CN109097398A - 与工业制药应用相容的可放大的慢病毒载体生产系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与工业制药应用相容的可放大的慢病毒载体生产系统。具体地，本发明涉及重组慢病毒载体生产的工业化，以便制造用于治疗性应用例如基因疗法和/或DNA疫苗接种的足够的材料，以用于临床试验和/或商业用途。

Description

与工业制药应用相容的可放大的慢病毒载体生产系统
本申请是国际申请日2012年11月26日、国际申请号PCT/EP2012/073645于2014年5月26日进入中国国家阶段、申请号201280058157.9、发明名称“与工业制药应用相容的可放大的慢病毒载体生产系统”的申请的分案申请。
本发明涉及重组慢病毒载体生产的工业化，以便制造用于治疗性应用例如基因疗法和/或DNA疫苗接种的足够的材料，以用于临床试验和/或商业用途。
技术领域
重组病毒载体用于基因疗法和DNA疫苗接种应用的用途的进步产生了大规模制造临床级病毒载体以转移遗传物质的需要。一种这样的病毒载体家族是属于逆转录病毒科的慢病毒属。
用于基因疗法应用的慢病毒载体常规是利用慢病毒构建物DNA系统通过磷酸钙转染贴壁细胞而制造的，所述转染需要培养基中有胎牛血清(Merten等，2011,Hum GeneTher.22(3):343-56)。培养物中存在这种动物来源的组分构成了安全性风险，限制了该方法的GMP合规性。此外，这种生产方法就扩大规模而言严重受限，并且不适用于基因疗法的治疗、商业和/或工业应用所要求的生产大量载体粒子。例如，现有的常规方法允许在纯化前在一次运行中产生24至48L慢病毒载体悬液，其滴度为约1×107至3×107个功能性载体粒子/mL，在20％的标准纯化产率下，这会在终产物中产生最多3×1011个粒子。相比而言，I期临床试验需要至少5×1011个功能性慢病毒载体粒子(McGregor等，2001,Hum Gene Ther.,12:2028-2029)。因此，现今强烈需要工业化慢病毒载体生物制造方法，其将满足当每个患者需要大量载体或者必须对大量患者进行治疗时对于足够量的治疗性载体的需要，或者更通常地对将成本保持在合理水平并且维持优良制造规范(good manufacturing practice)(GMP)的合规性的需要。
改进的一个潜在途径是使用在不存在胎牛血清(FBS)的化学条件培养基中悬浮生长的细胞培养物，以克服与使用FBS有关的安全性风险以及对导致常规方法缺乏可放大性的主要原因的细胞培养容器的需要。例如，最近已经描述了在不存在血清的悬浮培养物中通过瞬时转染来生产病毒载体。具体地，Ansorge等已经提出了在灌注培养物中通过瞬时转染悬浮生长的HEK293SF-3F6细胞来生产慢病毒的方法(Ansorge等，2009,J Gene Med,11:868-876)。然而，所提出的方法既复杂，又在规模上受限。事实上，Ansorge等的方法是在灌注培养物中进行的，这需要数个收获步骤以及复杂的控制措施。此外，那项研究中提出的生产局限于3升的体积。Segura等也已提出通过瞬时转染悬浮培养物来生产慢病毒载体的方法(Segura等，2007,Biotechnology and Bioengineering,98(4):789-799)。尽管如此，所提出的方法是复杂的，因为其需要数个收获步骤以及在转染后第3、4和5天更换全部培养基以及复杂的控制措施对照测量。此外，病毒载体的生产局限于3升的体积，而且据报道，仅仅是重组蛋白的生产，而非病毒载体的生产已经被放大至60L规模。因此，尽管存在这些报道，仍然需要开发用于从悬浮细胞培养物生产慢病毒载体的简单明了的工业化方法，其能同时解决商业规模的基于慢病毒的疫苗和/或基因疗法产品所面对的数量和质量问题。本发明通过公开一种能够提高病毒产量的优化的细胞培养物和慢病毒生产方法，解决并满足了这些需要。
发明内容
本发明涉及制药级重组慢病毒载体的工业化规模生产方法。下面显示的结果表明，发明人已经能够提供一种在产量和质量方面与利用贴壁细胞的现有GMP生产方法一样好或者更好、但具有大得多的放大生产潜能的方法。
因此，在第一个方面，本发明涉及用于生产重组慢病毒载体、慢病毒和假病毒的方法，其包括：
-在无血清培养基中悬浮培养哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞转染有至少一种适合于生产慢病毒载体的质粒，所述培养在至少5L的体积中进行；
-从培养基中收获所产生的重组慢病毒载体。
在一个优选的实施方案中，哺乳动物细胞是人胚肾293T细胞(也被称为HEK293T细胞或293T细胞)，其能够在无血清条件下悬浮生长。发明人已经显示，这些细胞特别适合于工业化生产满足数量和质量要求两者的大量重组慢病毒载体以用于疗法、特别是基因疗法临床试验和商业应用。
在一个特定的实施方案中，在转染后36小时至72小时之间、优选在48小时后收获慢病毒载体。在又一个实施方案中，培养以至少10L的规模，或优选至少50L的规模，或者甚至优选至少100L的规模实施，并且特别适合于慢病毒载体的工业化生产，使得能够收获至少107个感染性基因组IG/mL。本发明的方法首次使得能够进行慢病毒工业化生产，并且将获得非常高水平的病毒载体，正如由实验部分中示出的从100mL到50L的线性规模扩大所表明的。因此，通过实施本方法可获得非常高水平的病毒载体(例如在1000L的规模下)。在另一个优选的实施方案中，收获步骤由单次慢病毒收获组成。据发明人所知，这是首次报道在如此高的规模下实施单次收获来生产慢病毒载体。该实施方案的优势在于提供了一种简单明了的方法，该方法需要尽可能少的步骤并且能够控制成本。
此外，本发明还涉及上述方法，其中哺乳动物细胞的转染是瞬时转染，并且收获步骤由在转染后48至72小时之间实施的单次收获组成。
本发明进一步公开了在培养用于生产慢病毒的细胞之前对转染过程进行优化。在一个特定的实施方案中，用聚乙烯亚胺(PEI)和质粒的混合物转染细胞。在一个特定的实施方案中，上述方法包括转染步骤，其中用PEI和质粒的这种混合物转染细胞。在一个特定的变体中，利用至少1.5μg/106个细胞的总质粒DNA的量进行转染。在另一个特定的变体中，PEI是20-25kD的线性PEI。在又一个特定的变体中，本发明提供的优化还涉及混合物中每种组分的相对量。具体地，在本发明的一个特定的变体中，在转染前将PEI和质粒依照少于10的N/P比率混合，其中N/P是指每个寡核苷酸磷酸的PEI氮原子数目。在一个优选的变体中，N/P比率为6左右。在又一个特定的变体中，还已经探索了在加入到细胞培养物中之前PEI和质粒之间的接触时间，接触时间理想地可能在5至30分钟之间，接触时间具体地是10分钟左右。
可以通过在转染后24小时将丁酸钠加入到细胞培养物中而不更换培养基，对本发明的生产方法有利地进行优化。优选地，丁酸钠以2mM至12mM之间、具体地在2mM至10mM之间或5mM至12mM之间(例如5、8或12mM左右)的终浓度，更具体地是5mM的终浓度加入到培养物中。
在本发明方法的又一个实施方案中，被转染在细胞中的质粒包括4种质粒，包括：编码包膜蛋白的质粒(Env质粒)，该质粒可以来源于所讨论的慢病毒，但也可以来源于其他包膜病毒；编码慢病毒Gag和Pol蛋白的质粒(Gag-Pol质粒)；编码慢病毒Rev蛋白的质粒(Rev质粒)；以及在慢病毒3’-LTR和慢病毒5’LTR之间包含目标转基因(TOI)表达盒的质粒(TOI质粒)。
在又一个方面中，本发明提供了细胞培养装置(或生物反应器)，其中所述培养装置含有至少5L体积的无血清培养基，所述培养基中包含转染有至少一种适合于生产慢病毒载体的质粒的哺乳动物细胞，所述细胞在所述培养装置中悬浮生长。在一个特定的实施方案中，无血清培养基中的细胞是HEK 293T细胞。
在另一个方面中，本发明涉及通过在无血清培养基中悬浮生长的哺乳动物细胞而对慢病毒载体的生产进行优化的方法，所述哺乳动物细胞转染有所述生产所需的质粒，该方法包括在转染后24小时将丁酸钠加入到培养物中而不更换培养基。优选地，丁酸钠以5mM的终浓度加入。
具体实施方式
本发明涉及制药级重组慢病毒载体的工业化规模生产方法。所生产的载体可以用于治疗有需要的动物对象、具体地是哺乳动物、更具体地是人类对象中的病症。
用于生产慢病毒的质粒
慢病毒是哺乳动物的外源性逆转录病毒，并形成逆转录病毒的一个属。慢病毒载体(LV)来源于多种灵长类动物慢病毒，例如人免疫缺陷病毒(HIV)-1或-2或多种猴免疫缺陷病毒(SIV)，或者来源于非灵长类动物慢病毒，例如马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)或山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)。
可用于生产重组慢病毒载体的慢病毒组分是本领域已知的。参见例如Zufferey等，1997,Nat.Biotechnol.15:871-875和Dull等，1998,J.Virol.72(11):8463-8471。“第二代”慢病毒载体系统是指缺少功能性附加基因的包装系统，例如其中附加基因vif、vpr、vpu和nef已经缺失或失活的包装系统(Zufferey等，在前引用)。“第三代”慢病毒载体系统是指具有第二代载体系统的特性并且进一步缺少功能性tat基因的慢病毒包装系统，例如其中tat基因已经缺失或失活的慢病毒包装系统。通常，编码Rev的基因被提供在单独的表达构建物上(参见例如Dull等，在前引用)。对于可用于生产重组慢病毒载体的慢病毒载体系统的最新概述，还参见Schweizer和Merten,2010,Current Gene Therapy 10(6),474-486，更具体地是第2.2部分(“慢病毒载体系统”)。Schweizer和Merten报道了不可工业化的方法。
可以通过任意数量的质粒来向细胞提供慢病毒载体生产所必需的不同功能。具体地，这些功能可以通过至少1、2、3或4种质粒来提供。在本发明的一个特定的实施方案中，通过适合于生产慢病毒载体的4种质粒的转染、具体地是瞬时转染，来向哺乳动物细胞(具体地是在无血清条件下悬浮生长的293T细胞)提供慢病毒载体生产所必需的不同功能，其中一种质粒编码包膜蛋白(Env质粒)，一种质粒编码慢病毒Gag和Pol蛋白(Gag-Pol质粒)，一种质粒编码慢病毒Rev蛋白(Rev质粒)，并且一种质粒在慢病毒3’-LTR和慢病毒5’LTR之间包含目标转基因(TOI)表达盒(TOI质粒)。
每种功能(或组分)可以来源于任何适合的慢病毒。然而，在一个优选的实施方案中，gag-pol、rev和慢病毒基因组(3’-LTR和5’LTR)来源于HIV病毒，具体地来源于HIV-1或HIV-2。
此外，重组慢病毒载体可以是假型载体，其包含经修饰的包膜蛋白、来源于不同病毒的包膜蛋白或嵌合包膜蛋白。因此，例如Env质粒可以编码VSV-G Env蛋白，尽管本领域技术人员会意识到可以使用其他env基因。
当然，质粒中使用的TOI取决于慢病毒载体所预期的特定用途。TOI的说明性但非限制性实例包括编码治疗性RNA的TOI(例如编码与靶RNA或DNA序列互补的反义RNA的TOI)、编码在患病对象中缺陷或缺失的蛋白的基因疗法TOI，以及用于DNA疫苗接种的疫苗TOI，即编码的蛋白的表达会诱导受体生物体对所述蛋白的疫苗接种。
哺乳动物悬浮细胞
用于生产慢病毒的哺乳动物细胞是本领域已知的。这种细胞的代表性实例包括人胚肾(HEK)293细胞及其衍生物(例如293SF-3F6细胞系)，所述衍生物因能够在无血清条件下悬浮生长而被选择，并且理想地是高度可转染的。其他细胞类型包括但不限于HeLa细胞、A549细胞、KB细胞、CKT1细胞、NIH/sT3细胞、Vero细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或支持慢病毒生命周期的任意真核细胞。
在一个特定的实施方案中，细胞是本领域公知的293T细胞。293T可从许多供应商商购。这些细胞对应于来源于需要胎牛血清进行生长并转化有SV40大T抗原的人胚肾细胞的细胞系。具体地，HEK 293细胞系最初来源于转染有5型人腺病毒(Ad5)的机械剪切片段的人胚肾细胞，所述人胚肾细胞通过对表现出许多Ad转化特性的细胞进行选择而得到。人腺病毒的转化区含有早期区1(E1)，其由两个转录单元E1a和E1b组成，其产物对于哺乳动物细胞被Ad转化而言是必要且充分的。这些293细胞是初始Frank Graham 293细胞的亚克隆，所述Frank Graham 293细胞因更高的病毒产率(可能是腺病毒)和更好的细胞生长而被选择(Graham等，1977,J Gen Virol,36,59-74)。在Michele Calos(Stanford University)实验室中通过用编码SV-40T抗原的基因和新霉素抗性基因进行转染而从HEK 293细胞产生了293T细胞系。
先前，贴壁的293T细胞已经用于生产慢病毒载体。然而，本发明的发明人首次提出一种从适合于无血清悬浮培养条件的这些细胞生产慢病毒载体的有效方法，以满足慢病毒载体的工业化规模生产。事实上，在本申请的实施例中，发明人首次示出了一种生产慢病毒载体的方法，其规模从100mL线性扩大至50L。因此，通过实施该方法可得到非常高水平的病毒载体(例如在1000L的规模下)。
在根据所使用的具体细胞而选择的并且允许生产慢病毒载体的无血清培养基中培养细胞。无血清培养基使得能够生产适合于治疗性应用的慢病毒载体。对于无血清培养基的综述，参见《动物细胞的培养：基本技术手册(Culture of Animal Cells:A Manual ofBasic Technique)》的第9章(无血清培养基(serum-free media))；Ed.Freshen,RI,2000,Wiley-Lisps,pp.89-104和105-120。一般来说，对无血清培养基进行操控以增强所培养的各个细胞系的生长，其可能包括以下任一种：选择分泌的细胞蛋白、可扩散的营养物、氨基酸、有机和/或无机盐、维生素、痕量金属、糖和脂质以及可能还有其他化合物例如促生长物质(例如细胞因子)。还希望这种培养基增补有谷氨酰胺或谷氨酰胺替代物例如本文中公开的GlutaMAXTM。这种培养基是可商购的，并且根据本发明的进一步知识，本领域技术人员能够选择对于哺乳动物宿主细胞来说合适的培养基。培养基可以增补有添加剂，例如用于在悬浮培养物中控制剪切力的非离子型表面活性剂例如F68(Invitrogen,目录号24040-032)、抗结块剂(例如来自Invitrogen，目录号0010057AE)以及L-谷氨酰胺或L-谷氨酰胺替代物例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺二肽，例如GlutaMAXTM(Invitrogen，目录号35050-038)。本发明中使用的培养基和添加剂有利地是符合GMP的。例如，可用于293T细胞悬浮生长的可商购的代表性无血清培养基包括F17(Invitrogen)和Ex-Cell(SAFC)。具体地，293T细胞可以生长在增补有防止细胞聚集体形成的添加剂的定制的F17中。具体地，本文中表明，当F17增补有0.05％至0.1％之间、更具体地是0.08％的F68，0.01％至0.1％之间、更具体地是0.01％的抗结块剂，以及2至6mM之间、更具体地是4mM终浓度的GlutaMAXTM时，本发明的方法得到改进。以本文中提供的量使用的这些添加剂是有利的，因为它们能够最佳地防止293T细胞聚集。
有利地，本发明中使用的培养基和添加剂是无血清且无动物组分的，它们遵守GMP并因此允许工业化生产可用于动物、特别是人的治疗的慢病毒载体。
在一个特定的实施方案中，细胞可以以0.8至1.3×106个细胞/mL之间的细胞密度使用。
瞬时转染
在本发明的方法中，哺乳动物细胞、特别是如上面所描述的293T细胞转染有一种或多种适合于生产慢病毒载体的质粒。优选地，所述转染是瞬时转染。
可以使用本领域已知的多种技术将核酸分子导入到细胞中。这种技术包括：利用化合物例如磷酸钙、阳离子脂质、阳离子聚合物进行化学促进的转染，脂质体介导的转染，非化学方法例如电穿孔、粒子轰击或微注射，以及用含有目标核酸分子的病毒进行感染(有时称为“转导”)。
然而，根据本发明的一个优选的实施方案，利用聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂进行瞬时转染。PEI在表现出低细胞毒性的同时在很多细胞系中具有高基因转移活性，是成本有效的，并因此与工作化规模生产应用相容。该聚合物可以以线性和分支异构体两者获得，具有宽范围的分子量和多分散性，这些理化参数对于高效的基因转移活性来说是关键的(Godbey W.T.等，J.Control Release,60,149160(1999))。在一个特定的实施方案中，本发明中使用的PEI是20-25kD的线性PEI。例如，在一个特定的实施方案中，本发明中使用的PEI是或(二者均可从PolyPlus获得)。和转染试剂是线性聚乙烯亚胺衍生物，不含动物来源的组分，这提供了高度有效且可重现的基因递送。用于转染细胞的其他PEI或与其结构类似的阳离子聚合物被公开在美国专利号6,013,240和EP专利号0770140中。
在加入到培养基中之前将质粒与PEI混合。
N/P比率是对复合物的离子平衡的度量。在使用或的情况下，N/P比率是指每个寡核苷酸磷酸的氮残基数目。优选地，N/P比率低于10。在一个特定的实施方案中，该比率为约6。优化该比率允许获得由转染的细胞所产生的慢病毒载体的最佳产率以及有限的毒性。
质粒与PEI在转染步骤之前的接触时间本身也是一个重要的参数，以便适当地使质粒DNA与PEI分子复合。本发明的发明人已经能够证实，使质粒与PEI接触5至30分钟导致混合物具有非常好的转染能力。优选地，接触时间为约10分钟，以优化转染混合物的形成。
还可以调整用于生产慢病毒的不同质粒之间的摩尔比率，以优化这种生产的规模扩大。根据本文中提供的结果，本领域技术人员能够使该参数适合于其所使用的用于生产目标慢病毒的特定质粒。例如，本发明的发明人在此显示，1:1:2:1的比率(Env质粒:Gag-Pol质粒:Rev质粒:TOI质粒)导致更稳健的转染，并且就实施例中所示的慢病毒而言，满足慢病毒的生产。当然，本领域技术人员能够使该比率适合于所要生产的特定慢病毒。基于本发明的教导(参见下面的实施例)和重组慢病毒生产领域的公知常识，可以容易地使该比率适合于每种新情况(例如就用于转染的每个特定质粒载体而言)。具体地，需要考虑质粒的摩尔比率，以优化这些质粒中每种质粒的量。使用摩尔比率而非重量比率这样的理念并非是显而易见的，因为在本发明的领域中，一般使用重量比率来确定病毒载体生产所需要的每种质粒的量。
本领域技术人员能够使转染方法适合于所使用的特定细胞培养物。具体地，总DNA量(具体地包含重组慢病毒生产所需要的4种质粒)可以变化。然而，在本发明的一个特定的实施方案中，该量是至少1.5μg/106个细胞。在一个特定的实施方案中，该量是至少2μg/106个细胞，具体地是至少2.5μg/106个细胞。在一个优选的实施方案中，总DNA的量是大约2μg/106个细胞。
细胞培养物
在转染后，例如在将DNA与PEI的混合物加入到细胞培养物中之后，使该细胞培养物生长一段时间，所述时间可以是在转染后36至72小时之间，具体地是48小时后。
在一个特定的实施方案中，用于培养细胞的培养基与用于转染所述细胞的培养基相同。例如，在用PEI和质粒的混合物进行转染的情况下，所述混合物可以在F17中制备，细胞在转染后也可以在所述F17中生长。
培养可以在多种培养装置中进行，例如适合于培养悬浮细胞的生物反应器。生物反应器可以是单次使用(一次性)或者可重复使用的生物反应器。生物反应器例如可以选自培养瓶或培养袋以及罐式反应器。非限制性代表性生物反应器包括玻璃生物反应器(例如2L-10L,Sartorius)、利用摇摆运动振荡的单次使用的生物反应器例如波浪生物反应器(例如Cultibag10L-25L,Sartorius)、单次使用的搅拌器罐式生物反应器(Cultibag50L,Sartorius)或不锈钢罐式生物反应器。生长在受控条件下进行(例如，对于本文所示实施例中所报道的293T细胞的培养来说，pH＝7.2，pO2＝50％，37℃，以及根据系统进行特定振荡)。
根据一个特定的方面，本发明因而还涉及含有至少5L体积的无血清培养基的细胞培养装置(即生物反应器)，所述无血清培养基中包含转染有至少一种适合于生产慢病毒载体的质粒的哺乳动物细胞，所述细胞适合于在所述培养装置中悬浮生长。在一个优选的实施方案中，细胞是HEK 293T细胞。在一个特定的实施方案中，培养装置含有至少10L、至少50、至少100L、至少200L或至少1000L体积的如上面所定义的无血清培养基。在其他实施方案中，无血清培养基、转染条件、培养条件以及细胞如上面所定义。
然后可以通过一个或多个收获步骤收获(或收集)慢病毒。在一个优选的实施方案中，对细胞培养物中存在的慢病毒进行单次收获。这是本发明超越现有技术的显著进步，现有技术中可获得的报道一般建议通过多次更换培养基对培养物进行数次收集。此处，优选的实施方案包括单次收获，从接种到生物反应器中直至收获，无需更换培养基，这是一种简单明了、成本有效的工业化相容性方法。在又一个特定的实施方案中，单次收获在转染后48小时进行。然后，可以根据技术人员公知的方法收获并纯化由此产生的慢病毒粒子。
正如上面所提及的，可以将2mM至10mM丁酸钠加入到培养基中，丁酸钠在存在血清的贴壁细胞系统中是慢病毒生产的已知诱导物。出乎意料地，从本文中使用的条件(无血清培养基和悬浮培养)来说，本发明的发明人已经显示，当在转染后24小时将丁酸钠加入到培养基中时，特别是当丁酸钠以5mM的浓度使用时，可以在无血清条件下在悬浮培养中获得优化的生产。
进一步的目标：
本发明还涉及一种用于大规模生产重组慢病毒载体的方法，其包括：
-用PEI与质粒的混合物瞬时转染能够悬浮生长的哺乳动物细胞，所述质粒适合于生产重组慢病毒载体；
-在无血清培养基中以至少5L的体积在分批培养中培养转染后的细胞；以及
-从培养基中收获所产生的重组慢病毒载体。
在该方法的一个特定的实施方案中，质粒包括编码包膜蛋白的质粒(Env质粒)、编码慢病毒Gag和Pol蛋白的质粒(Gag-Pol质粒)、编码慢病毒Rev蛋白的质粒(Rev质粒)以及在慢病毒3’-LTR和慢病毒5’LTR之间包含目标转基因(TOI)表达盒的质粒。在一个特定的变体中，利用至少1.5μg/106个细胞的总DNA量进行转染。优选的细胞是适合于悬浮生长的293T细胞。此外，在一个特定的实施方案中，用聚乙烯亚胺(PEI)和DNA的混合物转染细胞，其中所述PEI是20-25kD的线性PEI。在一个特定的变体中，在转染前将PEI和质粒依照少于10的N/P比率(例如比率为6左右)混合，其中N/P是指每个寡核苷酸磷酸的PEI氮原子数目。可以对在加入到细胞培养物中之前PEI与质粒之间的接触时间进行调整，但是该时间具体地在5至30分钟之间，例如10分钟左右。可以在例如转染后24小时将丁酸钠加入到细胞培养物中而不更换培养基。培养物中丁酸钠的终浓度可以在2mM至10mM之间。可以以单次收获对细胞进行收获，具体地是在转染后48小时至72小时之间进行单次收获。本发明的方法可以以至少10L或更大的规模进行。该方法可以具体地涉及高规模生产慢病毒载体的方法，其允许收获至少107个感染性基因组/mL，优选至少3×107IG/mL。
在以下非限制性实施例中对本发明进行进一步说明。
附图说明
图1是实施例中示出的研究中所使用的4种质粒的图示。
图2是表示在含有HEK293F细胞的100mL摇瓶中测试不同转染条件以及通过流式细胞术测定GFP阳性细胞的图。
图3是表示在含有HEK293F细胞的100mL摇瓶中测试不同转染条件以及通过p24ELISA测试测定p24HIV衣壳抗原的量的图。
图4是表示在含有HEK293T的100mL摇瓶中测试不同转染条件以及通过流式细胞术测定GFP阳性细胞的图。
图5是表示在含有HEK293T细胞的100mL摇瓶中测试不同转染条件以及通过p24ELISA测试测定p24HIV衣壳抗原的量的图。
图6是表示对于转染复合物的生成而言两种不同的SFM培养基对生产产率的影响的图(F17和)。
图7是显示在质粒最佳摩尔比率(1:1:2:1)下转染以生产具有不同大小的两种不同产物(不同TOI)的图。在最佳转染条件下在100mL的摇瓶中进行该测定。
图8是显示丁酸钠加入策略对生产率的影响的图，其中测定了上清液中p24的浓度。
图9是显示丁酸钠加入策略对生产率的影响的图，其中测定了上清液中感染性基因组(IG)的浓度。
图10是显示丁酸钠加入策略对生产率的影响的图，其中测定了上清液中物理粒子/感染性粒子的比率(PP/IP)。
图11是表示100mL摇瓶中HIV-VSVG-WASp的6次生产的平均值的图，其中丁酸钠在转染后24小时以在培养物中5mM的终浓度加入。
图12是显示无血清培养基中悬浮生长HEK293T的100mL悬浮方案与10层细胞工厂的标准方案在生产HIV-VSVG-WASP慢病毒载体中的比较、转染后48小时上清液中的IG结果和PP/IP比率的图。
图13是表示对不同细胞培养装置(旋转、波浪和搅拌罐)中以不同规模(100mL至50L)进行的本发明悬浮方法的评估以及与利用血清的常规贴壁细胞的比较的图。
实施例
本研究的目的是生产符合工业化应用规模的慢病毒载体，其中在生物反应器中在无血清培养基中进行悬浮培养。有利地，该过程已经发展至50L，并且生产可以容易地适合于至少100L、200L生物反应器规模，或者甚至至少1000L。
对于重组慢病毒的生产，我们使用4种质粒(参见图1中的策略)。
材料和方法
细胞培养：
所有载体的生产和细胞培养利用贴壁依赖型(anchorage dependent)HEK293T工作细胞库(WCB)进行，其最初在胎牛血清存在下生长，被调整以适合在无血清培养基中悬浮生长，建立了新的工作细胞库。细胞培养于补充了F68(Invitrogen)、抗凝集剂(Anti-Clumping Agent)(Invitrogen)和4mM GlutaMAXTM(Invitrogen)的改良的F17中。对于所描述的方法的开发，在受控条件下使用不同的培养容器：
-对于100mL的规模，在受控条件(37℃，120rpm)下使用摇瓶(Techne,UK)
-对于较大规模：在受控条件(pH＝7.2，pO2＝50％，37℃，以及根据系统进行特定振荡)下使用玻璃生物反应器(2L-10L,Sartorius)、波浪式生物反应器(Cultibag10L-25L,Sartorius)、一次性搅拌罐式生物反应器(Cultibag50L,Sartorius)
载体和质粒：
Zanta-Boussif等，2009,Gene Ther.；16(5):605-19中描述的W1.6-huWASP-WPRE载体通过利用4种质粒瞬时转染293T细胞而产生，所述4种质粒由W1.6-huWASP-WPREmut6-K转移质粒分别联合编码HIV-1gag-pol、rev基因以及不相关的疱疹性口腔炎病毒G糖蛋白的GagPol、VSV-G、Rev质粒组成。所有质粒均含有卡那霉素抗性基因。进一步的细节提供于上文引用的Merten等中。
HIV-VSVG-GFP载体利用相同的试剂产生，除了转基因质粒是pRRLSINcPPT-PGK-eGFP-WPRE。
丁酸钠：
丁酸钠可商购获得(丁酸钠≥98.5％(GC)∣Sigma-Aldrich)。储备溶液在定制的F17中以500mM制备并进行0.22μm过滤。
培养基：
F17(Invitrogen)通过补充终浓度为0.08％的F68、0.01％的抗凝集剂(Invitrogen)和4mM的GlutaMAXTM而定制。
慢病毒载体的生产：
以0.2×106个细胞/mL接种悬浮培养容器或袋。接种后72小时进行转染。转染时，细胞密度在0.8至1.3×106个细胞/mL之间。
WASp生产的实例(最佳模式)：
本研究中使用的4种质粒示于图1中。已经对不同的总DNA量进行了测试。已经测试了不同的浓度，但是在最佳条件下，所使用的总DNA量是大约2μg/106个细胞。所使用的转染试剂是(Polyplus的产品)，N/P比率大约为6。在培养基中分别稀释DNA和随后温和混合大约10分钟。这种混合使得形成转染复合物，将其直接加入到细胞培养物中。转染后24小时，加入丁酸钠，使其终浓度大约为5mM。转染后72小时，收获含有慢病毒载体粒子的条件培养基，以用于分析目的。
滴度测定：
所产生的物理粒子通过利用特定的ELISA试剂盒测定p24(HIV衣壳蛋白)的量而进行定量。对易受慢病毒载体感染的细胞系进行感染后，如先前Merten等(上文)中所描述利用qPCR(TaqMan)测定感染粒子的滴度。
结果
A-对使HEK293T细胞适合于在无血清条件下在化学限定性培养基中悬浮培养的描 述
-HEK293T细胞系的来源：
细胞来自一小瓶培养于含10％FBS的DMEM中的贴壁的GMP种源(工作)293T细胞库。
-适合于在无血清培养基中悬浮培养：
在T75组织培养瓶(DMEM+10％FBS)中使细胞解冻。传代2次并在T175组织培养瓶中扩大培养后，我们对贴壁细胞进行彻底的培养基的更换，用改良的F17(无血清培养基)替换DMEM。更换培养基后48小时，使所有细胞从支持物上脱离，其活力仍然在90％左右。在T175组织培养瓶中在F17中持续培养细胞。在F17中传代3次并在T225组织培养瓶中扩大培养后，在50ml悬浮条件下将细胞接种于摇瓶中(利用一次性摇瓶，Corning)。在第8次(P8)传代时，产生了54小瓶的悬浮293T细胞(50x106细胞/小瓶)的细胞库。
-细胞库产生。
用于冷冻保藏的制剂是：80％F17，10％DMSO和10％甲基纤维素1％。
B-在经典的HEK293F和HEK293T中生产表达绿色荧光蛋白的慢病毒载体
我们的工作目的之一是建立在无血清条件下通过悬浮培养制造慢病毒载体以用于工业化应用的方法。
最初，实验利用HEK293F细胞系进行，其是一种经改造以适合于在无血清条件下进行悬浮培养的市售细胞系。
为了通过(Zanta-Boussif等，2009,Gene Ther.；16(5):605-19)中描述的4种质粒转染系统产生HIV-GFP慢病毒载体，将HEK293F细胞以1×106个细胞/mL接种于100mL摇瓶中。在100L的规模下对不同的转染条件进行测试：可变参数是：每1×106个细胞所使用的总DNA量，以及4种质粒间的摩尔比率/1×106个细胞。尽管这些参数可能发生改变，但是利用转染试剂形成复合物的接触时间(10分钟)以及DNA/PEI比率(N/P＝6)固定作为用于生产慢病毒的最佳条件。
在10mL(Invitrogen)、一种化学限定性培养基中产生DNA/PEI复合物。接触10分钟后，将DNA/PEI复合物直接加入到培养物中。
为了评估转染效率，通过流式细胞术对细胞培养物进行分析，以测定绿色荧光蛋白的表达。
此外，对细胞培养物上清液进行p24ELISA测试，以测定HIV p24衣壳抗原的浓度，所述抗原指示慢病毒粒子的存在。
结果展示于图2和3中。
转染后48小时的转染效率
结果显示，即使在一定的DNA浓度和比率条件下(分别为2.5μg，1:1:1:1和1:1:1:2)HEK293F能够被有效转染，但是可以检测到的p24抗原的量极少(<50ng/mL)。p24的量大于150ng/mL表示慢病毒有效生产，而较低数值基本上是由于游离的p24。利用ELISA试剂盒(联合HIV-1P24抗原ELISA试剂盒(480测试),PerkinElmer)，我们可以将p24的量与物理粒子的量相关联，所述试剂盒提供以下信息：1ng p24＝1.2×107PP。
C-从HEK293T生产HIV-GFP
利用HEK293T细胞在相似条件下进行慢病毒载体HIV-GFP的生产。转染后48小时确定转染效率以及细胞培养物上清液中p24抗原的浓度。
结果展示于图4和5中。
结果显示，在相似的转染效率(2和2.5μg DNA、比率为1:1:2:1时，～90％)下，HEK293T细胞在产生p24抗原以及因而产生HIV慢病毒载体粒子方面比HEK293F更加有效(198ng/mL和314ng/mL)。
总之，这些实验使得我们确定了在HEK293T细胞中小规模产生慢病毒载体的有效条件。进一步研究那些条件，以评估在无血清条件下以允许工业化应用的规模通过悬浮培养制造慢病毒载体的可行性。
D-在缺少胎牛血清的情况下在悬浮HEK293T细胞中生产慢病毒载体的方法的优化
D1-不使用培养基来产生PEI/DNA复合物。
为了简化方法，我们研究了直接在F17中产生PEI/DNA复合物以避免使用不同培养基的可能性。利用先前实验中确定的转染条件，即使用HEK293T细胞，质粒摩尔比率为1:1:2:1，总DNA为2.5μg/1×106个细胞，在摇瓶中以100mL的规模进行慢病毒载体的生产。收获细胞和上清液以进行测试，结果显示于图6中。
结果显示，与F17相比，如果从复合在Optipro培养基中的PEI/DNA产生的话，p24浓度没有大的差异。在整个过程中仅使用F17培养基而非利用两种不同类型的培养基，构成了使得所述方法适合于工业化规模的重大改进。
D2-生产系统中使用质粒摩尔比率代替质粒(DNA)质量比率的重要性-由于使用摩尔比率而带来的过程的灵活性：
本实验中使用的慢病毒载体生产系统涉及4种质粒。其中3种(Gag-Pol质粒、VSV-G质粒和Rev质粒)是所有慢病毒载体共有的，因为其编码形成慢病毒粒子本身所必需的反式作用功能，即结构性元件(载体衣壳，VSV-G包膜)、酶类蛋白(逆转录酶，整合酶)和表达调控因子(Rev蛋白)。唯一变化的因子是编码载体基因组的质粒。由于由载体基因组质粒编码的转基因表达盒可以以不同大小(不同启动子，cDNA)出现，产生功能性粒子所必需的质粒的最终量可以随载体而不同，并且具有不同的表达盒。因此，假设摩尔比率1:1:2:1(Env质粒:Gag-Pol质粒:Rev质粒:TOI质粒)给出了最佳结果，我们想要证明通过保持摩尔比率不变，我们能够可再现地维持慢病毒生产的产率，即使质粒大小发生变化。由于该摩尔比率保持每种质粒分子的数量不随其以碱基对为单位的大小(因而其重量)而改变，无论产物如何，我们均能够保证最佳的转染条件。
图7显示了一个实施例，其中我们对编码GFP蛋白cDNA(质粒总大小＝7388bp)的慢病毒载体与编码Wiskott-Aldrich蛋白(WASp)cDNA(质粒总大小＝9780bp)的慢病毒载体进行比较。
结果显示，通过在分子数量方面保持质粒比率相等(这反过来影响所使用的个体质粒的量)，慢病毒载体的产率保持不变。这些结果表明，利用总量为2.5μg/1×106个细胞、摩尔比率为1:1:2:1、在无血清条件下在悬浮培养的HEK293T细胞中生产慢病毒载体的方法，能够用于不同的载体，无论其大小如何。当然，尽管是最佳的，这些条件可以由这些数值起始而发生改变，以使本领域技术人员能够使得参数适合于用于生产所期望慢病毒载体的特定细胞和质粒。
D3-生产率的改进：使用丁酸钠
已经报道丁酸钠在贴壁细胞系统中能够增强慢病毒载体的生产(Gasmi等，1999年3月)。我们想要确定丁酸钠是否可以用于这种悬浮培养物中。然而，如果情况是这样的，丁酸钠的使用不应当使方法更加冗长，优先的是保持方法可应用于工业化应用。因此，我们决定测试转染后加入丁酸钠而不更换培养基是否能够在先前建立的条件下(HEK293T，悬浮培养，无血清，2.5μg/mL质粒，比率为1:1:2:1)对慢病毒载体的产率产生积极影响。
在摇瓶中以100mL的规模进行实验。在定制的F17中制备丁酸钠，并在转染后以5mM的终浓度加入。通过利用ELISA测定p24抗原以及通过利用qPCR(TaQman)测定感染性粒子的浓度，评估对慢病毒载体生产的影响。测定两种参数使得能够计算PP/IP比率(粒子总数量比感染性粒子)，其指示慢病毒载体制备物的质量。当PP/IP比率在100-250之间(在GENETHON的GMP生产中通常观察到的结果)时，生产质量被认为是可接受的。
最初，我们对将丁酸钠加入到100mL摇瓶中的不同策略进行测试。一种策略是转染后6小时将其直接加入到培养物中。另一种策略是转染后24小时彻底更换培养基并将丁酸钠加入到用于重悬细胞的新鲜培养基中。最终，给出最佳结果的策略是转染后24小时将丁酸钠直接加入到培养物中而不更换培养基。
注意：在更换培养基的过程中，使细胞于500g离心5分钟，随后在新鲜F17中将其重悬。
我们在3个摇瓶中进行了一项平行实验，以证实先前的实验，结果显示在图8、9和10中。
结果显示，转染后24小时以5mM的终浓度加入丁酸钠使载体生产率就感染性粒子而言增加了3-4倍，以及所产生的p24的量也有增加。
图10展示了我们在本实验中得到的PP/IP比率。
该图表明，丁酸钠不仅使得生产率增加，还通过给出在可接受范围内的PP/IP比率(100-250)而保持可接受的生产质量。
通过利用相同实验方案进行6个摇瓶的实验，评估这种策略的稳健性。结果显示于图11中。
这些实验证实，根据转染后48小时的IG浓度和与PP/IP比率有关生产质量，较好的收获时间是转染后48小时。
E-扩大规模
E1-表明在无血清条件下在悬浮生长的细胞中生产慢病毒载体的方法给出了与在存在血清条件下在贴壁细胞中生产慢病毒载体的常规系统相似的结果。
通常，在存在血清条件下利用HEK293贴壁细胞的转染进行大规模慢病毒载体的生产，以用于研究或临床目的。由于载体滴度的原因，HEK293T是最常使用的细胞。生产方案基本上基于使用2层或10层细胞工厂或等效的复盘(multitray)系统。参见Schweizer和Merten,2010Current Gene Therapy 10(6),474-486，最具体的是第2.3部分("largescale process,Including Transient Transfection")。
已经将这种基于贴壁细胞的方案与上面定义的最佳方法进行了比较，在所述最佳方法中，HEK293T细胞在无血清条件下悬浮生长，并用2.5μg DNA/1×106个细胞以质粒摩尔比率1:1:2:1进行转染，其中转染后24小时以5mM加入丁酸钠而不更换培养基。
图12显示了对于生产HIV-VSVG-WAS慢病毒载体而言，使用HEK293T的100mL悬浮培养方案与10层细胞工厂中的标准之间的比较。
结果表明，悬浮系统以与贴壁细胞系统相似的产率和质量产生慢病毒载体。
E2-表明根据本发明的在无血清条件下通过悬浮培养的慢病毒载体生产系统能够扩大规模并应用于工业化应用。
在慢病毒载体HIV-VSVG-WASp的情况下，根据粒子(p24ELISA)和感染性粒子(qPCR,TaqMan)的产率，在多种培养物体积中对上面描述的慢病毒生产最佳方法(HEK293T细胞在无血清条件下悬浮培养，利用2.5μg/mL DNA/1×106个细胞，质粒比率为1:1:2:1，加入丁酸钠)的可放大性进行了评估。对于每种规模，计算如上面所描述的PP/IP比率，并制成柱状图，示出在图13中，其中与在存在血清的条件性在贴壁细胞中利用常规生产方法获得的结果进行对比。
结果显示，慢病毒载体生产的新型系统的载体生产率(感染性基因组的数量，IG)和质量(PP/IP)在广泛的培养物体积中均能够保持，并且其能够与使用生长于含血清培养基中的贴壁细胞的常规生产方法所获得的那些结果有利相比(在所有规模下质量和产率相同，并可与细胞工厂方法相竞争)。
这些结果表明，通过悬浮培养的慢病毒生产新型方法将效率与实用性相结合，因此能够用于慢病毒载体的工业化规模应用中。

Claims (20)

1.一种用于生产重组慢病毒载体的方法，其包括：
-在无血清培养基中悬浮培养哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞转染有至少一种适合于生产慢病毒载体的质粒，所述培养在至少5L的体积中进行；
-从培养基中收获所产生的重组慢病毒载体。
2.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物细胞是HEK293T细胞。
3.权利要求1或2的方法，其中收获步骤由单次慢病毒收获组成。
4.权利要求3的方法，其中所述转染是瞬时转染，并且单次收获在转染后48至72小时之间实施。
5.权利要求1至3任一项的方法，其包括转染步骤，其中用聚乙烯亚胺(PEI)和质粒的混合物转染细胞。
6.权利要求5的方法，其中所述PEI是20-25kD的线性PEI。
7.权利要求5或6的方法，其中利用至少1.5μg/106个细胞的DNA总量进行转染。
8.权利要求5至7任一项的方法，其中在转染前将PEI和质粒依照少于10的N/P比率混合，其中N/P是指每个寡核苷酸磷酸的PEI氮原子数目。
9.权利要求8的方法，其中所述N/P比率为6左右。
10.权利要求5至9任一项的方法，其中在加入到细胞培养物中之前PEI和质粒之间的接触时间是在5至30分钟之间，接触时间具体地是10分钟左右。
11.权利要求1至10任一项的方法，其中在细胞转染后24小时将丁酸钠加入到细胞培养物中而不更换培养基。
12.权利要求11的方法，其中丁酸钠以在培养物中2mM至12mM之间、具体地在2mM至10mM之间的终浓度，更具体地是5mM的终浓度加入到细胞培养物中。
13.权利要求1至12任一项的方法，其中用4种质粒转染细胞，所述4种质粒包括编码包膜蛋白的质粒(Env质粒)、编码慢病毒GagPol蛋白的质粒(Gag-Pol质粒)、编码慢病毒Rev蛋白的质粒(Rev质粒)以及在慢病毒3’-LTR和慢病毒5’LTR之间包含目标转基因(TOI)的质粒(TOI质粒)。
14.权利要求1至13任一项的方法，其中所述培养在至少50L的体积中实施。
15.权利要求1至14任一项的方法，其中产生了至少107个感染基因组/mL。
16.权利要求1至15任一项的方法，其中：
-细胞是293T细胞；
-利用PEI与所需质粒的混合物进行细胞的转染；
-在转染后24小时加入丁酸钠而不更换培养基；并且
-对所产生的慢病毒载体进行单次收获。
17.一种细胞培养装置，其中所述培养装置含有至少5L体积的无血清培养基，所述培养基中包含转染有至少一种适合于生产慢病毒载体的质粒的哺乳动物细胞，所述细胞在所述培养装置中悬浮生长。
18.权利要求17的细胞培养装置，其中所述细胞是HEK 293T细胞。
19.一种通过在无血清培养基中悬浮生长的哺乳动物细胞而对慢病毒载体的生产进行优化的方法，所述哺乳动物细胞转染有所述生产所需的质粒，所述方法包括在转染后24小时将丁酸钠加入到细胞培养物中而不更换培养基。
20.权利要求19的方法，其中所述丁酸钠以5mM的终浓度加入。
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