
发明详述
申请人已发现了用于治疗2A型乌谢尔综合征，例如与USH2A基因中的IVS40突变相关的2A型乌谢尔综合征的新型方法。该方法可以导致减慢或逆转2A型乌谢尔综合征的发展或者预防个体中的疾病发展。
治疗方法
本文提供的方法，无论是细胞、离体还是体内方法，可以涉及下述方法之一或组合。一种方法涉及通过由于非同源端连接(NHEJ)途径而出现的插入和/或缺失，破坏用作USH2A基因中的IVS40突变内或附近的剪接供体位点的共有序列。在另一种方法中，切除位于USH2A基因的内含子40中的IVS40突变。在第三种方法中，通过HDR校正突变等位基因(例如，IVS40突变)。
NHEJ策略可以涉及用一种或多种CRISPR核酸内切酶和gRNA(例如，cRNA +tracrRNA或sgRNA)，诱导在USH2A基因的IVS40突变内或附近的一个单链断裂或双链断裂。这种方法编辑在IVS40突变内或附近的序列，并且可以破坏引起不正确剪接的序列。这种方法利用了对于USH2A基因中IVS40突变特异性的gRNA或sgRNA。
切除策略可以包括在USH2A基因的内含子40内，在IVS40突变的上游和下游结合的一组向导RNA或sgRNA，并且切除含有IVS40突变的基因组区域。可以预计这种策略影响突变型(Mut)和野生型(WT)等位基因两者，其是内含子突变所允许的。切除策略可以导致较短形式的新生前体信使RNA(前mRNA，缺少显性剪接供体产生突变)，其可以正确剪接，导致WTmRNA和WT usherin蛋白在编辑细胞中的表达，如图3中描绘的。在其中足够的支持性视网膜结构仍可获得的情况下，可以预计编辑细胞的功能和存活改善。这种方法利用了在USH2A基因的内含子40内，对于在IVS40突变上游和下游的区域特异性的gRNA或sgRNA。
通过切除策略产生的缺失大小可以是50至5000个碱基对(bp)。例如，缺失范围可以是大小50-100；50-250；50-500；50-1000；50-1500；50-2000；200-500；200-750；200-1000；200-1100；500-1,000；1,000-1,500；1,500-2,000；1,000-2,000；2,000-2,500；2,500-3,000；3,000-3,500；3,500-4,000；4,000-4,500；4,500-5,000或50-2,900个碱基对。
HDR策略可以涉及在外源引入的供体DNA模板的存在下，用一种或多种CRISPR核酸内切酶和gRNA(例如，crRNA + tracrRNA或sgRNA)，诱导在USH2A基因的内含子40内或附近，在IVS40突变的上游和下游的一个或多个单链断裂或双链断裂，或者用一种或多种CRISPR核酸内切酶(Cas9、Cpf1等等)和两种或更多种gRNA，诱导在USH2A基因的内含子40内或附近，在IVS40突变的上游和下游的一个或多个单链断裂或双链断裂，以指导对同源性修复的细胞DSB应答。供体DNA模板可以是短的单链寡核苷酸，短的双链寡核苷酸，长的单链或双链DNA分子。该方法可以提供通过将切割基因两次来制备缺失的gRNA对：在IVS40突变的5'端处切割的一个gRNA，以及在IVS40突变的3'端处切割的另一个gRNA，其促进来自多核苷酸供体模板的新序列的插入，以替换USH2A基因中的IVS40突变。切割可以通过各自制备DSB(在内含子40内或附近的IVS40突变的每端上的一个DSB)的一对DNA内切酶来完成，或通过一起制备DSB(在内含子40内或附近的IVS40突变的每端上的一个DSB)的多重切口酶来完成。这种方法利用了在USH2A基因的内含子40内，对于在IVS40突变上游和下游的区域特异性的gRNA或sgRNA。这种方法还利用了供体DNA分子。
关于上文策略(RNA剪接共有序列的破坏、切除和HDR策略)的优点是相似的，原则上包括短期和长期的有益临床和实验室效应。
此类方法使用核酸内切酶，例如CRISPR相关的(Cas9、Cpf1等等)核酸酶，以稳定地校正在USH2A基因的基因组基因座内的IVS40突变。任何CRISPR核酸内切酶都可以用于本公开内容的方法中，每种CRISPR核酸内切酶具有其自身相关的PAM，其可以是或不是疾病特异性的。例如，用来自化脓性链球菌的CRISPR/Cas9核酸内切酶，靶向USH2A基因中的IVS40突变的gRNA间隔区序列已在序列表的SEQ ID NO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328和5443中得到鉴定。例如，用来自金黄色葡萄球菌的CRISPR/Cas9核酸内切酶，靶向USH2A基因中的IVS40突变的gRNA间隔区序列已在序列表的SEQ ID NO：5446-5461中得到鉴定。
本公开内容中阐述的实例可以诱导在USH2A基因的内含子40内的IVS40突变内或附近、上游和下游的单链断裂或双链断裂，以引入RNA剪接共有序列的破坏、切除，或用少至一次治疗(而不是对于患者的一生递送潜在的治疗剂)校正USH2A基因内的IVS40突变。
乌谢尔综合征
乌谢尔综合征是常染色体隐性遗传疾病，其特征在于感觉神经性听力丧失、色素性视网膜炎(RP)以及在一些情况下的前庭功能障碍。乌谢尔综合征的患病率估计在1/6000至1/25000之间。
乌谢尔综合征是临床和遗传上异质性的疾病，占合并的遗传性耳聋-失明的所有病例的约一半。迄今为止，该疾病已与13种基因相关。基于听力损害的严重程度、前庭功能障碍的存在或不存在、以及疾病发作的年龄，已鉴定了该疾病的三种临床形式(USH I、II和III)。
II型乌谢尔综合征是最常见的临床形式，占所有乌谢尔综合征病例的大约50%。II型乌谢尔综合征的特征在于先天性听力丧失和青春期或成年期起始的进行性视力丧失。听力丧失的范围从轻度到重度，并且主要影响听到高频声音的能力。视力丧失随着视网膜的光感测细胞逐渐退化而发生。夜间视力丧失首先开始，随后为周边视力的丧失。随着时间过去，这些盲区扩大并合并以产生管状视力。在一些情况下，视力通过白内障进一步损害。许多患者在生命的第5个十年内变成法定盲人。
2A型乌谢尔综合征是由于USH2A基因中的突变，并且占所有II型乌谢尔综合征病例的大约80%和所有乌谢尔综合征病例的40%。
USH2A基因
USH2A基因(例如，SEQ ID NO：5266)是800,503个碱基对，并且位于染色体1上：215,622,893:216,423,395(Genome Reference Consortium – GRCh38/hg38)(1q41)。USH2A基因包含72个外显子，并且编码称为usherin的蛋白质的两种可变剪接的同种型。全长580kDa usherin蛋白(同种型b)是具有大细胞外结构域的5,202个氨基酸的复杂跨膜蛋白质。短的170 kDa usherin蛋白(同种型a)从仅由前21个编码外显子组成的剪接变体翻译，并且被视为1546个氨基酸的细胞外蛋白质。
usherin蛋白定位紧靠纤周膜处的囊泡载点，并且可能在光感受器的内部区段和外部区段之间的囊泡转运中起作用。
IVS40突变
存在与乌谢尔综合征相关的各种突变，其可以是插入、缺失、错义、无义、移码及其它突变，具有使USH2A基因失活的共同效应。
USH2A基因中的C.7595-2144A>G(IVS40突变)导致剪接供体位点的产生，以及在USH2A mRNA内插入152 bp，其依次又导致移码以及截断和无功能的蛋白质。
可以修复任何一种或多种突变，以便恢复usherin蛋白功能。例如，可以切除或校正病理变体IVS40，以恢复usherin蛋白表达(参见表1)。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
基于体内的疗法
本文提供的是用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的方法。在一些方面，该方法是基于体内细胞的疗法。可以使用本文描述的材料和方法来编辑2A型乌谢尔综合征患者中的细胞的染色体DNA。例如，体内方法可以包括编辑患者的细胞，如感光细胞或视网膜祖细胞中的USH2A基因中的IVS40突变。
尽管某些细胞呈现了用于离体治疗和疗法的有吸引力的靶，但增加的递送功效可以允许对此类细胞的直接体内递送。理想地，将瞄准和编辑导向相关细胞。也可以通过使用仅在某些细胞和/或发育阶段活性的启动子来预防其它细胞中的切割。另外的启动子是可诱导的，并且因此如果核酸酶作为质粒递送，则可以在时间上进行控制。递送的RNA和蛋白质保留在细胞中的时间量也可以使用添加以改变半衰期的处理或结构域进行调整。体内治疗将消除许多治疗步骤，但较低的递送率可能要求较高的编辑率。体内治疗可以消除来自离体治疗和移植物植入的问题和损失。
体内基因疗法的优点可以是治疗剂产生和施用的容易性。相同的治疗方法和疗法具有用于治疗多于一个患者，例如共享相同或相似基因型或等位基因的许多患者的潜力。相比之下，离体细胞疗法通常要求使用患者的自身细胞，其被分离、操纵并返回给相同患者。
基于离体的疗法
本文提供的是用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的方法。此类方法的一个方面是基于离体细胞的疗法。例如，可以产生患者特异性的诱导性多能干细胞(iPSC)。然后，可以使用本文所述的材料和方法，编辑这些iPSC细胞的染色体DNA。例如，该方法可以包括在iPSC的USH2A基因中的IVS40突变内或附近的编辑。接下来，可以使基因组编辑的iPSC分化成其它细胞，例如感光细胞或视网膜祖细胞。最后，可以将分化的细胞(例如感光细胞或视网膜祖细胞)植入患者内(即，植入患者的眼内)。
此类方法的另一个方面是基于离体细胞的疗法。例如，可以从患者中分离感光细胞或视网膜祖细胞。接下来，可以使用本文描述的材料和方法，编辑这些感光细胞或视网膜祖细胞的染色体DNA。例如，该方法可以包括在感光细胞或视网膜祖细胞的USH2A基因中的IVS40突变内或附近的编辑。最后，可以将基因组编辑的感光细胞或视网膜祖细胞植入患者内(即，植入患者的眼内)。
此类方法的另一个方面是基于离体细胞的疗法。例如，可以从患者体内分离间充质干细胞，其可以从患者的骨髓、外周血、脂肪组织或脐带中分离。接下来，可以使用本文所述的材料和方法，编辑这些间充质干细胞的染色体DNA。例如，该方法可以包括在间充质干细胞的USH2A基因中的IVS40突变内或附近的编辑。接下来，可以使基因组编辑的间充质干细胞分化成任何类型的细胞，例如感光细胞或视网膜祖细胞。最后，可以将分化的细胞(例如感光细胞或视网膜祖细胞)植入患者内(即，植入患者的眼内)。
离体细胞治疗方法的一个优点是在施用之前进行治疗剂的全面分析的能力。基于核酸酶的治疗剂可以具有一定水平的脱靶效应。离体执行基因校正允许在植入之前表征校正的细胞群体。本公开内容包括对校正细胞的整个基因组进行测序，以确保脱靶效应(如果有的话)可以处于与对患者的最低限度风险相关的基因组位置。此外，可以在植入之前分离特异性细胞的群体，包括克隆群体。
离体细胞疗法的另一个优点涉及与其它原代细胞来源相比，iPSC中的基因校正。iPSC是多产的，使得容易获得基于细胞的疗法所需的大量细胞。此外，iPSC是用于执行克隆分离的理想细胞类型。这允许筛选正确的基因组校正，而无生存力减少的风险。相比之下，其它原代细胞，例如感光细胞或视网膜祖细胞，仅存活少数传代，并且难以克隆扩增。因此，操纵iPSC用于治疗2A型乌谢尔综合征可能容易得多，并且可以缩短制备所需的基因校正需要的时间。
基因组编辑
基因组编辑指例如以精确或预定的方式修饰基因组的核苷酸序列的过程。本文所述的基因组编辑方法的实例包括使用定点核酸酶在基因组中的精确靶位置处切割DNA，从而在基因组内的特定位置处产生单链或双链DNA断裂的方法。此类断裂可以并且通过天然的内源性细胞过程(例如HDR和NHEJ)定期进行修复。这两个主要的DNA修复过程由一系列替代途径组成。NHEJ直接连接起因于双链断裂的DNA端，有时伴随核苷酸序列的丧失或添加，其可能破坏或增强基因表达。HDR利用同源序列或供体序列作为模板，用于在断点处插入限定的DNA序列。同源序列可以在内源基因组中，例如姐妹染色单体。可替代地，供体可以是外源核酸，例如质粒、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸、双链体寡核苷酸或病毒，其具有与核酸酶切割的基因座具有高度同源性的区域，但还可以含有另外的序列或序列变化，包括可以掺入切割的靶基因座内的缺失。第三种修复机制可以是微同源介导的端连接(MMEJ)，也称为“替代NHEJ(ANHEJ)”，其遗传结果与NHEJ相似，因为在切割位点处可以发生小的缺失和插入。MMEJ可以利用侧接DNA断裂位点的几个碱基对的同源序列，以驱动更有利的DNA端连接修复结果，并且最近的报道已进一步阐明了这种过程的分子机制。在一些情况下，可能能够基于在DNA断裂位点处潜在的微观同源性的分析来预测可能的修复结果。
这些基因组编辑机制各自可以用于产生所需的基因组改变。基因组编辑过程中的一个步骤可以是在靠近预期突变位点的靶基因座中产生一个或两个DNA断裂，后者为双链断裂或两个单链断裂。如本文所述和所示的，这可以通过使用定点多肽来实现。
定点多肽，例如DNA核酸内切酶，可以在核酸例如基因组DNA中引入双链断裂或单链断裂。双链断裂可以刺激细胞的内源性DNA修复途径[例如，同源依赖性修复(HDR)或非同源端连接(NHEJ)或(ANHEJ)或(MMEJ)]。NHEJ可以修复切割的靶核酸，而无需同源模板。这有时可以导致在切割位点处在靶核酸中的小缺失或插入(插入缺失(indel))，并且可以导致基因表达的破坏或改变。
当同源修复模板或供体可用时，可以发生HDR。同源供体模板可以包含野生型USH2A基因或cDNA的至少一部分。野生型USH2A基因或cDNA的至少一部分可以是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、内含子区域、其片段或组合、或者整个USH2A基因或cDNA。
供体模板可以是单链或双链多核苷酸。供体模板可以是至多11 kb。供体模板可以是至多10 kb。供体模板可以是至多9 kb。供体模板可以是至多8 kb。供体模板可以是至多7kb。供体模板可以是至多6 kb。供体模板可以是至多5 kb。供体模板可以是至多4 kb。供体模板可以是至多3 kb。供体模板可以是至多2 kb。供体模板可以是至多1 kb。供体模板可以小于1 kb。供体模板可以是500 bp至1000 bp。供体模板可以是250 bp至500 bp。供体模板可以是100至250 bp。供体模板可以通过AAV递送。同源供体模板可以包含与侧接靶核酸切割位点的序列同源的序列。例如，供体模板可以具有与1q41区域同源的臂。供体模板也可以具有与病理变体IVS40同源的臂。姐妹染色单体可以被细胞用作修复模板。然而，出于基因组编辑的目的，修复模板可以作为外源核酸供应，所述外源核酸例如质粒、双链体寡核苷酸、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸或病毒核酸。利用外源供体模板，可以在同源性的侧翼区域之间引入另外的核酸序列(例如转基因)或修饰(例如单个或多重碱基变化或缺失)，使得另外的或改变的核酸序列也变得掺入靶基因座内。MMEJ可以导致与NHEJ相似的遗传结果，因为在切割位点处可以发生小的缺失和插入。MMEJ可以利用侧接切割位点的几个碱基对的同源序列，以驱动有利的端连接DNA修复结果。在一些情况下，可能能够基于在核酸酶靶区域中潜在的微观同源性的分析来预测可能的修复结果。
因此，在一些情况下，同源重组可以用于将外源多核苷酸序列插入靶核酸切割位点内。外源多核苷酸序列在本文中称为供体多核苷酸(或供体或供体序列或多核苷酸供体模板)。可以将供体多核苷酸、供体多核苷酸的一部分、供体多核苷酸的拷贝、或供体多核苷酸的拷贝的一部分插入靶核酸切割位点内。供体多核苷酸可以是外源多核苷酸序列，即并非天然存在于靶核酸切割位点处的序列。
由于NHEJ和/或HDR的靶DNA的修饰可以导致例如基因校正。
CRISPR核酸内切酶系统
CRISPR(成簇规律间隔短回文重复)基因组基因座可以在许多原核生物(例如细菌和古细菌)的基因组中发现。在原核生物中，CRISPR基因座编码充当一类免疫系统的产物，以帮助原核生物针对外来侵入者例如病毒和噬菌体的防御。存在CRISPR基因座功能的三个阶段：新序列整合到CRISPR基因座内，CRISPR RNA(crRNA)的表达，以及外来侵入者核酸的沉默。已鉴定了五种类型的CRISPR系统(例如，I型、II型、III型、U型和V型)。
CRISPR基因座包括许多短重复序列，称为“重复”。当表达时，重复可以形成二级结构(例如发夹)和/或包含非结构化的单链序列。重复通常成簇出现，并且经常在物种之间趋异。重复由称为“间隔区”的独特间插序列规律地间隔，导致重复-间隔区-重复基因座体系结构。间隔区与已知的外来侵入者序列等同或具有高度同源性。间隔区-重复单元编码crispRNA(crRNA)，其被加工成间隔区-重复单元的成熟形式。crRNA包含涉及靶向靶核酸的“种子”或间隔区序列(以原核生物中天然存在的形式，间隔区序列靶向外来侵入者核酸)。间隔区序列位于crRNA的5'端或3'端处。
CRISPR基因座还包含编码CRISPR相关(Cas)基因的多核苷酸序列。Cas基因编码涉及原核生物中crRNA功能的生物发生和干扰阶段的核酸内切酶。一些Cas基因包含同源的二级和/或三级结构。
II型CRISPR系统
本质上，II型CRISPR系统中的crRNA生物发生要求反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。tracrRNA可以通过内源性RNA酶III进行修饰，然后与前体crRNA阵列中的crRNA重复杂交。可以募集内源性RNA酶III来切割前体crRNA。切割的crRNA可以经受核糖核酸外切酶修整，以产生成熟的crRNA形式(例如5'修整)。tracrRNA可以保持与crRNA杂交，并且tracrRNA和crRNA与定点多肽(例如，Cas9)相关。crRNA-tracrRNA-Cas9复合物的crRNA可以将复合物引导至crRNA可以与之杂交的靶核酸。crRNA与靶核酸的杂交可以激活Cas9用于靶向核酸切割。II型CRISPR系统中的靶核酸称为前间隔区邻近基序(PAM)。在自然界中，PAM对于促进定点多肽(例如，Cas9)与靶核酸的结合是必需的。II型系统(也称为Nmeni或CASS4)进一步再分成II-A型(CASS4)和II-B型(CASS4a)。Jinek等人，Science，337(6096):816-821(2012)显示了CRISPR/Cas9系统可用于RNA可编程基因组编辑，并且国际专利申请公开号WO2013/176772提供了用于位点特异性基因编辑的CRISPR/Cas核酸内切酶系统的众多实例和应用。
V型CRISPR系统
V型CRISPR系统与II型系统具有几个重大差异。例如，Cpf1是单个RNA指导核酸内切酶，与II型系统相比，其缺少tracrRNA。实际上，Cpf1相关的CRISPR阵列可以无需另外的反式激活tracrRNA被加工为成熟的crRNA。V型CRISPR阵列可以被加工成长度42-44个核苷酸的短的成熟crRNA，其中每种成熟的crRNA以19个核苷酸的直接重复开始，随后为23-25个核苷酸的间隔区序列。相比之下，II型系统中的成熟crRNA可以以20-24个核苷酸的间隔区序列起始，随后为约22个核苷酸的直接重复。另外，Cpf1可以利用富含T的前间隔区邻近基序，使得Cpf1-crRNA复合物有效地切割之前为短的富含T的PAM的靶DNA，这与II型系统的靶DNA之后的富含G的PAM形成对比。因此，V型系统在远离PAM的点处切割，而II型系统在与PAM邻近的点处切割。另外，与II型系统相比，Cpf1经由交错的DNA双链断裂(具有4或5个核苷酸的5'突出端)切割DNA。II型系统经由平端双链断裂切割。与II型系统相似，Cpf1含有预测的RuvC样核酸内切酶结构域，但缺少第二个HNH核酸内切酶结构域，其与II型系统相反。
Cas基因/多肽和前间隔区邻近基序
示例性的CRISPR/Cas多肽包括Fonfara等人，Nucleic Acids Research，42: 2577-2590(2014)的图1中的Cas9多肽。自从发现Cas基因以来，CRISPR/Cas基因命名系统已经历了广泛的重写。上文Fonfara的图5提供了来自各个物种的Cas9多肽的PAM序列。
定点多肽
定点多肽是在基因组编辑中用于切割DNA的核酸酶。定点核酸酶可以作为以下中的任一施用于细胞或患者：一种或多种多肽、或者编码该多肽的一种或多种mRNA。SEQ ID NO：1-612中列出的或本文公开的任何酶或直向同源物均可以用于本文的方法中。
在CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1系统的背景下，定点多肽可以与向导RNA结合，所述向导RNA依次又指定了多肽导向其的靶DNA中的位点。在本文公开的CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1系统中，定点多肽可以是核酸内切酶，例如DNA核酸内切酶。
定点多肽可以包含多个核酸切割(即核酸酶)结构域。两个或更多个核酸切割结构域可以经由接头连接在一起。例如，接头可以包含柔性接头。接头可以包含长度1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40个或更多个氨基酸。
天然存在的野生型Cas9酶包含两个核酸酶结构域：HNH核酸酶结构域和RuvC结构域。在本文中，“Cas9”指天然存在的Cas9和重组Cas9两者。本文考虑的Cas9酶可以包含HNH或HNH样核酸酶结构域，和/或RuvC或RuvC样核酸酶结构域。
HNH或HNH样结构域包含McrA样折叠。HNH或HNH样结构域包含两条反向平行的β链和α螺旋。HNH或HNH样结构域包含金属结合位点(例如，二价阳离子结合位点)。HNH或HNH样结构域可以切割靶核酸的一条链(例如，crRNA靶向链的互补链)。
RuvC或RuvC样结构域包含RNA酶H或RNA酶H样折叠。RuvC/RNA酶H结构域涉及多种基于核酸的功能，包括作用于RNA和DNA两者的功能。RNA酶H结构域包含被多个α-螺旋包围的5条β链。RuvC/RNA酶H或RuvC/RNA酶H样结构域包含金属结合位点(例如，二价阳离子结合位点)。RuvC/RNA酶H或RuvC/RNA酶H样结构域可以切割靶核酸的一条链(例如，双链靶DNA的非互补链)。
定点多肽可以在核酸例如基因组DNA中引入双链断裂或单链断裂。双链断裂可以刺激细胞的内源性DNA修复途径(例如HDR或NHEJ或ANHEJ或MMEJ)。NHEJ可以修复切割的靶核酸，而无需同源模板。这有时可以导致在切割位点处在靶核酸中的小缺失或插入(插入缺失)，并且可以导致基因表达的破坏或改变。当同源修复模板或供体可用时，可以发生HDR。同源供体模板可以包含与侧接靶核酸切割位点的序列同源的序列。姐妹染色单体可以被细胞用作修复模板。然而，出于基因组编辑的目的，修复模板可以作为外源核酸供应，所述外源核酸例如质粒、双链体寡核苷酸、单链寡核苷酸或病毒核酸。利用外源供体模板，可以在同源性的侧翼区域之间引入另外的核酸序列(例如转基因)或修饰(例如单个或多重碱基变化或缺失)，使得另外的或改变的核酸序列也变得掺入靶基因座内。MMEJ可以导致与NHEJ相似的遗传结果，因为在切割位点处可以发生小的缺失和插入。MMEJ可以利用侧接切割位点的几个碱基对的同源序列，以驱动有利的端连接DNA修复结果。在一些情况下，可能能够基于在核酸酶靶区域中潜在的微观同源性的分析来预测可能的修复结果。
因此，在一些情况下，同源重组可以用于将外源多核苷酸序列插入靶核酸切割位点内。外源多核苷酸序列在本文中称为供体多核苷酸(或供体或供体序列)。可以将供体多核苷酸、供体多核苷酸的一部分、供体多核苷酸的拷贝、或供体多核苷酸的拷贝的一部分插入靶核酸切割位点内。供体多核苷酸可以是外源多核苷酸序列，即并非天然存在于靶核酸切割位点处的序列。
定点多肽可以包含氨基酸序列，其与野生型示例性定点多肽[例如，来自化脓性链球菌的Cas9，US2014/0068797序列ID号8或Sapranauskas等人，Nucleic Acids Res，39(21): 9275-9282(2011)]、以及各种其它定点多肽具有至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%的同一性。定点多肽可以包含在10个邻接氨基酸上，与野生型定点多肽(例如，来自化脓性链球菌的Cas9，同上)至少70、75、80、85、90、95、97、99或100%的同一性。定点多肽可以包含在10个邻接氨基酸上，与野生型定点多肽(例如，来自化脓性链球菌的Cas9，同上)至多：70、75、80、85、90、95、97、99或100%的同一性。定点多肽可以包含在定点多肽的HNH核酸酶结构域中的10个邻接氨基酸上，与野生型定点多肽(例如，来自化脓性链球菌的Cas9，同上)至少：70、75、80、85、90、95、97、99或100%的同一性。定点多肽可以包含在定点多肽的HNH核酸酶结构域中的10个邻接氨基酸上，与野生型定点多肽(例如，来自化脓性链球菌的Cas9，同上)至多：70、75、80、85、90、95、97、99或100%的同一性。定点多肽可以包含在定点多肽的RuvC核酸酶结构域中的10个邻接氨基酸上，与野生型定点多肽(例如，来自化脓性链球菌的Cas9，同上)至少：70、75、80、85、90、95、97、99或100%的同一性。定点多肽可以包含在定点多肽的RuvC核酸酶结构域中的10个邻接氨基酸上，与野生型定点多肽(例如，来自化脓性链球菌的Cas9，同上)至多：70、75、80、85、90、95、97、99或100%的同一性。
定点多肽可以包含野生型示例性定点多肽的修饰形式。野生型示例性定点多肽的修饰形式可以包含降低定点多肽的核酸切割活性的突变。野生型示例性定点多肽的修饰形式可以具有小于90%、小于80%、小于70%、小于60%、小于50%、小于40%、小于30%、小于20%、小于10%、小于5%或小于1%的野生型示例性定点多肽(例如，来自化脓性链球菌的Cas9，同上)的核酸切割活性。定点多肽的修饰形式可以不具有基本的核酸切割活性。当定点多肽是不具有基本的核酸切割活性的修饰形式时，它在本文中称为“无酶促活性的”。
定点多肽的修饰形式可以包含突变，使得它可以诱导靶核酸上的SSB(例如，通过仅切割双链靶核酸的糖磷酸主链之一)。突变可以导致野生型定点多肽(例如，来自化脓性链球菌的Cas9，同上)的多个核酸切割结构域的一个或多个中，小于90%、小于80%、小于70%、小于60%、小于50%、小于40%、小于30%、小于20%、小于10%、小于5%或小于1%的核酸切割活性。突变可以导致多个核酸切割结构域中的一个或多个保留了切割靶核酸的互补链的能力，但降低了其切割靶核酸的非互补链的能力。突变可以导致多个核酸切割结构域中的一个或多个保留了切割靶核酸的非互补链的能力，但降低了其切割靶核酸的互补链的能力。例如，使野生型示例性化脓性链球菌Cas9多肽中的残基，例如Asp10、His840、Asn854和Asn856突变，以使多个核酸切割结构域(例如，核酸酶结构域)中的一个或多个失活。待突变的残基可以对应于野生型示例性化脓性链球菌Cas9多肽中的残基Asp10、His840、Asn854和Asn856(例如，如通过序列和/或结构比对确定的)。突变的非限制性实例包括D10A、H840A、N854A或N856A。除丙氨酸取代外的突变可以是合适的。
D10A突变可以与H840A、N854A或N856A突变中的一种或多种组合，以产生基本上缺乏DNA切割活性的定点多肽。H840A突变可以与D10A、N854A或N856A突变中的一种或多种组合，以产生基本上缺乏DNA切割活性的定点多肽。N854A突变可以与H840A、D10A或N856A突变中的一种或多种组合，以产生基本上缺乏DNA切割活性的定点多肽。N856A突变可以与H840A、N854A或D10A突变中的一种或多种组合，以产生基本上缺乏DNA切割活性的定点多肽。包含一个基本上无活性的核酸酶结构域的定点多肽称为“切口酶”。
RNA指导的核酸内切酶例如Cas9的切口酶变体，可以用于增加CRISPR介导的基因组编辑的特异性。野生型Cas9通常由单个向导RNA引导，所述单个向导RNA设计为与靶序列(例如内源基因组基因座)中指定的~20核苷酸序列杂交。然而，几个错配在向导RNA和靶基因座之间可以是耐受的，有效地将靶位点中的所需同源性的长度降低到例如少至13 nt的同源性，并且从而导致结合的潜力升高，以及靶基因组中的其它地方通过CRISPR/Cas9复合物的双链核酸切割 - 也称为脱靶切割。因为Cas9的切口酶变体各自仅切割一条链，所以为了产生双链断裂，一对切口酶必须紧密接近地并且在靶核酸的相反链上结合，从而产生一对切口，其等价于双链断裂。这要求两种分开的向导RNA(每个切口酶一种)必须紧密接近地并且在靶核酸的相反链上结合。这种要求基本上使双链断裂发生所需的最小同源长度加倍，从而降低了双链切割事件在基因组中的其它地方发生的可能性，其中两个向导RNA位点(如果它们存在的话)不太可能彼此足够接近，以使得双链断裂能够形成。如本领域中所述，切口酶还可以用于促进HDR相对于NHEJ。通过使用有效介导所需变化的特异性供体序列，HDR可以用于将所选择的变化引入基因组中的靶位点内。
考虑的突变可以包括取代、添加和缺失或其任何组合。突变将突变的氨基酸转换为丙氨酸。突变将突变的氨基酸转换为另一种氨基酸(例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸或精氨酸)。突变将突变的氨基酸转换为非天然氨基酸(例如硒代甲硫氨酸)。突变将突变的氨基酸转换为氨基酸模拟物(例如磷酸模拟物)。突变可以是保守突变。例如，突变将突变的氨基酸转换为这样的氨基酸，其类似突变氨基酸的大小、形状、电荷、极性、构象和/或旋转异构体(例如半胱氨酸/丝氨酸突变、赖氨酸/天冬酰胺突变、组氨酸/苯丙氨酸突变)。突变可以引起读码框中的移动和/或过早终止密码子的产生。突变可以引起对基因或基因座的调节区域的变化，其影响一种或多种基因的表达。
定点多肽(例如，变体、突变、无酶促活性和/或条件无酶促活性的定点多肽)可以靶向核酸。定点多肽(例如，变体、突变、无酶促活性和/或条件无酶促活性的核糖核酸内切酶)可以靶向DNA。定点多肽(例如，变体、突变、无酶促活性和/或条件无酶促活性的核糖核酸内切酶)可以靶向RNA。
定点多肽可以包含一个或多个非天然序列(例如，定点多肽是融合蛋白)。
定点多肽可以包含氨基酸序列，其包含与来自细菌(例如，化脓性链球菌)的Cas9至少15%的氨基酸同一性、核酸结合结构域、以及两个核酸切割结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)。
定点多肽可以包含氨基酸序列，其包含与来自细菌(例如，化脓性链球菌)的Cas9至少15%的氨基酸同一性、以及两个核酸切割结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)。
定点多肽可以包含氨基酸序列，其包含与来自细菌(例如，化脓性链球菌)的Cas9至少15%的氨基酸同一性、以及两个核酸切割结构域，其中所述核酸切割结构域之一或两者包含与来自细菌(例如，化脓性链球菌)的Cas9的核酸酶结构域至少50%的氨基酸同一性。
定点多肽可以包含氨基酸序列，其包含与来自细菌(例如，化脓性链球菌)的Cas9至少15%的氨基酸同一性、两个核酸切割结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)、以及非天然序列(例如，核定位信号)或将定点多肽与非天然序列连接的接头。
定点多肽可以包含氨基酸序列，其包含与来自细菌(例如，化脓性链球菌)的Cas9至少15%的氨基酸同一性、两个核酸切割结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)，其中所述定点多肽包含在核酸切割结构域之一或两者中的突变，所述突变使核酸酶结构域的切割活性降低至少50%。
定点多肽可以包含氨基酸序列，其包含与来自细菌(例如，化脓性链球菌)的Cas9至少15%的氨基酸同一性、以及两个核酸切割结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)，其中所述核酸切割结构域之一包含天冬氨酸10的突变，和/或其中所述核酸酶结构域之一可以包含组氨酸840的突变，并且其中所述突变使核酸酶结构域的切割活性降低至少50%。
一种或多种定点多肽，例如DNA核酸内切酶，可以包含在基因组中的特异性基因座处一起实现一个双链断裂的两种切口酶、或者在基因组中的特异性基因座处一起实现或引起两个双链断裂的四种切口酶。可替代地，一种定点多肽，例如DNA核酸内切酶，可以在基因组中的特异性基因座处实现或引起一个双链断裂。
来自其它细菌菌株的Cas9直向同源物的非限制性实例包括但不限于在以下中鉴定的Cas蛋白：Acaryochloris marina MBIC11017；阿拉伯醋酸喜盐菌(Acetohalobium arabaticum)DSM 5501；喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)；氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)ATCC 23270；酸热脂环芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)LAA1；酸热脂环芽孢杆菌酸热亚种(Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. acidocaldarius)DSM 446；酒色别样着色菌(Allochromatium vinosum)DSM 180；Ammonifex degensii KC4；多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)ATCC 29413；极大节螺藻(Arthrospira maxima)CS-328；钝顶节螺藻(Arthrospira platensis)菌株 Paraca；节螺藻属物种(Arthrospira sp.)PCC 8005；假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)DSM12442；还原硒酸盐芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)MLS10；伯克氏菌目细菌(Burkholderiales bacterium)1_1_47；热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)DSM 6725；Candidatus Desulforudis audaxviator MP104C；热液口热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor hydrothermalis)_108；梭状芽孢杆菌噬菌体(Clostridium phage)c-st；肉毒梭菌(Clostridium botulinum)A3菌株Loch Maree；肉毒梭菌Ba4菌株657；艰难梭菌QCD-63q42；Crocosphaera watsonii WH 8501；蓝藻属物种(Cyanothece sp.)ATCC 51142；蓝藻属物种CCY0110；蓝藻属物种PCC 7424；蓝藻属物种PCC 7822；西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)255-15；大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)ATCC 29328；成簇细枝菌(Ktedonobacter racemifer)DSM 44963；德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)PB2003/044-T3-4；唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)ATCC 11741；英诺克李斯特菌(Listeria innocua)；鞘丝藻属物种(Lyngbya sp.)PCC 8106；海杆菌属物种(Marinobacter sp.)ELB17；调查甲烷盐菌(Methanohalobium evestigatum)Z-7303；微囊藻噬菌体(Microcystis phage)Ma-LMM01；铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)NIES-843；海洋微颤菌(Microscilla marina)ATCC23134；喜泥微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)PCC 7420；脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)； Nitrosococcus halophilus Nc4；达氏拟诺卡氏菌达氏亚种(Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei)DSM 43111；泡沫节球藻(Nodularia spumigena)CCY9414；念珠藻属物种(Nostoc sp.)PCC 7120；颤藻属物种(Oscillatoria sp.)PCC 6506；嗜热丙酸降解菌(Pelotomaculum_thermopropionicum)_SI；运动石孢菌(Petrotoga mobilis)SJ95；食萘极单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)CJ2；极单胞菌属物种(Polaromonas sp.)JS666；游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)TAC125；始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)ATCC 25486；始旋链霉菌ATCC 25486；嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)；绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)DSM 40736；玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum)DSM 43021；聚球藻属物种(Synechococcus sp.)PCC 7335；以及非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)TCF52B((Chylinski等人，RNA Biol.，2013；10(5): 726-737。
除Cas9直向同源物之外，其它Cas9变体，例如无活性的dCas9和具有不同功能的效应子结构域的融合蛋白，可以充当用于遗传调节的平台。前述酶中的任一种在本公开内容中都可以是有用的。
SEQ ID NO：1-612提供了可以在本公开内容中利用的核酸内切酶的进一步实例。这些蛋白质可以在使用前进行修饰，或者可以在核酸序列例如DNA、RNA或mRNA中、或在载体构建体例如本文所教导的质粒或腺相关病毒(AAV)载体中进行编码。进一步地，它们可以进行密码子优化。
尽管命名法在本文中用于指示关于给定定点多肽的起源物种，但应理解，与起源物种中出现的序列相比，定点多肽和/或编码定点多肽的核酸可以进行修饰。例如，“SpCas9”指示所讨论的Cas9基因/蛋白质起源于化脓性链球菌，并且已例如通过添加NLS和/或密码子优化的执行进行修饰。例如，“SaCas9”指示所讨论的Cas9基因/蛋白质起源于金黄色葡萄球菌，并且已例如通过添加NLS和/或密码子优化的执行进行修饰。
基因组靶向核酸
本公开内容提供了基因组靶向核酸，其可以将相关多肽(例如定点多肽)的活性导向靶核酸内的特定靶序列。基因组靶向核酸可以是RNA。基因组靶向RNA在本文中称为“向导RNA”或“gRNA”。向导RNA可以至少包含与目的靶核酸序列杂交的间隔区序列和CRISPR重复序列。在II型系统中，gRNA还包含称为tracrRNA序列的第二RNA。在II型gRNA中，CRISPR重复序列和tracrRNA序列彼此杂交，以形成双链体。在V型gRNA中，crRNA形成双链体。在两个系统中，双链体均可以结合定点多肽，使得向导RNA和定点多肽形成复合物。由于其与定点多肽的结合，基因组靶向核酸可以为复合物提供靶特异性。因此，基因组靶向核酸可以指导定点多肽的活性。
示例性的向导RNA包括序列表的SEQ ID NO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328、5443和5446-5461中的间隔区序列(图2A-B、G和J)。靶DNA序列(5'-3')(参见SEQ IDNO：5329-5385、5444和5462-5477)可以在图2C-D、2H和2K中找到。sgRNA所结合的靶DNA序列的反向链(5'-3')可以在图2E-F、I和L中找到。
每个向导RNA可以被设计为包括与其基因组靶序列互补的间隔区序列。例如，序列表的SEQ ID NO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328、5443和5446-5461中的间隔区序列各自可以置于单个RNA嵌合体或crRNA(连同相应的tracrRNA一起)内。参见Jinek等人，Science，337，816-821(2012)和Deltcheva等人，Nature，471，602-607(2011)。
本文公开的gRNA或sgRNA可以与DNA核酸内切酶结合，以形成核糖核蛋白复合物，其可以引起USH2A基因中的IVS40突变内或附近的稳定编辑。由这种编辑造成的DNA序列中的变化(例如，编辑)可以是非瞬时的。
基因组靶向核酸可以是双分子向导RNA(图1A)。基因组靶向核酸可以是单分子向导RNA(图1B)。可以修饰双分子向导RNA或单分子向导RNA。
双分子向导RNA可以包含两条RNA链。第一链在5'至3'方向上包含任选的间隔区延伸序列、间隔区序列和最小CRISPR重复序列。第二链可以包含最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3' tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。
II型系统中的单分子向导RNA(sgRNA)可以在5'至3'方向上包含任选的间隔区延伸序列、间隔区序列、最小CRISPR重复序列、单分子向导接头、最小tracrRNA序列、3'tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。任选的tracrRNA延伸可以包含对向导RNA贡献另外的功能性(例如，稳定性)的元件。单分子向导接头可以连接最小的CRISPR重复和最小tracrRNA序列，以形成发夹结构。任选的tracrRNA延伸可以包含一个或多个发夹。
sgRNA可以包含在sgRNA序列(表2)的5'端处具有17-30个核苷酸的可变长度的间隔区序列。在其它实例中，sgRNA可以包含在sgRNA序列的5'端处具有17-24个核苷酸的可变长度的间隔区序列。
sgRNA可以包含在sgRNA序列的5’端处的20个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5’端处的少于20个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5’端处的19个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5’端处的18个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5’端处的17个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5’端处的多于20个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5’端处的21个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5’端处的22个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5’端处的23个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5’端处的24个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5’端处的25个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5’端处的26个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5’端处的27个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5’端处的28个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5’端处的29个核苷酸的间隔区序列。sgRNA可以包含在sgRNA序列的5’端处的30个核苷酸的间隔区序列。
sgRNA可以不包含在sgRNA序列的3’端处的尿嘧啶，例如在表2的SEQ ID NO：5268、5527、5530、5533或5536中。sgRNA可以包含在sgRNA序列的3’端处的一个或多个尿嘧啶，例如在表2中的SEQ ID NO：5267、5269、5526、5528、5529、5531、5532、5534、5535或5537中。例如，sgRNA可以包含在sgRNA序列的3’端处的1个尿嘧啶(U)。sgRNA可以包含在sgRNA序列的3’端处的2个尿嘧啶(UU)。sgRNA可以包含在sgRNA序列的3’端处的3个尿嘧啶(UUU)。sgRNA可以包含在sgRNA序列的3’端处的4个尿嘧啶(UUUU)。sgRNA可以包含在sgRNA序列的3’端处的5个尿嘧啶(UUUUU)。sgRNA可以包含在sgRNA序列的3’端处的6个尿嘧啶(UUUUUU)。sgRNA可以包含在sgRNA序列的3’端处的7个尿嘧啶(UUUUUUU)。sgRNA可以包含在sgRNA序列的3’端处的8个尿嘧啶(UUUUUUUU)。
sgRNA可以是未修饰的或修饰的。例如，修饰的sgRNA可以包含一个或多个2'-O-甲基硫代磷酸酯核苷酸。
表2
Figure 202557DEST_PATH_IMAGE002
V型系统中的单分子向导RNA(sgRNA)可以在5'至3'方向上包含最小CRISPR重复序列和间隔区序列。
作为举例说明，用于CRISPR/Cas/Cpf1系统中的向导RNA、或其它较小的RNA可以通过化学手段容易地合成，如下文所示和本领域中所述的。在化学合成程序不断扩展的同时，随着多核苷酸长度显著增加超过一百个左右的核苷酸，通过程序例如高效液相层析(HPLC，其避免使用凝胶如PAGE)纯化此类RNA趋于变得更具挑战性。用于生成更大长度的RNA的一种方法是产生连接在一起的两个或更多个分子。长得多的RNA例如编码Cas9或Cpf1核酸内切酶的那些，更容易酶促生成。如本领域所述，可以在RNA的化学合成和/或酶促生成期间或之后引入各种类型的RNA修饰，例如，增强稳定性、降低先天性免疫应答的可能性或程度、和/或增强其它属性的修饰。
间隔区扩展序列
在基因组靶向核酸的一些实例中，间隔区延伸序列可以修饰活性、提供稳定性和/或提供用于修饰基因组靶向核酸的位置。间隔区延伸序列可以修饰中靶或脱靶活性或特异性。在一些实例中，可以提供间隔区延伸序列。间隔区延伸序列可以具有多于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000或7000个或更多个核苷酸的长度。间隔区延伸序列可以具有少于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000个或更多个核苷酸的长度。间隔区延伸序列的长度可以少于10个核苷酸。间隔区延伸序列的长度可以在10-30个核苷酸之间。间隔区延伸序列的长度可以在30-70个核苷酸之间。
间隔区延伸序列可以包含另一个部分(例如，稳定性控制序列、核糖核酸内切酶结合序列、核酶)。该部分可以减少或增加核酸靶向核酸的稳定性。该部分可以是转录终止子区段(即，转录终止序列)。该部分可以在真核细胞中起作用。该部分可以在原核细胞中起作用。该部分可以在真核细胞和原核细胞两者中起作用。合适部分的非限制性实例包括：5'帽(例如7-甲基鸟苷酸帽(m7 G))、核糖开关序列(例如，以允许通过蛋白质和蛋白质复合物调节的稳定性和/或调节的可及性)、形成dsRNA双链体的序列(即，发夹)、将RNA靶向亚细胞位置(例如，核、线粒体、叶绿体等等)的序列、提供用于跟踪的修饰或序列(例如，与荧光分子的直接缀合、与促进荧光检测的部分的缀合、允许荧光检测的序列等)、和/或提供用于蛋白质(例如，作用于DNA的蛋白质，包括转录激活子、转录阻遏物、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰基酶等等)的结合位点的修饰或序列。
间隔区序列
间隔区序列与目的靶核酸中的序列杂交。基因组靶向核酸的间隔区可以经由杂交(即，碱基配对)，以序列特异性的方式与靶核酸相互作用。间隔区的核苷酸序列可以根据目的靶核酸的序列而变。
在本文的CRISPR/Cas系统中，间隔区序列可以设计为与位于系统中使用的Cas9酶的PAM的5'的靶核酸杂交。间隔区可以与靶序列完全匹配或可以具有错配。每种Cas9酶具有其在靶DNA中识别的特定PAM序列。例如，化脓性链球菌在靶核酸中识别包含序列5'-NRG-3'的PAM，其中R包含A或G，其中N是任何核苷酸并且N紧邻由间隔区序列靶向的靶核酸序列的3'。例如，金黄色葡萄球菌Cas9在靶核酸中识别包含序列5'-NNGRRT-3'的PAM，其中R包含A或G，其中N是任何核苷酸并且N紧邻由间隔区序列靶向的靶核酸序列的3'。在某些实例中，金黄色葡萄球菌Cas9在靶核酸中识别包含序列5'-NNGRRN-3'的PAM，其中R包含A或G，其中N是任何核苷酸并且N紧邻由间隔区序列靶向的靶核酸序列的3'。例如，空肠弯曲杆菌(C. jejuni)在靶核酸中识别包含序列5'-NNNNACA-3'或5'-NNNNACAC-3'的PAM，其中N是任何核苷酸并且N紧邻由间隔区序列靶向的靶核酸序列的3'。在某些实例中，空肠弯曲杆菌Cas9在靶核酸中识别包含序列5'-NNNVRYM-3'或5'-NNVRYAC-3'的PAM，其中V包含A、G或C，其中R包含A或G，其中Y包含C或T，其中M包含A或C，其中N是任何核苷酸并且N紧邻由间隔区序列靶向的靶核酸序列的3'。
靶核酸序列可以包含20个核苷酸。靶核酸可以包含少于20个核苷酸。靶核酸可以包含多于20个核苷酸。靶核酸可以包含至少：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。靶核酸可以包含至多：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。靶核酸序列可以包含紧邻PAM的第一个核苷酸的5'的20个碱基。例如，在包含5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3'(SEQ ID NO：5270)的序列中，靶核酸可以包含对应于Ns的序列，其中N是任何核苷酸，并且加下划线的NRG序列是化脓性链球菌PAM。
与靶核酸杂交的间隔区序列可以具有至少约6个核苷酸(nt)的长度。间隔区序列可以是至少约6 nt、至少约10 nt、至少约15 nt、至少约18 nt、至少约19 nt、至少约20 nt、至少约25 nt、至少约30 nt、至少约35 nt或至少约40 nt、约6 nt至约80 nt、约6 nt至约50nt、约6 nt至约45 nt、约6 nt至约40 nt、约6 nt至约35 nt、约6 nt至约30 nt、约6 nt至约25 nt、约6 nt至约20 nt、约6 nt至约19 nt、约10 nt至约50 nt、约10 nt至约45 nt、约10nt至约40 nt、约10 nt至约35 nt、约10 nt至约30 nt、约10 nt至约25 nt、约10 nt至约20nt、约10 nt至约19 nt、约19 nt至约25 nt、约19 nt至约30 nt、约19 nt至约35 nt、约19nt至约40 nt、约19 nt至约45 nt、约19 nt至约50 nt、约19 nt至约60 nt、约20 nt至约25nt、约20 nt至约30 nt、约20 nt至约35 nt、约20 nt至约40 nt、约20 nt至约45 nt、约20nt至约50 nt、或约20 nt至约60 nt。在一些实例中，间隔区序列可以包含24个核苷酸。在一些实例中，间隔区序列可以包含23个核苷酸。在一些实例中，间隔区序列可以包含22个核苷酸。在一些实例中，间隔区序列可以包含21个核苷酸。在一些实例中，间隔区序列可以包含20个核苷酸。在一些实例中，间隔区序列可以包含19个核苷酸。在一些实例中，间隔区序列可以包含18个核苷酸。在一些实例中，间隔区序列可以包含17个核苷酸。
在一些实例中，间隔区序列与靶核酸之间的互补性百分比为至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或100%。在一些实例中，间隔区序列与靶核酸之间的互补性百分比为至多约30%、至多约40%、至多约50%、至多约60%、至多约65%、至多约70%、至多约75%、至多约80%、至多约85%、至多约90%、至多约95%、至多约97%、至多约98%、至多约99%或100%。在一些实例中，间隔区序列与靶核酸之间的互补性百分比在靶核酸的互补链的靶序列的六个邻接的最5'核苷酸上为100%。间隔区序列与靶核酸之间的互补性百分比在约20个邻接核苷酸上可以为至少60%。间隔区序列和靶核酸的长度可以相差1至6个核苷酸，其可以被视为一个或多个凸起。
间隔区序列可以使用计算机程序进行设计或选择。计算机程序可以使用变量，例如预测的解链温度、二级结构形成、预测的退火温度、序列同一性、基因组背景、染色质可及性、% GC、基因组出现频率(例如，等同或相似，但由于错配、插入或缺失而在一个或多个点中变化的序列)、甲基化状态、SNP的存在等等。
最小CRISPR重复序列
最小CRISPR重复序列可以是这样的序列，其与参考CRISPR重复序列(例如，来自化脓性链球菌的crRNA)具有至少约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%的序列同一性。
最小CRISPR重复序列可以包含可以与细胞中的最小tracrRNA序列杂交的核苷酸。最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列可以形成双链体，即碱基配对的双链结构。共同地，最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列可以结合定点多肽。最小CRISPR重复序列的至少一部分可以与最小tracrRNA序列杂交。最小CRISPR重复序列的至少一部分可以包含与最小tracrRNA序列至少约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%的互补性。最小CRISPR重复序列的至少一部分可以包含与最小tracrRNA序列至多约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%的互补性。
最小CRISPR重复序列可以具有约7个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，最小CRISPR重复序列的长度为约7个核苷酸(nt)至约50 nt、约7 nt至约40 nt、约7 nt至约30nt、约7 nt至约25 nt、约7 nt至约20 nt、约7 nt至约15 nt、约8 nt至约40 nt、约8 nt至约30 nt、约8 nt至约25 nt、约8 nt至约20 nt、约8 nt至约15 nt、约15 nt至约100 nt、约15nt至约80 nt、约15 nt至约50 nt、约15 nt 至约40 nt、约15 nt至约30 nt、或约15 nt至约25 nt。在一些实例中，最小CRISPR重复序列的长度可以是大约9个核苷酸。最小CRISPR重复序列的长度可以是大约12个核苷酸。
最小CRISPR重复序列可以在至少6、7或8个邻接核苷酸的段上，与参考的最小CRISPR重复序列(例如，来自化脓性链球菌的野生型crRNA)至少约60%等同。例如，最小CRISPR重复序列可以在至少6、7或8个邻接核苷酸的段上，与参考的最小CRISPR重复序列至少约65%等同、至少约70%等同、至少约75%等同、至少约80%等同、至少约85%等同、至少约90%等同、至少约95%等同、至少约98%等同、至少约99%等同或100%等同。
最小tracrRNA序列
最小tracrRNA序列可以是这样的序列，其与参考tracrRNA序列(例如，来自化脓性链球菌的野生型tracrRNA)具有至少约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%的序列同一性。
最小tracrRNA序列可以包含与细胞中的最小CRISPR重复序列杂交的核苷酸。最小tracrRNA序列和最小CRISPR重复序列形成双链体，即碱基配对的双链结构。共同地，最小tracrRNA序列和最小CRISPR重复可以结合定点多肽。最小tracrRNA序列的至少一部分可以与最小CRISPR重复序列杂交。最小tracrRNA序列可以与最小CRISPR重复序列至少约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%互补。
最小tracrRNA序列可以具有约7个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，最小tracrRNA序列可以长约7个核苷酸(nt)至约50 nt、约7 nt至约40 nt、约7 nt至约30 nt、约7 nt至约25 nt、约7 nt至约20 nt、约7 nt至约15 nt、约8 nt至约40 nt、约8 nt至约30nt、约8 nt至约25 nt、约8 nt至约20 nt、约8 nt至约15 nt、约15 nt至约100 nt、约15 nt至约80 nt、约15 nt至约50 nt、约15 nt 至约40 nt、约15 nt至约30 nt、或约15 nt至约25nt。最小tracrRNA序列的长度可以是大约9个核苷酸。最小tracrRNA序列的长度可以是大约12个核苷酸。最小tracrRNA可以由在Jinek等人，同上中所述的tracrRNA nt 23-48组成。
最小tracrRNA序列可以在至少6、7或8个邻接核苷酸的段上，与参考的最小tracrRNA(例如，来自化脓性链球菌的野生型tracrRNA)序列至少约60%等同。例如，最小tracrRNA序列可以在至少6、7或8个邻接核苷酸的段上，与参考的最小tracrRNA序列至少约65%等同、约70%等同、约75%等同、约80%等同、约85%等同、约90%等同、约95%等同、约98%等同、约99%等同或100%等同。
最小CRISPR RNA和最小tracrRNA之间的双链体可以包含双螺旋。最小CRISPR RNA和最小tracrRNA之间的双链体可以包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。最小CRISPR RNA和最小tracrRNA之间的双链体可以包含至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。
双链体可以包含错配(即，双链体的两条链并非100%互补的)。双链体可以包含至少约1、2、3、4或5个或错配。双链体可以包含至多约1、2、3、4或5个或错配。双链体可以包含不多于2个错配。
凸起
在一些情况下，最小CRISPR RNA和最小tracrRNA之间的双链体中可能存在“凸起”。凸起是双链体中核苷酸的未配对区域。凸起可以促成双链体与定点多肽的结合。凸起可以在双链体的一侧上包含未配对的5'-XXXY-3'，其中X是任何嘌呤，并且Y包含可以与相反链上的核苷酸形成摆动对的核苷酸，以及在双链体的另一侧上的未配对的核苷酸区域。双链体的两侧上的未配对核苷酸数目可以是不同的。
在一个实例中，凸起可以包含在该凸起的最小CRISPR重复链上的未配对嘌呤(例如腺嘌呤)。在一些实例中，凸起可以包含该凸起的最小tracrRNA序列链的未配对的5'-AAGY-3'，其中Y包含可以与最小CRISPR重复链上的核苷酸形成摆动配对的核苷酸。
双链体的最小CRISPR重复侧上的凸起可以包含至少1、2、3、4或5个或更多个未配对的核苷酸。双链体的最小CRISPR重复侧上的凸起可以包含至多1、2、3、4或5个或更多个未配对的核苷酸。双链体的最小CRISPR重复侧上的凸起可以包含1个未配对的核苷酸。
双链体的最小tracrRNA序列侧上的凸起可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个未配对的核苷酸。双链体的最小tracrRNA序列侧上的凸起可以包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个未配对的核苷酸。双链体第二侧(例如，双链体的最小tracrRNA序列侧)上的凸起可以包含4个未配对的核苷酸。
凸起可以包含至少一个摆动配对。在一些实例中，凸起可以包含至多一个摆动配对。凸起可以包含至少一个嘌呤核苷酸。凸起可以包含至少3个嘌呤核苷酸。凸起序列可以包含至少5个嘌呤核苷酸。凸起序列可以包含至少一个鸟嘌呤核苷酸。在一些实例中，凸起序列可以包含至少一个腺嘌呤核苷酸。
发夹
在各种实例中，一个或多个发夹可以位于3' tracrRNA序列中的最小tracrRNA的3'。
发夹可以从最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列双链体的最后一个配对的核苷酸3'开始至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个核苷酸。发夹可以从最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列双链体的最后一个配对的核苷酸3'开始至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。
发夹可以包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20或更多个连续的核苷酸。发夹可以包含至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或更多个连续的核苷酸。
发夹可以包含CC二核苷酸(即，两个连续的胞嘧啶核苷酸)。
发夹可以包含双链体核苷酸(例如，发夹中杂交在一起的核苷酸)。例如，发夹可以包含在3' tracrRNA序列的发夹双链体中与GG二核苷酸杂交的CC二核苷酸。
一个或多个发夹可以与定点多肽的向导RNA相互作用区域相互作用。
在一些实例中，存在两个或更多个发夹，并且在其它实例中，存在三个或更多个发夹。
3' tracrRNA序列
3' tracrRNA序列可以包含这样的序列，其与参考tracrRNA序列(例如，来自化脓性链球菌的tracrRNA)具有至少约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或100%的序列同一性。
3' tracrRNA序列可以具有约6个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，3’tracrRNA序列可以具有约6个核苷酸(nt)至约50 nt、约6 nt至约40 nt、约6 nt至约30 nt、约6 nt至约25 nt、约6 nt至约20 nt、约6 nt至约15 nt、约8 nt至约40 nt、约8 nt至约30nt、约8 nt至约25 nt、约8 nt至约20 nt、约8 nt至约15 nt、约15 nt至约100 nt、约15 nt至约80 nt、约15 nt至约50 nt、约15 nt 至约40 nt、约15 nt至约30 nt、或约15 nt至约25nt的长度。3' tracrRNA序列可以具有大约14个核苷酸的长度。
3' tracrRNA序列可以在至少6、7或8个邻接核苷酸的段上，与参考的3’ tracrRNA序列(例如，来自化脓性链球菌的野生型3’ tracrRNA序列)至少约60%等同。例如，3’tracrRNA序列可以在至少6、7或8个邻接核苷酸的段上，与参考的3’ tracrRNA序列(例如，来自化脓性链球菌的野生型3’ tracrRNA序列)至少约60%等同、约65%等同、约70%等同、约75%等同、约80%等同、约85%等同、约90%等同、约95%等同、约98%等同、约99%等同或100%等同。
3' tracrRNA序列可以包含多于一个双链体区域(例如，发夹、杂交区域)。3'tracrRNA序列可以包含两个双链体区域。
3' tracrRNA序列可以包含茎环结构。3' tracrRNA中的茎环结构可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个或更多个核苷酸。3’ tracrRNA中的茎环结构可以包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。茎环结构可以包含功能部分。例如，茎环结构可以包含适体、核酶、蛋白质相互作用发夹、CRISPR阵列、内含子或外显子。茎环结构可以包含至少约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。茎环结构可以包含至多约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。
3' tracrRNA序列中的发夹可以包含P结构域。在一些实例中，P结构域可以包含在发夹中的双链区域。
tracrRNA延伸序列
无论tracrRNA是在单分子向导还是双分子向导的背景下，都可以提供tracrRNA延伸序列。tracrRNA延伸序列可以具有约1个核苷酸至约400个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有多于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380或400个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有约20至约5000个或更多个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有多于1000个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有少于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400个或更多个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以具有少于1000个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列可以包含少于10个核苷酸的长度。tracrRNA延伸序列的长度可以为10-30个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以为30-70个核苷酸。
tracrRNA延伸序列可以包含功能部分(例如，稳定性控制序列、核酶、核糖核酸内切酶结合序列)。功能部分可以包含转录终止子区段(即，转录终止序列)。功能部分可以具有约10个核苷酸(nt)至约100个核苷酸、约10 nt至约20 nt、约20 nt至约30 nt、约30 nt至约40 nt、约40 nt至约50 nt、约50 nt至约60 nt、约60 nt至约70 nt、约70 nt至约80 nt、约80 nt至约90 nt、或约90 nt至约100 nt、约15 nt至约80 nt、约15 nt至约50 nt、约15nt至约40 nt、约15 nt至约30 nt、或约15 nt至约25 nt的总长度。该功能部分可以在真核细胞中起作用。该功能部分可以在原核细胞中起作用。该功能部分可以在真核细胞和原核细胞两者中起作用。
合适的tracrRNA延伸功能部分的非限制性实例包括3'聚腺苷酸化尾、核糖开关序列(例如，以允许通过蛋白质和蛋白质复合物调节的稳定性和/或调节的可及性)、形成dsRNA双链体的序列(即，发夹)、将RNA靶向亚细胞位置(例如，核、线粒体、叶绿体等等)的序列、提供用于跟踪的修饰或序列(例如，与荧光分子的直接缀合、与促进荧光检测的部分的缀合、允许荧光检测的序列等)、和/或提供用于蛋白质(例如，作用于DNA的蛋白质，包括转录激活子、转录阻遏物、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰基酶等等)的结合位点的修饰或序列。tracrRNA延伸序列可以包含引物结合位点或分子索引(例如条形码序列)。tracrRNA延伸序列可以包含一个或多个亲和标签。
单分子向导接头序列
单分子向导核酸的接头序列可以具有约3个核苷酸至约100个核苷酸的长度。在Jinek等人，同上中，例如，使用简单的4个核苷酸的“四环”(-GAAA-)，Science，337(6096):816-821(2012)。示例性的接头具有约3个核苷酸(nt)至约90 nt、约3 nt至约80 nt、约3 nt至约70 nt、约3 nt至约60 nt、约3 nt至约50 nt、约3 nt至约40 nt、约3 nt至约30 nt、约3 nt至约20 nt、约3 nt至约10 nt的长度。例如，接头可以具有约3 nt至约5 nt、约5 nt至约10nt、约10 nt至约15 nt、约15 nt至约20 nt、约20 nt至约25 nt、约25 nt至约30 nt、约30nt至约35 nt、约35 nt至约40 nt、约40 nt至约50 nt、约50 nt至约60 nt、约60 nt至约70nt、约70 nt至约80 nt、约80 nt至约90 nt、或约90 nt至约100 nt的长度。单分子向导核酸的接头可以在4至40个核苷酸之间。接头可以是至少约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000个或更多个核苷酸。接头可以是至多约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000个或更多个核苷酸。
接头可以包含各种序列中的任一种，尽管在一些实例中，接头不包含与向导RNA的其它部分具有广泛同源性区域的序列，其可能引起可以干扰向导的其它功能区域的分子内结合。在Jinek等人，同上中，使用简单的4个核苷酸序列-GAAA-，Science，337(6096):816-821(2012)，但同样可以使用众多其它序列，包括更长的序列。
接头序列可以包含功能部分。例如，接头序列可以包含一个或多个特点，包括适体、核酶、蛋白质相互作用发夹、蛋白质结合位点、CRISPR阵列、内含子或外显子。接头序列可以包含至少约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。在一些实例中，接头序列可以包含至多约1、2、3、4或5个或更多个功能部分。
基因组靶向核酸和定点多肽的复合物
基因组靶向核酸与定点多肽(例如核酸指导的核酸酶，例如Cas9)相互作用，从而形成复合物。基因组靶向核酸将定点多肽导向靶核酸。
核糖核蛋白复合物(RNP)
定点多肽和基因组靶向核酸可以各自分开施用于细胞或患者。另一方面，定点多肽可以与一种或多种向导RNA、或者一种或多种crRNA连同tracrRNA一起预复合。定点多肽可以与一种或多种sgRNA预复合。然后可以将预复合材料施用于细胞或患者。此类预复合材料被称为核糖核蛋白颗粒(RNP)。RNP中的定点多肽可以是例如Cas9核酸内切酶或Cpf1核酸内切酶。定点多肽可以通过一个或多个核定位信号(NLS)，在N末端、C末端或N末端和C末端两者处侧接。例如，Cas9核酸内切酶可以由两个NLS侧接，一个NLS位于N末端处，而第二NLS位于C末端处。NLS可以是本领域已知的任何NLS，例如SV40 NLS。RNP中的基因组靶向核酸与定点多肽的重量比可以为1：1。例如，RNP中的sgRNA与Cas9核酸内切酶的重量比可以为1：1。
靶序列选择
5'边界和/或3'边界相对于特定参考基因座的位置中的移动可以用于促进或增强基因编辑的特定应用，其部分取决于选择用于编辑的核酸内切酶系统，如本文进一步描述且示出的。
在此类靶序列选择的第一个非限制性实例中，许多核酸内切酶系统具有可以指导用于切割的潜在靶位点的初始选择的规则或标准，例如在CRISPR II型或V型核酸内切酶的情况下，在与DNA切割位点相邻的特定位置中的PAM序列基序的要求。
在靶序列选择或优化的另一个非限制性实例中，关于靶序列和基因编辑核酸内切酶的特定组合的脱靶活性的频率，可以相对于中靶活性的频率进行评价。在一些情况下，相对于其它细胞，已在所需基因座处正确编辑的细胞具有选择优势。选择优势的说明性但非限制性实例包括属性的获得，所述属性例如增强比率的复制、持久性、对某些条件的抗性、在引入患者内之后增强比率的成功植入物植入或体内持久性、以及与此类细胞的维持或增加数目或生存力相关的其它属性。在其它情况下，可以通过用于鉴定、分类或以其它方式选择已正确编辑的细胞的一种或多种筛选方法，积极地选择已在所需基因座处正确编辑的细胞。选择优势和定向选择方法两者均可以利用与校正相关的表型。在一些情况下，细胞可以进行两次或更多次编辑，以便产生第二修饰，其产生用于选择或纯化预期细胞群体的新表型。可以通过添加用于可选择或可筛选标记物的第二gRNA，来产生此类第二修饰。在一些情况下，可以使用含有cDNA以及可选择标记物的DNA片段，在所需基因座处正确地编辑细胞。
无论在特定情况下是应用任何选择优势还是应用任何定向选择，还可以通过考虑脱靶频率来指导靶序列选择，以便增强应用的有效性和/或降低在除所需靶外的位点处的不希望有的改变的可能性。如本文和本领域中进一步描述且示出的，脱靶活性的发生可以受多种因素影响，所述因素包括靶位点与各种脱靶位点之间的相似性和相异性、以及所使用的特定核酸内切酶。帮助预测脱靶活性的生物信息学工具是可获得的，并且经常可以使用此类工具来鉴定脱靶活性的最可能位点，其然后可以在实验设置中进行评价，以评估脱靶活性与中靶活性的相对频率，从而允许选择具有较高相对中靶活性的序列。本文提供了此类技术的说明性实例，并且其它技术是本领域已知的。
本公开内容的gRNA可以指导在其中需要编辑的遗传基因座(例如，USH2A基因的突变等位基因)处的编辑。如本文使用的，“中靶编辑”、“中靶活性”或“中靶切割”意指在其中需要编辑的遗传基因座处的编辑。当gRNA指导在IVS40突变内或附近的相应突变等位基因的编辑时，本文公开的gRNA可以具有中靶活性。
本公开内容的gRNA也可以指导在其中不需要编辑的遗传基因座处的编辑。如本文使用的，“脱靶编辑”、“脱靶活性”或“脱靶切割”意指在其中不需要编辑的遗传基因座处的编辑。
脱靶编辑可以是USH2A基因的野生型等位基因的编辑。在本文中，此类脱靶编辑称为“野生型脱靶编辑”、“野生型脱靶活性”或“野生型脱靶切割”。当gRNA指导野生型USH2A等位基因的编辑时，本文公开的gRNA可以具有野生型脱靶活性。
脱靶编辑可以是第二基因或基因座的编辑(例如，并非USH2A基因的序列或USH2A基因的调节序列的基因组序列的编辑)。在本文中，此类脱靶编辑称为“基因组脱靶编辑”、“基因组脱靶活性”或“基因组脱靶切割”。当gRNA指导并非USH2A基因的序列或USH2A基因的调节序列的基因组序列的编辑时，本文公开的gRNA具有基因组脱靶活性。
在一些实例中，gRNA的野生型脱靶活性可以是“最低限度的”。具有最低限度的野生型脱靶活性的gRNA可以使用本领域已知的方法来确定，所述方法例如基于在计算机芯片上(in silico)的分析的方法、体外方法、或确定由gRNA引起的野生型脱靶编辑量的体内方法。具有最低限度的野生型脱靶活性的gRNA可以在30%或更少的细胞，例如25%或更少的细胞、20%或更少的细胞、15%或更少的细胞 10%或更少的细胞、5%或更少的细胞、4%或更少的细胞、3%或更少的细胞、2%或更少的细胞、1%或更少的细胞、0.5%或更少的细胞、0.25%或更少的细胞、或者0.1%或更少的细胞中引起脱靶编辑。在一些情况下，可以使用体外系统来确定此类确定。
在一些实例中，gRNA的基因组脱靶活性可以是“最低限度的”。具有最低限度的基因组脱靶活性的gRNA可以基于在计算机芯片上的分析、体外方法、或确定由gRNA引起的基因组脱靶编辑量的体内方法来确定。具有最低限度的基因组脱靶活性的gRNA可以在30%或更少的细胞，例如25%或更少的细胞、20%或更少的细胞、15%或更少的细胞 10%或更少的细胞、5%或更少的细胞、4%或更少的细胞、3%或更少的细胞、2%或更少的细胞、1%或更少的细胞、0.5%或更少的细胞、0.25%或更少的细胞、或者0.1%或更少的细胞中引起基因组脱靶编辑的至少一种情况。在一些情况下，可以使用体外系统来确定此类确定。
靶序列选择的另一个方面涉及同源重组事件。共享同源性区域的序列可以充当导致间插序列缺失的同源重组事件的焦点。此类重组事件在染色体及其它DNA序列的正常复制过程期间，以及在合成DNA序列时的其它时间发生，例如在双链断裂(DSB)修复的情况下，其在正常细胞复制周期过程中定期地发生，但也可以通过各种事件(例如UV光和DNA断裂的其它诱导剂)的发生或某些试剂(例如各种化学诱导剂)的存在得到增强。许多此类诱导剂促使DSB在基因组中无差别地发生，并且DSB可以在正常细胞中被定期诱导且修复。在修复过程中，原始序列可以伴随完全保真性重构，然而，在一些情况下，在DSB位点处引入小的插入或缺失(称为“插入缺失”)。
如在本文中描述的核酸内切酶系统的情况下，也可以在特定位置处特异性地诱导DSB，其可以用于在选择的染色体位置处引起定向的或优先的基因修饰事件。在DNA修复(以及复制)的背景下，同源序列经受重组的趋势可以在许多情况下利用，并且是基因编辑系统如CRISPR的一种应用的基础，其中同源定向修复用于将通过使用“供体”多核苷酸提供的目的序列插入所需的染色体位置内。
特定序列之间的同源性区域，其可以是可以包含少至十个碱基对或更少的“微观同源性”的小区域，也可以用于造成所需缺失。例如，单个DSB可以在与附近序列显示出微观同源性的位点处引入。在此类DSB的正常修复过程期间，由于通过DSB和伴随的细胞修复过程促进的重组，以高频率发生的结果是间插序列的缺失。
然而，在一些情况下，在同源性区域内选择靶序列也可以引起大得多的缺失，包括基因融合(当缺失在编码区中时)，鉴于特定情况，其可能是或不是期望的。
本文提供的实例进一步示出了用于产生DSB的各种靶区域的选择，所述DSB被设计为诱导导致usherin蛋白功能的恢复的替换，以及在此类区域内设计为相对于中靶事件，使脱靶事件最小化的特异性靶序列的选择。
同源定向修复(HDR)/供体核苷酸
同源定向修复是用于修复双链断裂(DSB)的细胞机制。最常见的形式是同源重组。存在HDR的另外途径，包括单链退火和替代HDR。基因组改造工具允许研究人员操纵细胞同源重组途径，以对基因组产生位点特异性修饰。已发现，使用反式提供的合成供体分子，细胞可以修复双链断裂。因此，通过在特异性突变附近引入双链断裂并提供合适的供体，可以在基因组中制备靶向变化。特异性切割使HDR比率增加超过接受单独的同源供体的106个细胞中1个的比率多于1,000倍。在特定核苷酸处的HDR比率是与切割位点的距离的函数，因此选择重叠或最近的靶位点很重要。基因编辑提供了超过基因添加的优点，因为原位校正使基因组的剩余部分不受干扰。
用于通过HDR编辑的供应供体显著不同，但可以含有具有小或大侧翼同源臂的预期序列，以允许对基因组DNA的退火。侧接引入的遗传变化的同源性区域可以为30 bp或更小，或者大至可以含有启动子、cDNA等的多千碱基盒。单链和双链寡核苷酸供体两者均已得到使用。这些寡核苷酸的大小范围为小于100 nt至超过许多kb，尽管还可以生成且使用更长的ssDNA。可以使用双链供体，包括PCR扩增子、质粒和小环。一般而言，已发现，尽管关于个别供体的包装限度<5kb，但AAV载体可以是递送供体模板的非常有效的手段。供体的活性转录使HDR增加了三倍，指示启动子的包括可能增加转换。相反地，供体的CpG甲基化减少基因表达和HDR。
用于校正突变的供体核苷酸经常很小(< 300 bp)。这是有利的，因为HDR效率可能与供体分子的大小反相关。另外，预计供体模板可以适合大小受限的AAV分子，其已显示是供体模板递送的有效手段。
除野生型核酸内切酶，例如Cas9之外，还存在切口酶变体，其具有失活的一个或另一个核酸酶结构域，导致仅切割一条DNA链。可以由个别Cas切口酶或使用侧接靶区域的成对切口酶来指导HDR。供体可以是单链的、有切口的或dsDNA。
供体DNA可以提供有核酸酶或独立地通过各种不同的方法来提供，所述方法例如通过转染、纳米颗粒、显微注射或病毒转导。已提议了一系列栓系选项，以增加供体对于HDR的可用性。实例包括将供体附着至核酸酶，附着至附近结合的DNA结合蛋白，或者附着至涉及DNA端结合或修复的蛋白质。
修复途径选择可以通过多种培养条件，例如影响细胞周期的那些条件来指导，或通过靶向DNA修复和相关蛋白来指导。例如，为了增加HDR，可以压制关键的NHEJ分子，例如KU70、KU80或DNA连接酶IV。
如果不存在供体，可以使用几种非同源修复途径，来连接来自DNA断裂的端部或来自不同断裂的端部，其中DNA端部在连接处具有很少的碱基配对或没有碱基配对而连接。除规范的NHEJ之外，存在类似的修复机制，例如ANHEJ。如果存在两个断裂，则间插区段可以缺失或倒转。NHEJ修复途径可以导致在连接处的插入、缺失或突变。
NHEJ用于在核酸酶切割后，将15-kb的可诱导基因表达盒插入人细胞系中的限定基因座内。大型可诱导基因表达盒的插入方法已得到描述[Maresca，M.，Lin，V.G.，Guo，N.& Yang，Y.，Genome Res 23，539-546(2013)，Suzuki等人Nature，540，144-149(2016)]。
除通过NHEJ或HDR的基因组编辑之外，已进行了使用NHEJ途径和HDR两者的位点特异性基因插入。组合方法可以适用于某些设置中，可能包括内含子/外显子边界。NHEJ可能证明对于内含子中的连接有效，而无错误的HDR可能更适合编码区域中。
USH2A基因内的示例性修饰包括在上文提及的突变内或附近(接近)的替换，例如在特异性突变上游或下游的小于3 kb、小于2kb、小于1 kb、小于0.5 kb的区域内。考虑到USH2A基因中突变的相对广泛的变化，应了解，上文提及的替换的许多变化(包括但不限于较大和较小的缺失)，预计导致usherin蛋白功能的恢复。
此类变体可以包括在5'和/或3'方向上比所讨论的特异性突变更大，或在任一方向上更小的替换。相应地，关于特异性替换的“附近”或“接近”，预期与所需替换边界(在本文中也称为端点)相关的SSB或DSB基因座可以在距参考基因座，例如突变位点小于约3 kb的区域内。SSB或DSB基因座可以更接近，并且在2 kb内、在1 kb内、在0.5 kb内、或在0.1 kb内。在小替换的情况下，所需终点可以在参考基因座处或“邻近”参考基因座，这预期终点可以在距参考基因座100 bp内、50 bp内、25 bp内、或小于约10 bp至5 bp。
较大或较小的替换可以提供相同的益处，只要恢复usherin蛋白功能。因此，预计本文描述且示出的替换的许多变化可以有效用于改善2A型乌谢尔综合征。
关于SSB或DSB的术语“附近”或“接近”指SSB或DSB在IVS40突变的2 kb内、1 kb内、0.5 kb内、0.25 kb内、0.2 kb内、0.1 kb内、50 bp内、25 bp内、20 bp内、15 bp内、10 bp内、5 bp内。SSB或DSB基因座也可以在内含子40的2 kb内、1 kb内、0.5 kb内、0.25 kb内、0.2kb内、或0.1 kb内、50 bp内、25 bp内、20 bp内、15 bp内、10 bp内、5 bp内。
核酸修饰(化学和结构修饰)
在一些情况下，引入细胞内的多核苷酸可以包含一种或多种修饰，其可以个别地或组合使用，例如，以增强活性、稳定性或特异性，改变递送，降低宿主细胞中的先天性免疫应答，或用于其它增强，如本文进一步描述和本领域已知的。
在某些实例中，修饰的多核苷酸可以用于CRISPR/Cas9/Cpf1系统，在所述情况下，可以修饰引入细胞内的向导RNA(单分子向导或双分子向导)、和/或编码Cas或Cpf1核酸内切酶的DNA或RNA，如下文描述且示出的。此类修饰的多核苷酸可以用于CRISPR/Cas9/Cpf1系统中，以编辑任何一个或多个基因组基因座。
使用CRISPR/Cas9/Cpf1系统用于此类用途的非限制性说明的目的，可以使用向导RNA的修饰，以增强CRISPR/Cas9/Cpf1基因组编辑复合物的形成或稳定性，所述复合物包含可以是单分子向导或双分子的向导RNA、以及Cas或Cpf1核酸内切酶。向导RNA的修饰也可以或可替代地用于增强基因组编辑复合物与基因组中的靶序列之间的相互作用的起始、稳定性或动力学，这可以例如用于增强中靶活性。向导RNA的修饰也可以或可替代地用于增强特异性，例如与在其它(脱靶)位点处的效应相比，在中靶位点处的基因组编辑的相对比率。
例如通过增加其对细胞中存在的核糖核酸酶(RNA酶)的降解的抗性，修饰也可以或可替代地用于增加向导RNA的稳定性，从而引起其在细胞中的半衰期增加。增强向导RNA半衰期的修饰在这样的方面可以是特别有用的，其中经由需要翻译以便生成核酸内切酶的RNA，将Cas或Cpf1核酸内切酶引入待编辑的细胞内，因为与编码核酸内切酶的RNA同时引入的向导RNA的半衰期增加，可以用于增加向导RNA与编码的Cas或Cpf1核酸内切酶在细胞中共存的时间。
修饰也可以或可替代地用于减少引入细胞内的RNA引发先天性免疫应答的可能性或程度。如下文和本领域中所述的，已在RNA干扰(RNAi)包括小干扰RNA(siRNA)的背景下充分表征的此类应答，趋于与RNA的半衰期降低和/或细胞因子或与免疫应答相关的其它因子的引发相关。
还可以对引入细胞内的编码核酸内切酶的RNA制备一种或多种类型的修饰，包括但不限于增强RNA的稳定性的修饰(例如增加其通过细胞中存在的RNA酶的降解)，增强所得到的产物(即核酸内切酶)的翻译的修饰，和/或减少引入细胞内的RNA引发先天性免疫应答的可能性或程度的修饰。
同样可以使用如前述及其它修饰的组合。例如，在CRISPR/Cas9/Cpf1的情况下，可以对向导RNA制备一种或多种类型的修饰(包括上文例示的那些)，和/或可以对编码Cas核酸内切酶的RNA制备一种或多种类型的修饰(包括上文例示的那些)。
作为举例说明，用于CRISPR/Cas9/Cpf1系统中的向导RNA、或其它较小的RNA可以通过化学手段容易地合成，使得许多修饰能够容易地掺入，如下文所示和本领域中所述的。在化学合成程序不断扩展的同时，随着多核苷酸长度显著增加超过一百个左右的核苷酸，通过程序例如高效液相层析(HPLC，其避免使用凝胶如PAGE)纯化此类RNA趋于变得更具挑战性。可以用于生成更大长度的化学修饰的RNA的一种方法是产生连接在一起的两个或更多个分子。长得多的RNA例如编码Cas9核酸内切酶的那些，更容易酶促生成。尽管更少类型的修饰可用于酶促产生的RNA中，但仍存在可以用于例如增强稳定性、降低先天性免疫应答的可能性或程度、和/或增强其它属性的修饰，如下文和本领域中进一步描述的；并且新类型的修饰经常处于开发中。
作为各种类型的修饰，特别是频繁与较小的化学合成的RNA一起使用的那些修饰的举例说明，修饰可以包含在糖的2'位置处修饰的一个或多个核苷酸，在一些方面，2'-O-烷基、2'-O-烷基-O-烷基、或2'-氟修饰的核苷酸。在一些实例中，RNA修饰可以包含在RNA的3'端处的嘧啶、无碱基残基或倒转碱基的核糖上的2'-氟、2'-氨基或2'-O-甲基修饰。此类修饰可以常规地掺入寡核苷酸内，并且这些寡核苷酸已显示具有针对给定靶比2'-脱氧寡核苷酸更高的Tm(即，更高的靶结合亲和力)。
许多核苷酸和核苷修饰已显示使得它们掺入其内的寡核苷酸比天然寡核苷酸对核酸酶消化更具抗性；这些修饰的寡核苷酸比未修饰的寡核苷酸完整地存活更长的时间。修饰寡核苷酸的具体实例包括包含修饰主链的那些寡核苷酸，所述修饰主链例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键合或短链杂原子或杂环糖间键合。一些寡核苷酸是具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸，以及具有杂原子主链的寡核苷酸，所述杂原子主链特别是CH2-NH-O-CH2、CH,~N(CH3)~O~CH2(称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链)、CH2-O-N(CH3)-CH2、CH2 -N(CH3)-N(CH3)-CH2和O-N(CH3)- CH2 -CH2主链，其中天然磷酸二酯主链表示为O- P- O- CH)；酰胺主链[参见De Mesmaeker等人，Ace. Chem. Res.，28:366-374(1995)]；吗啉代主链结构(参见Summerton和Weller，美国专利号5,034,506)；肽核酸(PNA)主链(其中寡核苷酸的磷酸二酯主链替换为聚酰胺主链，核苷酸与聚酰胺主链的氮杂氮原子直接或间接结合，参见Nielsen等人，Science 1991，254，1497)。含磷键合包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基及其它烷基膦酸酯包含3'亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯包含3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、以及具有正常的3'-5'键合的硼烷磷酸酯、这些的2'-5'连接的类似物、以及具有逆转极性的那些，其中相邻的核苷单元对3'-5'与5'-3'或2'-5'与5'-2'连接；参见美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050。
基于吗啉代的寡聚化合物在以下中描述：Braasch和Corey，Biochemistry，41(14): 4503-4510(2002)；Genesis，第30卷，Issue 3,(2001)；Heasman，Dev. Biol.，243:209-214(2002)；Nasevicius等人，Nat. Genet.，26:216-220(2000)；Lacerra等人，Proc.Natl. Acad. Sci.，97: 9591-9596(2000)；以及1991年7月23日授权的美国专利号5,034,506。
环己烯基核酸寡核苷酸模拟物在Wang等人，J. Am. Chem. Soc.，122: 8595-8602(2000)中描述。
其中不包括磷原子的修饰的寡核苷酸主链具有这样的主链，其由短链烷基或环烷基核苷间键合、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键合、或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键合形成。这些包括具有以下的那些：吗啉代键合(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物，亚砜和砜主链；甲酰基和硫代甲酰乙酰基(thioformacetyl)主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰乙酰基主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其它主链；参见美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439。
还可以包括一个或多个取代的糖部分，例如在2'位置处的下述之一：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3、OCH3 O(CH2)n CH3、O(CH2)n NH2或O(CH2)n CH3，其中n为1至约10；C1至C10低级烷基，烷氧基烷氧基，取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2 CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报道基团；嵌入剂；用于改善寡核苷酸的药代动力学特性的基团；或用于改善寡核苷酸的药效学特性的基团和具有类似特性的其它取代基。在一些方面，修饰包括2'-甲氧基乙氧基((2'-O-CH2CH2OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基))(Martin等人，HeIv. Chim. Acta，1995，78，486)。其它修饰包括2'-甲氧基(2'-O-CH3)，2'-丙氧基(2'-OCH2 CH2CH3)和2'-氟(2'-F)。也可以在寡核苷酸上的其它位置，特别是在3'末端核苷酸上的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置处制备类似的修饰。寡核苷酸也可以具有糖模拟物，例如代替戊呋喃糖基的环丁基。
在一些实例中，核苷酸单元的糖和核苷间键合(即主链)两者均可以替换为新型基团。可以维持碱基单元用于与适当的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物，已显示具有优异的杂交特性的寡核苷酸模拟物，被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖-主链可以替换为含有酰胺的主链，例如氨基乙基甘氨酸主链。核碱基可以被保留，并且与主链的酰胺部分的氮杂氮原子直接或间接结合。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262。PNA化合物的进一步教导可以在Nielsen等人，Science，254: 1497-1500(1991)中找到。
向导RNA还可以另外地或可替代地包括核碱基(在本领域中经常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文使用的，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括仅在天然核酸中罕有地或瞬时地发现的核碱基，例如次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶，特别是5-甲基胞嘧啶(也称为5-甲基-2'脱氧胞嘧啶，并且在本领域中经常被称为5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和胆二糖基(gentobiosyl)HMC，以及合成的核碱基，例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其它杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。Kornberg，A.，DNA Replication，W. H. Freeman & Co.，San Francisco，第75-77页(1980)；Gebeyehu等人，Nucl. Acids Res. 15:4513(1997)。还可以包括本领域已知的“通用”碱基，例如肌苷。5-Me-C取代已显示将核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃。(Sanghvi，Y. S.，于Crooke，S. T.和Lebleu，B.编辑，Antisense Researchand Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，第276-278页)，并且是碱基取代的方面。
修饰的核碱基可以包含其它合成的和天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基及其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基及其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基及其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤(methylquanine)和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
进一步地，核碱基可以包含美国专利号3,687,808中公开的那些，'The ConciseEncyclopedia of Polymer Science and Engineering'，第858-859页，Kroschwitz，J.I.编辑，John Wiley & Sons，1990中公开的那些，通过Englisch等人，Angewandle Chemie，International Edition'，1991，30，第613页中公开的那些，以及通过Sanghvi，Y. S.，第15章，Antisense Research and Applications'，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.ea.，CRC Press，1993中公开的那些。这些核碱基中的某些对于增加本发明的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包含2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示将核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编辑，'Antisense Research and Applications'，CRC Press，Boca Raton，1993，第276-278页)，并且是碱基取代的方面，甚至更特别是当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。修饰的核碱基在以下中描述：美国专利号3,687,808，以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,830,653；6,005,096；和美国专利申请公开2003/0158403。
因此，术语“修饰的”指掺入向导RNA、核酸内切酶或向导RNA和核酸内切酶两者内的非天然糖、磷酸酯或碱基。给定寡核苷酸中的所有位置无需均匀地修饰，并且实际上多于一种上述修饰可以掺入单个寡核苷酸中，或者甚至掺入寡核苷酸内的单个核苷中。
向导RNA和/或编码核酸内切酶的mRNA(或DNA)可以化学连接至一个或多个部分或缀合物，其增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。此类部分包含但不限于脂质部分，例如胆固醇部分[Letsinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，86: 6553-6556(1989)]；胆酸[Manoharan等人，Bioorg. Med. Chem. Let.，4: 1053-1060(1994)]；硫醚，例如己基-S-三苯基甲硫醇[Manoharan等人，Ann. N. Y. Acad. Sci.，660: 306-309(1992)和Manoharan等人，Bioorg. Med. Chem. Let.，3: 2765-2770(1993)]；巯基胆固醇[Oberhauser等人，Nucl. Acids Res.，20: 533-538(1992)]；脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基[Kabanov等人，FEBS Lett.，259: 327-330(1990)和Svinarchuk等人，Biochimie，75: 49- 54(1993)]；磷脂，例如双十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-双-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯[Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，36: 3651-3654(1995)和Shea等人，Nucl. Acids Res.，18: 3777-3783(1990)]；多胺或聚乙二醇链[Mancharan等人，Nucleosides & Nucleotides，14: 969-973(1995)]；金刚烷乙酸[Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，36: 3651-3654(1995)]；棕榈基部分[(Mishra等人，Biochim. Biophys. Acta，1264: 229-237(1995)]；或者十八胺或己基氨基-羰基-t羟胆固醇部分[Crooke等人，J. Pharmacol. Exp. Ther.，277: 923-937(1996)]。还参见美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599，928和5,688,941。
糖及其它部分可以用于将包含核苷酸的蛋白质和复合物(例如阳离子多聚核糖体和脂质体)靶向至特定位点。例如，肝细胞定向转移可以经由去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)介导；参见例如，Hu等人，Protein Pept Lett. 21(10):1025-30(2014)。本领域已知的和常规开发的其它系统可以用于将在本文情况下使用的生物分子和/或其复合物靶向至特定的目的靶细胞。
这些靶向部分或缀合物可以包括与官能团例如伯羟基或仲羟基共价结合的缀合物基团。本公开内容的缀合物基团包括嵌入剂、报道分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物的药效学特性的基团、以及增强寡聚物的药代动力学特性的基团。典型的缀合物基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素和染料。在本公开内容的上下文中，增强药效学特性的基团包括改善摄取、增强对降解的抗性、和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本发明的上下文中，增强药代动力学特性的基团包括改善本公开内容的化合物的摄取、分布、代谢或排泄的基团。代表性的缀合物基团公开于1992年10月23日提交的国际专利申请号PCT/US92/09196(作为WO1993007883公开)和美国专利号6,287,860中。缀合物部分包括但不限于脂质部分例如胆固醇部分，胆酸，硫醚例如己基-5-三甲基苯硫醇，巯基胆固醇，脂肪族链例如十二烷二醇或十一烷基残基，磷脂例如双十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-双-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯，多胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸，棕榈基部分或者十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。参见例如，美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717，5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203，5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。
较不顺应化学合成并且通常通过酶促合成产生的更长的多核苷酸也可以通过各种手段进行修饰。此类修饰可以包括例如某些核苷酸类似物的引入，在分子的5'或3'端处掺入特定序列或其它部分，以及其它修饰。作为举例说明，编码Cas9的mRNA为长度大约4kb，并且可以通过体外转录合成。对mRNA的修饰可以应用于例如增加其翻译或稳定性(例如通过增加其对由细胞降解的抗性)，或降低RNA引发先天性免疫应答的趋势，所述先天性免疫应答经常在外源RNA，特别是较长的RNA，例如编码Cas9的RNA引入之后在细胞中观察到。
众多此类修饰已在本领域中得到描述，例如多聚A尾、5'帽类似物(例如，抗反向帽类似物(Anti Reverse Cap Analog)(ARCA)或m7G(5’)ppp(5’)G(mCAP))、修饰的5'或3'非翻译区(UTR)、修饰碱基(例如假UTP、2-硫代-UTP、5-甲基胞苷-5'-三磷酸酯(5-甲基-CTP)或N6-甲基-ATP)的使用、或用磷酸酶处理以去除5'末端磷酸酯。这些及其它修饰是本领域已知的，并且RNA的新修饰经常处于开发中。
存在修饰RNA的众多商业供应商，包括例如TriLink Biotech，AxoLabs，Bio-Synthesis Inc.，Dharmacon及许多其它供应商。如通过TriLink所述的，例如，5-甲基-CTP可以用于赋予所需特征，例如增加的核酸酶稳定性、增加的翻译或降低的先天性免疫受体与体外转录的RNA的相互作用。5-甲基胞苷-5'-三磷酸酯(5-甲基-CTP)、N6-甲基-ATP、以及假UTP和2-硫代-UTP，也已显示降低培养物中和体内的先天性免疫刺激，同时增强翻译，如通过下文提及的Kormann等人和Warren等人在出版物中示出的。
已显示体内递送的化学修饰的mRNA可以用于实现改善的疗效；参见例如，Kormann等人，Nature Biotechnology 29，154–157(2011)。此类修饰可以用于例如增加RNA分子的稳定性和/或降低其免疫原性。使用化学修饰例如假U、N6-甲基-A、2-硫代-U和5-甲基-C，发现用2-硫代-U和5-甲基-C分别取代仅四分之一的尿苷和胞苷残基，导致小鼠中toll样受体(TLR)介导的mRNA识别中的显著减少。通过降低先天性免疫系统的激活，这些修饰可以用于有效地增加体内mRNA的稳定性和寿命；参见例如，Kormann等人，同上。
还已显示掺入设计为绕过先天性抗病毒应答的修饰的合成信使RNA的重复施用，可以将分化的人细胞重编程为多能性。参见例如，Warren等人，Cell Stem Cell，7(5):618-30(2010)。充当初级重编程蛋白的此类修饰的mRNA可以是使多重人细胞类型重编程的有效手段。此类细胞被称为诱导性多能干细胞(iPSC)，并且发现掺入5-甲基-CTP、假UTP和抗反向帽类似物(ARCA)的酶促合成的RNA，可以用于有效地逃避细胞的抗病毒应答；参见例如，Warren等人，同上。
本领域中描述的多核苷酸的其它修饰包括例如多聚A尾的使用，5'帽类似物例如(m7G(5')ppp(5')G(mCAP))的添加，5'或3'非翻译区(UTR)的修饰，或用磷酸酶处理以去除5'末端磷酸酯 – 并且新方法经常处于开发中。
可应用于生成用于本文用途的修饰RNA的许多组合物和技术已与RNA干扰(RNAi)，包括小干扰RNA(siRNA)的修饰结合进行开发。siRNA在体内呈现特定挑战，因为它们经由mRNA干扰对基因沉默的作用一般是瞬时的，其可能需要重复施用。另外，siRNA是双链RNA(dsRNA)，并且哺乳动物细胞具有已进化为检测且中和dsRNA的免疫应答，所述dsRNA经常是病毒感染的副产物。因此，存在哺乳动物酶如PKR(dsRNA响应激酶)和可能地视黄酸诱导基因I(RIG-1)，其可以介导对dsRNA以及Toll样受体(例如TLR3、TLR7和TLR8)的细胞应答，其可以响应此类分子而触发细胞因子的诱导；参见例如，通过以下的综述：Angart等人，Pharmaceuticals(Basel)6(4): 440–468(2013)；Kanasty等人，Molecular Therapy 20(3): 513–524(2012)；Burnett等人，Biotechnol J. 6(9):1130-46(2011)；Judge和MacLachlan，Hum Gene Ther 19(2):111-24(2008)。
如本文所述，已开发了各种各样的修饰，并且应用于增强RNA稳定性、降低先天性免疫应答、和/或实现与多核苷酸引入人细胞内结合可以有用的其它益处；参见例如，通过以下的综述：Whitehead KA等人，Annual Review of Chemical and BiomolecularEngineering，2: 77-96(2011)；Gaglione和Messere，Mini Rev Med Chem，10(7):578-95(2010)；Chernolovskaya等人，Curr Opin Mol Ther.，12(2):158-67(2010)；Deleavey等人，Curr Protoc Nucleic Acid Chem Chapter 16:Unit 16.3(2009)；Behlke，Oligonucleotides 18(4):305-19(2008)；Fucini等人，Nucleic Acid Ther 22(3): 205–210(2012)；Bremsen等人，Front Genet 3:154(2012)。
如上文指出的，存在修饰RNA的许多商业供应商，其中许多已专攻设计为改善siRNA的有效性的修饰。基于文献中报道的各种发现，提供了各种方法。例如，Dharmacon指出，用硫(硫代磷酸酯，PS)替换非桥连氧已广泛用于改善siRNA的核酸酶抗性，如通过Kole，Nature Reviews Drug Discovery 11:125-140(2012)报道的。核糖的2'-位置的修饰已报道改善核苷酸间磷酸键的核酸酶抗性，同时增加双链体稳定性(Tm)，其也已显示提供不受免疫激活的保护。适度的PS主链修饰与小的、良好耐受的2'-取代(2'-O-甲基、2'-氟、2'-氢)的组合已与用于体内应用的高度稳定的siRNA相关，如通过Soutschek等人Nature 432:173-178(2004)报道的；并且2’-O-甲基修饰已报道有效改善稳定性，如通过Volkov，Oligonucleotides 19:191-202(2009)报道的。关于减少先天性免疫应答的诱导，用2'-O-甲基、2'-氟、2'-氢修饰特定序列已报道降低TLR7/TLR8相互作用，同时一般保存沉默活性；参见例如，Judge等人，Mol. Ther. 13:494-505(2006)；以及Cekaite等人，J. Mol. Biol.365:90-108(2007)。另外的修饰，例如2-硫尿嘧啶、假尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和N6-甲基腺苷，还已显示使由TLR3、TLR7和TLR8介导的免疫效应降到最低。参见例如，Kariko，K.等人，Immunity 23:165-175(2005)。
如本领域也已知的且商购可得的，许多缀合物可以应用于用于本文中的多核苷酸，例如RNA，其可以增强其递送和/或由细胞的摄取，包括例如胆固醇、生育酚和叶酸、脂质、肽、聚合物、接头和适体；参见例如，通过Winkler，Ther. Deliv. 4:791-809(2013)的综述。
密码子优化
可以根据本领域标准的方法，对编码定点多肽的多核苷酸进行密码子优化，用于在含有目的靶DNA的细胞中表达。例如，如果预期的靶核酸在人细胞中，则人密码子优化的编码Cas9的多核苷酸考虑用于产生Cas9多肽。
核酸编码系统组分
本公开内容提供了包含编码本公开内容的基因组靶向核酸的核苷酸序列的核酸，本公开内容的定点多肽，和/或执行本公开内容的方法方面所必需的任何核酸或蛋白质分子。
编码本公开内容的基因组靶向核酸的核酸，本公开内容的定点多肽，和/或执行本公开内容的方法方面所必需的任何核酸或蛋白质分子可以包含载体(例如重组表达载体)。
术语“载体”指能够转运它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指另外的核酸区段可以连接到其内的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体；其中另外的核酸区段可以连接到病毒基因组内。某些载体能够在它们引入其内的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。在引入宿主细胞内之后，其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)整合到宿主细胞的基因组内，并且从而连同宿主基因组一起复制。
在一些实例中，载体可以能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”，或更简单地称为“表达载体”，其发挥等价功能。
术语“可操作地连接”意指目的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式与调节序列连接。术语“调节序列”预期包括例如启动子，增强子及其它表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类调节序列例如在Goeddel；Gene Expression Technology: Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成性表达的那些，以及仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的那些(例如，组织特异性调节序列)。本领域技术人员应了解，表达载体的设计可以取决于此类因素如靶细胞的选择、所需表达水平等等。
考虑的表达载体包括但不限于基于以下的病毒载体：牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、逆转录病毒(例如鼠白血病病毒、脾坏死病毒和衍生自逆转录病毒的载体，所述逆转录病毒例如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)及其它重组载体。考虑用于真核靶细胞的其它载体包括但不限于载体pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(Pharmacia)。考虑用于真核靶细胞的另外载体包括但不限于载体pCTx-1、pCTx-2和pCTx-3。可以使用其它载体，只要它们与宿主细胞相容。
在一些实例中，载体可以包含一种或多种转录和/或翻译控制元件。根据利用的宿主/载体系统，许多合适的转录和翻译控制元件，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等，可以用于表达载体中。载体可以是自灭活载体，其使病毒序列或CRISPR机制的组分或其它元件失活。
合适的真核启动子(即，在真核细胞中有功能的启动子)的非限制性实例包括来自以下的那些：巨细胞病毒(CMV)立即早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复(LTR)、人延伸因子1启动子(EF1)、包含与鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)融合的巨细胞病毒(CMV)增强子的杂合构建体、鼠干细胞病毒启动子(MSCV)、磷酸甘油酸激酶1位点启动子(PGK)和小鼠金属硫蛋白-I。
为了表达小RNA，包括与Cas核酸内切酶结合使用的向导RNA，各种启动子例如RNA聚合酶III启动子，包括例如U6和H1，可能是有利的。用于增强此类启动子的使用的描述和参数是本领域已知的，并且另外的信息和方法经常得到描述；参见例如，Ma，H.等人，Molecular Therapy - Nucleic Acids 3，e161(2014)doi:10.1038/mtna.2014.12。
表达载体还可以含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体还可以包含用于扩增表达的适当序列。表达载体还可以包括编码非天然标签(例如，组氨酸标签、血凝素标签、绿色荧光蛋白等)的核苷酸序列，所述非天然标签与定点多肽融合，因此导致融合蛋白。
启动子可以是诱导型启动子(例如，热休克启动子、四环素调节的启动子、类固醇调节的启动子、金属调节的启动子、雌激素受体调节的启动子等)。启动子可以是组成型启动子(例如，CMV启动子、UBC启动子)。在一些情况下，启动子可以是空间受限和/或时间受限的启动子(例如，组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子等)。
编码本公开内容的基因组靶向核酸和/或定点多肽的核酸可以包装到递送媒介物内或表面上，用于递送至细胞。考虑的递送媒介物包括但不限于纳米球、脂质体、量子点、纳米颗粒、聚乙二醇颗粒、水凝胶和胶束。如本领域中所述，各种靶向部分可以用于增强此类媒介物与所需细胞类型或位置的优先相互作用。
本公开内容的复合物、多肽和核酸引入细胞内可以通过病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等等来发生。
微小RNA(miRNA)
另一类基因调节区域是微小RNA(miRNA)结合位点。miRNA是在转录后基因调节中起关键作用的非编码RNA。miRNA据报道调节大量哺乳动物蛋白编码基因的表达。发现了通过双链RNA(RNAi)的特异性和有力的基因沉默，加上另外的小的非编码RNA(Canver，M.C.等人，Nature(2015))。对于基因沉默重要的最大一类的非编码RNA是miRNA。在哺乳动物中，miRNA首先被转录为长RNA转录物，其可以是分开的转录单位、蛋白质内含子的部分或其它转录物。长转录物称为初级miRNA(pri-miRNA)，其包括不完全碱基配对的发夹结构。这些pri-miRNA可以通过Microprocessor(涉及Drosha的核中的蛋白质复合物)切割成一种或多种较短的前体miRNA(miRNA前体)。
miRNA前体是长度~70个核苷酸的短茎环，具有2个核苷酸的3'-突出端，其被输出到成熟的19-25个核苷酸的miRNA：miRNA*双链体内。具有较低碱基配对稳定性的miRNA链(向导链)可以加载到RNA诱导的沉默复合物(RISC)上。过客向导链(用*标记)可以是有功能的，但通常是降解的。成熟的miRNA将RISC栓系至3'非翻译区(UTR)内占优势地发现的靶mRNA中的部分互补的序列基序，并且诱导转录后基因沉默(Bartel，D.P. Cell 136，215-233(2009)；Saj，A. & Lai，E.C. Curr Opin Genet Dev 21，504-510(2011))。
miRNA在哺乳动物及其它多细胞生物的发育、分化、细胞周期和生长控制、以及实际上所有生物途径中都可能是重要的。miRNA还可以涉及细胞周期控制、细胞凋亡和干细胞分化、造血、缺氧、肌肉发育、神经发生、胰岛素分泌、胆固醇代谢、衰老、病毒复制和免疫应答。
单个miRNA可以靶向数百种不同的mRNA转录物，而个别转录物可以被许多不同的miRNA靶向。最新版本的miRBase(v.21)中已注释了多于28645种微小RNA。一些miRNA可以由多重基因座编码，其中一些可以由串联共转录簇表达。该特点允许具有多重途径和反馈控制的复杂调节网络。miRNA可能是这些反馈和调节回路的集成部分，并且可以通过将蛋白质生产保持在限度内来帮助调节基因表达(Herranz，H. & Cohen，S.M. Genes Dev 24，1339-1344(2010)；Posadas，D.M. & Carthew，R.W. Curr Opin Genet Dev 27，1-6(2014))。
miRNA在与异常miRNA表达相关的大量人疾病中也很重要。此类相关强调了miRNA调节途径的重要性。最近的miRNA缺失研究已将miRNA与免疫应答的调节联系(Stern-Ginossar，N.等人，Science 317，376-381(2007))。
miRNA也与癌症具有很强的联系，并且可以在不同类型的癌症中起作用。已发现miRNA在许多肿瘤中是下调的。miRNA在关键的癌症有关途径(例如细胞周期控制和DNA损伤应答)的调节中可以是重要的，并且因此可以用于诊断中并可以在临床上靶向。miRNA可以精巧地调节血管生成的平衡，使得耗尽所有miRNA的实验压制肿瘤血管生成(Chen，S.等人，Genes Dev 28，1054-1067(2014))。
如对于蛋白质编码基因已显示的，miRNA基因也可以经受伴随癌症发生的表观遗传变化。许多miRNA基因座可以与CpG岛相关，增加了它们通过DNA甲基化调节的机会(Weber，B.，Stresemann，C.，Brueckner，B. & Lyko，F. Cell Cycle 6，1001-1005(2007))。大多数研究已使用由染色质重塑药物的处理，以揭示表观遗传沉默的miRNA。
除其在RNA沉默中的作用之外，miRNA还可以激活翻译(Posadas，D.M. & Carthew，R.W. Curr Opin Genet Dev 27，1-6(2014))。敲除这些位点可以导致靶基因的表达减少，而引入这些位点可以增加表达。
通过使种子序列(微小RNA的碱基2-8)突变，可以最有效地敲除个别miRNA，这对于结合特异性可以是重要的。在这个区域中的切割，随后为通过NHEJ的错误修复，可以通过阻断与靶位点的结合来有效取消miRNA功能。miRNA也可以通过与回文序列相邻的专门环区域的特异性靶向来抑制。无催化活性的Cas9也可以用于抑制shRNA表达(Zhao，Y.等人，Sci Rep 4，3943(2014))。除靶向miRNA之外，结合位点也可以被靶向且突变，以预防通过miRNA的沉默。
根据本公开内容，可以将任何miRNA或其结合位点掺入本发明的组合物内。
组合物可以具有这样的区域，例如但不限于包含SEQ ID NO：613-4696中列出的任何miRNA的序列的区域，SEQ ID NO：613-4696中列出的miRNA的反向互补体，或SEQ ID NO：613-4696中列出的任何miRNA的miRNA反种子区域。
本发明的组合物可以包含一种或多种miRNA靶序列、miRNA序列或miRNA种子。此类序列可以对应于任何已知的miRNA，例如美国公开号2005/0261218和美国公开号2005/0059005中教导的那些。作为非限制性实例，在人基因组中的已知miRNA、其序列及其结合位点序列在SEQ ID NO：613-4696中列出。
miRNA序列包含“种子”区域，即成熟miRNA的位置2-8的区域中的序列，所述序列与miRNA靶序列具有完全沃森-克里克互补性。miRNA种子可以包含成熟的微小RNA的位置2-8或2-7。在一些实例中，miRNA种子可以包含7个核苷酸(例如，成熟的微小RNA的核苷酸2-8)，其中相应miRNA靶中的种子互补位点侧翼为与miRNA位置1相对的腺嘌呤(A)。在一些实例中，miRNA种子可以包含6个核苷酸(例如，成熟的微小RNA的核苷酸2-7)，其中相应miRNA靶中的种子互补位点侧翼为与微小RNA位置1相对的腺嘌呤(A)。参见例如，Grimson A，FarhKK，Johnston WK，Garrett-Engele P，Lim LP，Bartel DP；Mol Cell. 2007 Jul 6；27(1):91-105。miRNA种子的碱基与靶序列具有完全互补性。
miRNA的鉴定、miRNA靶区域、以及其表达模式和在生物学中的作用已得到报道(Bonauer等人，Curr Drug Targets 2010 11:943-949；Anand and Cheresh Curr OpinHematol 2011 18:171-176；Contreras and Rao Leukemia 2012 26:404-413(2011 Dec20. doi: 10.1038/leu.2011.356)；Bartel Cell 2009 136:215-233；Landgraf等人，Cell，2007 129:1401-1414；Gentner和Naldini，Tissue Antigens. 2012 80:393-403。
例如，如果组合物不预期递送至肝而是在其中终止，则miR-122(肝中丰富的miRNA)可以抑制递送的序列的表达，如果miR的一个或多个靶位点-122被改造到编码该靶序列的多核苷酸内。可以改造对于不同miRNA的一个或多重结合位点引入，以进一步减少寿命、稳定性和蛋白质翻译，从而提供了另外一层可保持性。
如本文使用的，术语“miRNA位点”指miRNA靶位点或miRNA识别位点、或者miRNA与之结合或相关的任何核苷酸序列。应当理解，“结合”可以遵循传统的沃森-克里克杂交规则，或者可以反映在miRNA位点处或邻近miRNA与靶序列的任何稳定结合。
相反地，出于本公开内容的组合物的目的，miRNA结合位点可以被改造出(即，从其中去除)它们天然存在于其中的序列，以便增加特异性组织中的蛋白质表达。例如，可以去除miR-122结合位点，以改善肝中的蛋白质表达。
具体地，已知miRNA在免疫细胞(也称为造血细胞)中差异表达，所述免疫细胞例如抗原呈递细胞(APC)(例如树突状细胞和巨噬细胞)、巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、粒细胞、天然杀伤细胞等。免疫细胞特异性miRNA涉及免疫原性、自身免疫、对感染的免疫应答、炎症、以及在基因疗法和组织/器官移植后不需要的免疫应答。免疫细胞特异性微小RNA还调节造血细胞(免疫细胞)的发育、增殖、分化和凋亡的许多方面。例如，miR-142和miR-146专一地在免疫细胞中表达，在髓样树突状细胞中特别丰富。将miR-142结合位点引入本公开内容的多肽的3'-UTR内，可以通过miR-142介导的mRNA降解选择性地压制抗原呈递细胞中的基因表达，限制了在专职APC(例如树突状细胞)中的抗原呈递，并且从而预防了在基因递送后的抗原介导的免疫应答(参见，Annoni A等人，blood，2009，114，5152-5161。
在一个实例中，可以将已知在免疫细胞，特别是抗原呈递细胞中表达的miRNA结合位点改造到多核苷酸内，以通过miRNA介导的RNA降解来压制APC中的多核苷酸表达，制止抗原介导的免疫应答，同时多核苷酸的表达在其中不表达免疫细胞特异性miRNA的非免疫细胞中得以维持。
已进行了许多miRNA表达研究，并且在本领域中得到描述，以概括分析miRNA在各种癌细胞/组织及其它疾病中的差异表达。一些miRNA在某些癌细胞中是异常过表达的，而其它的是表达不足的。例如，miRNA在以下中是差异表达的：癌细胞(WO2008/154098、US2013/0059015、US2013/0042333、WO2011/157294)；癌症干细胞(US2012/0053224)；胰腺癌和疾病(US2009/0131348、US2011/0171646、US2010/0286232、US8389210)；哮喘和炎症(US8415096)；前列腺癌(US2013/0053264)；肝细胞癌(WO2012/151212、US2012/0329672、WO2008/054828、US8252538)；肺癌细胞(WO2011/076143、WO2013/033640、WO2009/070653、US2010/0323357)；皮肤T细胞淋巴瘤(WO2013/011378)；结肠直肠癌细胞(WO2011/0281756、WO2011/076142)；癌阳性淋巴结(WO2009/100430、US2009/0263803)；鼻咽癌(EP2112235)；慢性阻塞性肺疾病(US2012/0264626、US2013/0053263)；甲状腺癌(WO2013/066678)；卵巢癌细胞(US2012/0309645、WO2011/095623)；乳腺癌细胞(WO2008/154098、WO2007/081740、US2012/0214699)，白血病和淋巴瘤(WO2008/073915、US2009/0092974、US2012/0316081、US2012/0283310、WO2010/018563。
人细胞
如本文描述且示出的，为了改善2A型乌谢尔综合征或与USH2A相关的任何病症，用于基因编辑的主要靶是人细胞。例如，在离体方法中，人细胞可以是体细胞，其在使用所描述的技术修饰后可以产生分化的细胞，例如感光细胞或视网膜祖细胞。例如，在体内方法中，人细胞可以是感光细胞或视网膜祖细胞。
通过在衍生自有此需要的患者并且因此已经与之完全匹配的自体细胞中执行基因编辑，能够生成可以安全地重新引入患者内的细胞，并且有效地产生可以有效地改善与患者的疾病相关的一种或多种临床状况的细胞群体。
祖细胞(在本文中也称为干细胞)既能增殖又能产生更多的祖细胞，这些依次又具有生成大量母细胞的能力，所述母细胞依次又可以产生分化的或可分化的子细胞。子细胞本身可以被诱导以增殖并产生后代，所述后代随后分化成一种或多种成熟细胞类型，同时还保留了具有亲代发育潜能的一种或多种细胞。术语“干细胞”随后指在特定情况下具有分化为更专门的或分化的表型的能力或潜力，并且在某些情况下保留增殖的能力而基本上不分化的细胞。在一个方面，术语祖细胞或干细胞指广义的母细胞，其子代(后代)经常通过分化(例如通过获得完全个别的特征)而在不同方向上专门化，如在胚胎细胞和组织的逐步多样化中发生的。细胞分化是通常通过许多细胞分裂而发生的复杂过程。分化的细胞可以衍生自多潜能细胞，其本身衍生自多潜能细胞，依此类推。虽然这些多潜能细胞各自可以被视为干细胞，但各自可以产生的细胞类型的范围可以相当大地不同。一些分化的细胞也具有产生更大发育潜能的细胞的能力。此类能力可以是天然的，或可以是在用各种因子处理后人工诱导的。在许多生物学情况下，干细胞也可以是“多潜能的”，因为它们可以产生多于一种不同细胞类型的后代，但这不是“干性”所必需的。
自我更新可以是干细胞的另一个重要方面。在理论上，自我更新可以通过两种主要机制中的任一发生。干细胞可以不对称分裂，其中一个子细胞保留干细胞状态，而另一个子细胞表达一些独特的其它特异性功能和表型。可替代地，群体中的一些干细胞可以对称地分裂成两个干，因此整体上维持群体中的一些干细胞，而群体中的其它细胞仅产生分化的后代。一般地，“祖细胞”具有更原始的细胞表型(即，处于沿着发育途径或进展比完全分化的细胞更早的步骤)。经常地，祖细胞也具有显著或非常高的增殖潜力。祖细胞可以产生多重不同的分化细胞类型或单一的分化细胞类型，取决于发育途径以及细胞在其中发育且分化的环境。
在细胞个体发育的背景下，形容词“分化的”或“分化”是相对术语。“分化的细胞”是比它与之相比较的细胞沿发育途径中进一步向下进展的细胞。因此，干细胞可以分化成谱系受限的前体细胞(例如，肌细胞祖细胞)，其依次又可以分化成沿途径进一步向下的其它类型的前体细胞(例如，肌细胞前体)，然后为末期分化的细胞，例如肌细胞，其在某种组织类型中起特征性作用，并且可以保留或不能保留进一步增殖的能力。
编辑的人细胞
本文提供的是用于编辑人细胞中的USH2A基因中的IVS40突变的方法。本文提供的是用于编辑人细胞中的USH2A基因中的IVS40突变的gRNA。
本文公开的这些方法和/或gRNA可以用于编辑人细胞的群体。可以编辑细胞群体内足以用于治疗患者的人细胞数目。例如，可以编辑细胞群体内95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%或50%的人细胞，并且足以使用治疗患者。在其它实例中，可以编辑细胞群体内45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、1%或0.5%的人细胞，并且可以足以用于治疗患者。在各种实例中，在将编辑的人细胞施用于患者之前，可以首先选择且培养编辑的人细胞，以扩展编辑细胞的数目。
诱导性多能干细胞
本文所述的遗传改造的人细胞可以是诱导性多能干细胞(iPSC)。使用iPSC的优点在于细胞可以衍生自祖细胞待施用于其的相同受试者。即，体细胞可以得自受试者，重编程为诱导性多能干细胞，然后再分化成待施用于受试者的祖细胞(例如自体细胞)。因为祖细胞基本上衍生自自体来源，所以与使用来自另一个受试者或受试者组的细胞相比，可以降低移植物植入排斥或变应性应答的风险。另外，使用iPSC消除了从胚胎来源获得的细胞的需要。因此，在一个方面，在公开的方法中使用的干细胞不是胚胎干细胞。
尽管分化在生理背景下一般是不可逆的，但最近已开发了几种方法，以将体细胞重编程为iPSC。示例性方法是本领域技术人员已知的，并且在本文下文中简要描述。
术语“重编程”指改变或逆转分化细胞(例如体细胞)的分化状态的过程。换句话说，重编程指将细胞的分化向回驱动为更未分化的或更原始类型的细胞的过程。应该指出的是，将许多原代细胞置于培养中可以导致完全分化特征的一些丧失。因此，术语分化细胞中包括的简单地培养此类细胞并不致使这些细胞成为非分化细胞(例如，未分化细胞)或多能细胞。分化的细胞向多能性的转变要求重编程刺激超出导致培养物中的分化特征的部分丧失的刺激。相对于原代细胞亲本，重编程的细胞还具有延长传代的能力而不丧失生长潜能的特征，所述原代细胞亲本一般仅具有培养中的有限数目分裂的能力。
待重编程的细胞在重编程之前可以是部分分化的或终末分化的。重编程可以涵盖将分化细胞(例如体细胞)的分化状态完全逆转为多能状态或多潜能状态。重编程可以涵盖将分化细胞(例如体细胞)的分化状态完全或部分逆转为未分化细胞(例如胚胎样细胞)。重编程可以导致特定基因由细胞的表达，所述特定基因的表达进一步促成重编程。在本文所述的某些实例中，分化细胞(例如体细胞)的重编程可以促使分化细胞采取未分化状态(例如，是未分化细胞)。所得到的细胞被称为“重编程细胞”或“诱导性多能干细胞(iPSC或iPS细胞)”。
重编程可以涉及在细胞分化期间发生的核酸修饰(例如，甲基化)、染色质凝聚、表观遗传变化、基因组印迹等中的至少一些可遗传模式的改变，例如逆转。重编程不同于简单地维持已经是多能的细胞的现有未分化状态、或维持已经是多潜能细胞(例如成肌干细胞)的细胞的现有的低于完全分化状态。重编程也不同于促进已经是多能或多潜能的细胞的自我更新或增殖，尽管在一些实例中，本文所述的组合物和方法也可以用于此类目的。
本领域已知可以用于从体细胞生成多能干细胞的许多方法。将体细胞重编程为多能表型的任何此类方法对于用于本文所述的方法中都是适当的。
已描述了使用转录因子的确定组合用于生成多能细胞的重编程方法。通过Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的直接转导，可以将小鼠体细胞转换为具有扩大的发育潜能的ES细胞样细胞；参见例如，Takahashi和Yamanaka，Cell 126(4): 663–76(2006)。iPSC类似ES细胞，因为它们恢复了多能性相关的转录回路和许多表观遗传环境。另外，小鼠iPSC满足关于多能性的所有标准测定：具体地，在体外分化成三个胚层的细胞类型、畸胎瘤形成、促成嵌合体、种系传递[参见例如，Maherali和Hochedlinger，Cell Stem Cell. 3(6):595-605(2008)]和四倍体互补。
可以使用类似的转导方法获得人iPSC，并且转录因子三重体(trio)，OCT4、SOX2和NANOG已被确立为控制多能性的转录因子的核心集合；参见例如，Budniatzky和Gepstein，Stem Cells Transl Med. 3(4):448-57(2014)；Barrett等人，Stem Cells Trans Med 3:1-6 sctm.2014-0121(2014)；Focosi等人，Blood Cancer Journal 4: e211(2014)。历史上使用病毒载体，可以通过将编码干细胞相关基因的核酸序列引入成人体细胞内，来实现iPSC的生产。
iPSC可以由终末分化的体细胞以及成人干细胞或体干细胞生成或衍生。即，非多能祖细胞可以通过重编程致使成为多能的或多潜能的。在此类情况下，可以无需包括与使终末分化细胞再编程所要求的一样多的再编程因子。进一步地，可以通过重编程因子的非病毒引入来诱导重编程，例如，通过引入蛋白质本身，或通过引入编码重编程因子的核酸，或通过引入在翻译时产生重编程因子的信使RNA(参见例如，Warren等人，Cell Stem Cell，7(5):618-30(2010)。重编程可以通过引入编码干细胞相关基因的核酸组合来实现，所述基因包括例如Oct-4(也称为Oct-3/4或Pouf51)、Soxl、Sox2、Sox3、Sox 15、Sox 18、NANOG、Klfl、Klf2、Klf4、Klf5、NR5A2、c-Myc、1-Myc、n-Myc、Rem2、Tert和LIN28。使用本文所述的方法和组合物的重编程可以进一步包括将Oct-3/4、Sox家族的成员、Klf家族的成员和Myc家族的成员中的一种或多种引入体细胞中。本文所述的方法和组合物可以进一步包括引入Oct-4、Sox2、Nanog、c-MYC和Klf4各自中的一种或多种，用于重编程。如上文指出的，用于重编程的确切方法对于本文所述的方法和组合物不一定是关键的。然而，当从重编程的细胞分化的细胞待用于例如人疗法中时，在一个方面，重编程不受改变基因组的方法的影响。因此，在此类实例中，例如，可以无需使用病毒或质粒载体而实现重编程。
可以通过添加各种试剂例如小分子，来增强衍生自起始细胞群体的重编程的效率(即重编程细胞的数目)，如通过Shi等人，Cell-Stem Cell 2:525-528(2008)；Huangfu等人，Nature Biotechnology 26(7):795-797(2008)以及Marson等人，Cell-Stem Cell 3:132-135(2008)所示的。因此，增强诱导性多能干细胞产生的效率或速率的试剂或试剂组合，可以用于产生患者特异性或疾病特异性iPSC。增强重编程效率的试剂的一些非限制性实例尤其包括可溶性Wnt、Wnt条件培养基、BIX-01294(G9a组蛋白甲基转移酶)、PD0325901(MEK抑制剂)、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂、丙戊酸、5'-氮杂胞苷、地塞米松、辛二酰苯胺、异羟肟酸(SAHA)、维生素C和曲古抑菌素(TSA)。
重编程增强剂的其它非限制性实例包括：辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA(例如MK0683、伏立诺他)及其它异羟肟酸)、BML-210、Depudecin(例如(-)-Depudecin)、HC毒素、Nullscript(4-(1,3-二氧代-1H,3H-苯并[de]异喹啉-2-基)-N-羟基丁酰胺)、苯丁酸盐(如苯丁酸钠)和丙戊酸((VP A)及其它短链脂肪酸、Scriptaid、苏拉明钠、曲古抑菌素A(TSA)、APHA化合物8、Apicidin、丁酸钠、新戊酰氧基甲基丁酸酯(Pivanex、AN-9)、Trapoxin B、Chlamydocin、酯肽(也称为FR901228或FK228)、苯甲酰胺(例如CI-994(例如N-乙酰基地那林)和MS-27-275)、MGCD0103、NVP-LAQ-824、CBHA(间羧基肉桂酸双异羟肟酸)、JNJ16241199、Tubacin、A-161906、proxamide、奥沙姆丁、3-Cl-UCHA(例如6-(3-氯苯基脲基)己酸异羟肟酸)、AOE(2-氨基-8-氧代-9,10-环氧癸酸)、CHAP31和CHAP50。其它重编程增强剂包括例如HDAC的显性失活形式(例如无催化活性形式)、HDAC的siRNA抑制剂、以及与HDAC特异性结合的抗体。此类抑制剂可得自例如BIOMOL International、Fukasawa、MerckBiosciences、Novartis、Gloucester Pharmaceuticals、Titan Pharmaceuticals、MethylGene和Sigma Aldrich。
为了确认用于与本文所述方法一起使用的多能干细胞的诱导，可以测试分离的克隆的干细胞标记物的表达。在衍生自体细胞的细胞中的此类表达将细胞鉴定为诱导性多能干细胞。干细胞标记物可以选自包括以下的非限制性组：SSEA3、SSEA4、CD9、Nanog、Fbxl5、Ecatl、Esgl、Eras、Gdf3、Fgf4、Cripto、Daxl、Zpf296、Slc2a3、Rexl、Utfl和Natl。在一种情况下，例如，将表达Oct4或Nanog的细胞鉴定为多能的。用于检测此类标记物表达的方法可以包括例如，RT-PCR和检测编码多肽的存在的免疫学方法，例如蛋白质印迹或流式细胞术分析。检测不仅可以涉及RT-PCR，而且还可以包括蛋白质标记物的检测。细胞内标记物可以经由RT-PCR或蛋白质检测方法例如免疫细胞化学得到最佳鉴定，而细胞表面标记物可以例如通过免疫细胞化学容易地鉴定。
分离的细胞的多能干细胞特征可以通过评估iPSC分化成三个胚层各自的细胞的能力的测试来确认。作为一个实例，裸鼠中的畸胎瘤形成可以用于评估分离的克隆的多能特征。可以将细胞引入裸鼠内，并且可以对起于细胞的肿瘤执行组织学和/或免疫组织化学。例如，包含来自所有三个胚层的细胞的肿瘤的生长进一步指示该细胞是多能干细胞。
视网膜祖细胞和感光细胞
在一些实例中，本文所述的遗传改造的人细胞是感光细胞或视网膜祖细胞(RPC)。RPC是多潜能祖细胞，其可以产生视网膜的所有六种神经元以及米勒胶质细胞。米勒胶质细胞是一类视网膜神经胶质细胞，并且是视网膜的主要神经胶质组分。它们的功能是支持视网膜的神经元，并且维持视网膜稳态和完整性。从成年人视网膜中分离的米勒胶质细胞已显示分化成杆光感受器。此类米勒胶质细胞衍生的光感受器通过膜片钳记录的功能表征已揭示，它们的电学特性与成体杆的那些可比较(Giannelli等人，2011，Stem Cells,(2):344-56)。RPC在视网膜发生过程中逐渐指定成谱系受限的前体细胞，其然后成熟为终末分化的神经元或米勒胶质细胞。胎儿衍生的人视网膜祖细胞(hRPC)显示出直至第六代，指示视网膜祖细胞状态的分子特征。他们证实从第1代到第6代，KI67、SOX2和波形蛋白阳性细胞的百分比中的逐渐减少，而直到第6代可见巢蛋白和PAX6的持续表达。第1代hRPC的微阵列分析证实早期视网膜发育基因的表达：VIM(波形蛋白)、KI67、NES(巢蛋白)、PAX6、SOX2、HES5、GNL3、OTX2、DACH1、SIX6和CHX10(VSX2)。hRPC本质上是功能性的，并且响应兴奋性神经递质(Schmitt等人，2009，Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 2009；50(12):5901-8)。视网膜的最外部区域含有支持性视网膜色素上皮(RPE)层，其通过转运营养素且回收脱落的光感受器部分来维持光感受器健康。RPE附着至布鲁赫膜，在脉络膜与视网膜之间的界面处的细胞外基质结构。在RPE的另一侧上，向内朝向眼的内部移动，存在三层神经元：光感测杆和锥光感受器、连接神经元的中间层(无长突细胞、双极细胞和水平细胞)、以及最内部的神经节细胞层，其将源于光感受器层的信号传递通过视神经且进入大脑内。在一些方面，本文所述的遗传改造的人细胞是感光细胞，其是在视网膜中发现的专门类型的神经元。光感受器将光转换成能够刺激生物过程并负责视力的信号。视杆和视锥是促成对视觉系统的信息的两种典型感光细胞。
分离视网膜祖细胞和感光细胞
可以根据本领域已知的任何方法分离视网膜细胞，包括祖细胞。例如，从新鲜的手术标本中分离人视网膜细胞。通过用IV型胶原酶消化组织，将视网膜色素上皮(RPE)与脉络膜分开，并且培养视网膜色素上皮斑块。在从外植体生长100-500个细胞之后，传代了原代培养物((Ishida M.等人，Current Eye Research 1998；17(4):392-402)，并且表征了RPE标记物的表达。通过使用木瓜蛋白酶破坏活组织检查的视网膜来分离杆。采取预防措施以避免严重破坏并改善细胞得率。将分离的细胞分选，以产生纯杆细胞的群体，并且通过免疫染色进一步表征(Feodorova等人，MethodsX 2015；2:39-46)。
为了分离视锥，鉴定神经视网膜，切割出来并且置于10%明胶上。使用激光分离视网膜内层。将分离的视锥单层培养18小时，并且通过光学显微镜检查和透射显微镜检查与未处理的视网膜进行比较，以检查任何结构损伤。细胞就视锥特异性标记物的表达进行表征(Salchow等人，Current Eye Research 2001；22)。
为了分离视网膜祖细胞，将活组织检查的视网膜用双重解剖刀切碎，并且在37℃下的培养箱中进行酶促消化。将消化的细胞的上清液离心，并且将细胞重悬浮于无细胞的视网膜祖细胞条件培养基中。将细胞转移到含有新鲜培养基的纤连蛋白包被的组织培养瓶中，并进行培养(Klassen等人，Journal of Neuroscience Research 2004；77:334-343)。
产生患者特异性iPSC
本公开内容的离体方法的一个步骤可以涉及产生患者特异性iPS细胞，患者特异性iPS细胞或患者特异性iPS细胞系。如Takahashi和Yamanaka 2006；Takahashi，Tanabe等人2007中所述，在本领域中存在用于产生患者特异性iPS细胞的许多建立方法。例如，产生步骤可以包括：a)从患者中分离体细胞，例如皮肤细胞或成纤维细胞；并且b)将多能性相关基因的集合引入体细胞内，以便诱导该细胞成为多能干细胞。多能性相关基因的集合可以是选自以下的一种或多种基因：OCT4、SOX1、SOX2、SOX3、SOX15、SOX18、NANOG、KLF1、KLF2、KLF4、KLF5、c-MYC、n-MYC、REM2、TERT和LIN28。
执行活组织检查或患者的骨髓的抽吸
活组织检查或抽吸物是从机体获取的组织或流体的样品。存在许多不同种类的活组织检查或抽吸物。几乎所有这些都涉及使用锋利的工具来取出少量的组织。如果活组织检查将在皮肤或其它敏感区域上，则可以首先应用麻木药。可以根据本领域已知的任何方法执行活组织检查或抽吸。例如，在骨髓抽吸中，使用大的针以进入骨盆骨，以收集骨髓。
分离间充质干细胞
间充质干细胞可以根据本领域已知的任何方法，例如从患者的骨髓或外周血中分离。例如，可以将骨髓抽吸物收集到具有肝素的注射器内。细胞可以洗涤并在Percoll™密度梯度上离心。可以使用密度梯度离心介质Percoll™来分开细胞，例如血细胞、肝细胞、间质细胞、巨噬细胞、肥大细胞和胸腺细胞。然后可以在含有10%胎牛血清(FBS)的达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)(低葡萄糖)中培养细胞(Pittinger MF，Mackay AM，Beck SC等人，Science 1999；284:143–147)。
基因组编辑的iPSC分化成其它细胞类型
本公开内容的离体方法的另一个步骤可以包括使基因组编辑的iPSC分化成感光细胞或视网膜祖细胞。可以根据本领域中已知的任何方法来执行分化步骤。例如，iPSC可以用于生成视网膜类器官和光感受器，如本领域中所述(Phillips等人，Stem Cells，June 2014，32(6)：第1480-1492页；Zhong等人Nat. Commun.，2014，5：第4047页；Tucker等人，PLoSOne，2011年4月，6(4)：e18992)。例如，hiPSC使用各种处理，包括Wnt、Nodal和Notch途径抑制剂(Noggin、Dk1、LeftyA和DAPT)及其它生长因子分化成视网膜祖细胞。视网膜祖细胞进一步分化成感光细胞，所述处理包括：在共培养系统中暴露于天然视网膜细胞，通过用视黄酸和牛磺酸的后续处理的RX+或Mitf+，或暴露于几种外源因子包括Noggin、Dkk1、DAPT和胰岛素样生长因子(Yang等人，Stem Cells International 2016)。
基因组编辑的间充质干细胞分化成感光细胞或视网膜祖细胞
本公开内容的离体方法的另一个步骤可以包括将基因组编辑的间充质干细胞分化成感光细胞或视网膜祖细胞。分化步骤可以根据本领域已知的任何方法执行。
将细胞植入患者内
本公开内容的离体方法的另一个步骤可以包括将感光细胞或视网膜祖细胞植入患者内。可以使用本领域已知的任何植入方法来完成这个植入步骤。例如，可以将遗传修饰的细胞直接注射到患者的血液中或以其它方式施用于患者。
本发明的离体方法的另一个步骤涉及将感光细胞或视网膜祖细胞植入患者内。可以使用本领域已知的任何植入方法来完成这个植入步骤。例如，可以将遗传修饰的细胞直接注射到患者的眼中或以其它方式施用于患者。
遗传修饰的细胞
术语“遗传修饰的细胞”指包含通过基因组编辑(例如，使用CRISPR/Cas9/Cpf1系统)引入的至少一种遗传修饰的细胞。在本文的一些离体实例中，遗传修饰的细胞可以是遗传修饰的祖细胞。在本文的一些体内实例中，遗传修饰的细胞可以是遗传修饰的感光细胞或视网膜祖细胞。本文考虑了包含外源基因组靶向核酸和/或编码基因组靶向核酸的外源核酸的遗传修饰的细胞。
术语“对照处理的群体”描述了这样的细胞群体，其已用等同的培养基、病毒诱导、核酸序列、温度、汇合度、烧瓶大小、pH等进行处理，除了添加的基因组编辑组分之外。本领域已知的任何方法都可以用于测量USH2A基因或usherin蛋白表达或活性的恢复，例如，usherin蛋白的蛋白质印迹分析或用于定量USH2A mRNA的实时PCR。
术语“分离的细胞”指已从它最初在其中发现的生物中取出的细胞，或此类细胞的子代。任选地，可以例如在限定条件下或在其它细胞的存在下，在体外培养细胞。任选地，细胞可以随后被引入第二生物内、或重新引入它(或它由其传下的细胞)从其中分离的生物内。
关于分离的细胞群体的术语“分离的群体”指已从混合的或异质的细胞群体中取出并分开的细胞群体。在一些情况下，与细胞从其中分离或富集的异质群体相比，分离的群体可以是基本上纯的细胞群体。在一些情况下，与包含人祖细胞和人祖细胞衍生自其的细胞的异质细胞群体相比，分离的群体可以是分离的人祖细胞群体，例如基本上纯的人祖细胞群体。
关于特定细胞群体的术语“基本上增强的”指这样的细胞群体，其中相对于预先存在的水平或参考水平，特定类型细胞的出现增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少400倍、至少1000倍、至少5000倍、至少20000倍、至少100000倍或更多倍，取决于例如此类细胞用于改善2A型乌谢尔综合征的所需水平。
关于特定细胞群体的术语“基本上富集的”指关于构成总细胞群体的细胞，其为至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%或更多的细胞群体。
关于特定细胞群体的术语“基本上纯的”指关于构成总细胞群体的细胞，其为至少约75%、至少约85%、至少约90%或至少约95%纯的细胞群体。即，关于祖细胞群体的术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”指这样的细胞群体，其含有少于约20%、约15%、约10%、约9%、约8%、约7%、约6%、约5%、约4%、约3%、约2%、约1%或小于1%的如通过本文术语定义的并非祖细胞的细胞。
递送
向导RNA多核苷酸(RNA或DNA)和/或核酸内切酶多核苷酸(RNA或DNA)可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送媒介物来递送。可替代地，核酸内切酶多肽可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送媒介物，例如电穿孔或脂质纳米颗粒来递送。在进一步的替代方面，DNA核酸内切酶可以作为一种或多种多肽，单独或者与一种或多种向导RNA、或一种或多种crRNA连同tracrRNA一起预复合地递送。
多核苷酸可以通过非病毒递送媒介物来递送，所述非病毒递送媒介物包括但不限于纳米颗粒、脂质体、核糖核蛋白、带正电荷的肽、小分子RNA-缀合物、适体-RNA嵌合体和RNA融合蛋白复合物。一些示例性的非病毒递送媒介物在Peer和Lieberman，Gene Therapy，18: 1127–1133(2011)(其集中于用于siRNA的非病毒递送媒介物，其也可用于递送其它多核苷酸)中进行描述。
多核苷酸，例如向导RNA、sgRNA和编码核酸内切酶的mRNA，可以通过脂质纳米颗粒(LNP)递送至细胞或患者。
LNP指直径小于1000 nm、500 nm、250 nm、200 nm、150 nm、100 nm、75 nm、50 nm或25 nm的任何颗粒。可替代地，纳米颗粒的大小范围可以是1-1000 nm、1-500 nm、1-250 nm、25-200 nm、25-100 nm、35-75 nm或25-60 nm。
LNP可以由阳离子、阴离子或中性脂质制备。中性脂质，例如致融磷脂DOPE或膜组分胆固醇，可以作为‘辅助脂质’包括在LNP中，以增强转染活性和纳米颗粒稳定性。阳离子脂质的局限性包括由于弱稳定性和快速清除的低功效，以及炎性或抗炎应答的生成。
LNP也可以由疏水性脂质、亲水性脂质、或疏水性脂质和亲水性脂质两者组成。
本领域已知的任何脂质或脂质组合都可以用于产生LNP。用于产生LNP的脂质的实例是：DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC-胆固醇、DOTAP-胆固醇、GAP-DMORIE–DPyPE和GL67A–DOPE–DMPE–聚乙二醇(PEG)。阳离子脂质的实例是：98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA(MC3)、XTC、MD1和7C1。中性脂质的实例是：DPSC、DPPC、POPC、DOPE和SM。PEG修饰的脂质的实例是：PEG-DMG、PEG-CerC14和PEG-CerC20。
脂质可以以任何数目的摩尔比组合，以产生LNP。另外，多核苷酸可以以广泛范围的摩尔比与脂质组合，以产生LNP。
如先前所述，定点多肽和基因组靶向核酸可以各自分开施用于细胞或患者。另一方面，定点多肽可以与一种或多种向导RNA、或者一种或多种crRNA连同tracrRNA一起预复合。然后可以将预复合材料施用于细胞或患者。此类预复合材料被称为核糖核蛋白颗粒(RNP)。
RNA能够与RNA或DNA形成特异性相互作用。尽管这种特性用于许多生物学过程中，但它也伴随着在富含核酸的细胞环境中的混杂相互作用的风险。这个问题的一种解决方案是形成核糖核蛋白颗粒(RNP)，其中RNA与核酸内切酶预复合。RNP的另一个益处是保护RNA免受降解。
RNP中的核酸内切酶可以是修饰的或未修饰的。同样地，gRNA、crRNA、tracrRNA或sgRNA可以是修饰的或未修饰的。众多修饰是本领域已知的并且可以使用。
核酸内切酶和sgRNA一般可以以1：1的摩尔比组合。可替代地，核酸内切酶、crRNA和tracrRNA一般可以以1：1：1的摩尔比组合。然而，广泛范围的摩尔比可以用于生产RNP。
AAV(腺相关病毒)
重组腺相关病毒(AAV)载体可以用于递送。产生rAAV颗粒的技术是本领域的标准技术，其中将包括待递送的多核苷酸、rep和cap基因、以及辅助病毒功能的待包装AAV基因组提供给细胞。rAAV的生产通常要求下述组分存在于单一细胞(在本文中称为包装细胞)内：rAAV基因组、与rAAV基因组分开(即不在其中)的AAV rep和cap基因、以及辅助病毒功能。AAVrep和cap基因可以来自重组病毒可以衍生自其的任何AAV血清型，并且可以来自与rAAV基因组ITR不同的AAV血清型，包括但不限于本文所述的AAV血清型。假型rAAV的生产公开于例如国际专利申请公开号WO 01/83692中。
AAV血清型
包装编码本公开内容的组合物，例如本公开内容的核酸内切酶、供体序列或RNA向导分子的多核苷酸的AAV颗粒，可以包含或衍生自任何天然或重组AAV血清型。根据本公开内容，AAV颗粒可以利用或基于选自下述血清型中任一的血清型，以及其变体，包括但不限于AAV1、AAV10、AAV106.1/hu.37、AAV11、AAV114.3/hu.40、AAV12、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.1/hu.43、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV16.12/hu.11、AAV16.3、AAV16.8/hu.10、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2、AAV2.5T、AAV2-15/rh.62、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV2-3/rh.61、AAV24.1、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV27.3、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV2G9、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV3、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-11/rh.53、AAV3-3、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV3-9/rh.52、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV4-19/rh.55、AAV42.12、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV4-4、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV4-8/r11.64、AAV4-8/rh.64、AAV4-9/rh.54、AAV5、AAV52.1/hu.20、AAV52/hu.19、AAV5-22/rh.58、AAV5-3/rh.57、AAV54.1/hu.21、AAV54.2/hu.22、AAV54.4R/hu.27、AAV54.5/hu.23、AAV54.7/hu.24、AAV58.2/hu.25、AAV6、AAV6.1、AAV6.1.2、AAV6.2、AAV7、AAV7.2、AAV7.3/hu.7、AAV8、AAV-8b、AAV-8h、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAV-b、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAV-h、AAVH-1/hu.1、AAVH2、AAVH-5/hu.3、AAVH6、AAVhE1.1、AAVhER1.14、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhER1.23、AAVhEr1.35、AAVhEr1.36、AAVhEr1.5、AAVhEr1.7、AAVhEr1.8、AAVhEr2.16、AAVhEr2.29、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhEr2.4、AAVhEr3.1、AAVhu.1、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.11、AAVhu.12、AAVhu.13、AAVhu.14/9、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.19、AAVhu.2、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.3、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.4、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.5、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.53、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.6、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.7、AAVhu.8、AAVhu.9、AAVhu.t 19、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVLG-9/hu.39、AAV-LK01、AAV-LK02、AAVLK03、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAVN721-8/rh.43、AAV-PAEC、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAVpi.1、AAVpi.2、AAVpi.3、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.2、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.2R、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.43、AAVrh.44、AAVrh.45、AAVrh.46、AAVrh.47、AAVrh.48、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.50、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.55、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.59、AAVrh.60、AAVrh.61、AAVrh.62、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.65、AAVrh.67、AAVrh.68、AAVrh.69、AAVrh.70、AAVrh.72、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、BAAV、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、牛AAV、山羊AAV、日本AAV 10、真实类型AAV(ttAAV)、UPENN AAV 10、AAV-LK16、AAAV、AAV穿梭100-1、AAV穿梭100-2、AAV穿梭100-3、AAV穿梭100-7、AAV穿梭10-2、AAV穿梭10-6、AAV穿梭10-8、AAV SM 100-10、AAV SM 100-3、AAV SM 10-1、AAV SM 10-2和/或AAV SM 10-8。
在一些实例中，如通过N Pulicherla等人(Molecular Therapy 19(6):1070-1078(2011)描述的，AAV血清型可以是或具有AAV9序列中的突变，例如但不限于AAV9.9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84。
在一些实例中，AAV血清型可以是或具有如美国专利号US 6156303中所述的序列，例如但不限于AAV3B(US 6156303的SEQ ID NO：1和10)、AAV6(US 6156303的SEQ ID NO：2、7和11)、AAV2(US 6156303的SEQ ID NO：3和8)、AAV3A(US 6156303的SEQ ID NO：4和9)或其衍生物。
在一些实例中，血清型可以是AAVDJ或其变体，例如AAVDJ8(或AAV-DJ8)，如通过Grimm等人(Journal of Virology 82(12): 5887-5911(2008))描述的。AAVDJ8的氨基酸序列可以包含两个或更多个突变，以便去除肝素结合结构域(HBD)。作为非限制性实例，在美国专利号7,588,772中描述为SEQ ID NO：1的AAV-DJ序列可以包含两个突变：(1)R587Q，其中在氨基酸587处的精氨酸(R；Arg)变成谷氨酰胺(Q；Gln)，以及(2)R590T，其中在氨基酸590处的精氨酸(R；Arg)变成苏氨酸(T；Thr)。作为另一个非限制性实例，可以包含三个突变：(1)K406R，其中在氨基酸406处的赖氨酸(K；Lys)变成精氨酸(R；Arg)，(2)R587Q，其中在氨基酸587处的精氨酸(R；Arg)变成谷氨酰胺(Q；Gln)，以及(3)R590T，其中在氨基酸590处的精氨酸(R；Arg)变成苏氨酸(T；Thr)。
在一些实例中，AAV血清型可以是或具有如国际公开号WO2015121501中所述的序列，例如但不限于真实类型AAV(ttAAV)(WO2015121501的SEQ ID NO：2)、“UPenn AAV10”(WO2015121501的SEQ ID NO：8)、“日本AAV10”(WO2015121501的SEQ ID NO：9)或其变体。
根据本公开内容，AAV衣壳血清型选择或用途可以来自各种物种。在一个实例中，AAV可以是禽类AAV(AAAV)。AAAV血清型可以是或具有如美国专利号US 9238800中所述的序列，例如但不限于AAAV(美国专利9,238,800的SEQ ID NO：1、2、4、6、8、10、12和14)或其变体。
在一个实例中，AAV可以是牛AAV(BAAV)。BAAV血清型可以是或具有如美国专利号US 9,193,769中所述的序列，例如但不限于BAAV(US 9193769的SEQ ID NO：1和6)或其变体。BAAV血清型可以是或具有如美国专利号US7427396中所述的序列，例如但不限于BAAV(US7427396的SEQ ID NO：5和6)或其变体。
在一个实例中，AAV可以是山羊AAV。山羊AAV血清型可以是或具有如美国专利号US7427396中所述的序列，例如但不限于山羊AAV(US7427396的SEQ ID NO：3)或其变体。
在其它实例中，AAV可以被改造为来自两种或更多种亲本血清型的杂合AAV。在一个实例中，AAV可以是AAV2G9，其包含来自AAV2和AAV9的序列。AAV2G9 AAV血清型可以是或具有如美国专利公开号US20160017005中所述的序列。
在一个实例中，AAV可以是由AAV9衣壳文库生成的血清型，其具有氨基酸390-627(VP1编号)中的突变，如通过Pulicherla等人(Molecular Therapy 19(6):1070-1078(2011)描述的。血清型以及相应的核苷酸和氨基酸取代可以是但不限于，AAV9.1(G1594C；D532H)、AAV6.2(T1418A和T1436X；V473D和I479K)、AAV9.3(T1238A；F413Y)、AAV9.4(T1250C和A1617T；F417S)、AAV9.5(A1235G、A1314T、A1642G、C1760T；Q412R、T548A、A587V)、AAV9.6(T1231A；F411I)、AAV9.9(G1203A、G1785T；W595C)、AAV9.10(A1500G、T1676C；M559T)、AAV9.11(A1425T、A1702C、A1769T；T568P、Q590L)、AAV9.13(A1369C、A1720T；N457H、T574S)、AAV9.14(T1340A、T1362C、T1560C、G1713A；L447H)、AAV9.16(A1775T；Q592L)、AAV9.24(T1507C、T1521G；W503R)、AAV9.26(A1337G、A1769C；Y446C、Q590P)、AAV9.33(A1667C；D556A)、AAV9.34(A1534G、C1794T；N512D)、AAV9.35(A1289T、T1450A、C1494T、A1515T、C1794A、G1816A；Q430L、Y484N、N98K、V606I)、AAV9.40(A1694T、E565V)、AAV9.41(A1348T、T1362C；T450S)、AAV9.44(A1684C、A1701T、A1737G；N562H、K567N)、AAV9.45(A1492T、C1804T；N498Y、L602F)、AAV9.46(G1441C、T1525C、T1549G；G481R、W509R、L517V)、9.47(G1241A、G1358A、A1669G、C1745T；S414N、G453D、K557E、T582I)、AAV9.48(C1445T、A1736T；P482L、Q579L)、AAV9.50(A1638T、C1683T、T1805A；Q546H、L602H)、AAV9.53(G1301A、A1405C、C1664T、G1811T；R134Q、S469R、A555V、G604V)、AAV9.54(C1531A、T1609A；L511I、L537M)、AAV9.55(T1605A；F535L)、AAV9.58(C1475T、C1579A；T492I、H527N)、AAV.59(T1336C；Y446H)、AAV9.61(A1493T；N498I)、AAV9.64(C1531A、A1617T；L511I)、AAV9.65(C1335T、T1530C、C1568A；A523D)、AAV9.68(C1510A；P504T)、AAV9.80(G1441A,；G481R)、AAV9.83(C1402A、A1500T；P468T、E500D)、AAV9.87(T1464C、T1468C；S490P)、AAV9.90(A1196T；Y399F)、AAV9.91(T1316G、A1583T、C1782G、T1806C；L439R、K528I)、AAV9.93(A1273G、A1421G、A1638C、C1712T、G1732A、A1744T、A1832T；S425G、Q474R、Q546H、P571L、G578R、T582S、D611V)、AAV9.94(A1675T；M559L)和AAV9.95(T1605A；F535L)。
在一个实例中，AAV可以是包含至少一个AAV衣壳CD8+ T细胞表位的血清型。作为非限制性实例，血清型可以是AAV1、AAV2或AAV8。
在一个实例中，AAV可以是变体，例如PHP.A或PHP.B，如Deverman. 2016. NatureBiotechnology. 34(2): 204-209中描述的。
在一个实例中，AAV可以是选自SEQ ID NO：4697-5265和表3中发现的任何血清型。
在一个实例中，AAV可以由如SEQ ID NO：4697-5265和表3中所述的序列、片段或变体编码。
生成包装细胞的方法涉及产生稳定表达用于AAV颗粒生产的所有必需组分的细胞系。例如，将质粒(或多重质粒)整合到细胞的基因组内，所述质粒包含缺少AAV rep和cap基因的rAAV基因组、与rAAV基因组分开的AAV rep和cap基因、以及可选择标记物例如新霉素抗性基因。AAV基因组已通过程序引入细菌质粒内，所述程序例如GC加尾(Samulski等人，1982，Proc. Natl. Acad. S6. USA，79:2077-2081)、含有限制性核酸内切酶切割位点的合成接头的添加(Laughlin等人，1983，Gene，23:65-73)、或通过直接的平端连接(Senapathy& Carter，1984，J. Biol. Chem.，259:4661-4666)。然后可以用辅助病毒，例如腺病毒感染包装细胞系。这种方法的优点在于细胞是可选择的，并且适合于rAAV的大规模生产。合适方法的其它实例采用腺病毒或杆状病毒而不是质粒，以将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞内。
rAAV生产的一般原理在例如以下中进行综述：Carter，1992，Current Opinionsin Biotechnology，1533-539；以及Muzyczka，1992，Curr. Topics in Microbial. andImmunol.，158:97-129)。各种方法在以下中进行描述：Ratschin等人，Mol. Cell. Biol.4:2072(1984)；Hermonat等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81:6466(1984)；Tratschin等人，Mo1. Cell. Biol. 5:3251(1985)；McLaughlin等人，J. Virol.，62:1963(1988)；以及Lebkowski等人，1988 Mol. Cell. Biol.，7:349(1988). Samulski等人(1989，J.Virol.，63:3822-3828)；美国专利号5,173,414；WO 95/13365和相应的美国专利号5,658.776 ；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人(1995)Vaccine 13:1244-1250；Paul等人(1993)HumanGene Therapy 4:609-615；Clark等人(1996)Gene Therapy 3:1124-1132；美国专利号5,786,211；美国专利号5,871,982；以及美国专利号6,258,595。
AAV载体血清型可以与靶细胞类型相匹配。例如，下述示例性细胞类型可以尤其通过指示的AAV血清型等进行转导。
表3：组织/细胞类型和血清型
组织/细胞类型 血清型
肝 AAV3、AA5、AAV8、AAV9
骨骼肌 AAV1、AAV7、AAV6、AAV8、AAV9
中枢神经系统 AAV1、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9
RPE AAV5、AAV4、AAV2、AAV8、AAV9　　AAVrh8r
感光细胞 AAV5 、AAV8、AAV9、AAVrh8R
肺 AAV9、AAV5
心脏 AAV8
胰腺 AAV8
肾 AAV2、AAV8
除腺相关病毒载体之外，还可以使用其它病毒载体。此类病毒载体包括但不限于慢病毒、α病毒、肠病毒、瘟病毒、杆状病毒、疱疹病毒、EB病毒、乳多空病毒(papovavirusr)、痘病毒、牛痘病毒和单纯疱疹病毒。
在一些情况下，Cas9 mRNA、靶向USH2A基因中的一个或两个基因座的sgRNA和供体DNA可以各自分开配制到脂质纳米颗粒内，或全部共配制到一种脂质纳米颗粒内。
在一些情况下，Cas9 mRNA可以配制到脂质纳米颗粒中，而sgRNA和供体DNA可以在AAV载体中递送。
选项可用于递送作为DNA质粒、mRNA或蛋白质的Cas9核酸酶。向导RNA可以由相同的DNA表达，或者也可以作为RNA递送。RNA可以进行化学修饰，以改变或改善其半衰期、或者减少免疫应答的可能性或程度。核酸内切酶蛋白可以在递送之前与gRNA复合。病毒载体允许有效递送；Cas9和Cas9的较小直向同源物的拆分形式可以包装在AAV中，如用于HDR的供体一样。还存在可以递送这些组分中的每一种的一系列非病毒递送方法，或者可以串联采用非病毒方法和病毒方法。例如，纳米颗粒可以用于递送蛋白质和向导RNA，而AAV可以用于递送供体DNA。
慢病毒
在一些方面，慢病毒载体或颗粒可以用作递送媒介物。慢病毒是逆转录病毒科的亚组。慢病毒颗粒能够将其遗传材料整合到靶/宿主细胞的基因组内。慢病毒的实例包括人免疫缺陷病毒：HIV-1和HIV-2、Jembrana病病毒(JDV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、马传染性贫血病毒、visna-maedi和山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)。由于其通过靶细胞的完整核膜的独特能力，LV能够感染分裂细胞和非分裂细胞两者，Greenberg等人，University of Berkeley，California；2006)。形成基因递送媒介物的慢病毒颗粒是复制缺陷的，并且通过减弱HIV毒力基因而生成。例如，基因Vpu、Vpr、Nef、Env和Tat被切除，使得载体是生物学安全的。例如，衍生自HIV-1/HIV-2的慢病毒媒介物可以介导转基因在非分裂细胞内的有效递送、整合和长期表达。如本文使用的，术语“重组”指含有慢病毒序列和非慢病毒逆转录病毒序列两者的载体或其它核酸。
为了产生能够感染宿主细胞的慢病毒，需要在产生病毒的细胞中共表达三种类型的载体：含有目的转基因和自灭活的3'-LTR区域的主链载体、表达病毒结构蛋白的一种构建体、以及编码用于封装的水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVG)的一种载体(Naldini，L.等人，Science 1996；272，263–267)。Rev基因与其它结构基因的分开通过降低反向重组的可能性进一步增加了生物安全性。可以用于产生高滴度慢病毒颗粒的细胞系可以包括但不限于293T细胞、293FT细胞和293SF-3F6细胞(Witting等人，Human Gene Therapy，2012；23:243–249；Ansorge等人，Journal of Genetic Medicine，2009；11: 868–876)。
本领域讨论了用于生成重组慢病毒颗粒的方法，例如，WO 2013076309(PCT/EP2012/073645)；WO 2009153563(PCT/GB2009/001527)；美国专利号: 7,629,153；以及6，808，905。
细胞类型例如光感受器、视网膜色素上皮和神经节细胞已用慢病毒(LV)载体成功地靶向。对光感受器和神经节细胞的递送效率用AAV明显高于LV载体。
药学上可接受的载体
向本文考虑的受试者施用祖细胞的离体方法涉及使用包含祖细胞的治疗组合物。
治疗组合物可以含有生理学上耐受的载体连同细胞组合物，以及作为活性成分溶解或分散在其中的、任选地如本文所述的至少一种另外的生物活性剂。在一些情况下，当施用于哺乳动物或人患者用于治疗目的时，治疗组合物基本上没有免疫原性，除非有此需要。
一般而言，本文所述的祖细胞可以作为具有药学上可接受的载体的悬浮液施用。本领域技术人员将认识到，待用于细胞组合物中的药学上可接受的载体不包括其量基本上干扰待递送至受试者的细胞的生存力的缓冲液、化合物、冷冻保存剂、防腐剂或其它试剂。包含细胞的制剂可以包括例如渗透性缓冲液，其允许维持细胞膜完整性，以及任选地，营养素以维持细胞生存力或在施用时增强植入物植入。此类制剂和悬浮液是本领域技术人员已知的，和/或可以使用例行实验适于与祖细胞一起使用，如本文所述。
细胞组合物也可以是乳化的或作为脂质体组合物呈现，条件是乳化程序不会不利地影响细胞生存力。细胞和任何其它活性成分可以与赋形剂混合，所述赋形剂是药学上可接受的且与活性成分相容的，并且其量适用于本文所述的治疗方法中。
细胞组合物中包括的另外试剂可以包括其中的组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与以下形成的酸加成盐(由多肽的游离氨基形成)：无机酸例如盐酸或磷酸，或者此类有机酸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等。由游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁，以及此类有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等。
生理上可耐受的载体是本领域众所周知的。示例性的液体载体是无菌水溶液，其不包含除活性成分和水之外的任何材料，或者含有缓冲液例如在生理pH值下的磷酸钠、生理盐水或两者，例如磷酸盐缓冲盐水。更进一步地，水性载体可以含有多于一种缓冲盐，以及盐例如氯化钠和氯化钾、右旋糖、聚乙二醇及其它溶质。液体组合物还可以含有除了并且排除水的液相。此类另外的液相的实例是丙三醇，植物油例如棉籽油和水油乳剂。有效治疗特定病症或状况的细胞组合物中使用的活性化合物的量可以取决于病症或状况的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。
向导RNA配制
本公开内容的向导RNA可以与药学上可接受的赋形剂一起配制，所述赋形剂例如载体、溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂等，取决于特定的施用模式和剂型。向导RNA组合物可以配制为达到生理上相容的pH，并且取决于制剂和施用途径，范围为pH约3至pH约11、约pH 3至约pH7。在一些情况下，pH可以调整至约pH 5.0至约pH 8的范围。在一些情况下，组合物可以包含治疗有效量的如本文所述的至少一种化合物，连同一种或多种药学上可接受的赋形剂。任选地，组合物可以包含本文所述的化合物的组合，或可以包括可用于治疗或预防细菌生长的第二活性成分(例如且不限于抗菌剂或抗微生物剂)，或可以包括本公开内容的试剂的组合。
合适的赋形剂包括例如载体分子，其包括大的缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和灭活的病毒颗粒。其它示例性赋形剂可以包括抗氧化剂(例如且不限于抗坏血酸)、螯合剂(例如且不限于EDTA)、碳水化合物(例如且不限于糊精、羟烷基纤维素和羟烷基甲基纤维素)、硬脂酸、液体(例如且不限于油、水、盐水、甘油和乙醇)、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等等。
施用和功效
通过导致引入的细胞在所需位点，例如损伤或修复位点处的至少部分定位，使得产生所需效应的方法或途径，在将细胞例如祖细胞置于受试者内的背景下，术语“施用”、“引入”和“移植”可以是可互换使用的。可以通过任何适当的途径施用细胞，例如祖细胞或其分化的后代，所述途径导致递送至受试者中的所需位置，在所述位置中至少一部分植入的细胞或细胞组分保持活力。在施用于受试者后，细胞的生存期可以短至几小时例如二十四小时至几天，到长达数年或甚至患者的寿命，即，长期移植物植入。例如，在本文所述的一些方面，有效量的感光细胞或视网膜祖细胞经由全身性施用途径，如腹膜内或静脉内途径施用。
通过导致引入的gRNA、sgRNA和/或核酸内切酶在所需位点，例如损伤或修复位点处的至少部分定位，使得产生所需效应的方法或途径，在将gRNA、sgRNA和核酸内切酶中的至少一种置于受试者内的背景下，术语“施用”、“引入”和“移植”也可以是可互换使用的。gRNA、sgRNA和/或核酸内切酶可以通过任何适当的途径进行施用，所述条件导致递送至受试者中的所需位置。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，并且指对于其的诊断、治疗或疗法是期望的任何受试者。在一些方面，受试者是哺乳动物。在一些方面，受试者是人类。
当在预防上提供时，本文所述的祖细胞可以在2A型乌谢尔综合征的任何症状之前施用于受试者。相应地，祖细胞群体的预防施用作用于预防2A型乌谢尔综合征。
待根据本文所述方法施用的祖细胞群体可以包含得自一个或多个供体的同种异体祖细胞。此类祖细胞可以具有任何细胞或组织起源，例如肝、肌肉、心脏等。“同种异体”指祖细胞或生物学样品包含的祖细胞得自相同物种的一个或多个不同供体，其中在一个或多个基因座处的基因是不等同的。例如，待施用于受试者的感光细胞或视网膜祖细胞群体可以衍生自一个或多个无关的供体受试者、或者衍生自一个或多个不等同的兄弟姐妹。在一些情况下，可以使用同基因的祖细胞群体，例如得自遗传上等同的动物或同卵双胞胎的那些。祖细胞可以是自体细胞；即，祖细胞得自或分离自受试者，并且施用于相同受试者，即供体和接受者是相同的。
术语“有效量”指预防或减轻2A型乌谢尔综合征的至少一种或多种体征或症状所需的祖细胞群体或其后代的量，并且涉及足够量的组合物以提供所需效应，例如治疗患有2A型乌谢尔综合征的受试者。因此，术语“治疗有效量”指这样的祖细胞或包含祖细胞的组合物的量，当施用于典型受试者，例如患有2A型乌谢尔综合征或处于2A型乌谢尔综合征的风险中的受试者时，所述量足以促进特定效应。有效量还包括这样的量，其足以预防或延迟疾病症状的发展、改变疾病症状的过程(例如但不限于减慢疾病症状的进展)、或逆转疾病症状。应理解对于任何给定的情况，通过本领域普通技术人员使用例行实验可以确定适当的“有效量”。
对于在本文所述的各个方面中的使用，祖细胞的有效量包含至少102个祖细胞、至少5 X 102个祖细胞、至少103个祖细胞、至少5 X 103个祖细胞、至少104个祖细胞、至少5 X104个祖细胞、至少105个祖细胞、至少2 X 105个祖细胞、至少3 X 105个祖细胞、至少4 X 105个祖细胞、至少5 X 105个祖细胞、至少6 X 105个祖细胞、至少7 X 105个祖细胞、至少8 X105个祖细胞、至少9 X 105个祖细胞、至少1 X 106个祖细胞、至少2 X 106个祖细胞、至少3X 106个祖细胞、至少4 X 106个祖细胞、至少5 X 106个祖细胞、至少6 X 106个祖细胞、至少7 X 106个祖细胞、至少8 X 106个祖细胞、至少9 X 106个祖细胞或其倍数。祖细胞可以衍生自一个或多个供体，或者可以得自自体来源。在本文所述的一些实例中，可以在向有此需要的受试者施用之前，在培养中扩增祖细胞。
在2A型乌谢尔综合征患者的细胞中表达的功能性usherin蛋白的水平中的适度和增量增加，对于改善疾病的一种或多种症状、增加长期存活、和/或降低与其它治疗相关的副作用可以是有益的。在此类细胞施用于人患者后，产生功能性usherin蛋白的增加水平的祖细胞的存在是有益的。在一些情况下，相对于治疗受试者中的总usherin，受试者的有效治疗产生至少约3%、5%或7%的功能性usherin蛋白。在一些实例中，功能性usherin是总usherin的至少约10%。在一些实例中，功能性usherin蛋白是总usherin蛋白的至少约20%至30%。相似地，具有功能性usherin蛋白的显著升高水平的甚至相对有限的细胞亚群的引入在各种患者中可以是有益的，因为在一些情况下，标准化的细胞具有相对于患病细胞的选择优势。然而，即使具有升高水平的功能性usherin蛋白的祖细胞的适度水平，对于改善患者中的2A型乌谢尔综合征的一个或多个方面也可以是有益的。在一些实例中，此类细胞施用于其的患者中约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%或更多的感光细胞或视网膜祖细胞，产生增加水平的功能性usherin蛋白。
“施用的”指通过导致细胞组合物在所需位点处的至少部分定位的方法或途径，将祖细胞组合物递送到受试者内。可以通过导致受试者中的有效治疗的任何适当途径来施用细胞组合物，即，施用导致递送至受试者中的所需位置，在所述位置中递送的至少一部分组合物，即至少1 x 104个细胞递送至所需位点一段时间。
在该方法的一个方面，药物组合物可以经由例如但不限于以下的途径进行施用：肠内(进入肠内)、胃肠、硬膜外(进入硬脑膜内)、经口(通过口)、透皮、硬膜外、大脑内(进入大脑内)、脑室内(进入脑室内)、表皮(施加到皮肤上)、真皮内(进入皮肤本身内)、皮下(在皮肤下)、鼻施用(通过鼻)、静脉内(进入静脉内)、静脉内推注、静脉内滴注、动脉内(进入动脉内)、肌内(进入肌肉内)、心内(进入心脏内)、骨内输注(进入骨髓内)、鞘内(进入椎管内)、腹膜内(输注或注射到腹膜内)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼)、海绵体内注射(进入病理腔内)、腔内(进入阴茎基部内)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、透皮(扩散通过完整皮肤用于全身分布)、经粘膜(扩散通过粘膜)、经阴道、吹入(鼻吸)、舌下、唇下、灌肠、滴眼剂(在结膜上)、滴耳剂中、耳(耳内或通过耳)、颊(朝向脸颊)、结膜、皮肤、齿(至一个或多个牙齿)、电渗透、子宫颈内、鼻窦内、气管内、体外、血液透析、渗透、间质、腹内、羊膜内、关节内、胆内、支气管内、囊内(intrabursal)、软骨内(在软骨内)、尾部内(在马尾神经内)、脑池内(在小脑延髓池内)、角膜内(在角膜内)、牙冠内、冠状动脉内(在冠状动脉内)、阴茎海绵体内(在阴茎海绵体的可膨胀空间内)、椎间盘内(在椎间盘内)、管内(在腺管内)、十二指肠内(在十二指肠内)、硬膜内(在硬脑膜内或下方)、表皮内(至表皮)、食道内(至食道)、胃内(在胃内)、牙龈内(在牙龈内)、回肠内(在小肠的远侧部内)、病灶内(在局部病灶内或直接引入局部病灶)、管腔内(在管腔内)、淋巴管内(在淋巴内)、髓内(在骨髓腔内)、脑膜内(在脑膜内)、心肌内(在心肌内)、眼内(在眼内)、卵巢内(在卵巢内)、心包内(在心包膜内)、胸膜内(在胸膜内)、前列腺内(在前列腺内)、肺内(在肺或其支气管内)、窦内(在鼻窦或眶周窦内)、脊柱内(在脊柱内)、滑膜内(在关节的滑膜腔内)、腱内(在腱内)、睾丸内(在睾丸内)、鞘内(在任何水平的脑脊髓轴处的脑脊液内)、胸腔内(在胸腔内)、小管内(在器官的小管内)、肿瘤内(在肿瘤内)、鼓室内(在中耳(aurus media)内)、血管内(在一个或多个血管内)、心室内(在心室内)、离子电渗疗法(借助于电流，其中可溶性盐的离子迁移到机体组织内)、冲洗(以浸泡或冲洗开放性伤口或体腔)、喉(直接在喉上)、鼻胃(通过鼻并进入胃内)、封闭敷料技术(局部途径施用，其然后通过封闭该部位的敷料覆盖)、眼睛(至外部眼)、口咽(直接至口和咽)、肠胃外、经皮、关节周、硬膜外、神经周、牙周、直肠、呼吸器官(通过经口或鼻吸入呼吸道内，用于局部或全身效应)、眼球后(在脑桥后或在眼球后)、心肌内(进入心肌)、软组织、蛛网膜下、结膜下、粘膜下、局部、经胎盘(通过或跨越胎盘)、经气管(通过气管壁)、经鼓膜(跨越或通过鼓室腔)、输尿管(至输尿管)、尿道(至尿道)、阴道、骶管阻滞、诊断、神经阻滞、胆灌注、心脏灌注、光分离置换法(photopheresis)和脊柱。
施用模式包括注射、输注、滴注和/或摄入。“注射”包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、视网膜下、蛛网膜下、脊柱内、脑脊髓内(intracerebro spinal)、以及胸骨内注射和输注。在一些实例中，途径是静脉内的。对于细胞的递送，可以进行通过注射或输注的施用。对于gRNA、Cas9和供体模板的递送，施用可以是通过注射到视网膜下空间内，紧密接近光感受器。
细胞可以是全身施用的。短语“全身施用”、“全身性施用”、“外周施用”和“外周地施用”指除直接进入靶部位、组织或器官内的祖细胞群体施用，使得代替地，它进入受试者的循环系统，并且因此经受新陈代谢及其它类似过程。
包含用于治疗2A型乌谢尔综合征的组合物的治疗的功效可以由熟练的临床医生确定。然而，如果功能性usherin水平的任何一种或所有体征或症状(仅作为一个实例)以有益的方式改变(例如，增加至少10%)，或者其它临床上接受的疾病症状或标记物得到改进或改善，则该治疗被视为“有效治疗”。功效还可以通过个体恶化的失败进行测量，如果通过住院治疗或需要医学干预评价的(例如，疾病进展停止或至少减慢)。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述的。治疗包括个体或动物(一些非限制性实例包括人或哺乳动物)中的疾病的任何治疗，并且包括：(1)抑制疾病，例如，阻止或减缓症状的进展；或(2)缓解疾病，例如引起症状消退；以及(3)预防或降低症状发展的可能性。
根据本公开内容的治疗可以通过增加、减少或改变个体中功能性usherin的量，来改善与2A型乌谢尔综合征相关的一种或多种症状。通常与2A型乌谢尔综合征相关的体征包括例如听力丧失和称为色素性视网膜炎的眼病症，其引起夜盲症以及通过视网膜的进行性变性的周边视力丧失。许多患有乌谢尔综合征的人也具有严重的平衡问题。
试剂盒
本公开内容提供了用于进行本文描述的方法的试剂盒。试剂盒可以包括以下中的一种或多种：基因组靶向核酸、编码基因组靶向核酸的多核苷酸、定点多肽、编码定点多肽的多核苷酸、和/或进行本文所述方法的方面所需的任何核酸或蛋白质分子、或其任何组合。
试剂盒可以包含：(1)包含编码基因组靶向核酸的核苷酸序列的载体，(2)定点多肽或包含编码定点多肽的核苷酸序列的载体，和(3)用于重构和/或稀释载体和/或多肽的试剂。
试剂盒可以包含：(1)载体，其包含(i)编码基因组靶向核酸的核苷酸序列，和(ii)编码定点多肽的核苷酸序列；以及(2)用于重构和/或稀释载体的试剂。
在任何上述试剂盒中，试剂盒可以包含靶向基因组的单分子向导核酸。在任何上述试剂盒中，试剂盒可以包含双分子基因组靶向核酸。在任何上述试剂盒中，试剂盒可以包含一种或多种双分子向导或单分子向导。试剂盒可以包含编码核酸靶向核酸的载体。
在任何上述试剂盒中，试剂盒可以进一步包含待插入以实现所需遗传修饰的多核苷酸。
试剂盒的组分可以在分开的容器中，或组合在单个容器中。
上述任何试剂盒可以进一步包含一种或多种另外的试剂，其中此类另外的试剂选自缓冲液、用于将多肽或多核苷酸引入细胞内的缓冲液、洗涤缓冲液、对照试剂、对照载体、对照RNA多核苷酸、用于从DNA体外生产多肽的试剂、用于测序的衔接子等等。缓冲液可以是稳定化缓冲液、重构缓冲液、稀释缓冲液等。试剂盒还可以包含一种或多种组分，所述组分可以用于促进或增强中靶结合或通过核酸内切酶的DNA切割，或改善靶向特异性。
除上述组分之外，试剂盒可以进一步包含关于使用试剂盒的组分来实践方法的说明书。用于实践该方法的说明书可以记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在基材如纸或塑料等上。说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中，在试剂盒或其组分的容器的标签中(即，与包装或子包装相关)等。说明书可以作为电子存储数据文件存在于合适的计算机可读存储介质上，所述介质例如CD-ROM、软盘、闪存驱动器等。在一些情况下，实际的说明书不存在于试剂盒中，而是可以提供用于从远程来源(例如，经由因特网)获得说明书的手段。此类情况的实例是包含网址的试剂盒，在所述网址中可以查看说明书和/或可以由其下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的这种手段可以记录在合适的基材上。
另外的治疗方法
可以使用改造为靶向特异性序列的核酸酶进行基因编辑。迄今为止，存在四个主要类型的核酸酶：大范围核酸酶及其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子如效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas9核酸酶系统。核酸酶平台在设计难度、靶向密度和作用模式方面不同，特别是ZFN和TALEN的特异性是通过蛋白质-DNA相互作用，而RNA-DNA相互作用主要引导Cas9。Cas9切割还需要相邻基序PAM，其在不同的CRISPR系统之间不同。来自化脓性链球菌的Cas9使用NGG PAM切割，来自脑膜炎奈瑟菌的CRISPR可以用包括NNNNGATT、NNNNNGTTT和NNNNGCTT的PAM在位点处切割。许多其它Cas9直向同源物靶向与替代PAM相邻的前间隔区。
CRISPR内切酶，例如Cas9，可以用于本公开内容的方法中。然而，本文所述的教导例如治疗靶位点，可以应用于其它形式的核酸内切酶，例如ZFN、TALEN、HE或MegaTAL，或使用核酸酶的组合。然而，为了将本公开内容的教导应用于此类核酸内切酶，尤其需要改造针对特异性靶位点的蛋白质。
另外的结合结构域可以与Cas9蛋白融合以增加特异性。这些构建体的靶位点将映射到鉴定的gRNA指定位点，但需要另外的结合基序，例如锌指结构域。在Mega-TAL的情况下，大范围核酸酶可以与TALE DNA结合结构域融合。大范围核酸酶结构域可以增加特异性并提供切割。类似地，失活或死亡的Cas9(dCas9)可以与切割结构域融合，并且需要sgRNA/Cas9靶位点和用于融合的DNA结合结构域的相邻结合位点。除无催化活性之外，这可能还需要dCas9的一些蛋白质改造，以减少没有另外结合位点的结合。
锌指核酸酶
锌指核酸酶(ZFN)是包含与II型核酸内切酶FokI的催化结构域连接的改造的锌指DNA结合结构域的模块化蛋白质。因为FokI仅作为二聚体有功能，所以必须改造一对ZFN，以与相对的DNA链上的同源靶“半位点”序列结合，并且在它们之间具有精确的间隔，以致使形成催化活性的FokI二聚体。在其本身没有序列特异性的FokI结构域二聚化后，作为基因组编辑中的开始步骤，在ZFN半位点之间生成DNA双链断裂。
每个ZFN的DNA结合结构域通常由丰富的Cys2-His2体系结构的3-6个锌指组成，其中每个指主要识别靶DNA序列的一条链上的核苷酸的三联体，尽管与第四个核苷酸的交叉链相互作用也可以是重要的。指在与DNA进行关键接触的位置中的氨基酸改变，改变给定指的序列特异性。因此，四指锌指蛋白将选择性识别12 bp的靶序列，其中靶序列是由每个指贡献的三联体偏好的复合物，尽管三联体偏好可以受到相邻指的不同程度影响。ZFN的一个重要方面在于，简单地通过修饰个别指，可以容易地将它们重新靶向到几乎任何基因组地址，尽管要做到这一点需要相当多的专业知识。在ZFN的大多数应用中，使用分别识别12-18bp，4-6个指的蛋白质。因此，一对ZFN通常识别24-36 bp的组合靶序列，不包括半位点之间的通常5-7 bp间隔区。结合位点可以用包括15-17 bp的更大间隔区进一步分开。假设在设计过程期间排除了重复序列或基因同源物，这个长度的靶序列很可能在人基因组中是唯一的。然而，ZFN蛋白-DNA相互作用在其特异性方面并不是绝对的，因此脱靶结合和切割事件的确发生，或者是作为两个ZFN之间的异二聚体，或者是作为ZFN之一或另一个的同二聚体。通过改造FokI结构域的二聚化界面，以产生“正”和“负”变体(也称为专性异二聚体变体)，所述变体只能与彼此二聚化，而不能与其自身二聚化，已有效地消除了后面一种可能性。强迫专性异二聚体阻止同二聚体的形成。这已极大地增强了ZFN以及采用这些FokI变体的任何其它核酸酶的特异性。
各种基于ZFN的系统已在本领域中得到描述，经常报告其修改，并且众多参考文献描述了用于指导ZFN设计的规则和参数；参见例如，Segal等人，Proc Natl Acad Sci USA96(6):2758-63(1999)；Dreier B等人，J Mol Biol 303(4):489-502(2000)；Liu Q等人，JBiol Chem 277(6):3850-6(2002)；Dreier等人，J Biol Chem 280(42):35588-97(2005)；以及Dreier等人，J Biol Chem 276(31):29466-78(2001)。
转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)
转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)代表模块化核酸酶的另一种形式，由此与ZFN一样，改造的DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域连接，并且一对TALEN串联操作以实现靶向的DNA切割。与ZFN的主要区别在于DNA结合结构域的性质、以及相关的靶DNA序列识别特性。TALEN DNA结合结构域衍生自TALE蛋白，所述TALE蛋白最初在植物细菌病原体黄单胞菌属(Xanthomonas)物种中描述。TALE由33-35个氨基酸重复的串联阵列组成，其中每个重复识别靶DNA序列中通常长度至多20 bp的单个碱基对，给出至多40 bp的总靶序列长度。每个重复的核苷酸特异性由重复可变双残基(RVD)决定，所述重复可变双残基仅包括在位置12和13处的两个氨基酸。碱基鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶占优势地分别由四个RVD识别：Asn-Asn、Asn-Ile、His-Asp和Asn-Gly。这构成了比锌指简单得多的识别编码，并且因此代表对于核酸酶设计超过锌指的优点。然而，与ZFN一样，TALEN的蛋白质-DNA相互作用在其特异性方面也不是绝对的，并且TALEN也已受益于FokI结构域的专性异二聚体变体的使用，以降低脱靶活性。
已产生了在其催化功能中去活性的FokI结构域的另外变体。如果TALEN或ZFN对中的一半含有无活性的FokI结构域，则在靶位点处仅发生单链DNA切割(切口)，而不是DSB。结果与使用CRISPR/Cas9/Cpf1“切口酶”突变体(其中Cas9切割结构域之一已去活性)可比较。DNA切口可以用于通过HDR驱动基因组编辑，但效率比DSB低。与倾向于NHEJ介导的错误修复的DSB不同，主要益处在于脱靶切口快速而准确地修复。
各种基于TALEN的系统已在本领域中得到描述，并且经常报告其修改；参见例如，Boch，Science 326(5959):1509-12(2009)；Mak等人，Science 335(6069):716-9(2012)；以及Moscou等人，Science 326(5959):1501(2009)。基于"Golden Gate"平台或克隆方案的TALEN的使用已通过多个团体进行描述；参见例如，Cermak等人，Nucleic Acids Res 39(12):e82(2011)；Li等人，Nucleic Acids Res. 39(14):6315-25(2011)；Weber等人，PLoSOne. 6(2): e16765(2011)；Wang等人，J Genet Genomics 41(6):339-47，Epub 2014 May17(2014)；以及Cermak T等人，Methods Mol Biol 1239:133-59(2015)。
归巢核酸内切酶
归巢核酸内切酶(HE)是序列特异性核酸内切酶，其具有长识别序列(14-44个碱基对)，并且经常在基因组中独特的位点处以高特异性切割DNA。存在如按其结构分类的至少六个已知的HE家族，包括LAGLIDADG(SEQ ID NO: 5271)、GIY-YIG、His-Cis box、H-N-H、PD-(D/E)xK和Vsr样，其衍生自广泛范围的宿主，包括真核生物、原生生物、细菌、古细菌、蓝菌和噬菌体。与ZFN和TALEN一样，作为基因组编辑中的开始步骤，HE可以用于在靶基因座处产生DSB。另外，一些天然的和改造的HE仅切割DNA的单链，从而充当位点特异性切口酶。HE的大的靶序列以及它们提供的特异性，已使得它们成为产生位点特异性DSB的有吸引力的候选物。
各种基于HE的系统已在本领域中得到描述，并且经常报告其修改；参见例如，通过Steentoft等人，Glycobiology 24(8):663-80(2014)；Belfort和Bonocora，Methods MolBiol. 1123:1-26(2014)；Hafez和Hausner，Genome 55(8):553-69(2012)的综述。
MegaTAL/Tev-mTALEN/MegaTev
作为杂合核酸酶的进一步实例，MegaTAL平台和Tev-mTALEN平台使用TALE DNA结合结构域和催化活性HE的融合物，利用了TALE的可调DNA结合和特异性两者，以及HE的切割序列特异性；参见例如，Boissel等人，NAR 42: 2591-2601(2014)；Kleinstiver等人，G3 4:1155-65(2014)；以及Boissel和Scharenberg，Methods Mol. Biol. 1239: 171-96(2015)。
在进一步的变化中，MegaTev体系结构是大范围核酸酶(Mega)与衍生自GIY-YIG归巢核酸内切酶I-TevI(Tev)的核酸酶结构域的融合物。两个活性位点在DNA底物上相隔∼30bp放置，并且生成具有不相容粘端的两个DSB；参见例如，Wolfs等人，NAR 42，8816-29(2014)。预料现有基于核酸酶的方法的其它组合将发展，并且可用于实现本文所述的靶向基因组修饰。
dCas9-FokI或dCpf1-Fok1及其它核酸酶
组合上述核酸酶平台的结构和功能特性，提供了基因组编辑的进一步方法，其可以潜在地克服一些固有缺陷。例如，CRISPR基因组编辑系统通常使用单个Cas9核酸内切酶来产生DSB。靶向的特异性由向导RNA中的20或24个核苷酸的序列驱动，所述序列经历与靶DNA的沃森-克里克碱基配对(在来自化脓性链球菌的Cas9的情况下，加上相邻NAG或NGG PAM序列中的另外2个碱基)。此类序列足够长，以在人基因组中是唯一的，然而，RNA/DNA相互作用的特异性并不是绝对的，其中明显的混杂有时是耐受的，特别是在靶序列的5'一半中，有效地降低了驱动特异性的碱基数目。这点的一种解决方案是使Cas9或Cpf1催化功能完全去活性– 仅保留RNA引导的DNA结合功能 – 并且代替地，使FokI结构域与去活性的Cas9融合；参见例如，Tsai等人，Nature Biotech 32: 569-76(2014)；以及Guilinger等人，NatureBiotech 32: 577-82(2014)。因为FokI必须二聚化以变得催化活性，所以需要两个向导RNA来栓系紧密接近的两个FokI融合物，以形成二聚体，并切割DNA。这使组合的靶位点中的碱基数目基本上倍增，从而增加了通过基于CRISPR的系统的靶向的严格性。
作为进一步的实例，TALE DNA结合结构域与催化活性HE(例如I-TevI)的融合物，利用了TALE的可调DNA结合和特异性两者、以及I-TevI的切割序列特异性，伴随可以进一步降低脱靶切割的期望。
本发明的方法、组合物、治疗剂和试剂盒
相应地，本公开内容特别涉及下述非限制性发明：
在第一种方法，方法1中，本公开内容提供了用于编辑人细胞中的USH2A基因的方法，所述方法包括：将一种或多种DNA核酸内切酶引入人细胞内，从而实现在USH2A基因或编码USH2A基因的调节序列的DNA序列内或附近的一个或多个SSB或DSB，其导致校正，从而产生编辑的人细胞。
在另一种方法，方法2中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：将一种或多种DNA核酸内切酶引入人细胞内，以实现在USH2A基因的内含子40内或附近的一个或多个SSB或DSB，其导致校正，从而产生编辑的人细胞。
在另一种方法，方法3中，本公开内容提供了如方法2中提供的，用于编辑人细胞中含有IVS40突变的USH2A基因的方法，其中所述IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
在另一种方法，方法4中，本公开内容提供了用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，所述方法包括：编辑患者的细胞中含有IVS40突变的USH2A基因。
在另一种方法，方法5中，本公开内容提供了如方法4中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述编辑包括：将一种或多种DNA核酸内切酶引入细胞内，以实现在USH2A基因的内含子40内或附近的一个或多个SSB或DSB，其导致校正并且导致usherin蛋白功能的恢复。
在另一种方法，方法6中，本公开内容提供了如方法4或5中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
在另一种方法，方法7中，本公开内容提供了如方法1-2或5中任何一种中提供的方法，其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或Cpf1核酸内切酶；其同源物，其天然存在的分子的重组，其密码子优化的或其修饰形式，及其组合。
在另一种方法，方法8中，本公开内容提供了如方法7中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述方法包括将编码一种或多种DNA核酸内切酶的一种或多种多核苷酸引入细胞内。
在另一种方法，方法9中，本公开内容提供了如方法7中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述方法包括将编码一种或多种DNA核酸内切酶的一种或多种RNA引入细胞内。
在另一种方法，方法10中，本公开内容提供了如方法8或9中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述一种或多种多核苷酸或者一种或多种RNA是一种或多种修饰的多核苷酸或者一种或多种修饰的RNA。
在另一种方法，方法11中，本公开内容提供了如方法7中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述DNA核酸内切酶是一种或多种蛋白质或多肽。
在另一种方法，方法12中，本公开内容提供了如方法1-11中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述方法进一步包括：将一种或多种gRNA引入细胞内。
在另一种方法，方法13中，本公开内容提供了如方法12中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述一种或多种gRNA是sgRNA。
在另一种方法，方法14中，本公开内容提供了如方法12-13中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述一种或多种gRNA或者一种或多种sgRNA是一种或多种修饰的gRNA或者一种或多种修饰的sgRNA。
在另一种方法，方法15中，本公开内容提供了如方法11-13中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述一种或多种DNA核酸内切酶与一种或多种gRNA或者一种或多种sgRNA预复合。
在另一种方法，方法16中，本公开内容提供了如方法1-15中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其进一步包括：将多核苷酸供体模板引入细胞内，所述多核苷酸供体模板包含野生型USH2A基因或cDNA的至少一部分。
在另一种方法，方法17中，本公开内容提供了如方法16中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述野生型USH2A基因或cDNA的至少一部分是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、内含子区域、其片段或组合、或者整个USH2A基因或cDNA。
在另一种方法，方法18中，本公开内容提供了如方法16-17中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述供体模板是单链或双链多核苷酸。
在另一种方法，方法19中，本公开内容提供了如方法16-17中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述供体模板具有与1q41区域同源的臂。
在另一种方法，方法20中，本公开内容提供了如方法2或5中任何一种中提供的方法，其进一步包括：将一种gRNA引入细胞内；其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是一种或多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其实现在位于USH2A基因的内含子40内或附近的基因座处的一个SSB或DSB；并且其中所述gRNA包含与位于内含子40内的基因座区段互补的间隔区序列。
在另一种方法，方法21中，本公开内容提供了如方法2或5中任何一种中提供的方法，其进一步包括：将一种或多种gRNA引入细胞内；其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是一种或多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其实现在USH2A基因的内含子40内或附近的一对SSB或DSB，第一个在5'基因座处而第二个在3'基因座处；并且其中所述第一向导RNA包含与5'基因座的区段互补的间隔区序列，而第二向导RNA包含与3'基因座的区段互补的间隔区序列。
在另一种方法，方法22中，本公开内容提供了如方法20或21中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
在另一种方法，方法23中，本公开内容提供了如方法20-22中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述一种或多种gRNA是一种或多种sgRNA。
在另一种方法，方法24中，本公开内容提供了如方法20-23中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述一种或多种gRNA或者一种或多种sgRNA是一种或多种修饰的gRNA或者一种或多种修饰的sgRNA。
在另一种方法，方法25中，本公开内容提供了如方法20-24中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述一种或多种DNA核酸内切酶与一种或多种gRNA或者一种或多种sgRNA预复合。
在另一种方法，方法26中，本公开内容提供了如方法20中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其进一步包括：包含野生型USH2A基因的至少一部分的多核苷酸供体模板；其中将来自所述多核苷酸供体模板的新序列插入位于USH2A基因的内含子40内或附近的基因座处的染色体DNA内，其导致USH2A基因中的IVS40突变的校正。
在另一种方法，方法27中，本公开内容提供了如方法21中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其进一步包括：包含野生型USH2A基因的至少一部分的多核苷酸供体模板；其中将来自所述多核苷酸供体模板的新序列插入在USH2A基因的内含子40内或附近的5'基因座和3'基因座之间的染色体DNA内，其导致在USH2A基因的内含子40内或附近的5'基因座和3'基因座之间的染色体DNA的校正。
在另一种方法，方法28中，本公开内容提供了如方法20-27中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述野生型USH2A基因或cDNA的至少一部分是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、内含子区域、其片段或组合、或者整个USH2A基因或cDNA。
在另一种方法，方法29中，本公开内容提供了如方法20-28中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述多核苷酸供体模板是单链或双链多核苷酸。
在另一种方法，方法30中，本公开内容提供了如方法20-29中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述多核苷酸供体模板具有与1q41区域同源的臂。
在另一种方法，方法31中，本公开内容提供了如方法20-30中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述SSB或DSB位于内含子40，IVS40突变上游的0-1800个核苷酸内。
在另一种方法，方法32中，本公开内容提供了如方法20-30中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述SSB或DSB位于内含子40，IVS40突变下游的0-1100个核苷酸内。
在另一种方法，方法33中，本公开内容提供了如方法12-15或23-25中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述gRNA或sgRNA与USH2A基因的内含子40的区段互补。
在另一种方法，方法34中，本公开内容提供了如方法1-3或5-33中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述校正是通过HDR。
在另一种方法，方法35中，本公开内容提供了如方法26-27中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述供体模板具有与IVS40突变同源的臂。
在另一种方法，方法36中，本公开内容提供了如方法2或5中任何一种中提供的方法，其进一步包括：将两种gRNA引入细胞内；其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是一种或多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其实现在USH2A基因的内含子40内或附近的一对双链断裂(DSB)，第一个在5' DSB基因座处而第二个在3' DSB基因座处，所述双链断裂引起5' DSB基因座和3' DSB基因座之间的染色体DNA缺失，其导致在USH2A基因的内含子40内或附近的5'DSB基因座和3' DSB基因座之间的染色体DNA缺失；并且其中所述第一向导RNA包含与5'DSB基因座的区段互补的间隔区序列，而第二向导RNA包含与3' DSB基因座的区段互补的间隔区序列。
在另一种方法，方法37中，本公开内容提供了如方法36中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
在另一种方法，方法38中，本公开内容提供了如方法36或37中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述两种gRNA是两种sgRNA。
在另一种方法，方法39中，本公开内容提供了如方法36-38中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述两种gRNA或两种sgRNA是两种修饰的gRNA或两种修饰的sgRNA。
在另一种方法，方法40中，本公开内容提供了如方法36-39中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述一种或多种DNA核酸内切酶与两种gRNA或两种sgRNA预复合。
在另一种方法，方法41中，本公开内容提供了如方法36-40中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中内含子40内的5’ DSB位于 IVS40突变上游的0-1800个核苷酸。
在另一种方法，方法42中，本公开内容提供了如方法36-40中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中内含子40内的3’ DSB位于IVS40突变下游的0-1100个核苷酸。
在另一种方法，方法43中，本公开内容提供了如方法36-42中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述缺失是50 bp至2900 bp的缺失。
在另一种方法，方法44中，本公开内容提供了如方法36-42中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述缺失是50 bp至2000 bp的缺失。
在另一种方法，方法45中，本公开内容提供了如方法36-42中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述缺失是50 bp至1000 bp的缺失。
在另一种方法，方法46中，本公开内容提供了如方法36-42中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述缺失是50 bp至500 bp的缺失。
在另一种方法，方法47中，本公开内容提供了如方法36-42中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述缺失是50 bp至250 bp的缺失。
在另一种方法，方法48中，本公开内容提供了如方法36-47中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其进一步包括：包含野生型USH2A基因的至少一部分的多核苷酸供体模板。
在另一种方法，方法49中，本公开内容提供了如方法20-22和36-37中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述Cas9或Cpf1 mRNA、gRNA和供体模板各自配制到分开的脂质纳米颗粒内，或全部共配制到脂质纳米颗粒内。
在另一种方法，方法50中，本公开内容提供了如方法20-22和36-37中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述Cas9或Cpf1 mRNA、gRNA和供体模板各自配制到分开的AAV载体内，或全部共配制到AAV载体内。
在另一种方法，方法51中，本公开内容提供了如方法20-22和36-37中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述Cas9或Cpf1 mRNA配制到脂质纳米颗粒内，并且所述gRNA和供体模板两者均通过AAV载体递送至细胞。
在另一种方法，方法52中，本公开内容提供了如方法20-22和36-37中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述Cas9或Cpf1 mRNA配制到脂质纳米颗粒内，并且所述gRNA通过电穿孔递送至细胞，并且所述供体模板通过AAV载体递送至细胞。
在另一种方法，方法53中，本公开内容提供了如方法50-52中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述AAV载体是自灭活的AAV载体。
在另一种方法，方法54中，本公开内容提供了如方法1-53中任何一种中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述USH2A基因位于染色体1上：215,622,893-216,423,395(Genome Reference Consortium – GRCh38/hg38)。
在另一种方法，方法55中，本公开内容提供了如方法1-3或5-54中任何一种中提供的方法，其中usherin蛋白功能的恢复与野生型或正常的usherin蛋白功能进行比较。
在另一种方法，方法56中，本公开内容提供了如方法16中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述多核苷酸供体模板是至多11 kb。
在另一种方法，方法57中，本公开内容提供了如方法56中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述多核苷酸供体模板通过AAV进行递送。
在另一种方法，方法58中，本公开内容提供了如方法1-3中任何一种中提供的方法，其中所述人细胞是感光细胞或视网膜祖细胞。
在另一种方法，方法59中，本公开内容提供了如方法4-57中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述细胞是感光细胞或视网膜祖细胞。
在另一种方法，方法60中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5321的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
在另一种方法，方法61中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5323的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
在另一种方法，方法62中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5325的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
在另一种方法，方法63中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5327的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
在另一种方法，方法64中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5328的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
在另一种方法，方法65中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5321和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
在另一种方法，方法66中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5323和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
在另一种方法，方法67中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5325和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
在另一种方法，方法68中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5327和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
在另一种方法，方法69中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5328和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
在另一种方法，方法70中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5321。
在另一种方法，方法71中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5323。
在另一种方法，方法72中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5325。
在另一种方法，方法73中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5327。
在另一种方法，方法74中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5328。
在另一种方法，方法75中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5321和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
在另一种方法，方法76中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5323和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
在另一种方法，方法77中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5325和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
在另一种方法，方法78中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5327和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
在另一种方法，方法79中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5328和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
在另一种方法，方法80中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5295的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ IDNO：5279的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
在另一种方法，方法81中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5294的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ IDNO：5300的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
在另一种方法，方法82中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5295的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ IDNO：5300的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
在另一种方法，方法83中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5290的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ IDNO：5300的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
在另一种方法，方法84中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5277的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ IDNO：5300的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
在另一种方法，方法85中，本公开内容提供了方法80-84中任何一种的方法，其中所述第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA同时施用；所述第一gRNA或sgRNA在所述第二gRNA或sgRNA之前施用；或者所述第二gRNA或sgRNA在所述第一gRNA或sgRNA之前施用。
在另一种方法，方法86中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5295，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5279。
在另一种方法，方法87中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5294，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5300。
在另一种方法，方法88中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5295，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5300。
在另一种方法，方法89中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5290，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5300。
在另一种方法，方法90中，本发明提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5277，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5300。
在另一种方法，方法91中，本公开内容提供了方法86-90中任何一种的方法，其中所述第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA同时施用；所述第一gRNA或sgRNA在所述第二gRNA或sgRNA之前施用；或者所述第二gRNA或sgRNA在所述第一gRNA或sgRNA之前施用于患者。
在另一种方法，方法92中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5452的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ IDNO：5449的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
在另一种方法，方法93中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5453的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ IDNO：5449的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
在另一种方法，方法94中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5455的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ IDNO：5457的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
在另一种方法，方法95中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5452的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ IDNO：5451的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
在另一种方法，方法96中，本公开内容提供了用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ ID NO：5448的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ IDNO：5449的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
在另一种方法，方法97中，本公开内容提供了方法92-96中任何一种的方法，其中所述第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA同时施用；所述第一gRNA或sgRNA在所述第二gRNA或sgRNA之前施用；或者所述第二gRNA或sgRNA在所述第一gRNA或sgRNA之前施用。
在另一种方法，方法98中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5452，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5449。
在另一种方法，方法99中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5453，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5449。
在另一种方法，方法100中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5455，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5457。
在另一种方法，方法101中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5452，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5451。
在另一种方法，方法102中，本公开内容提供了用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5448，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5449。
在另一种方法，方法103中，本公开内容提供了方法98-102中任何一种的方法，其中所述第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA同时施用；所述第一gRNA或sgRNA在所述第二gRNA或sgRNA之前施用；或者所述第二gRNA或sgRNA在所述第一gRNA或sgRNA之前施用。
在另一种方法，方法104中，本公开内容提供了如方法1中提供的，用于编辑人细胞中的USH2A基因的方法，其中所述人细胞具有缺陷活性，并且所述编辑的人细胞表达功能性USH2A。
在另一种方法，方法105中，本公开内容提供了如方法2中提供的，用于编辑人细胞中含有IVS40突变的USH2A基因的方法，其中所述人细胞具有缺陷活性，并且所述编辑的人细胞表达功能性USH2A。
在另一种方法，方法106中，本公开内容提供了如方法1中提供的，用于编辑人细胞中的USH2A基因的方法，其中所述校正导致USH2A基因的表达或功能的调节。
在另一种方法，方法107中，本公开内容提供了如方法2中提供的，用于编辑人细胞中含有IVS40突变的USH2A基因的方法，其中所述校正导致USH2A基因的表达或功能的调节。
在另一种方法，方法108中，本公开内容提供了如方法5中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述校正导致USH2A基因的表达或功能的调节，并且导致usherin蛋白功能的恢复。
在另一种方法，方法109中，本公开内容提供了如方法4中提供的，用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，其中所述编辑包括：将一种或多种DNA核酸内切酶引入细胞内，以实现在USH2A基因的内含子40内或附近的一个或多个SSB或DSB，其导致USH2A基因的表达或功能的调节，并且导致usherin蛋白功能的恢复。
在另一种方法，方法110中，本公开内容提供了用于编辑人细胞中的USH2A基因的方法，所述方法包括：将一种或多种DNA核酸内切酶引入人细胞内，以实现在USH2A基因或编码USH2A基因的调节序列的其它DNA序列内或附近的一个或多个SSB或DSB，其导致USH2A基因的表达或功能的调节，从而产生编辑的人细胞。
在另一种方法，方法111中，本公开内容提供了用于编辑人细胞中含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：将一种或多种DNA核酸内切酶引入人细胞内，以实现在USH2A基因的内含子40内或附近的一个或多个SSB或DSB，其导致USH2A基因的表达或功能的调节，从而产生编辑的人细胞。
在另一种方法，方法112中，本公开内容提供了如方法111中提供的，用于编辑人细胞中含有IVS40突变的USH2A基因的方法，其中所述IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
在第一组合物，组合物1中，本公开内容提供了一种或多种gRNA，用于编辑来自2A型乌谢尔综合征患者的细胞中的USH2A基因中的IVS40突变，所述一种或多种gRNA包含间隔区序列，其选自序列表的SEQ ID NO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328、5443和5446-5461中的核酸序列。
在另一种组合物，组合物2中，本公开内容提供了组合物1的一种或多种gRNA，其中所述IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
在另一种组合物，组合物3中，本发明提供了组合物1或2中任何一种的一种或多种gRNA，其中所述一种或多种gRNA是一种或多种sgRNA。
在另一种组合物，组合物4中，本公开内容提供了组合物1-3中任何一种的一种或多种gRNA，其中所述一种或多种gRNA或者一种或多种sgRNA是一种或多种修饰的gRNA或者一种或多种修饰的sgRNA。
在另一种组合物，组合物5中，本公开内容提供了组合物1-4中任何一种的一种或多种gRNA，其中所述细胞是感光细胞、视网膜祖细胞、间充质干细胞(MSC)或诱导性多能干细胞(iPSC)。
在另一种组合物，组合物6中，本公开内容提供了单分子向导RNA(sgRNA)，用于编辑来自2A型乌谢尔综合征患者的细胞中的USH2A基因中的IVS40突变，所述sgRNA包含SEQID NO：5321。
在另一种组合物，组合物7中，本公开内容提供了单分子向导RNA(sgRNA)，用于编辑来自2A型乌谢尔综合征患者的细胞中的USH2A基因中的IVS40突变，所述sgRNA包含SEQID NO：5323。
在另一种组合物，组合物8中，本公开内容提供了单分子向导RNA(sgRNA)，用于编辑来自2A型乌谢尔综合征患者的细胞中的USH2A基因中的IVS40突变，所述sgRNA包含SEQID NO：5325。
在另一种组合物，组合物9中，本公开内容提供了单分子向导RNA(sgRNA)，用于编辑来自2A型乌谢尔综合征患者的细胞中的USH2A基因中的IVS40突变，所述sgRNA包含SEQID NO：5327。
在另一种组合物，组合物10中，本公开内容提供了单分子向导RNA(sgRNA)，用于编辑来自2A型乌谢尔综合征患者的细胞中的USH2A基因中的IVS40突变，所述sgRNA包含SEQID NO：5328。
在另一种组合物，组合物11中，本公开内容提供了单分子向导RNA(sgRNA)，用于编辑来自2A型乌谢尔综合征患者的细胞中的USH2A基因中的IVS40突变，所述sgRNA包含SEQID NO：5321和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
在另一种组合物，组合物12中，本公开内容提供了单分子向导RNA(sgRNA)，用于编辑来自2A型乌谢尔综合征患者的细胞中的USH2A基因中的IVS40突变，所述sgRNA包含SEQID NO：5323和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
在另一种组合物，组合物13中，本公开内容提供了单分子向导RNA(sgRNA)，用于编辑来自2A型乌谢尔综合征患者的细胞中的USH2A基因中的IVS40突变，所述sgRNA包含SEQID NO：5325和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
在另一种组合物，组合物14中，本公开内容提供了单分子向导RNA(sgRNA)，用于编辑来自2A型乌谢尔综合征患者的细胞中的USH2A基因中的IVS40突变，所述sgRNA包含SEQID NO：5327和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
在另一种组合物，组合物15中，本公开内容提供了单分子向导RNA(sgRNA)，用于编辑来自2A型乌谢尔综合征患者的细胞中的USH2A基因中的IVS40突变，所述sgRNA包含SEQID NO：5328和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
在另一种组合物，组合物16中，本公开内容提供了用于编辑USH2A基因中的IVS40突变的一种或多种gRNA，所述一种或多种gRNA包含间隔区序列，其选自序列表的SEQ IDNO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328、5443和5446-5461中的核酸序列。
在第一治疗剂，治疗剂1中，本公开内容提供了用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的治疗剂，所述治疗剂包含用于编辑USH2A基因中的IVS40突变的至少一种或多种gRNA，所述一种或多种gRNA包含间隔区序列，其选自序列表的SEQ ID NO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328、5443和5446-5461中的核酸序列。
在另一种治疗剂，治疗剂2中，本公开内容提供了治疗剂1的治疗剂，其中所述IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
在另一种治疗剂，治疗剂3中，本公开内容提供了治疗剂1或2中任何一种的治疗剂，其中所述一种或多种gRNA是一种或多种sgRNA。
在另一种治疗剂，治疗剂4中，本公开内容提供了治疗剂1-3中任何一种的治疗剂，其中所述一种或多种gRNA或者一种或多种sgRNA是一种或多种修饰的gRNA或者一种或多种修饰的sgRNA。
在另一种治疗剂，治疗剂5中，本公开内容提供了用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的治疗剂，所述治疗剂通过包括以下的方法形成：引入一种或多种DNA核酸内切酶；引入一种或多种gRNA或者一种或多种sgRNA，用于编辑USH2A基因中的IVS40突变；任选地引入一种或多种供体模板；其中所述一种或多种gRNA或sgRNA包含间隔区序列，其选自序列表的SEQID NO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328、5443和5446-5461中的核酸序列。
在另一种治疗剂，治疗剂6中，本公开内容提供了治疗剂5的治疗剂，其中所述IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
在第一种试剂盒，试剂盒1中，本公开内容提供了用于在体内治疗2A型乌谢尔综合征的患者的试剂盒，所述试剂盒包含用于编辑USH2A基因中的IVS40突变的一种或多种gRNA或sgRNA，其中所述一种或多种gRNA或sgRNA包含间隔区序列，其选自序列表的SEQ ID NO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328、5443和5446-5461中的核酸序列；一种或多种DNA核酸内切酶；以及任选地，一种或多种供体模板。
在另一种试剂盒，试剂盒2中，本公开内容提供了试剂盒1的试剂盒，其中所述IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
在另一种试剂盒，试剂盒3中，本发明提供了试剂盒1或2中任何一种的试剂盒，其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或Cpf1核酸内切酶；其同源物，其天然存在的分子的重组，其密码子优化的或其修饰形式，及其组合。
在另一种试剂盒，试剂盒4中，本公开内容提供了试剂盒1-3中任何一种的试剂盒，其包含一种或多种供体模板。
在另一种试剂盒，试剂盒5中，本公开内容提供了试剂盒4的试剂盒，其中所述供体模板具有与1q41区域同源的臂。
在另一种试剂盒，试剂盒6中，本公开内容提供了试剂盒4的试剂盒，其中所述供体模板具有与IVS40突变同源的臂。
在第一种核酸，核酸1中，本公开内容提供了编码gRNA的核酸，所述gRNA包含间隔区序列，其选自SEQ ID NO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328、5443和5446-5461。
在另一种核酸，核酸2中，本公开内容提供了核酸1的核酸，其中所述gRNA是sgRNA。
在第一种载体，载体1中，本公开内容提供了编码gRNA的载体，所述gRNA包含间隔区序列，其选自SEQ ID NO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328、5443和5446-5461。
在另一种载体，载体2中，本公开内容提供了载体1的载体，其中所述gRNA是sgRNA。
在另一种载体，载体3中，本公开内容提供了载体1或2中任何一种的载体，其中所述载体是AAV。
在另一种载体，载体4中，本公开内容提供了载体1-3中任何一种的载体，其中所述载体是AAV5血清型衣壳载体。
定义
除本文先前阐述的定义之外，下述定义与本公开内容有关：
如本文使用的，术语“基因”指编码并能够表达特异性基因产物的核酸区段。基因经常产生蛋白质或多肽作为其基因产物，但基因可以产生任何所需的多肽或核酸产物。
术语“改变”或“遗传信息的改变”指细胞的基因组中的任何变化。
术语“插入”指在DNA序列中的一个或多个核苷酸的添加。插入的范围可以从几个核苷酸的小插入到大区段例如cDNA或基因的插入。
术语“缺失”指DNA序列中的一个或多个核苷酸的丧失或去除，或者基因功能的丧失或去除。在一些情况下，缺失可以包括例如几个核苷酸、外显子、内含子、基因区段或基因的整个序列的丧失。在一些情况下，基因的缺失指基因或其基因产物的功能或表达的消除或降低。这不仅可以起因于基因内或附近的序列缺失，还可以起因于破坏基因表达的其它事件(例如插入、无义突变)。
如本文使用的，术语“校正”指细胞中基因组的一个或多个核苷酸的变化。变化的非限制性实例包括插入、缺失、取代、整合、倒转或重复。对于校正的基因组位点，此类校正可以导致在结构或功能上更有利的基因型或表型结果。“校正”的一个非限制性实例包括突变体或缺陷序列的改变，其恢复了基因或其基因产物的结构或功能。取决于突变的性质，可以经由本文公开的各种策略来实现校正。
“可杂交的”或“互补的”或“基本上互补的”意指核酸(例如RNA)包含使得其能够非共价结合的核苷酸序列，例如：在适当的体外和/或体内温度和溶液离子强度的条件下，以序列特异性、反平行的方式(即，核酸与互补核酸特异性结合)与另一种核酸形成沃森-克里克碱基对、“退火”或“杂交”。如本领域已知的，标准的沃森-克里克碱基配对包括：腺嘌呤(A)与胸苷(T)配对，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)配对，并且鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对[DNA，RNA]。在一些实例中，gRNA或sgRNA的间隔区序列可以与核苷酸序列完全互补。在其它实例中，除了在至少一个位置中之外，gRNA或sgRNA的间隔区序列可以与核苷酸序列完全互补。在其它实例中，除了在至少两个位置中之外，gRNA或sgRNA的间隔区序列可以与核苷酸序列完全互补。
术语“敲入”指将DNA序列或其片段添加到基因组内。待敲入的此类DNA序列可以包括一个或多个完整基因，可以包括与基因相关的调节序列或者前述基因的任何部分或片段。例如，可以将编码野生型蛋白的cDNA插入携带突变基因的细胞的基因组内。敲入策略无需整体或部分替换缺陷基因。在一些情况下，敲入策略可以进一步涉及用提供的序列取代现有序列，例如用野生型拷贝取代突变等位基因。另一方面，术语“敲除”指基因或基因表达的消除。例如，可以通过缺失或添加导致读码框破坏的核苷酸序列来敲除基因。作为另一个实例，可以通过用不相关的序列替换基因的部分来敲除基因。最后，如本文使用的，术语“击倒”指基因或其基因产物的表达中的降低。作为基因击倒的结果，蛋白质活性或功能可能减弱，或者蛋白质水平可能降低或消除。
术语“包括(comprising)”或“包括(comprises)”用于指组合物、治疗剂、试剂盒、方法及其分别的组分，其对于本公开内容是必需的，仍对于无论是否必需的未指定要素的包括开放。
术语“基本上由……组成”指对于给定方面所需的那些要素。该术语允许存在实质上不影响本公开内容的该方面的基本和新型或功能特征的另外要素。
术语“由……组成”指如本文所述的组合物、治疗剂、试剂盒、方法及其分别的组分，其排除了该方面的描述中未叙述的任何要素。
除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物。
在本说明书中叙述的任何数值范围描述了在所述范围内包含的具有相同数值精度(即，具有相同数目的指定数字)的所有子范围。例如，所叙述的范围“1.0至10.0”描述了所叙述的最小值1.0与所叙述的最大值10.0之间(且包括)的所有子范围，例如“2.4至7.6”，即使在说明书的文本中没有明确叙述“2.4至7.6”的范围。相应地，申请人保留修正本说明书包括权利要求的权利，以明确叙述在本说明书中明确叙述的范围内包含的相同数值精度的任何子范围。在说明书中固有地描述了所有此类范围，使得对明确叙述任何此类子范围的修正顺应书面描述书、描述的充分性和附加的事项要求，包括根据35 U.S.C. § 112(a)和EPC第123(2)条的要求。另外，除非上下文明确说明或另有要求，否则本说明书中描述的所有数值参数(例如表示值、范围、量、百分比等等的数值参数)都可以读作如同由单词“约”开头，即使单词“约”并未明确出现在数目之前。另外，应该根据报告的有效数字的数目、数值精度、以及通过应用普通的舍入技术来解释本说明书中描述的数值参数。还应理解，在本说明书中描述的数值参数必然具有用于确定参数的数值的基础测量技术的固有可变性特征。
除非另有说明，否则本文中标识的任何专利、出版物或其它公开材料整体引入本说明书内作为参考，但仅至所引入的材料与本说明书中明确阐述的现有描述、定义、陈述或其它公开材料不冲突的程度。像这样以及在必要的程度上，如本说明书中阐述的明确公开内容替代了通过引用并入的任何冲突材料。据说引入本说明书内作为参考，但与本文阐述的现有定义、陈述或其它公开材料冲突的任何材料或其部分，仅引入至所引入的材料和现有的公开材料之间不发生冲突的程度。申请人保留修正本说明书，以明确叙述通过引用并入本文的任何主题或其一部分的权利。
本公开内容的一个或多个方面的细节在下面的所附实施例中阐述。尽管现在描述了所考虑的材料和方法的具体实例，但与本文描述的那些相似或等价的任何材料和方法都可以用于本公开内容的实践或测试中。本公开内容的其它特点、目的和优点根据说明书将是显而易见的。在描述实例中，单数形式也包括复数，除非上下文另有明确说明。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。在冲突的情况下，以本说明书为准。
实施例
本公开内容将通过参考下述实施例而得到更充分地理解，所述实施例提供了本发明的说明性非限制性方面。
实施例描述了使用CRISPR系统作为说明性的基因组编辑技术，以在USH2A基因中的IVS40突变内或附近产生确定的治疗性基因组缺失、插入或替换，其导致在基因组基因座中的IVS40突变的破坏或切除，其恢复usherin蛋白功能。如本文所述且所示的，确定的治疗修饰的引入代表了用于潜在改善(如果没有消除的话)2A型乌谢尔综合征的新型治疗策略。
实施例1
用于USH2A基因中的IVS40突变的CRISPR/化脓性链球菌(Sp)Cas9 PAM位点
为了发现用于通过SpCas9的基因组编辑的靶位点，针对SpCas9前间隔区邻近基序(PAM)，扫描跨越USH2A基因的内含子40中的IVS40突变上游的1800个核苷酸和下游的1100个核苷酸的区域(总共2.9 kB)。在该区域中扫描了具有序列NRG的PAM。然后鉴定了在紧邻NRG PAM上游定位的gRNA间隔区序列(17-24 bp)。这些序列是用于编辑基因的候选物。
实施例2
用于USH2A基因中的IVS40突变的CRISPR/金黄色葡萄球菌(Sa)Cas9 PAM位点
为了发现用于通过SaCas9的基因组编辑的靶位点，针对SaCas9 PAM，扫描跨越USH2A基因的内含子40中的IVS40突变上游的1100个核苷酸和下游的550个核苷酸的区域。在该区域中扫描了具有序列NNGRRT的PAM。然后鉴定了在紧邻NNGRRT PAM上游定位的gRNA间隔区序列(17-24 bp)。这些序列是用于编辑基因的候选物。
实施例3
用于USH2A基因中的IVS40突变的CRISPR/嗜热链球菌(St)Cas9 PAM位点
为了发现用于通过StCas9的基因组编辑的靶位点，针对StCas9 PAM，扫描跨越USH2A基因的内含子40中的IVS40突变上游的1800个核苷酸和下游的1100个核苷酸的区域(总共2.9kB)。在该区域中扫描了具有序列NNAGAAW的PAM。然后鉴定了在紧邻NNAGAAW PAM上游定位的gRNA间隔区序列(17-24 bp)。这些序列是用于编辑基因的候选物。
实施例4
用于USH2A基因中的IVS40突变的CRISPR/齿垢密螺旋体(T. denticola)(Td)Cas9 PAM 位点
为了发现用于通过TdCas9的基因组编辑的靶位点，针对TdCas9 PAM，扫描跨越USH2A基因的内含子40中的IVS40突变上游的1800个核苷酸和下游的1100个核苷酸的区域(总共2.9kB)。在该区域中扫描了具有序列NAAAAC的PAM。然后鉴定了在紧邻NAAAAC PAM上游定位的gRNA间隔区序列(17-24 bp)。这些序列是用于编辑基因的候选物。
实施例5
用于USH2A基因中的IVS40突变的CRISPR/脑膜炎奈瑟菌(N. meningitides)(Nm)Cas9 PAM位点
为了发现用于通过NmCas9的基因组编辑的靶位点，针对NmCas9 PAM，扫描跨越USH2A基因的内含子40中的IVS40突变上游的1800个核苷酸和下游的1100个核苷酸的区域(总共2.9kB)。在该区域中扫描了具有序列NNNNGHTT的PAM。然后鉴定了在紧邻NNNNGHTT PAM上游定位的gRNA间隔区序列(17-24 bp)。这些序列是用于编辑基因的候选物。
实施例6
用于USH2A基因中的IVS40突变的CRISPR/Cpf1 PAM位点
为了发现用于通过Cpf-1的基因组编辑的靶位点，针对Cpf1 PAM，扫描跨越USH2A基因的内含子40中的IVS40突变上游的1800个核苷酸和下游的1100个核苷酸的区域(总共2.9kB)。在该区域中扫描了具有序列YTN的PAM。然后鉴定了在紧邻YTN PAM上游定位的gRNA间隔区序列(17-24 bp)。这些序列是用于编辑基因的候选物。
实施例7
向导RNA链的生物信息学分析
gRNA或sgRNA可以将RNP复合物导向中靶位点，例如需要编辑的基因组序列，但也可能具有与不需要编辑的脱靶位点相互作用的潜力。为了鉴定哪些候选gRNA可能具有中靶活性和/或脱靶活性，可以在使用计算机芯片上的结合分析以及在中靶和脱靶位点两者处实验上评价的活性的单一过程或多步过程中，筛选且选择候选gRNA。
作为举例说明，如下文更详细地描述且示出的，使用可用于评价脱靶结合的各种生物信息学工具中的一种或多种，就其在具有相似序列的脱靶位点处切割的潜力，评价具有与特定的中靶位点(例如在USH2A基因中的IVS40突变内或附近的位点)以及邻近的PAM相匹配的序列的候选gRNA，以便评价在除预期位置外的染色体位置处的效应的可能性。
然后在实验上评价预测对于脱靶活性具有相对较低的潜力的候选物，以测量其中靶活性，然后为在各个位点处的脱靶活性。具有足够高的中靶活性以在所选基因座处达到所需水平的基因编辑，以及相对较低的脱靶活性以降低在其它染色体基因座处的改变的可能性的gRNA是优选的。中靶活性与脱靶活性的比率经常被称为gRNA的“特异性”。
关于预测的脱靶活性的初步筛选，存在已知且可公开获得的许多生物信息学工具，其用于预测最可能的脱靶位点；并且由于与CRISPR/Cas9/Cpf1核酸酶系统中的靶位点的结合由互补序列之间的沃森-克里克碱基配对驱动，因此相异性程度(以及因此关于脱靶结合的潜力降低)基本上与一级序列差异有关：错配和凸起，即碱基变为非互补碱基，以及相对于靶位点，在潜在的脱靶位点处的碱基插入或缺失。称为COSMID(具有错配、插入和缺失的CRISPR脱靶位点)(可在网络上的crispr.bme.gatech.edu处获得)的示例性生物信息学工具，汇集了此类相似性。其它生物信息学工具包括但不限于autoCOSMID和CCTop。
生物信息学工具用于使脱靶切割降到最低，以便降低突变和染色体重排的有害效应。关于CRISPR/Cas9系统的研究提示，特别是在远离PAM区域的位置处，由于向导链与具有碱基对错配和/或凸起的DNA序列的非特异性杂交，而导致脱靶活性的可能性。因此，重要的是具有鉴定潜在的脱靶位点的生物信息学工具，除碱基对错配外，所述脱靶位点具有在RNA向导链和基因组序列之间的插入和/或缺失。基于脱靶预测算法CCTop的生物信息学工具用于在基因组中搜索潜在的CRISPR脱靶位点(CCTop可在网络上的crispr.cos.uni-heidelberg.de/处获得)。基于错配数目和位置，对潜在的脱靶位点的排序列表输出，允许更明智地选择靶位点，并且避免使用更可能脱靶切割的位点。
采用了另外的生物信息学渠道，其权衡了区域中的gRNA靶向位点的估计的中靶和/或脱靶活性。用于预测活性的其它特点包括关于所讨论的细胞类型、DNA可及性、染色质状态、转录因子结合位点、转录因子结合数据及其它CHIP-seq数据的信息。权衡了预测编辑效率的另外因素，例如，gRNA对的相对位置和方向、局部序列特点和微观同源性。
这些过程允许选择高特异性gRNA。
实施例8
IVS40突变细胞系的生成
为了测试候选gRNA针对基因组DNA的中靶活性，使用野生型HEK 293细胞，生成了具有纯合的C.7595-2144A>G突变的HEK 293细胞系(IVS40 USH2A突变细胞系)。野生型HEK 293细胞含有人USH2A基因的两个野生型等位基因，并且内源性表达低水平的USH2A。
使用Lonza的Nucleofector™试剂盒、Lonza的核转染机、以及对于HEK 293细胞推荐的程序(可得自Lonza，瑞士)，用核糖核蛋白(RNP)和单链DNA寡核苷酸(3-6 μg)转染野生型HEK 293细胞。
用2.5 µg TrueCut™ Cas9 Protein v2(可得自ThermoFisher Scientific，Massachusetts，US)和1µg(~25 pM)合成gRNA(来自ThermoFisher Scientific)制备核糖核蛋白(RNP)。合成gRNA包含下述未修饰的前间隔区区域：UAAAGAUGAUCUCUUAUCUU(SEQ IDNO：5326)和ThermoFisher的专用tracrRNA序列。这样设计用于在野生型HEK 293基因组中引入双链断裂的合成gRNA，使得一旦将所需的IVS40突变引入基因组，由RNP识别的PAM序列就不再充当PAM序列，因此预防已经历成功HDR的细胞基因组的进一步编辑(图4A)。
用作HDR模板的单链DNA寡核苷酸是：GCACTTCAAACCCCCACAATACACAGCCTTTTCTTAAAGATGATCTCTTACCTTGGGAAAGGAGAGGTGTTCAATTTCAATTTCATGATTTGTTTCCCCCT(SEQ ID NO：5494)。
允许转染的细胞在转染后在培养中恢复3-7天。将单细胞自动分选到96孔板内，并且集落源于单细胞。从每个细胞集落中分离基因组DNA，使用正向引物AGTTGCAGGCCAGTTGATTTGTAT(SEQ ID NO：5495)和反向引物CAAAATGGGGATACAGCTCCTTTC(SEQ ID NO：5496)进行PCR扩增，并且就人USH2A基因中的所需C.7595-2144A>G(IVS40)单核苷酸突变的存在，测序PCR产物。分离了具有引入两个等位基因内的IVS40突变的几个克隆(图4B)。因此，申请人生成了适用于中靶编辑实验中的细胞系。
实施例9
sgRNA(USH2A MO、USH2A MG、USH2A MB、USH2A MP和USH2A MR)的测试
对于预测具有最低脱靶活性的所选gRNA，使用实施例8中获得的IVS40 USH2A突变细胞系测试了中靶活性。
将IVS40 USH2A突变细胞系以200,000个细胞/孔接种到96孔板中的200 μl 10%热灭活的(HI)FBS/90% DMEM中，并且用作为RNP复合物的1 μg sgRNA和2.5 μg SpCas9蛋白进行核转染。
用于这种测定的sgRNA作为未修饰的合成sgRNA购自Thermo Fisher Scientific。sgRNA靶向IVS40突变(图5A-5B；6A，第1-5行)。
将转染的IVS40 USH2A突变细胞与对照细胞进行比较，所述对照细胞是用编码绿色荧光蛋白(GFP)的质粒转染的IVS40 USH2A突变细胞(以在视觉上确认转染效率)、或根本不进行转染(数据未显示)。
在转染后48-96小时，从IVS40 USH2A突变细胞中收获基因组DNA，并且在USH2A基因的IVS40突变周围进行PCR扩增。然后用位于各个扩增的PCR产物内部的引物，测序所得到的基因组特异性PCR产物，并且对序列进行TIDE分析。TIDE是网络工具，以快速评价通过由向导RNA(gRNA或sgRNA)确定的靶基因座的CRISPR-Cas9的基因组编辑。基于来自两个标准毛细管测序反应的定量序列跟踪数据，TIDE软件定量编辑功效且鉴定靶细胞库的DNA中占优势类型的插入和缺失(插入缺失)。关于详细解释和实例，参见Brinkman等人，Nucl.Acids Res.(2014)。
序列分析揭示，靶向IVS40突变的USH2A MP(包含SEQ ID NO：5327的sgRNA)具有69.7%的中靶编辑效率；靶向IVS40突变的USH2A MO(包含SEQ ID NO：5321的sgRNA)具有68.3%的中靶编辑效率；靶向IVS40突变的USH2A MG(包含SEQ ID NO：5323的sgRNA)具有86.45%的中靶编辑效率；靶向IVS40突变的USH2A MB(包含SEQ ID NO：5325的sgRNA)具有86.3%的中靶编辑效率；并且靶向IVS40突变的USH2A MR(包含SEQ ID NO：5328的sgRNA)具有91.3%的中靶编辑效率(图5B)。
这些数据提供了本文提供的gRNA可以指导在突变型IVS40 USH2A基因座内或附近的编辑的证据。通过gRNA(例如在本实施例中测试的gRNA)的编辑可以经由至少NHEJ策略促成IVS40突变的校正。
实施例10
sgRNA(USH2A MO、USH2A MG、USH2A MB、USH2A MP和USH2A MR)的测试
对于靶向IVS40突变的所选gRNA，执行测试以确定HEK 293细胞中的脱靶活性，所述HEK293细胞对于USH2A是野生型。
将HEK 293细胞以200,000个细胞/孔接种到96孔板中的200 μl 10% HIFBS/DMEM中，并且用作为RNP复合物的1 μg sgRNA和2.5 μg SpCas9蛋白进行核转染。
用于这种测定的sgRNA作为未修饰的合成sgRNA购自Thermofisher。sgRNA靶向IVS40突变(图5A-B)。
将转染的HEK 293细胞与对照细胞进行比较，所述对照细胞是用编码GFP的质粒转染的HEK 293细胞(对于USH2A野生型)(以在视觉上确认转染效率)、或根本不进行转染(数据未显示)。
在转染后48-96小时，从HEK 293细胞中收获基因组DNA，并且在USH2A基因的IVS40突变周围进行PCR扩增。然后用位于各个扩增的PCR产物内部的引物，测序所得到的基因组特异性PCR产物，并且对序列进行TIDE分析。
序列分析揭示，靶向IVS40突变的USH2A MP(包含SEQ ID NO：5327的sgRNA)具有0.7%的脱靶编辑效率；靶向IVS40突变的USH2A MO(包含SEQ ID NO：5321的sgRNA)具有1.05%的脱靶编辑效率；靶向IVS40突变的USH2A MG(包含SEQ ID NO：5323的sgRNA)具有40.55%的脱靶编辑效率；靶向IVS40突变的USH2A MB(包含SEQ ID NO：5325的sgRNA)具有6.65%的脱靶编辑效率；并且靶向IVS40突变的USH2A MR(包含SEQ ID NO：5328的sgRNA)具有1.45%的脱靶编辑效率(图5B)。
这些数据提供了本文提供的gRNA可以具有最低限度的野生型脱靶活性，并且这些gRNA可以用于特异性地校正IVS40突变的证据。
实施例11
在表达SpCas9的HEK 293FT细胞(对于USH2A WT)中测试sgRNA的中靶活性
虽然实施例9和10中表征的gRNA在与其基因组靶杂交时与IVS40突变重叠，但本文还提供了在IVS40突变的上游或下游杂交的另一组gRNA。使用SpCas9，就野生型HEK 293FT细胞中的中靶编辑效率，测试了预期具有最低脱靶活性的来自该组的gRNA。因为gRNA与在IVS40突变附近但与IVS40突变不重叠的DNA序列结合，所以申请人在野生型HEKFT 293细胞中执行了这些实验。
具有由整合到AAVS1基因座内的组成型启动子调节的SpCas9开放读码框(ORF)的这些HEK 293FT细胞，在补充有1 μg/ml嘌呤霉素的10% HI FBS/90% DMEM中进行培养，并且每3-4天进行传代。
将表达SpCas9的HEK 293FT细胞系以50,000个细胞/孔接种到96孔板中的200 μl10% HIFBS/DMEM中，并且使用Lipofectamine® Messenger-Max™(可得自Thermo FisherScientific，Massachusetts，US)，用1 μg sgRNA进行转染。
用于这种测定的sgRNA通过体外转录(IVT)进行合成。sgRNA靶向在IVS40突变下游或上游的位置(图6A-B)。
在转染后48小时，去除培养基，并且使用prepGem®组织试剂盒(可得自VWR，Pennsylvania，US)提取总DNA。PCR扩增USH2A基因的内含子40的部分(gRNA在其中编辑)。使用AMPure XP珠(可得自Beckman Coulter，California，US)提纯所得到的产物，并且进行测序以评价Cas9介导的遗传修饰。使用TIDE评估小插入和缺失(插入缺失)的频率。
经由关于sgRNA(包含SEQ ID NO：5272-5319中任何一个的sgRNA)的TIDE分析，确定了在USH2A基因的内含子40内的中靶编辑效率(图2A-B)。
序列分析揭示，靶向IVS40突变下游的位置的sgRNA具有24.0至89.9%的中靶编辑效率范围(图6A-B)。
序列分析揭示，靶向IVS40突变上游的位置的sgRNA具有24.3至91.3%的中靶编辑效率范围(图6A-B)。
这些数据提供了本文提供的上游和下游gRNA可以在USH2A基因座处展示中靶活性的证据。此类中靶活性可以经由至少切除策略和/或HDR策略来促成IVS40突变校正。
实施例12
在表达SaCas9的K562细胞(对于USH2A为WT)中测试sgRNA的编辑效率
就中靶活性测试了在IVS40突变的上游或下游杂交的另一组gRNA。这些gRNA与SaCas9相关，并且用于遗传改造的K562细胞中。K562细胞由诱导型启动子表达SaCas9蛋白，并且具有野生型USH2A基因。
在转染前48小时，用1-10 μg/mL多西环素处理表达SaCas9的野生型K562细胞，以诱导SaCas9表达。将细胞系以200,000个细胞/孔接种到96孔板中的200 μl 10% FBS/IMDM中，并且用1 μg编码sgRNA的总质粒进行核转染。
sgRNA靶向在IVS40突变下游或上游的位置(图6C)。
将编辑的K562细胞与对照细胞进行比较，所述对照细胞用编码GFP的质粒进行转染(以在视觉上确认转染效率)、或根本不进行转染(数据未显示)。
在转染后48-96小时，从K562细胞中收获基因组DNA，并且在USH2A基因的IVS40突变周围进行PCR扩增。然后用位于各个扩增的PCR产物内部的引物，测序所得到的基因组特异性PCR产物，并且进行TIDE分析。
序列分析揭示，靶向IVS40突变下游的位置的sgRNA具有1.67至15.58%的中靶编辑效率范围(图6C)。
序列分析进一步揭示，靶向IVS40突变上游的位置的sgRNA具有1.14至30.61%的中靶编辑效率范围(图6C)。
这些数据提供了本公开内容的上游和下游gRNA可以在USH2A基因座处展示中靶活性的证据。此类中靶活性可以经由至少切除策略和/或HDR策略来促成IVS40突变校正。
实施例13
pET01构建
为了测量在根据本公开内容的基因组编辑后内含子40的剪接，从pET01构建了两种质粒。使用pET01产生的两种质粒是：(1)pET01-IVS40(SEQ ID NO：5525)；以及(2)pET01-WT(SEQ ID NO：5524)。
pET01(图12A)是包括由内含子序列分开的大鼠前胰岛素原5'和3'外显子的质粒。内含子序列含有多克隆位点(MCS)。内含子侧翼为真核生物外显子的5'剪接供体位点和3'剪接受体位点。3'剪接受体位点随后为3'聚腺苷酸化位点(多聚A)。该载体含有用于在原核细胞和真核细胞中复制的原核和真核遗传元件。这种载体序列的表达由劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端重复(LTR)中存在的启动子驱动，随后为一段短真核基因(磷酸酶)。
将包含IVS40突变的USH2A内含子40的3150 bp区域克隆到pET01的MCS内，以产生pET01-IVS40。USH2A内含子40中的IVS40突变导致产生剪接供体位点，以及152 bp插入USH2A mRNA内，使得扩增的USH2A mRNA片段总共387个碱基对(图12B)。
将包含野生型序列的USH2A内含子40的3150 bp区域克隆到pET01的MCS内，以产生pET01-WT。由pET01-WT转录USH2A mRNA，并且从mRNA中去除内含子，使得扩增的USH2A mRNA片段总共235个碱基对(图12B)。
因此，可以分析来自pET01-IVS40和pET01-WT质粒的转录物，以调查IVS40突变的校正以及USH2A基因中在内含子40处的剪接状态。
实施例14
剪接受体测定
为了测量在根据本公开内容的基因组编辑后内含子40的剪接，使用表达SpCas9的HEK293细胞调查了来自实施例13中构建的两种质粒的转录物剪接。
具有由整合到AAVS1基因座内的组成型启动子调节的SpCas9开放读码框(ORF)的野生型HEK 293细胞，在补充有1 μg/ml嘌呤霉素的10%热灭活的(HI)FBS/DMEM中进行培养，并且每3-4天进行传代。
将表达SpCas9的野生型HEK 293细胞系以200,000个细胞/孔接种到96孔板中的200 μl 10% HIFBS/DMEM中，并且用1 μg包含以下任何一种的sgRNA进行转染：USH2A MP(SEQ ID NO：5327)、USH2A MO(SEQ ID NO：5321)、USH2A MG(SEQ ID NO： 5323)或USH2A MB(SEQ ID NO：5325)。用于这种测定的sgRNA通过体外转录(IVT)由Thermofisher合成。
在转染后48-168小时，从转染的野生型HEK 293细胞中收获RNA，并且使用转录物特异性引物GATCCACGATGC(SEQ ID NO：5498)逆转录成cDNA，所述引物仅扩增质粒转录的产物。
然后使用正向引物GGTGACAGCTGCCAGGATCG(SEQ ID NO：5499)和反向引物GCCACCTCCAGTGCCAAGGT(SEQ ID NO：5500)PCR扩增cDNA。PCR产物在Bioanalyzer(可得自Agilent Technologies，California，US)上运行，所述Bioanalyzer是用于分析RNA的基于芯片的毛细管电泳仪。
当用pET01-IVS40和包含USH2A MP(SEQ ID NO：5327)的sgRNA转染野生型HEK 293细胞时，生物分析仪结果显示了235 bp的产物(图12C，泳道4)。这些结果指示，USH2A内含子40中的IVS40突变已被编辑，其导致剪接供体位点的破坏，以及152 bp从USH2A mRNA片段中的去除，使得USH2A mRNA片段总共235个碱基对。
当用pET01-IVS40和包含USH2A MO(SEQ ID NO：5321)的sgRNA转染野生型HEK 293细胞时，生物分析仪结果显示了235 bp的产物(图12C，泳道6)。这些结果指示，USH2A内含子40中的IVS40突变已被编辑，其导致剪接供体位点的破坏，以及152 bp从USH2A mRNA片段中的去除，使得USH2A mRNA片段总共235个碱基对。
当用pET01-IVS40和包含USH2A MG(SEQ ID NO：5323)的sgRNA转染野生型HEK 293细胞时，生物分析仪结果显示了235 bp的产物(图12C，泳道8)。这些结果指示，USH2A内含子40中的IVS40突变已被编辑，其导致剪接供体位点的破坏，以及152 bp从USH2A mRNA片段中的去除，使得USH2A mRNA片段小于总共235个碱基对。生物分析仪错误导致条带中的向下位移是可能的。
当用pET01-IVS40和包含USH2A MB(SEQ ID NO：5325)的sgRNA转染野生型HEK 293细胞时，生物分析仪结果显示了235 bp的产物(图12C，泳道10)。这些结果指示，USH2A内含子40中的IVS40突变已被编辑，其导致剪接供体位点的破坏，以及152 bp从USH2A mRNA片段中的去除，使得USH2A mRNA片段总共235个碱基对。
当用pET01-WT和包含USH2A MP(SEQ ID NO：5327)的sgRNA转染野生型HEK 293细胞时，生物分析仪结果显示了235 bp的产物(图12C，泳道3)。这些结果指示，包含USH2A MP(SEQ ID NO：5327)的sgRNA不影响包含野生型序列的USH2A内含子40的RNA剪接。
当用pET01-WT和包含USH2A MO(SEQ ID NO: 5321)的sgRNA转染野生型HEK 293细胞时，生物分析仪结果显示了235 bp的产物(图12C，泳道5)。这些结果指示，包含USH2A MO(SEQ ID NO: 5321)的sgRNA不影响包含野生型序列的USH2A内含子40的RNA剪接。
当用pET01-WT和包含USH2A MG(SEQ ID NO: 5323)的sgRNA转染野生型HEK 293细胞时，生物分析仪结果显示了235 bp的产物(图12C，泳道7)。这些结果指示，包含USH2A MG(SEQ ID NO: 5323)的sgRNA不影响包含野生型序列的USH2A内含子40的RNA剪接。
当用pET01-WT和包含USH2A MB(SEQ ID NO: 5325)的sgRNA转染野生型HEK 293细胞时，生物分析仪结果显示了235 bp的产物(图12C，泳道9)。这些结果指示，包含USH2A MB(SEQ ID NO: 5325)的sgRNA不影响包含野生型序列的USH2A内含子40的RNA剪接。
将表达SpCas9的转染的野生型HEK 293FT细胞与对照细胞进行比较，所述对照细胞是表达SpCas9的野生型HEK 293细胞，并且用pET01-IVS40或pET01-WT进行转染，但未用任何sgRNA进行转染。当野生型HEK 293细胞用pET01-WT以及无sgRNA进行转染时，生物分析仪结果显示了235 bp的产物(图12C，泳道1)。当野生型HEK 293细胞用pET01-IVS40以及无sgRNA进行转染时，生物分析仪结果显示了387 bp的产物(图12C，泳道2)。
这些数据提供了本文提供的gRNA可以至少经由NHEJ策略校正与IVS40突变相关的剪接表型的证据。另外，gRNA不影响转录物与包含野生型序列的USH2A内含子40的剪接。
实施例15
测试sgRNA在细胞中的脱靶活性
一般期望限制脱靶编辑。相应地，为了在基因组水平上确定脱靶编辑的程度，使用GUIDE-seq、Amplicon-seq和/或Digenome-seq，就靶向全基因组的脱靶编辑测试了证实具有中靶活性的gRNA(或sgRNA)。脱靶效应在人或非人灵长类动物(NHP)感光细胞中进行测试。此类方法是本领域已知的，并且在本文中提供了实例。
实施例16
使用SpCas9的双重sgRNA编辑
为了进一步调查切除策略，可以与SpCas9结合的sgRNA成对使用，以缺失在USH2A基因的内含子40内的IVS40突变(图7A)。“双重sgRNA编辑”指靶向IVS40突变下游的位置的第一sgRNA，以及靶向IVS40突变上游的位置的第二sgRNA。
图7B-F显示了使用双重sgRNA的5种可能的编辑结果，其中第一sgRNA结合/靶向IVS40突变上游的位置，而第二sgRNA结合/靶向IVS40突变下游的位置。5种可能的编辑结果包括：(1)基因组DNA保持未编辑的(图7B)；(2)基因组DNA在IVS40突变上游的位置或IVS40突变下游的位置处进行编辑(图7C)；(3)基因组DNA在IVS40突变上游的位置和IVS40突变下游的位置两者处进行编辑，但编辑不导致缺失(超出任何预计的插入缺失)(图7D)；(4)基因组DNA在IVS40突变上游的位置和IVS40突变下游的位置两者处进行编辑，并且编辑导致缺失(图7E)；以及(5)基因组DNA在IVS40突变上游的位置和IVS40突变下游的位置两者处进行编辑，但编辑不导致缺失。相反，编辑导致倒转(图7F)。
缺失产物的大小(在图7E的情况下)和编辑效率对于每种双重sgRNA都是重要的。由第一sgRNA和第二sgRNA之间的编辑生成的缺失产物的大小由理论上预测的DNA断裂位点进行计算，所述DNA断裂位点对于第一sgRNA和第二sgRNA各自位于PAM序列上游三个核苷酸。对于与SpCas9结合的双重sgRNA，缺失产物的大小范围为70至1422 bp(表4，图9A)。
表4
Figure 683479DEST_PATH_IMAGE004
具有由整合到AAVS1基因座内的组成型启动子调节的SpCas9开放读码框(ORF)的野生型HEK 293细胞，在补充有1 μg/ml嘌呤霉素的10%热灭活的(HI)FBS/DMEM中进行培养，并且每3-4天进行传代。因为双重sgRNA与IVS40突变上游和下游的区域结合，并且这些区域在野生型细胞系和IVS40 USH2A突变细胞系之间并无差异，所以对于该实验使用野生型HEK293细胞(其表达SpCas9)是可能的。具有纯合的C.7595-2144A>G突变的遗传改造的HEK 293细胞(IVS40 USH2A突变细胞系)可以用于这些实验，但这些细胞并不表达SpCas9。
将表达SpCas9的野生型HEK 293细胞系以200,000个细胞/孔接种到96孔板中的200 μl 10% HIFBS/DMEM中，并且用0.5 μg靶向IVS40突变上游的位置的第一sgRNA、以及0.5 μg靶向IVS40突变下游的位置的第二sgRNA进行转染。
用于这种测定的靶向IVS40突变上游或下游的位置的sgRNA由Thermofisher合成。这些sgRNA包含特异性前间隔区和ThermoFisher的有专利权的tracrRNA序列。
将表达SpCas9的转染的野生型HEK 293细胞与对照细胞进行比较，所述对照细胞是表达SpCas9的野生型HEK 293细胞，但未用任何sgRNA进行转染，或用编码GFP的质粒进行转染(数据未显示)。
当使用双重sgRNA时，TIDE分析不能用于测量编辑效率，因为切除了基因组DNA的大区域，并且TIDE软件不能定量这些较大的缺失。TIDE分析更适合分析小尺寸的缺失和插入，例如预计起因于通过单个sgRNA生成的DSB经由NHEJ生成的缺失和插入。另外，较短长度的PCR产物在PCR反应中将是有利的，以评估双重sgRNA的编辑水平，因此高估了编辑细胞的百分比。相反，使用液滴数字(dd)PCR，可以最佳地执行由第一sgRNA和第二sgRNA之间的编辑生成的缺失的定量分析。
在转染后48-96小时，从转染的野生型HEK 293细胞中收获基因组DNA，用BamHI限制性酶消化，并且将70 ng用于ddPCR。在ddPCR期间，可以扩增两种PCR产物(第一PCR产物和第二PCR产物)(图8)。为了降低在ddPCR之前的粘度，用BamHI消化基因组DNA，所述BamHI不在两种PCR产物的紧邻或它们之间的区域中切割。
使用正向引物CCAGAGCAGGAAGCTAATAAA(SEQ ID NO：5501)和反向引物GATGAACTTGCACTTCAAACC(SEQ ID NO：5503)，扩增第一PCR产物(靶PCR产物)。靶PCR产物由用6-羧基荧光素(FAM)标记的USH2A靶探针AATTGAACACCTCTCCTTTCCCAAG(SEQ ID NO：5502)结合。在未编辑的细胞中，没有基因组DNA缺失，正向引物和反向引物扩增了基因组DNA，产生靶PCR产物，并且USH2A靶探针(TaqMan型)标记/定量靶PCR产物。在编辑的细胞中，基因组DNA的部分被缺失，并且USH2A靶探针不能结合编辑的DNA，因为探针的结合位点已被切除。
使用正向引物ACCTACCTATGTTACCACTCA(SEQ ID NO：5504)和反向引物GTCACCTTCTCTTACCTCAAAT(SEQ ID NO：5506)，扩增第二PCR产物(参考PCR产物)。参考PCR产物由用2'-氯-7'苯基-1,4-二氯-6-羧基荧光素(VIC)标记的USH2A参考探针CTTAGTGGAATCACAGACAATGGGC(SEQ ID NO：5505)结合。在编辑和未编辑的细胞两者中，该基因组区域均不受影响，正向引物和反向引物扩增了基因组DNA，产生参考PCR产物，并且USH2A参考探针标记/定量参考PCR产物。为此，参考PCR产物的量在编辑和未编辑的细胞之间应该不变。
在未编辑的细胞中，靶PCR产物与参考PCR产物的比率的比较应该是稳定的，并且理想地接近于1(假设对于两种PCR产物存在相似的扩增效率)。在编辑的细胞中，探针不与靶PCR产物DNA结合，因为基因组内的靶位点已被切除；因此，例如，与未编辑的细胞中的比率相比，靶PCR产物与参考PCR产物的比率减少。
与SpCas9结合的所选双重sgRNA的编辑效率确定为在18.5%至66.3%的范围内(图9A-B)。
这些数据提供了本文提供的使用双重sgRNA的切除策略，可以引起编码IVS40突变的DNA的缺失的证据。数据提示，USH2A基因转录物的剪接可以被校正。
实施例17
使用SaCas9的双重sgRNA编辑
为了进一步调查切除策略，可以与SaCas9结合的sgRNA成对使用，以缺失在USH2A基因的内含子40内的IVS40突变(图7A)。“双重sgRNA编辑”指靶向IVS40突变下游的位置的第一gRNA，以及靶向IVS40突变上游的位置的第二sgRNA。
缺失产物的大小(在图7E的情况下)和编辑效率对于每种双重sgRNA都是重要的。由第一sgRNA和第二sgRNA之间的编辑生成的缺失产物的大小由理论上预测的DNA断裂位点进行计算，所述DNA断裂位点对于第一sgRNA和第二sgRNA各自位于PAM序列上游三个核苷酸。对于与SaCas9结合的双重sgRNA，缺失产物的大小范围为211至1078 bp(表5，图11A)。
表5
Figure 463216DEST_PATH_IMAGE006
Figure 858425DEST_PATH_IMAGE008
野生型K562细胞含有USH2A基因的两个野生型等位基因，并且这些细胞被改造为在多西环素诱导型启动子下稳定表达金黄色葡萄球菌Cas9核酸内切酶。因为双重sgRNA与IVS40突变上游和下游的区域结合，并且这些区域在野生型细胞系和IVS40 USH2A突变细胞系之间并无差异，所以对于该实验使用野生型K562细胞(其表达SaCas9)是可能的。可以使用具有纯合的C.7595-2144A>G突变的遗传改造的HEK 293细胞(IVS40 USH2A突变细胞系)，但这些细胞并不表达SaCas9。
在转染前48小时，用1-10 μg/mL多西环素处理表达SaCas9的野生型K562细胞，以诱导SaCas9表达。然后将表达SaCas9的野生型K562细胞以200,000个细胞/孔接种到96孔板中的200 μl 10% FBS/IMDM中，并且用1 μg编码靶向IVS40突变上游的位置的第一sgRNA(图10；或SEQ ID NO：5507-5522和SEQ ID NO：5551-5557中任何一个)的质粒、以及1 μg编码靶向IVS40突变下游的位置的第二sgRNA(图10；或SEQ ID NO：5507-5522和SEQ ID NO：5551-5557中任何一个)的质粒进行核转染。
将表达SaCas9的转染的野生型K562细胞与对照细胞进行比较，所述对照细胞是表达SaCas9的野生型K562细胞，但未用编码sgRNA的任何质粒进行转染(数据未显示)。
转染的野生型K562细胞用1-10 μg/mL多西环素处理转染后的另外48-96小时。在转染后48-96小时，从转染的野生型K562细胞中收获基因组DNA，用BamHI限制性酶消化，并且将40-70 ng用于ddPCR分析，如实施例16中所述。
与SaCas9结合的几种双重sgRNA的编辑效率确定为在8.7%至30.8%的范围内(图11A-B)。
这些数据提供了本文提供的使用双重sgRNA的切除策略，可以引起编码IVS40突变的DNA的缺失的证据。数据提示，USH2A基因转录物的剪接被校正。
实施例18
用于经由BFP表达测量剪接的细胞系的构建
为了使在gRNA和Cas9直向同源物的多重组合之间的直接比较成为可能，申请人设计了基于BFP表达的蓝色荧光蛋白(BFP)剪接报道物测定。HEK 293细胞用于产生BFP剪接报道物测定所需的细胞系。
Jump-In™ GripTite™ HEK 293 Kit(可得自Thermo Fisher Scientific)用于将报道构建体整合到HEK 293基因组内。这种试剂盒包括包含R4 attP位点的HEK 293细胞，所述R4 attP位点可以被R4整合酶靶向，以促进报道构建体在未指定位点处整合到细胞基因组内。将编码整合酶的质粒和改造为携带报道构建体的第二质粒共转染到细胞内。在整合后，使用10µg/mL杀稻瘟菌素选择包含报道构建体的细胞。
整合的报道构建体包含可操作地连接至BFP基因的磷酸甘油酸激酶启动子，以允许BFP基因的转录。BFP基因包含USH2A基因的内含子40的部分。存在两种形式的构建体。第一形式(“野生型形式”)包含野生型内含子40序列(图13A)。野生型形式用于验证BFP剪接报道物测定，并且确认构建体可以表达BFP(数据未显示)。第二种形式(“IVS40突变体形式”)包含IVS40突变体内含子40序列(图13B-C)。
图13B-C显示了可以如何解释来自BFP剪接报道物测定的结果的图解。包含构建体的IVS40突变体形式的细胞将不表达可检测水平的BFP。尽管磷酸甘油酸激酶启动子激活BFP基因的转录，但内含子40序列中的IVS40突变引起异常剪接和IVS40的侧翼内含子序列的包括，其使得报道BFP基因在框外(图13B)。然而，如果根据本公开内容的基因组编辑经由缺失IVS40突变或经由修饰在IVS40突变内或附近的序列，来校正异常的mRNA剪接，则BFP可以在框内翻译以产生功能性蛋白(图13C)。然后可以通过流式细胞术或适合检测蛋白质表达的另一种方法来检测BFP表达。BFP剪接报道物测定可以间接地评估由Cas9直向同源物及其相应gRNA介导的基因组编辑对USH2A IVS40突变体剪接的作用(及其速率)。
实施例19
使用SpCas9向导RNA的BFP剪接报道物测定
为了测试与SpCas9配对的gRNA校正由于IVS40突变的异常剪接的能力，执行了BFP剪接报道物测定。测试了NHEJ策略和切除策略两者。
在BFP剪接报道物测定期间使用来自实施例18的改造的HEK 293细胞，其包含实施例18中描述的构建体的IVS40突变体形式。改造的HEK 293细胞在补充有GlutaMAX™(可得自Thermo Fisher Scientific)、25mM HEPES缓冲液(pH=7.3)和0.1mM MEM非必需氨基酸溶液的90% DMEM/10%透析FBS中生长。
在一些测定中，使用了与IVS40突变重叠的单个sgRNA。这些测定测试了NHEJ策略。在其它测定中，使用双重sgRNA。这些测定测试了切除策略。
不管是使用单个sgRNA还是使用双重sgRNA，每种sgRNA都在分开的质粒上编码，所述质粒包含(1)与U6启动子可操作地连接的sgRNA基因，以及(2)与鸡β-肌动蛋白启动子可操作地连接的SpCas9基因。因此，在单个sgRNA实验中，用一种质粒转染细胞，而在双重sgRNA实验中，用两种质粒转染细胞。转染使用Lipofectamine® 3000(可得自ThermoFisher Scientific)。为了控制基因剂量，当转染两种质粒时，转染1 μg的每种质粒，而当转染单一质粒时，转染2 μg质粒。每种质粒还编码通过T2A肽可操作地连接至Cas9基因的GFP基因。这可以允许经由测量GFP信号来监测转染效率。
在每种测定中转染150,000个细胞，并且在通过流式细胞术的荧光水平分析之前温育72小时。作为编辑的阴性对照，还执行用编码SpCas9的质粒以及并不编辑人USH2A基因的内含子40的乱序sgRNA的细胞转染(数据未显示)。结果显示于表6和图14中。报告的值是BFP阳性的总活细胞的百分比。所有测定都一式三份执行。
表6
Figure DEST_PATH_IMAGE009
当用包含编码USH2A MO的sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5321的sgRNA)的质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在22.9%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2A MP的sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5327的sgRNA)的质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在24.4%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2A MR的sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5328的sgRNA)的质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在13.8%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T715的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5300的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T387的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5295的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在16.2%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T261的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5298的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T387的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5295的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在11.2%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T343的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5279的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T387的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5295的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在12.7%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T715的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5300的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T176的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5290的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在13.1%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T715的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5300的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T210的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5294的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在17.8%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T343的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5279的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T210的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5294的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在8.8%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T715的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5300的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T193的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5277的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在14.4%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T715的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5300的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T505的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5274的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在17.1%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T343的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5279的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T193的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5277的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在9.5%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T715的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5300的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T585的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5275的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在14.0%的细胞中的BFP表达。
这些数据提供了来自包含IVS40突变的USH2A基因的转录物的剪接，可以经由本文提供的NHEJ策略或本文提供的切除策略来校正的证据，并且提示可以表达功能性USH2A蛋白。
实施例20
使用SaCas9向导RNA的BFP剪接报道物测定
为了测试与SaCas9配对的gRNA校正由于IVS40突变的异常剪接的能力，执行了BFP剪接报道物测定。测试了切除策略。
在BFP剪接报道物测定期间使用来自实施例18的改造的HEK 293细胞，其包含实施例18中描述的构建体的IVS40突变体形式。改造的HEK 293细胞如实施例19中进行生长。使用双重sgRNA来测试切除策略。
每种sgRNA都在分开的质粒上编码，所述质粒包含(1)与U6启动子可操作地连接的sgRNA基因，以及(2)与鸡β-肌动蛋白启动子可操作地连接的SaCas9基因。因此，用两种质粒(对于待测试的双重sgRNA对中的每一个一种质粒)转染细胞。转染使用Lipofectamine®3000(可得自Thermo Fisher Scientific)。为了控制基因剂量，用1 μg的每种质粒转染细胞。每种质粒还编码通过T2A肽可操作地连接至Cas9的GFP基因。这可以允许经由测量GFP信号来监测转染效率。
在每种测定中转染150,000个细胞，并且在通过流式细胞术的荧光水平分析之前温育72小时。作为编辑的阴性对照，还执行用编码SaCas9的质粒以及并不编辑人USH2A基因的内含子40的乱序sgRNA的细胞转染(数据未显示)。结果显示于表7和图15中。报告的值是BFP阳性的总活细胞的百分比。所有测定都一式三份执行。
表7
Figure 735115DEST_PATH_IMAGE010
当用包含编码USH2Amut_T93的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5448的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T115的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5449的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在27.8%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T134的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5452的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T127的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5450的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在22.2%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T140的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5453的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T115的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5449的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在35.5%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T142的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5454的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T115的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5449的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在33.5%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T142的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5454的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T115的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5449的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在33.5%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T134的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5452的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T115的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5449的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在25.6%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T190的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5455的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T115的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5449的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在35.1%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T134的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5452的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T215的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5457的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在26.6%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T140的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5453的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T131的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5451的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在33.2%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T134的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5452的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T131的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5451的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在27.4%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T190的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5455的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T215的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5457的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在24.3%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T190的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5455的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T131的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5451的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在27.7%的细胞中的BFP表达。
这些数据提供了来自包含IVS40突变的USH2A基因的转录物的剪接可以经由本文提供的切除策略来校正的证据，并且提示可以表达功能性USH2A蛋白。
实施例21
关于SaCas9、SpCas9和gRNA的所选组合的BFP剪接报道物测定
为了测试与SaCas9或SpCas9配对的gRNA校正由于IVS40突变的异常剪接的能力，执行了BFP剪接报道物测定。这些实验允许使用来自单个实验的数据，在各种gRNA和核酸酶组合中进行比较。测试了NHEJ策略和切除策略两者。
在BFP剪接报道物测定期间使用来自实施例18的改造的HEK 293细胞，其包含实施例18中描述的构建体的IVS40突变体形式。改造的HEK 293细胞如实施例19中进行生长。
在一些测定中，使用了与IVS40突变重叠的单个sgRNA。这些测定测试了NHEJ策略。在其它测定中，使用双重sgRNA。这些测定测试了切除策略。
不管是使用单个sgRNA还是使用双重sgRNA，每种sgRNA都在分开的质粒上编码，所述质粒包含(1)与U6启动子可操作地连接的sgRNA或SaCas9基因，以及(2)与鸡β-肌动蛋白启动子可操作地连接的SpCas9基因。因此，在单个sgRNA实验中，用一种质粒转染细胞，而在双重sgRNA实验中，用两种质粒转染细胞。转染使用Lipofectamine® 3000(可得自ThermoFisher Scientific)。为了控制基因剂量，当转染两种质粒时，转染1 μg的每种质粒，而当转染单一质粒时，转染2 μg质粒。每种质粒还编码与分开的启动子可操作地连接的GFP基因。这可以允许经由测量GFP信号来监测转染效率。GFP阳性细胞是已用至少一种质粒成功转染的细胞。
在转染前24小时，将100,000-150,000个细胞接种到1 mL培养基中。在转染后，细胞在通过流式细胞术的荧光水平分析之前温育72小时。作为编辑的阴性对照，还执行用编码SaCas9的质粒以及并不编辑人USH2A基因的内含子40的非靶向sgRNA的细胞转染。用编码SpCas9的质粒和非靶向sgRNA执行类似的阴性对照。结果显示于表8和图16中。报告的值是BFP阳性的总GFP阳性细胞的百分比。
表8
Figure DEST_PATH_IMAGE011
对于连同SaCas9一起表达的sgRNA获得了下述数据：
当用包含载体主链阴性对照的第一质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在0.0%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T93的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5448的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T115的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5449的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在36.0%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T140的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5453的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T115的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5449的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在50.7%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T142的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5454的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T115的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5449的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在49.1%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T134的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5452的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T115的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5449的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在36.1%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T190的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5455的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T115的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5449的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在48.3%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T140的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5453的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T131的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5451的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在45.8%的细胞中的BFP表达。
对于连同SpCas9一起表达的sgRNA获得了下述数据：
当用包含载体主链阴性对照的第一质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在0.0%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2A MO的sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5321的sgRNA)的质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在38.0%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2A MP的sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5327的sgRNA)的质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在35.0%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T715的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5300的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T387的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5295的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在17.0%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T343的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5279的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T387的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5295的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在11.7%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T715的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5300的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T176的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5290的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在20.5%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T715的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5300的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T193的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5277的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在29.2%的细胞中的BFP表达。
当用包含编码USH2Amut_T715的第一sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5300的sgRNA)的第一质粒、以及包含编码USH2Amut_T505的第二sgRNA基因(包含SEQ ID NO：5274的sgRNA)的第二质粒转染改造的HEK 293细胞时，通过基因组编辑校正了BFP报道物的剪接，导致在27.9%的细胞中的BFP表达。
这些数据提供了来自包含IVS40突变的USH2A基因的转录物的剪接，可以经由本文提供的NHEJ策略或本文提供的切除策略来校正的证据，导致功能性USH2A蛋白的表达。
实施例22
关于所选SpCas9 gRNA的ddPCR测定
为了测试与SpCas9配对的gRNA校正IVS40突变的能力，执行了液滴数字逆转录酶PCR(ddPCR)实验。测试了NHEJ策略和切除策略两者。
实施例8中生成的IVS40 USH2A突变细胞系用于这些实验中。IVS40 USH2A突变细胞系以200,000个细胞/孔接种到96孔板中的200 μl 10%热灭活的(HI)FBS/90% DMEM中。
在一些实验中，使用单个未修饰的合成sgRNA(得自Thermo Fisher Scientific)。这些实验测试了NHEJ策略。在其它实验中，使用双重未修饰的合成sgRNA(得自ThermoFisher Scientific)(双重sgRNA)。这些实验测试了切除策略。
当使用单个sgRNA时，用1 μg sgRNA和2.5 μg SpCas9蛋白作为编辑RNP复合物执行核转染。当使用双重sgRNA时，用0.5 μg的每种sgRNA和2.5 μg SpCas9蛋白作为编辑RNP复合物执行核转染。
申请人希望对用编辑RNA复合物转染的细胞执行ddPCR。然而，USH2A基因在IVS40USH2A突变细胞遗传背景中以低水平转录，使得USH2A基因的转录激活在分离mRNA之前是优选的。为了增加USH2A mRNA的转录，用包含编码USH2A转录激活复合物的基因的质粒第二次转染细胞(在第一次转染后72小时)。第一质粒编码dCas9变体(包含使核酸酶活性失活的点突变的Cas9蛋白)。第二质粒编码与小鼠NF-κB(p65)p65亚基的C末端部分融合的sgRNA和细菌噬菌体MS2衣壳蛋白。sgRNA将RNA复合物引导至USH2A转录起始位点上游的区域。
dCas9与转录激活子VP64融合。sgRNA与两个MS2 RNA适体融合，后者可以募集与MS2衣壳蛋白(例如p65和HSF1)融合的反式激活子。当RNP复合物在USH2A转录起始位点的上游装配时，融合配偶体和细胞蛋白的活性可以激活USH2A基因的转录，从而增加先前编辑的IVS40 USH2A突变细胞中产生的mRNA量。
在第二次转染后7天，从细胞中分离mRNA，并且通过逆转录制备cDNA。对cDNA执行ddPCR，以定量相对于由其中IVS40突变未缺失或修饰的USH2A基因制备的转录物，由其中IVS40突变被缺失或修饰的USH2A基因制备的转录物。
在ddPCR期间，可以使用正向引物CCAACCGTACACAGAGTATATG(SEQ ID NO：5558)和反向引物CTTGACTTCACATCCAGAAGAA(SEQ ID NO：5559)，扩增第一PCR产物。第一PCR产物显示于图17A中，并且由起因于由USH2A基因转录的mRNA的cDNA产生，在所述USH2A基因中IVS40突变未缺失或修饰。第一PCR产物可以由第一探针(图17A中的“突变型特异性探针”)结合。第一探针用2'-氯-7'苯基-1,4-二氯-6-羧基荧光素(VIC)标记，并且包含序列AGTAGATTCGCTGCTCTTGTTGC(SEQ ID NO：5560)。
在ddPCR期间，可以使用正向引物CCAACCGTACACAGAGTATATG(SEQ ID NO：5558)和反向引物CTTGACTTCACATCCAGAAGAA(SEQ ID NO：5559)，扩增第二PCR产物。第二PCR产物显示于图17B中，并且由起因于由USH2A基因转录的mRNA的cDNA产生，在所述USH2A基因中IVS40突变被缺失或修饰。第二PCR产物可以由第二探针(图17B中的“野生型特异性探针”)结合。第二探针用6-羧基荧光素(FAM)标记，并且包含序列AGAGGACAAACCTGGACCTGTAG(SEQID NO：5561)。在ddPCR期间检测到的来自第一VIC标记的探针的总信号百分比，对应于由其中IVS40突变未缺失或修饰的USH2A基因产生的mRNA级分(%未校正的USH2A转录物，图18)。在ddPCR期间检测到的来自第二FAM标记的探针的总信号百分比，对应于由其中IVS40突变被缺失或修饰的USH2A基因产生的mRNA级分(%校正的USH2A转录物，图18)。
结果显示于表9和图18中。
表9
Figure DEST_PATH_IMAGE013
当切除策略与双重sgRNA一起使用时，获得了下述数据：
当用第一合成sgRNA，USH2Amut_T176(包含SEQ ID NO：5290的sgRNA)和第二合成sgRNA，USH2Amut_T715(包含SEQ ID NO：5300的sgRNA)转染IVS40 USH2A突变细胞时，77.5%的USH2A转录物不含由IVS40突变引起的异常内含子序列(假外显子)。
当用第一合成sgRNA，USH2Amut_T210(包含SEQ ID NO：5294的sgRNA)和第二合成sgRNA，USH2Amut_T715(包含SEQ ID NO：5300的sgRNA)转染IVS40 USH2A突变细胞时，67.3%的USH2A转录物不含由IVS40突变引起的异常内含子序列(假外显子)。
当用第一合成sgRNA，USH2Amut_T387(包含SEQ ID NO：5295的sgRNA)和第二合成sgRNA，USH2Amut_T715(包含SEQ ID NO：5300的sgRNA)转染IVS40 USH2A突变细胞时，77.6%的USH2A转录物不含由IVS40突变引起的异常内含子序列(假外显子)。
当用第一合成sgRNA，USH2Amut_T193(包含SEQ ID NO：5277的sgRNA)和第二合成sgRNA，USH2Amut_T343(包含SEQ ID NO：5279的sgRNA)转染IVS40 USH2A突变细胞时，62.6%的USH2A转录物不含由IVS40突变引起的异常内含子序列(假外显子)。
当用第一合成sgRNA，USH2Amut_T387(包含SEQ ID NO：5295的sgRNA)和第二合成sgRNA，USH2Amut_T343(包含SEQ ID NO：5279的sgRNA)转染IVS40 USH2A突变细胞时，77.4%的USH2A转录物不含由IVS40突变引起的异常内含子序列(假外显子)。
当用第一合成sgRNA，USH2Amut_T505(包含SEQ ID NO：5274的sgRNA)和第二合成sgRNA，USH2Amut_T343(包含SEQ ID NO：5279的sgRNA)转染IVS40 USH2A突变细胞时，48.5%的USH2A转录物不含由IVS40突变引起的异常内含子序列(假外显子)。
当用第一合成sgRNA，USH2Amut_T585(包含SEQ ID NO：5275的sgRNA)和第二合成sgRNA，USH2Amut_T343(包含SEQ ID NO：5279的sgRNA)转染IVS40 USH2A突变细胞时，71.9%的USH2A转录物不含由IVS40突变引起的异常内含子序列(假外显子)。
当IVS40 USH2A突变细胞不用RNP复合物进行模拟转染时，1.0%的USH2A转录物不含由IVS40突变引起的异常内含子序列(假外显子)。
当NHEJ策略与单个sgRNA一起使用时，获得了下述数据：
当用合成sgRNA，USH2A MP(包含SEQ ID NO：5327的sgRNA)转染IVS40 USH2A突变细胞时，90.7%的USH2A转录物不含由IVS40突变引起的异常内含子序列(假外显子)。
当用合成sgRNA，USH2A MO(包含SEQ ID NO：5321的sgRNA)转染IVS40 USH2A突变细胞时，89.8%的USH2A转录物不含由IVS40突变引起的异常内含子序列(假外显子)。
当用合成sgRNA，USH2A MG(包含SEQ ID NO：5323的sgRNA)转染IVS40 USH2A突变细胞时，37.4%的USH2A转录物不含由IVS40突变引起的异常内含子序列(假外显子)。
当用合成sgRNA，USH2A MB(包含SEQ ID NO：5325的sgRNA)转染IVS40 USH2A突变细胞时，43.3%的USH2A转录物不含由IVS40突变引起的异常内含子序列(假外显子)。
当用合成sgRNA，USH2A MR(包含SEQ ID NO：5328的sgRNA)转染IVS40 USH2A突变细胞时，84.1%的USH2A转录物不含由IVS40突变引起的异常内含子序列(假外显子)。
当用GFP质粒对照转染IVS40 USH2A突变细胞时，1.9%的USH2A转录物不含由IVS40突变引起的异常内含子序列(假外显子)。
当用mCherry mRNA对照转染IVS40 USH2A突变细胞时，4.1%的USH2A转录物不含由IVS40突变引起的异常内含子序列(假外显子)。
当用MOC转染对照转染IVS40 USH2A突变细胞时，3.0%的USH2A转录物不含由IVS40突变引起的异常内含子序列(假外显子)。
这些数据提供了来自包含IVS40突变的USH2A基因的转录物的剪接，可以经由本文提供的NHEJ策略或本文提供的切除策略来校正的证据，导致功能性USH2A蛋白的表达。
实施例23
测试向导RNA在细胞中的中靶活性和脱靶活性
为了进一步评估本文提供的gRNA，所选gRNA可以进一步测试在永生化的人患者衍生的成纤维细胞中的中靶活性，所述成纤维细胞具有USH2A基因的纯合IVS40突变。
在USH2A基因的等位基因中具有纯合IVS40突变的患者提供了皮肤活组织检查，以产生永生化的细胞系。永生化的细胞系用sgRNA和Cas9(或编码sgRNA和/或Cas9的核酸)进行转染。测试了NHEJ和切除策略两者。如本文所述，通过ddPCR执行编辑的细胞中的USH2A转录物的靶向基因组缺失和/或剪接的分析。结果可以指示根据本公开内容的基因组编辑校正IVS40突变的能力，导致患者衍生的细胞中的功能性USH2A蛋白表达。
对来自健康人志愿者的永生化细胞进行类似测试，以分析本公开内容的gRNA的脱靶活性。
实施例24
其它gRNA的测试
使用实验如与本文所述实施例中的那些对应的实验，来测试包含其它间隔区序列例如AUAUGAUGAUAGUAUUAU(SEQ ID NO：5443)的另外sgRNA。SEQ ID NO：5443是在图2G中发现的间隔区序列，靶DNA序列(5'-3')在图2H中发现，并且sgRNA所结合的靶DNA序列的反向链(5'- 3')在图2I中发现。
例如，使用本文所述的细胞系和方法，确定中靶活性和脱靶活性。使用BFP剪接报道物测定(在实施例18-21中例示)和/或ddPCR测定(在实施例22中例示)，来测试此类sgRNA校正USH2A IVS40剪接缺陷的能力。在患者衍生的细胞中执行另外的测试(实施例23)，以确认此类序列用于编辑的能力。包含其它间隔区序列的sgRNA可以彼此配对或与本文提供的其它sgRNA配对，并且作为双重sgRNA使用。包含其它间隔区序列的sgRNA可以作为单个sgRNA使用。
实施例25
测试用于HDR基因编辑的不同方法
除测试gRNA的中靶活性和脱靶活性之外，还测试了HDR策略。
对于HDR策略，提供了作为短单链寡核苷酸、短双链寡核苷酸(完整的PAM序列/突变的PAM序列)、长单链DNA分子(完整的PAM序列/突变的PAM序列)、或长双链DNA分子(完整的PAM序列/突变的PAM序列)的供体DNA模板。在一些实例中，供体DNA模板通过AAV递送。
这些结果证实了各种HDR基因编辑策略的功效，并且用于选择有效的构建体和策略。
实施例26
前导CRISPR-Cas9/DNA供体组合的重新评价
在一些情况下，对于缺失、重组和脱靶特异性的效率，在细胞中重新评价一种或多种CRISPR-Cas9/DNA供体组合。在一些实施方案中，将Cas9 mRNA或RNP配制到脂质纳米颗粒内用于递送，将sgRNA配制到纳米颗粒内或作为重组AAV颗粒递送，并且将供体DNA配制到纳米颗粒内或作为重组AAV颗粒递送。
这些数据证实了制剂用于例如HDR基因编辑策略的功效。
实施例27
在有关动物模型中的体内测试
在动物模型，例如恒河猴(猕猴(Macaca mulatta)和食蟹猕猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))中，在体内测试本文鉴定的所选CRISPR-Cas9/gRNA组合。另外，在来自人供体的人眼中测试制剂。
关于说明性实施例的注释
虽然本公开内容提供了各个具体方面的描述，用于说明本公开内容的各种实施例和/或其潜在应用的目的，但应理解，本领域技术人员将想到变化和修饰。相应地，本文描述的一个或多个发明应当理解为至少与其要求保护的范围一样宽，而不是像本文提供的特定说明性实施例那样更狭窄地定义。

Claims (137)

1.一种用于编辑人细胞中的USH2A基因的方法，所述方法包括：
将一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶引入人细胞内，从而实现在USH2A基因或编码USH2A基因的调节序列的DNA序列内或附近的一个或多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，其导致校正，从而产生编辑的人细胞。
2.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：
将一种或多种DNA核酸内切酶引入人细胞内，从而实现在USH2A基因的内含子40内或附近的一个或多个SSB或DSB，其导致校正，从而产生编辑的人细胞。
3.权利要求2的方法，其中所述IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
4.一种用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的体内方法，所述方法包括：编辑患者的细胞中含有IVS40突变的USH2A基因。
5.权利要求4的方法，其中所述编辑包括：
将一种或多种DNA核酸内切酶引入细胞内，以实现在USH2A基因的内含子40内或附近的一个或多个SSB或DSB，其导致校正并且导致usherin蛋白功能的恢复。
6.权利要求4-5中任一项的方法，其中所述IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
7.权利要求1-2或5中任一项的方法，其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或Cpf1核酸内切酶；其同源物，其天然存在的分子的重组，其密码子优化的或其修饰形式，及其组合。
8.权利要求7的方法，其中所述方法包括将编码一种或多种DNA核酸内切酶的一种或多种多核苷酸引入细胞内。
9.权利要求7的方法，其中所述方法包括将编码一种或多种DNA核酸内切酶的一种或多种核糖核酸(RNA)引入细胞内。
10.权利要求8或9中任一项的方法，其中所述一种或多种多核苷酸或者一种或多种RNA是一种或多种修饰的多核苷酸或者一种或多种修饰的RNA。
11.权利要求7的方法，其中所述DNA核酸内切酶是一种或多种蛋白质或多肽。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法进一步包括：将一种或多种向导核糖核酸(gRNA)引入细胞内。
13.权利要求12的方法，其中所述一种或多种gRNA是单分子向导RNA(sgRNA)。
14.权利要求12-13中任一项的方法，其中所述一种或多种gRNA或者一种或多种sgRNA是一种或多种修饰的gRNA或者一种或多种修饰的sgRNA。
15.权利要求11-13中任一项的方法，其中所述一种或多种DNA核酸内切酶与一种或多种gRNA或者一种或多种sgRNA预复合。
16.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括：将多核苷酸供体模板引入细胞内，所述多核苷酸供体模板包含野生型USH2A基因或cDNA的至少一部分。
17.权利要求16的方法，其中所述野生型USH2A基因或cDNA的至少一部分是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、内含子区域、其片段或组合、或者整个USH2A基因或cDNA。
18.权利要求16-17中任一项的方法，其中所述供体模板是单链或双链多核苷酸。
19.权利要求16-17中任一项的方法，其中所述供体模板具有与1q41区域同源的臂。
20.权利要求2或5的方法，其进一步包括：
将一种gRNA引入细胞内；
其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是一种或多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其实现在位于USH2A基因的内含子40内或附近的基因座处的一个SSB或DSB；和
其中所述gRNA包含与位于内含子40内的基因座区段互补的间隔区序列。
21.权利要求2或5的方法，其进一步包括：
将一种或多种gRNA引入细胞内；
其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是一种或多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其实现在USH2A基因的内含子40内或附近的一对SSB或DSB，第一个在5'基因座处而第二个在3'基因座处；和
其中所述第一gRNA包含与5'基因座的区段互补的间隔区序列，而第二gRNA包含与3'基因座的区段互补的间隔区序列。
22.权利要求20或21的方法，其中所述IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
23.权利要求20-22中任一项的方法，其中所述一种或多种gRNA是一种或多种sgRNA。
24.权利要求20-23中任一项的方法，其中所述一种或多种gRNA或者一种或多种sgRNA是一种或多种修饰的gRNA或者一种或多种修饰的sgRNA。
25.权利要求20-24中任一项的方法，其中所述一种或多种DNA核酸内切酶与一种或多种gRNA或者一种或多种sgRNA预复合。
26.权利要求20的方法，其进一步包括：包含野生型USH2A基因的至少一部分的多核苷酸供体模板；
其中将来自所述多核苷酸供体模板的新序列插入位于USH2A基因的内含子40内或附近的基因座处的染色体DNA内，其导致USH2A基因中的IVS40突变的校正。
27.权利要求21的方法，其进一步包括：包含野生型USH2A基因的至少一部分的多核苷酸供体模板；
其中将来自所述多核苷酸供体模板的新序列插入在USH2A基因的内含子40内或附近的5'基因座和3'基因座之间的染色体DNA内，其导致在USH2A基因的内含子40内或附近的5'基因座和3'基因座之间的染色体DNA的校正。
28.权利要求20-27中任一项的方法，其中所述野生型USH2A基因或cDNA的至少一部分是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、内含子区域、其片段或组合、或者整个USH2A基因或cDNA。
29.权利要求20-28中任一项的方法，其中所述多核苷酸供体模板是单链或双链多核苷酸。
30.权利要求20-29中任一项的方法，其中所述多核苷酸供体模板具有与1q41区域同源的臂。
31.权利要求20-30的方法，其中所述SSB或DSB位于内含子40，IVS40突变上游的0至1800个核苷酸内。
32.权利要求20-30的方法，其中所述SSB或DSB位于内含子40，IVS40突变下游的0至1100个核苷酸内。
33.权利要求12-15或23-25中任一项的方法，其中所述gRNA或sgRNA与USH2A基因的内含子40的区段互补。
34.权利要求1-3或5-33中任一项的方法，其中所述校正是通过同源定向修复(HDR)。
35.权利要求26-27中任一项的方法，其中所述供体模板具有与IVS40突变同源的臂。
36.权利要求2或5的方法，其进一步包括：
将两种gRNA引入细胞内；
其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是一种或多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其实现在USH2A基因的内含子40内或附近的引起5' DSB基因座和3' DSB基因座之间的染色体DNA缺失的一对DSB，第一个在5' DSB基因座处而第二个在3' DSB基因座处，其导致在USH2A基因的内含子40内或附近的5' DSB基因座和3' DSB基因座之间的染色体DNA缺失；和
其中所述第一gRNA包含与5' DSB基因座的区段互补的间隔区序列，而第二gRNA包含与3' DSB基因座的区段互补的间隔区序列。
37.权利要求36的方法，其中所述IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
38.权利要求36-37中任一项的方法，其中所述两种gRNA是两种sgRNA。
39.权利要求36-38中任一项的方法，其中所述两种gRNA或两种sgRNA是两种修饰的gRNA或两种修饰的sgRNA。
40.权利要求36-39中任一项的方法，其中所述一种或多种DNA核酸内切酶与两种gRNA或两种sgRNA预复合。
41.权利要求36-40中任一项的方法，其中内含子40内的5’ DSB位于 IVS40突变上游的0至1800个核苷酸。
42.权利要求36-40中任一项的方法，其中内含子40内的3’ DSB位于IVS40突变下游的0至1100个核苷酸。
43.权利要求36-42中任一项的方法，其中所述缺失是50 bp至2900 bp的缺失。
44.权利要求36-42中任一项的方法，其中所述缺失是50 bp至2000 bp的缺失。
45.权利要求36-42中任一项的方法，其中所述缺失是50 bp至1000 bp的缺失。
46.权利要求36-42中任一项的方法，其中所述缺失是50 bp至500 bp的缺失。
47.权利要求36-42中任一项的方法，其中所述缺失是50 bp至250 bp的缺失。
48.权利要求36-47中任一项的方法，其进一步包括：包含野生型USH2A基因的至少一部分的多核苷酸供体模板。
49.权利要求20-22和36-37中任一项的方法，其中所述Cas9或Cpf1 mRNA、gRNA和供体模板各自配制到分开的脂质纳米颗粒内，或全部共配制到脂质纳米颗粒内。
50.权利要求20-22和36-37中任一项的方法，其中所述Cas9或Cpf1 mRNA、gRNA和供体模板各自配制到分开的腺相关病毒(AAV)载体内，或全部共配制到AAV载体内。
51.权利要求20-22和36-37中任一项的方法，其中所述Cas9或Cpf1 mRNA配制到脂质纳米颗粒内，并且所述gRNA和供体模板两者均通过AAV载体递送至细胞。
52.权利要求20-22和36-37中任一项的方法，其中所述Cas9或Cpf1 mRNA配制到脂质纳米颗粒内，并且所述gRNA通过电穿孔递送至细胞，并且所述供体模板通过AAV载体递送至细胞。
53.权利要求50-52的方法，其中所述AAV载体是自灭活的AAV载体。
54.前述权利要求中任一项的方法，其中所述USH2A基因位于染色体1上：215,622,893-216,423,395(Genome Reference Consortium – GRCh38/hg38)。
55.权利要求1-3或5-54中任一项的方法，其中usherin蛋白功能的恢复与野生型或正常的usherin蛋白功能进行比较。
56.权利要求16的方法，其中所述多核苷酸供体模板是至多11 kb。
57.权利要求56的方法，其中所述多核苷酸供体模板通过AAV进行递送。
58.权利要求1-3的方法，其中所述人细胞是感光细胞或视网膜祖细胞。
59.权利要求4-57的方法，其中所述细胞是感光细胞或视网膜祖细胞。
60.权利要求1的方法，其中所述校正导致USH2A基因的表达或功能的调节。
61.权利要求2的方法，其中所述校正导致USH2A基因的表达或功能的调节。
62.权利要求5的方法，其中所述校正导致USH2A基因的表达或功能的调节，并且导致usherin蛋白功能的恢复。
63.权利要求4的方法，其中所述编辑包括：
将一种或多种DNA核酸内切酶引入细胞内，以实现在USH2A基因的内含子40内或附近的一个或多个SSB或DSB，其导致USH2A基因的表达或功能的调节，并且导致usherin蛋白功能的恢复。
64.用于编辑人细胞中的USH2A基因的方法，所述方法包括：
将一种或多种DNA核酸内切酶引入人细胞内，从而实现在USH2A基因或编码USH2A基因的调节序列的DNA序列内或附近的一个或多个SSB或DSB，其导致USH2A基因的表达或功能的调节，从而产生编辑的人细胞。
65.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：
将一种或多种DNA核酸内切酶引入人细胞内，从而实现在USH2A基因的内含子40内或附近的一个或多个SSB或DSB，其导致USH2A基因的表达或功能的调节，从而产生编辑的人细胞。
66.权利要求65的方法，其中所述IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
67.一种或多种gRNA，其用于编辑来自2A型乌谢尔综合征患者的细胞中含有IVS40突变的USH2A基因，所述一种或多种gRNA包含间隔区序列，其选自序列表的SEQ ID NO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328、5443和5446-5461中的核酸序列。
68.权利要求67的一种或多种gRNA，其中所述IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
69.权利要求67-68的一种或多种gRNA，其中所述一种或多种gRNA是一种或多种sgRNA。
70.权利要求67-69的一种或多种gRNA或sgRNA，其中所述一种或多种gRNA或者一种或多种sgRNA是一种或多种修饰的gRNA或者一种或多种修饰的sgRNA。
71.权利要求67-70的一种或多种gRNA或sgRNA，其中所述细胞是感光细胞、视网膜祖细胞、间充质干细胞(MSC)或诱导性多能干细胞(iPSC)。
72.一种治疗剂，其包含用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的至少一种或多种gRNA，所述一种或多种gRNA包含间隔区序列，其选自序列表的SEQ ID NO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328、5443和5446-5461中的核酸序列。
73.权利要求72的治疗剂，其中所述IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
74.权利要求72-73的治疗剂，其中所述一种或多种gRNA是一种或多种sgRNA。
75.权利要求72-74的治疗剂，其中所述一种或多种gRNA或者一种或多种sgRNA是一种或多种修饰的gRNA或者一种或多种修饰的sgRNA。
76.一种用于治疗2A型乌谢尔综合征患者的治疗剂，其通过包括以下的方法形成：
引入一种或多种DNA核酸内切酶；
引入一种或多种gRNA或者一种或多种sgRNA，其用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因；
任选地引入一种或多种供体模板；
其中所述一种或多种gRNA或sgRNA包含间隔区序列，其选自序列表的SEQ ID NO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328、5443和5446-5461中的核酸序列。
77.权利要求76的治疗剂，其中IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
78.一种用于在体内治疗2A型乌谢尔综合征的患者的试剂盒，所述试剂盒包含：
用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的一种或多种gRNA或sgRNA，其中所述一种或多种gRNA或sgRNA包含间隔区序列，其选自序列表的SEQ ID NO：5272-5319、5321、5323、5325、5327-5328、5443和5446-5461中的核酸序列；
一种或多种DNA核酸内切酶；和
任选地，一种或多种供体模板。
79.权利要求78的试剂盒，其中所述IVS40突变位于USH2A基因的内含子40内。
80.权利要求78-79的试剂盒，其中所述一种或多种DNA核酸内切酶是Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或Cpf1核酸内切酶；其同源物，其天然存在的分子的重组，其密码子优化的或其修饰形式，及其组合。
81.权利要求78-80中任一项的试剂盒，其包含一种或多种供体模板。
82.权利要求81的试剂盒，其中所述供体模板具有与1q41区域同源的臂。
83.权利要求81的试剂盒，其中所述供体模板具有与IVS40突变同源的臂。
84.一种gRNA或sgRNA，其包含SEQ ID NO：5321。
85.一种gRNA或sgRNA，其包含SEQ ID NO：5323。
86.一种gRNA或sgRNA，其包含SEQ ID NO：5325。
87.一种gRNA或sgRNA，其包含SEQ ID NO：5327。
88.一种gRNA或sgRNA，其包含SEQ ID NO：5328。
89.一种gRNA或sgRNA，其包含SEQ ID NO：5321和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
90.一种gRNA或sgRNA，其包含SEQ ID NO：5323和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
91.一种gRNA或sgRNA，其包含SEQ ID NO：5325和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
92.一种gRNA或sgRNA，其包含SEQ ID NO：5327和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
93.一种gRNA或sgRNA，其包含SEQ ID NO：5328和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
94.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ IDNO：5321的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
95.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ IDNO：5323的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
96.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ IDNO：5325的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
97.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ IDNO：5327的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
98.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ IDNO：5328的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
99.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQ IDNO：5321和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
100.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQID NO：5323和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
101.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQID NO：5325和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
102.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQID NO：5327和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
103.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQID NO：5328和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个的gRNA或sgRNA，编辑含有IVS40突变的USH2A基因。
104.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5321。
105.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5323。
106.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5325。
107.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5327。
108.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5328。
109.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5321和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
110.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5323和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
111.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5325和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
112.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5327和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
113.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用gRNA或sgRNA，其中所述gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5328和SEQ ID NO：5267-5269中任何一个。
114.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQID NO：5295的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5279的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
115.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQID NO：5294的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5300的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
116.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQID NO：5295的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5300的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
117.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQID NO：5290的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5300的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
118.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQID NO：5277的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5300的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
119.权利要求114-118中任一项的方法，其中所述第一gRNA和第二sgRNA同时施用；所述第一gRNA或sgRNA在所述第二gRNA或sgRNA之前施用；或者所述第二gRNA或sgRNA在所述第一gRNA或sgRNA之前施用。
120.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQID NO：5295，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5279。
121.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQID NO：5294，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5300。
122.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQID NO：5295，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5300。
123.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQID NO：5290，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5300。
124.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQID NO：5277，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5300。
125.权利要求120-124中任一项的方法，其中所述第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA同时施用；所述第一gRNA或sgRNA在所述第二gRNA或sgRNA之前施用；或者所述第二gRNA或sgRNA在所述第一gRNA或sgRNA之前施用于患者。
126.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQID NO：5452的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5449的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
127.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQID NO：5453的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5449的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
128.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQID NO：5455的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5457的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
129.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQID NO：5452的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5451的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
130.一种用于编辑含有IVS40突变的USH2A基因的方法，所述方法包括：使用包含SEQID NO：5448的第一gRNA或sgRNA、以及包含SEQ ID NO：5449的第二gRNA或sgRNA，缺失包含IVS40突变的序列。
131.权利要求126-130中任一项的方法，其中所述第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA同时施用；所述第一gRNA或sgRNA在所述第二gRNA或sgRNA之前施用；或者所述第二gRNA或sgRNA在所述第一gRNA或sgRNA之前施用。
132.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQID NO：5452，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5449。
133.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQID NO：5453，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5449。
134.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQID NO：5455，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5457。
135.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，第一gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5452，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5451。
136.一种用于治疗具有含有IVS40突变的USH2A基因的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA，其中所述第一gRNA或sgRNA包含SEQID NO：5448，并且所述第二gRNA或sgRNA包含SEQ ID NO：5449。
137.权利要求132-136中任一项的方法，其中所述第一gRNA或sgRNA和第二gRNA或sgRNA同时施用；所述第一gRNA或sgRNA在所述第二gRNA或sgRNA之前施用；或者所述第二gRNA或sgRNA在所述第一gRNA或sgRNA之前施用。
CN201880089894.2A 2017-12-21 2018-12-21 用于治疗2a型乌谢尔综合征的材料和方法 Pending CN111836892A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762609333P 2017-12-21 2017-12-21
US62/609333 2017-12-21
US201862746226P 2018-10-16 2018-10-16
US62/746226 2018-10-16
PCT/IB2018/060546 WO2019123429A1 (en) 2017-12-21 2018-12-21 Materials and methods for treatment of usher syndrome type 2a

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111836892A true CN111836892A (zh) 2020-10-27

Family

ID=65269008

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880089894.2A Pending CN111836892A (zh) 2017-12-21 2018-12-21 用于治疗2a型乌谢尔综合征的材料和方法

Country Status (7)

Country Link
US (2) US11072792B2 (zh)
EP (1) EP3728594A1 (zh)
JP (1) JP7402163B2 (zh)
CN (1) CN111836892A (zh)
AU (1) AU2018393050A1 (zh)
CA (1) CA3084632A1 (zh)
WO (1) WO2019123429A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115806989A (zh) * 2022-11-25 2023-03-17 昆明理工大学 针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA及载体和应用

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2018393050A1 (en) 2017-12-21 2020-06-18 Bayer Healthcare Llc Materials and methods for treatment of Usher Syndrome Type 2A
EP3728595A1 (en) 2017-12-21 2020-10-28 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of usher syndrome type 2a and/or non-syndromic autosomal recessive retinitis pigmentosa (arrp)
US20220145305A1 (en) * 2019-02-12 2022-05-12 Universita' Degli Studi Di Trento CAS12a GUIDE RNA MOLECULES AND USES THEREOF
KR20220004674A (ko) 2019-04-15 2022-01-11 에디진 인크. Rna를 편집하기 위한 방법 및 조성물
EP3963075A1 (en) * 2019-04-30 2022-03-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Correction of the two most prevalent ush2a mutations by genome editing
PE20220300A1 (es) 2019-07-12 2022-03-09 Univ Beijing Edicion de acido ribonucleico (arn) dirigido aprovechando la adenosina desaminasa que actua sobre acido ribonucleico endogeno (adar) utilizando acidos ribonucleicos (arn) modificados geneticamente
CR20220366A (es) * 2019-12-30 2022-11-28 Edigene Therapeutics Beijing Inc Método para el tratamiento del síndrome de usher y composición del mismo
WO2023150272A2 (en) * 2022-02-04 2023-08-10 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Exon skipping to treat usher syndrome
EP4223877A1 (en) * 2022-02-08 2023-08-09 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät System and method for editing genomic dna to modulate splicing
WO2023191570A1 (ko) * 2022-03-30 2023-10-05 주식회사 진코어 어셔 증후군 치료를 위한 유전자 편집 시스템
WO2023194359A1 (en) * 2022-04-04 2023-10-12 Alia Therapeutics Srl Compositions and methods for treatment of usher syndrome type 2a
WO2023201270A2 (en) * 2022-04-13 2023-10-19 Caribou Biosciences, Inc. Therapeutic applications of crispr type v systems

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015134812A1 (en) * 2014-03-05 2015-09-11 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
CN106061510A (zh) * 2013-12-12 2016-10-26 布罗德研究所有限公司 用于基因组编辑的crispr‑cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用

Family Cites Families (177)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
JP2828642B2 (ja) 1987-06-24 1998-11-25 ハワード フローレイ インスティテュト オブ イクスペリメンタル フィジオロジー アンド メディシン ヌクレオシド誘導体
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
JPH03503894A (ja) 1988-03-25 1991-08-29 ユニバーシィティ　オブ　バージニア　アランミ　パテンツ　ファウンデイション オリゴヌクレオチド　ｎ‐アルキルホスホラミデート
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
ES2116977T3 (es) 1990-05-11 1998-08-01 Microprobe Corp Soportes solidos para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y metodos para inmovilizar oligonucleotidos de modo covalente.
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
BR9106702A (pt) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Inc Analogo de oligonucleotideos e processos para modular a producao de uma proteina por um organismo e para tratar um organismo
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
IL113519A (en) 1990-08-03 1997-11-20 Sterling Winthrop Inc Oligonucleoside sequences of from about 6 to about 200 bases having a three atom internucleoside linkage, their preparation and pharmaceutical compositions for inhibiting gene expression containing said oligonucleosides
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
CA2092002A1 (en) 1990-09-20 1992-03-21 Mark Matteucci Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
ATE198598T1 (de) 1990-11-08 2001-01-15 Hybridon Inc Verbindung von mehrfachreportergruppen auf synthetischen oligonukleotiden
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
ATE239484T1 (de) 1991-10-24 2003-05-15 Isis Pharmaceuticals Inc Derivatisierte oligonukleotide mit verbessertem aufnahmevermögen
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
WO1994022891A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
PT728214E (pt) 1993-11-09 2004-11-30 Ohio Med College Linhas celulares estaveis capazes de expressar o gene de replicacao do virus adeno-associado
AU688428B2 (en) 1993-11-09 1998-03-12 Johns Hopkins University, The Generation of high titers of recombinant AAV vectors
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
WO1996017947A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
CA2625279A1 (en) 1995-08-30 1997-03-06 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adenovirus and aav
EP1983057A3 (en) 1995-09-08 2009-01-07 Genzyme Corporation Improved AAV vectors for gene therapy
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
EP1009808B1 (en) 1997-09-05 2012-12-05 Genzyme Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of recombinant aav vectors
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
US6287860B1 (en) 2000-01-20 2001-09-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of MEKK2 expression
WO2001083692A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
US6808905B2 (en) 2001-05-14 2004-10-26 Cell Genesys, Inc. Lentiviral vectors encoding clotting factors for gene therapy
US20030158403A1 (en) 2001-07-03 2003-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
ATE527347T1 (de) 2001-08-02 2011-10-15 Inst Clayton De La Rech Verfahren und zusammensetzungen im zusammenhang mit verbesserten lentivirusvektor- produktionssystemen
EP2428571B1 (en) 2001-09-28 2018-07-18 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. MicroRNA molecules
US8927269B2 (en) 2003-05-19 2015-01-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Avian adenoassociated virus and uses thereof
CA2533701A1 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
WO2005056807A2 (en) 2003-12-04 2005-06-23 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Bovine adeno-associated viral (baav) vector and uses thereof
US7427396B2 (en) 2004-06-03 2008-09-23 Genzyme Corporation AAV vectors for gene delivery to the lung
CA2633754C (en) 2006-01-05 2013-06-18 The Ohio State University Research Foundation Microrna-based methods and compositions for the diagnosis and treatment of solid cancers
EP2591794A1 (en) 2006-01-05 2013-05-15 The Ohio State University Research Foundation MicroRNA expressions abnormalities in pancreatic endocrine and acinar tumors
EP2522749A1 (en) 2006-03-02 2012-11-14 The Ohio State University MicroRNA expression profile associated with pancreatic cancer
EP2007795B1 (en) 2006-03-30 2016-11-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Aav capsid proteins
EP2115138A2 (en) 2006-09-19 2009-11-11 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in pancreatic diseases and uses thereof
WO2008054828A2 (en) 2006-11-01 2008-05-08 The Ohio State University Research Foundation Microrna expression signature for predicting survival and metastases in hepatocellular carcinoma
CN101622348A (zh) 2006-12-08 2010-01-06 奥斯瑞根公司 作为治疗性干预靶标的miR-20调节的基因和途径
WO2008147974A1 (en) 2007-05-23 2008-12-04 University Of South Florida Micro-rnas modulating immunity and inflammation
WO2008154098A2 (en) 2007-06-07 2008-12-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Reagents and methods for mirna expression analysis and identification of cancer biomarkers
JP2011505143A (ja) 2007-11-30 2011-02-24 ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション マイクロｒｎａ発現プロファイリング及び肺癌における末梢血ターゲティング
WO2009100430A2 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Asuragen, Inc miRNAs DIFFERENTIALLY EXPRESSED IN LYMPH NODES FROM CANCER PATIENTS
US20110052502A1 (en) 2008-02-28 2011-03-03 The Ohio State University Research Foundation MicroRNA Signatures Associated with Human Chronic Lymphocytic Leukemia (CCL) and Uses Thereof
EP2112235A1 (en) 2008-04-24 2009-10-28 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Compositions and methods for microRNA expression profiling of nasopharyngeal carcinoma
ES2762864T3 (es) 2008-06-18 2020-05-26 Oxford Biomedica Ltd Purificación de virus
WO2010018563A2 (en) 2008-08-12 2010-02-18 Rosetta Genomics Ltd. Compositions and methods for the prognosis of lymphoma
EP2358902A1 (en) 2008-12-10 2011-08-24 Universität Regensburg Compositions and methods for micro-rna expression profiling of cancer stem cells
WO2010129860A2 (en) 2009-05-08 2010-11-11 The Ohio State University Research Foundation Microrna expression profiling and targeting in chronic obstructive pulmonary disease (copd) lung tissue and methods of use thereof
KR100990111B1 (ko) 2009-08-19 2010-10-29 엘지전자 주식회사 태양전지
WO2011076143A1 (en) 2009-12-24 2011-06-30 Fudan University Compositions and methods for microrna expression profiling of lung cancer
WO2011076142A1 (en) 2009-12-24 2011-06-30 Fudan University Compositions and methods for microrna expession profiling in plasma of colorectal cancer
EP2341145A1 (en) 2009-12-30 2011-07-06 febit holding GmbH miRNA fingerprint in the diagnosis of diseases
WO2011094683A2 (en) 2010-01-29 2011-08-04 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Method of identifying myelodysplastic syndromes
EP2354246A1 (en) 2010-02-05 2011-08-10 febit holding GmbH miRNA in the diagnosis of ovarian cancer
WO2011113030A2 (en) 2010-03-11 2011-09-15 H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute Human cancer micro-rna expression profiles predictive of chemo-response
WO2011157294A1 (en) 2010-06-16 2011-12-22 Universita' Degli Studi Di Padova Compositions for use in treating or preventing cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, metastasis, heart failure, cardiac remodelling, dilated cardiomyopathy, autoimmune diseases, or diseases or disorders related thereto
WO2012151212A1 (en) 2011-05-01 2012-11-08 University Of Rochester Multifocal hepatocellular carcinoma microrna expression patterns and uses thereof
WO2012153187A2 (en) 2011-05-06 2012-11-15 Xentech Markers for cancer prognosis and therapy and methods of use
ES2610245T3 (es) 2011-07-15 2017-04-26 Leo Pharma A/S Perfilado de microARN para el diagnóstico en linfoma cutáneo de células T (CTCL)
US20150080243A1 (en) 2011-09-01 2015-03-19 Allegro Diagnostics Corp. Methods and compositions for detecting cancer based on mirna expression profiles
WO2013066678A1 (en) 2011-10-26 2013-05-10 Georgetown University Microrna expression profiling of thyroid cancer
CN109097398A (zh) 2011-11-24 2018-12-28 吉尼松公司 与工业制药应用相容的可放大的慢病毒载体生产系统
US9209196B2 (en) 2011-11-30 2015-12-08 Sharp Kabushiki Kaisha Memory circuit, method of driving the same, nonvolatile storage device using the same, and liquid crystal display device
DE102012007232B4 (de) 2012-04-07 2014-03-13 Susanne Weller Verfahren zur Herstellung von rotierenden elektrischen Maschinen
EA038924B1 (ru) 2012-05-25 2021-11-10 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Способы и композиции рнк-специфической модификации днк-мишени и рнк-специфической модуляции транскрипции
AU2014227766B2 (en) 2013-03-15 2018-10-04 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for dual glycan binding AAV vectors
JP2015092462A (ja) 2013-09-30 2015-05-14 Tdk株式会社 正極及びそれを用いたリチウムイオン二次電池
GB201403684D0 (en) 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
WO2015141521A1 (ja) 2014-03-21 2015-09-24 株式会社日立国際電気 基板処理装置、半導体装置の製造方法及び記録媒体
JP6197169B2 (ja) 2014-09-29 2017-09-20 東芝メモリ株式会社 半導体装置の製造方法
JP7109784B2 (ja) * 2015-10-23 2022-08-01 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 遺伝子編集のための進化したＣａｓ９蛋白質
WO2017186739A1 (en) * 2016-04-25 2017-11-02 Proqr Therapeutics Ii B.V. Oligonucleotides to treat eye disease
EP3728595A1 (en) 2017-12-21 2020-10-28 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of usher syndrome type 2a and/or non-syndromic autosomal recessive retinitis pigmentosa (arrp)
AU2018393050A1 (en) * 2017-12-21 2020-06-18 Bayer Healthcare Llc Materials and methods for treatment of Usher Syndrome Type 2A

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106061510A (zh) * 2013-12-12 2016-10-26 布罗德研究所有限公司 用于基因组编辑的crispr‑cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
WO2015134812A1 (en) * 2014-03-05 2015-09-11 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTEL VACHÉ等: "Usher syndrome type 2 caused by activation of an USH2A pseudoexon: implications for diagnosis and therapy" *
ERIN R BURNIGHT等: "CRISPR/Cas9-mediated genome editing for correction of inherited retinal disease mutations" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115806989A (zh) * 2022-11-25 2023-03-17 昆明理工大学 针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA及载体和应用
CN115806989B (zh) * 2022-11-25 2023-08-08 昆明理工大学 针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA及载体和应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20210403905A1 (en) 2021-12-30
JP2021508451A (ja) 2021-03-11
AU2018393050A1 (en) 2020-06-18
WO2019123429A1 (en) 2019-06-27
CA3084632A1 (en) 2019-06-27
EP3728594A1 (en) 2020-10-28
JP7402163B2 (ja) 2023-12-20
US20200354717A1 (en) 2020-11-12
US11072792B2 (en) 2021-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11118177B2 (en) Materials and methods for treatment of Usher syndrome type 2A and/or non-syndromic autosomal recessive retinitis pigmentosa (ARRP)
US10662425B2 (en) Materials and methods for treatment of autosomal dominant retinitis pigmentosa
EP3585900B1 (en) Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia type 2 (sca2) and other spinocerebellar ataxia type 2 protein (atxn2) gene related conditions or disorders
US11072792B2 (en) Materials and methods for treatment of usher syndrome type 2A
US11459587B2 (en) Materials and methods for treatment of pain related disorders
US20220047722A1 (en) Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia type 1 (sca1) and other spinocerebellar ataxia type 1 protein (atxn1) gene related conditions or disorders
US20230330270A1 (en) Materials and methods for treatment of friedreich ataxia and other related disorders
US10995328B2 (en) Materials and methods for treatment of autosomal dominant cone-rod dystrophy
WO2018002886A1 (en) Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia 3 (sca3) and other related disorders
WO2018002762A1 (en) Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als) and other related disorders

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination