CN108866013B - 一种大规模生产慢病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大规模生产慢病毒的方法,包括以下步骤:步骤一、细胞培养;步骤二、细胞培养袋培养;步骤三、慢病毒大规模扩增;步骤四、纯化;其中,步骤二和步骤三中的细胞培养袋均置于摇床中并于恒温箱培养;细胞培养袋培养条件为温度37℃,溶氧设置为60%,PH7.1,摇摆速度10‑20rpm,摇床角度7‑9°。本发明通过改善细胞生长环境,减少通气时对细胞的伤害,增加溶氧效果,减小机械剪切力对细胞的损伤,提高细胞的生长密度,从而提高细胞的总产量,进而提高慢病毒的产量。
Description
技术领域
本发明涉及生产慢病毒的技术领域,具体的说是涉及一种大规模生产慢病毒的方法。
背景技术
慢病毒载体(LV)提供了许多有价值的特性,包括稳定的将基因整合到宿主基因组中,通过VSV-G假型分型将遗传信息转移到分裂和非分裂细胞以及广泛的组织趋向性能力。目前正在临床试验中用于治疗罕见和更频密的遗传和后天疾病,以及CAR-T细胞癌症治疗。慢病毒介导的基因治疗将会很快成为不仅是罕见遗传病,也会是血液肿瘤、HIV等感染性疾病的常规治疗方法。将会有大量的病人等待治疗,因此可扩大的慢病毒生产工艺的改进变得越来越迫切。这种迫切性不仅在研究机构和医院,而且也在工业化生产领域,该领域正朝着这种医疗产品快速前进。
慢病毒载体通常是通过多质粒瞬时转染HEK293t贴壁细胞株而产生,贴壁培养时细胞附着和生长的面积决定放大倍数。由于瞬时转染中过量的质粒和转染试剂的残留,会引起终产物的污染。通过高度强化的贴壁培养物,及一次性固定床生物反应器,已解决部分病毒放大培养。事实上,在治疗中应用的慢病毒载体,需要以可再生的方式生产足够数量的临床和商业品质的病毒。根据应用和疾病,每名患者需要1-40×109个感染单位的载体,这不仅增加了经济压力,还需要开发高产量的生产工艺。慢病毒载体(LV)是基因和细胞治疗应用的关键工具,如何为临床应用提供足够数量的载体目前仍是一个难题,因此应促使该领域向更有利于大规模生产的培养发展。在本发明中,我们提出了一种生产慢病毒载体的技术,由于慢病毒载体的稳定性差,我们开发了一种在灌流模式下的生产工艺。
目前采用贴壁细胞大规模生产慢病毒工艺现状是大多数大规模生产都是小规模生产的直接放大,即通过增加培养/生产单元来实现。生产基本上采用大量的多层培养系统(Cell Factories(CF) (CF-10) (Figure 2))或者Cell Stacks(CS)。因为易于操作,10叠层装置(CS-10)是首选,虽然原则上40叠层装置同样也可以用,但是因为它重量增加的原因所以需要特殊的处理系统。此外,每层平板的气体交换及培养基层不可能一致,因此用显微镜控制40叠层装置细胞的生长很困难。生产要么采用放在层流工作台的开放模式,要么采用半封闭模式,后者对操作人员、环境及终产品的安全性更高。
病毒收获是通过简单的培养基置换完成的,在某些情况下,通过增加收获次数来提高最终慢病毒的质量。然而,在临床前及临床级大规模生产时,频繁收获是不现实的,在大多数时候只是收获1-3次,体积为1-3个工作体积;同时,对工业化生产来说,在大的生物反应器中培养细胞通常是最便捷的方式,而且转染贴壁细胞是生产慢病毒的金标准方法,但是这个方法在扩大规模上受限。本发明在贴壁培养系统中,培养上清可以间隔一天收获两次,且可连续收获6个工作体积,这大大降低了成本、提高了效益。虽然灌注系统在大规模时复杂且成本高,但对瞬时转染具有巨大吸引力,灌注系统可以在保持质粒用量不变的情况下,将收获体积扩大致数倍的工作体积。
发明内容
为解决上述背景技术中提出的问题,本发明的目的在于提供一种大规模生产慢病毒的方法。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
一种大规模生产慢病毒的方法,包括以下步骤:
步骤一、细胞培养:将冻存细胞复苏、培养、传代;
步骤二、细胞培养袋培养:将步骤一中所述传代后的细胞,以2-9E+5个/ml的接种密度及1.5L的工作体积接种到4L的细胞培养袋中,并采用灌注培养;当细胞培养袋内的细胞日耗糖为6-12g时,接种慢病毒;
步骤三、慢病毒大规模扩增:
1)转染前1h,将细胞培养袋内的细胞培养基更换为无血清DMEM培养基;
2)用无血清DMEM培养基稀释质粒,混匀,记为A液;用相等体积的Opti-MEM培养基稀释PEI,混匀,记为B液;室温静止5min后,将B液缓慢加到A液中并混匀,然后室温放置20min,得DNA-PEI混合液;其中,质粒:PEI=1:2,W/W;
3)将2)中的DNA-PEI混合液缓慢加入到1)中的细胞培养袋中,10rpm轻轻混匀20min后,摇床停止摆动;转染4h后灌注10%胎牛血清DMEM培养基,摇摆开始摇动,摆速10rpm,温度37℃;转染36h后开始灌注无血清培养基;每天细胞培养袋内取样测糖浓度和病毒颗粒数,收获液取样测病毒颗粒数,当病毒颗粒数小于5E+5TU时,停止收获;
步骤四、纯化:将步骤三中收获的慢病毒原液通过离心、超滤、核酸水解、凝胶过滤层析进行分离纯化,得到的纯化液进行检测并保存;
其中,步骤二和步骤三中的细胞培养袋均置于摇床中并于恒温箱培养,且对细胞培养袋内同时进行上部和底部通气;细胞培养袋培养条件为温度37℃,PH7-7.2,摇摆速度10-20rpm,摇床角度7-9°。
上述技术方案中,步骤二中,当细胞培养袋内的细胞日耗糖为8-10g时,接种慢病毒。
上述技术方案中,步骤二和步骤三中的细胞培养袋内均设有片状载体和隔膜,所述隔膜将细胞培养袋分隔成上下两部分,所述片状载体填充在细胞培养袋的下部。
上述技术方案中,所述片状载体的填充密度均为10-40g/L。
上述技术方案中,所述细胞培养袋的上方中间处设有进气口和排气口,所述细胞培养袋上方侧边均还设有进液口和出液口。
上述技术方案中,所述细胞培养袋的进气口包括上进气口和下进气口,上进气口设置在细胞培养袋的上部,所述下进气口设置在细胞培养袋的底部。
上述技术方案中,所述细胞培养袋下方还设有溶氧电极和PH电极。
上述技术方案中,所述细胞为HEK293t细胞。
上述技术方案中,步骤二中细胞在填充有片状载体的4L细胞培养袋中培养:
1)设备:三气控制器、细胞培养袋、摇床和恒温箱;
2)接种细胞:接种浓度2-9E+5个/ml,工作体积1.5L;
3)接种参数:温度37℃,摇摆速度10-20rpm,摇床角度7-9°,5%CO2的混合气体;
4)方法
a混匀:细胞接种到细胞培养袋时,细胞培养袋内浑浊,显微镜下观察到大量未贴壁细胞,将袋子放摇床上,通5%CO2的混合气体,摇摆转速20rpm,温度37℃,混匀15-25分钟;
b细胞贴壁:静置培养30min-2h后,观察细胞培养袋内液体澄清度,直到液体澄清,细胞贴壁;
c细胞培养:摇摆速度10-20rpm,温度37℃,摇床角度7-9°,5%CO2的混合气体;次日开始,每日2次取样测糖,统计结果;
d当糖浓度低于1.4g/L时,开始灌加培养。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
1、贴壁培养时提供非常大的一个细胞附着和生长的面积。
2、提供一种大规模生产用于慢病毒载体的装置和技术,填补在基因和细胞治疗的设备及技术的空缺。
3、采用灌流工艺,提供较好的生长环境,细胞可达到较高的密度。同时灌注培养可以解决在瞬时转染中过量的质粒和转染试剂的残留,引起终产物的污染的问题(在转染后的24到48小时间收获的液体有数个工作体积,灌注培养可以将过量的质粒和转染试剂置换出)。
4、本发明所提供的大规模生产慢病毒的方法,可一批次可生产足够数量的临床和商业的慢病毒。
5.采用全封闭模式的一次性培养工艺,减少对操作人员、环境的依赖,终产品具有更高的安全性。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图;
图2为培养细胞培养袋的结构示意图;
图3为细胞培养袋培养细胞培养袋的应用示意图;
图4为细胞培养袋内细胞在载体上的生长图片;
图5为灌注培养与换液培养的日耗糖量对比图:
图6为实施例1中收获液病毒颗粒数的线形图;
附图标记说明:
1、细胞培养袋;10、隔膜;11、载体;12、进气口;12a、上进气口;12b、下进气口;13、排气口;14、进液口;15、出液口;16、溶氧电极;17、PH电极;2、摇床;3、三气控制器;4、恒温箱。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合附图和具体实施方式,进一步阐述本发明是如何实施的。
如图1所示,本发明提供了一种大规模生产慢病毒的方法,包括以下步骤:
步骤一、细胞培养:
1)细胞复苏:将冻存HEK293t细胞冻存管放到37℃的温水中速溶,用75%酒精棉球擦拭冻存管表面消毒后,在超净工作台上打开管盖,吸出细胞悬液注入装有培养液的无菌离心管中,轻轻混匀,离心,弃上清后加入培养液重悬细胞,将重悬好的细胞加入到方瓶中,放入培养箱培养;
2)方瓶细胞传代:取1)中方瓶培养的需传代细胞,在超净工作台中打开方瓶,弃去培养液,加入PBS溶液洗涤一次后,加入消化液于方瓶中消化细胞,10-30s后加入细胞生长培养液中和,并用移液管吹散细胞,至细胞悬液充分混匀,分装到多个方瓶中,晃动方瓶使细胞均匀分散后,放入培养箱中培养;
步骤二、细胞培养袋培养:将4-20个步骤一中所述方瓶培养的细胞,以2-9E+5个/ml接种密度,均接种到4L的细胞培养袋中(工作体积为1.5L),采用灌注培养;当细胞培养袋内的细胞日耗糖为6-12g时,接种慢病毒;
步骤三、慢病毒大规模扩增:
1)转染前1h,将细胞培养袋内的细胞培养基更换为无血清DMEM培养基;
2)用无血清DMEM培养基稀释质粒,混匀,记为A液;用与无血清DMEM培养基相等体积的Opti-MEM培养基稀释PEI,小心混匀,记为B液;室温静止5min后,将B液缓慢加到A液中并混匀,然后室温放置20min,得DNA-PEI混合液;其中,质粒:PEI=1:2,W/W;质粒类型为:pGTV-PEDF、pPV-3rd、pVSV-G、pRev。
3)将2)中的DNA-PEI混合液缓慢加入到1)中的细胞培养袋中,10rpm轻轻混匀20min后,摇床停止摆动;转染4h后灌注10%胎牛血清DMEM培养基,摇摆开始摇动,摆速10rpm,温度37℃;转染36h后开始灌注无血清培养基;每天细胞培养袋内取样测糖浓度和病毒颗粒数,收获液取样测病毒颗粒数,当病毒颗粒数小于5E+5TU时,停止收获;
步骤四、纯化:将步骤三中收获的慢病毒原液通过离心、超滤、核酸水解、Souce15Q或30Q(GE Healthcare)凝胶过滤层析进行分离纯化,得到的纯化液进行稀释后检测保存;
其中,步骤二和步骤三中的细胞培养袋均置于摇床中并于恒温箱培养,且对细胞培养袋内同时进行上部和底部通气;细胞培养袋培养条件为温度37℃,PH7-7.2,摇摆速度10-20rpm,摇床角度7-9°。
如图2所示,细胞培养袋1内均设有片状载体11和隔膜10,所述隔膜10将细胞培养袋1分隔成上下两部分,所述片状载体11填充在细胞培养袋1的下部,细胞培养袋1的上方中间处设有进气口12和排气口13,细胞培养袋1上方侧边还设有进液口14和出液口15。其中,所述细胞培养袋1的进气口12包括上进气口12a和下进气口12b,上进气口12a设置在细胞培养袋1的上部,所述下进气口12b设置在细胞培养袋1的底部。
如图4所示,细胞袋内接种的HEK293t细胞在片状载体上贴壁生长;其中,所述片状载体可为专利名称为用于细胞培植的一次性固定床装置、专利申请号为201820246494.5中所公开的细胞载体,包含有若干个呈弧型连接的片状纤维叶片,且所述的若干个呈弧型连接的片状纤维叶片呈向外辐射张开设置,本发明中载体的填充密度均为10-40g/L。所述隔膜的孔隙可使细胞通过而阻止片状载体通过。
如图3所示,细胞培养袋用于接种细胞时,将细胞培养袋1放置在摇床2的托盘上,并通过三气控制器3给细胞培养袋1通气,通过细胞培养袋1上的进气口1并经过上进气口12a和下进气口12b同时给细胞培养袋1上部和底部同时通入5%CO2的混合气体,极大的增加了溶氧效果;同时解决了气泡在液面破裂带来细胞损伤问题。与此同时,将摇床2角度设置为7-9°,并将摇摆速度设置10-20rpm,放入37℃的恒温箱4内。
其中,摇床2为市场上生物实验常用的摇床,三气控制器3为气体混合器,可于市场上购置;可以将氧气、二氧化碳等气体通过三气控制器3来控制配比,并将配比好的混合气体通入细胞培养袋。
另外,所述细胞培养袋下方还设有溶氧电极16和PH电极17,用于对细胞培养袋内培养溶氧和PH的精准控制。
本发明中,步骤二中HEK293t细胞在填充有片状载体的4L细胞培养袋中培养:
1)设备:三气控制器、细胞培养袋、摇床和恒温箱;
2)接种细胞:接种密度2-9E+5个/ml,工作体积1.5L。
3)接种参数:温度37℃,摇摆速度10-20rpm,摇床角度7-9°,5%CO2的混合气体;
4)方法
a混匀:细胞接种到细胞培养袋时,细胞培养袋内浑浊,显微镜下看到大量未贴壁细胞,将袋子放摇床上,通5%CO2的混合气体,摇摆转速20rpm,温度37℃,混匀15-25分钟;
b细胞贴壁:静置培养30min-2h后,观察细胞培养袋内液体澄清度,直到液体澄清,细胞贴壁;
c细胞培养:摇摆速度10-20rpm,温度37℃,摇床角度7-9°,5%CO2的混合气体;溶氧60%。次日开始,每日2次取样测糖,统计结果;
d当糖浓度低于1.4g/L时,开始灌加培养。
实施例1
本实施例提供的一种大规模生产慢病毒的方法,包括以下步骤:
步骤一、细胞培养
1)细胞复苏:取一支HEK293t细胞冻存管放到37℃的温水中速溶,待融化至只剩一小块冰核时立即取出,用75%酒精棉球擦拭冻存管表面消毒后,在超净工作台上打开管盖,用5ml移液管吸出细胞悬液轻轻注入装有DMEM培养基的无菌离心管中,轻轻混匀;用5ml移液管将细胞冻存液吸到15ml离心管中,离心(800转/分钟,离心4分钟),弃上清后,加DMEM培养基重悬细胞;将重悬好的细胞加入到方瓶中(取样,计数),放入培养箱培养,培养箱条件:37℃,饱和湿度,5% CO2中培养,隔日观察。
2)方瓶细胞传代:取1)中方瓶培养的需传代的细胞,在超净工作台中打开方瓶,弃去培养液,沿方瓶壁轻轻加入适量PBS溶液洗涤一次,吸出PBS溶液弃去;加入适量消化液于方瓶中消化细胞,约1分钟后加入适量细胞生长培养液(加入细胞生长培养液的体积为消化液体积的1-3倍)中和,并用10ml移液管轻轻吹散细胞,至细胞悬液充分混匀;分装到多个方瓶中,轻轻晃动方瓶使细胞均匀分散,置于37℃,饱和湿度,5% CO2培养箱中培养。
步骤二、细胞培养袋培养:将12个步骤一中所述方瓶培养的细胞消化,共计数个数约为4E+8个细胞,均接种到4L的细胞培养袋(30g载体填充工作体积约为1.5L)中,采用灌注培养;其中,4L细胞培养袋置于摇床并于恒温箱中培养,且对细胞培养袋内同时进行上部和底部通气,通入5%CO2的混合气体;细胞培养袋提前一天加入1000ml培养基预孵,培养的相关参数:温度37℃,溶氧设置为60%,PH7.1,摇摆速度20rpm,摇床角度8°。
每天两次通过葡萄糖检测试剂盒检测溶液中的糖浓度,糖浓度为1.3g/L时开始灌加,维持糖浓度为1.1-1.6g/L之间;如图5所示,4L的细胞培养袋内的细胞在第5日时,日耗糖到7.6g时,接种慢病毒。
步骤三、慢病毒大规模扩增:
1)转染前1h,将细胞培养袋内的细胞培养基更换为无血清DMEM培养基;
2)用无血清DMEM培养基稀释质粒,混匀,记为A液;用相等体积的Opti-MEM培养基稀释PEI,小心混匀,记为B液;室温静止5min后,将B液缓慢加到A液中并混匀,然后室温放置20min,得DNA-PEI混合液;其中,质粒:PEI=1:2,W/W;
3)将2)中的DNA-PEI混合液缓慢加入到1)中的细胞培养袋中,10rpm轻轻混匀20min后,摇床停止摆动;转染4h后灌注10%胎牛血清DMEM培养基,摇床开始摇动,摆速10rpm,温度37℃;转染36h后开始灌注无血清培养基;每天细胞培养袋内取样测糖浓度和病毒颗粒数,收获液取样测病毒颗粒数,收获液检测结果如图6所示。当病毒颗粒数小于E+6TU时,停止收获。收获总体积为9L。收获病毒颗粒总数为7.4E+11TU。
步骤四、纯化:将收获的慢病毒液体通过离心(4000rpm,4℃,离心12分钟)、超滤、核酸水解、Souce 15Q或30Q(GE Healthcare)凝胶过滤层析进行分离纯化,得到的慢病毒纯化液进行稀释后检测保存。
其中,步骤二中HEK293t细胞在填充有片状载体的4L细胞培养袋中培养:
1)设备:三气控制器、细胞培养袋、摇床和恒温箱,控制系统;
2)接种细胞:接种浓度4E+5个/ml,工作体积1.5L。
3)接种参数:温度37℃,摇摆速度10-20rpm,摇床角度7-9°,5%CO2的混合气体;
4)方法
a混匀:细胞接种到细胞培养袋时,细胞培养袋内浑浊,显微镜下看到大量未贴壁细胞,将袋子放摇床上,通5%CO2的混合气体,摇摆转速20rpm,温度37℃,混匀15-25分钟;
b细胞贴壁:静置培养30min-2h后,观察细胞培养袋内液体澄清度,直到液体澄清,细胞贴壁;
c细胞培养:摇摆速度10rpm,温度37℃,摇床角度7°,5%CO2的混合气体;次日开始,每日2次取样测糖,统计结果;
d当糖浓度低于1.4g/L时,开始灌加培养。
实施例2
本实施例与实施例1所述的大规模生产慢病毒的方法所采用的实验步骤类似,区别在于:
步骤二和步骤三中的细胞培养袋内的载体填充数为10g/L;
步骤二中细胞接种密度为2E+5个/ml;
步骤二中4L细胞培养袋内细胞日耗糖6g,接种慢病毒;
步骤三中4L细胞培养袋内细胞接种慢病毒时,病毒感染宿主细胞的MOI为20;病毒的总颗粒数为3E+11TU。
实施例3
本实施例与实施例1所述的连续大规模生产慢病毒的方法类似,区别在于:
步骤二和步骤三中的细胞培养袋内的载体填充数为40g/L;
步骤二中细胞接种密度为9E+5个/ml;
步骤二中4L细胞培养袋内细胞日耗糖11g,接种慢病毒;
步骤三中30L细胞培养袋内细胞接种慢病毒时,病毒感染宿主细胞的MOI为20;病毒的总数量为5E+11TU。
采用分光光度法和高效液相色谱法分析实施例1、实施例2和实施例3所得重组慢病毒产品的纯度,采用组织培养半数感染剂量方法测定所得病毒的感染滴度。统计实施例1、实施例2和实施例3中生产的慢病毒的性能。
实施例4
本实施例与实施例1所述的连续大规模生产慢病毒的方法类似,区别在于:步骤二和步骤三中细胞培养采用换液培养。如图5所示,相较于实施例1中4L的细胞培养袋内的细胞采用灌注培养,第6日的日耗糖到12g;本实施例中4L的细胞培养袋内的细胞采用换液培养,第6日的日耗糖到5.3g,说明采用灌注培养有利于细胞日耗糖,能增大细胞产量。收获的病毒颗粒总数和体积,实施例1中病毒颗粒总数为7.4E+11TU,体积为9L。本实施例中病毒颗粒总数为1.4E+11TU,体积为6L。说明采用灌注培养可提高慢病毒的产量。
其中,灌注培养指将动物细胞接种后进行培养,一方面新鲜培养基不断加入反应器,另一方面又将反应液连续不断地取出,但细胞留在反应器内,使细胞处于一种不断的营养状态。
换液培养为在细胞增长和产物形成过程中,每间隔一段时间,从中取出部分培养物,再用新的培养液补足到原有体积,使反应器内的总体积不变。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
Claims (8)
1.一种大规模生产慢病毒的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一、细胞培养:将冻存细胞复苏、培养、传代;
步骤二、细胞培养袋培养:将步骤一中所述传代后的细胞,以2-9E+5个/ml的接种密度及1.5L的工作体积接种到4L的细胞培养袋中,并采用灌注培养;当细胞培养袋内的细胞日耗糖为6-12g时,接种慢病毒;
步骤三、慢病毒大规模扩增:
1)转染前1h,将细胞培养袋内的细胞培养基更换为无血清DMEM培养基;
2)用无血清DMEM培养基稀释质粒,混匀,记为A液;用相等体积的Opti-MEM培养基稀释PEI,混匀,记为B液;室温静止5min后,将B液缓慢加到A液中并混匀,然后室温放置20min,得DNA-PEI混合液;其中,质粒:PEI=1:2,W/W;
3)将2)中的DNA-PEI混合液缓慢加入到1)中的细胞培养袋中,10rpm轻轻混匀20min后,摇床停止摆动;转染4h后灌注10%胎牛血清DMEM培养基,摇摆开始摇动,摆速10rpm,温度37℃;转染36h后开始灌注无血清培养基;每天细胞培养袋内取样测糖浓度和病毒颗粒数,收获液取样测病毒颗粒数,当病毒颗粒数小于5E+5TU时,停止收获;
步骤四、纯化:将步骤三中收获的慢病毒原液通过离心、超滤、核酸水解、凝胶过滤层析进行分离纯化,得到的纯化液进行检测并保存;
其中,步骤二和步骤三中的细胞培养袋均置于摇床中并于恒温箱培养,且对细胞培养袋内同时进行上部和底部通气;细胞培养袋培养条件为温度37℃,PH7-7.2,摇摆速度10-20rpm,摇床角度7-9°;步骤二和步骤三中的细胞培养袋内均设有片状载体和隔膜,所述隔膜将细胞培养袋分隔成上下两部分,所述片状载体填充在细胞培养袋的下部,且所述隔膜的孔隙使细胞通过而阻止片状载体通过。
2.根据权利要求1所述的一种大规模生产慢病毒的方法,其特征在于,步骤二中,当细胞培养袋内的细胞日耗糖为6-11g时,接种慢病毒。
3.根据权利要求1所述的一种大规模生产慢病毒的方法,其特征在于,所述片状载体的填充密度均为10-40g/L。
4.根据权利要求1所述的一种大规模生产慢病毒的方法,其特征在于,所述细胞培养袋的上方中间处设有进气口和排气口,所述细胞培养袋上方侧边还设有进液口和出液口。
5.根据权利要求4所述的一种大规模生产慢病毒的方法,其特征在于,所述细胞培养袋的进气口包括上进气口和下进气口,上进气口设置在细胞培养袋的上部,所述下进气口设置在细胞培养袋的底部。
6.根据权利要求1所述的一种大规模生产慢病毒的方法,其特征在于,所述细胞培养袋下方还设有溶氧电极和PH电极。
7.根据权利要求1所述的一种大规模生产慢病毒的方法,其特征在于,所述细胞为HEK293t细胞。
8.根据权利要求1所述的一种大规模生产慢病毒的方法,其特征在于,步骤二中细胞在填充有片状载体的4L细胞培养袋中培养:
1)设备:三气控制器、细胞培养袋、摇床和恒温箱;
2)接种细胞:接种密度2-9E+5个/ml,工作体积1.5L;
3)接种参数:温度37℃,摇摆速度10-20rpm,摇床角度7-9°,5%CO2的混合气体;
4)方法
a混匀:细胞接种到细胞培养袋时,细胞培养袋内浑浊,显微镜下观察到大量未贴壁细胞,将袋子放摇床上,通5%CO2的混合气体,摇摆转速20rpm,温度37℃,混匀15-25分钟;
b细胞贴壁:静置培养30min-2h后,观察细胞培养袋内液体澄清度,直到液体澄清,细胞贴壁;
c细胞培养:摇摆速度10-20rpm,温度37℃,摇床角度7-9°,5%CO2的混合气体;次日开始,每日2次取样测糖,统计结果;
d当糖浓度低于1.4g/L时,开始灌加培养。
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