KR20150056548A

KR20150056548A - 1회용 병 반응기 탱크

Info

Publication number: KR20150056548A
Application number: KR1020157006457A
Authority: KR
Inventors: 예르크 카울링; 안네트 발드헬름; 헬무트 브로트; 베레나 헤르만; 스테파니 야코브
Original assignee: 바이엘 테크놀로지 서비시즈 게엠베하
Priority date: 2012-09-18
Filing date: 2013-09-13
Publication date: 2015-05-26
Also published as: JP2015531602A; IN2015DN02120A; CA2884865A1; US20150218501A1; EP2898059A1; WO2014044612A1; SG11201501572TA; CN104812888A; BR112015005781A2; AU2013320374A1

Abstract

본 발명은 커버 및/또는 내부에 체결된 광전식으로 판독 가능한 센서 패치를 포함하는 1회용 요소로서 설계된 반응기 탱크, 반응기 탱크와 반응기 탱크 홀더 및 선택적으로 센서 패치를 판독하기 위한 광전식 측정 시스템을 포함하는 반응기 탱크 수용 주변 장치를 포함하며, 여기서 반응기 탱크 홀더는 반응기 탱크의 중앙 수직축 주위에 반응기 탱크의 회전 진동 운동을 발생시키기 위한 구동 유닛에 결합되어 있는 것인 반응기, 및 또한 세포 및/또는 미생물을 배양하기 위한 상기 장치의 용도에 관한 것이다.

Description

1회용 병 반응기 탱크 {DISPOSABLE BOTTLE REACTOR TANK}

본 발명은 커버 및/또는 내부에 고정된 광전식으로 판독 가능한 센서 패치를 갖는 1회용 요소로서 설계된 반응기 탱크와, 반응기 탱크와 반응기 탱크 홀더 및 선택적으로 센서 패치를 판독하기 위한 광전식 측정 시스템을 포함하는 반응기 탱크 수용 주변 장치를 포함하며, 여기서 반응기 탱크 홀더는 그 중앙 수직축 주위에 반응기 탱크의 회전-진동 운동을 발생시키기 위한 구동 유닛에 결합되어 있는 것인 반응기, 및 또한 세포 및/또는 미생물을 배양하기 위한 이 장치의 용도에 관한 것이다.

고도로 통제된 약품 생산의 경우에, 시간의 견지에서 큰 비용, 기술적 비용 및 인력 비용이 청결하고 멸균된 생물반응기의 제공에 의해 기인하게 된다. 다목적 설비에서의 제품 교체 중에 또는 2개의 제품 배치 사이의 교차 오염을 신뢰적으로 회피하기 위해, 세정에 추가하여, 프로세스 적응의 경우에 반복될 필요가 있을 수도 있는 고도로 복잡한 세정 검증이 요구된다.

이는 상류 프로세싱(USP), 말하자면 발효기 내에서의 생물학적 제품 생산 뿐만 아니라, 하류 프로세싱(DSP), 즉 발효 제품의 정제에도 적용된다.

USP 및 DSP에서, 압력 용기는 교반 및 반응 시스템으로서 빈번히 사용된다. 특히 발효의 경우에, 무균 환경이 성공적인 배양을 위해 필수적이다. 회분식 또는 유가식 발효기의 멸균을 위해, 일반적으로 정치 증기 멸균(SIP) 기술이 사용된다. 연속적인 프로세스 절차의 경우에 충분한 장기간 멸균성을 보장하기 위해, 오토클레이빙 기술이 또한 이용되지만, 이는 반응기의 오토클레이브로의 어려운 운반을 필요로 하고 단지 비교적 소형 반응기 규모에서만 사용 가능하다. 발효 중에 오염의 위험은 샘플링 중에 그리고 교반기 샤프트의 이동시에 특히 중대하다. 교반기 샤프트는 일반적으로 복잡한 밀봉 시스템(예를 들어, 활주링 밀봉부)을 구비한다. 발효 케이싱을 이러한 관통 없이 관리하는 기술은 이들의 더 큰 프로세스 견실성에 기인하여 바람직하다.

준비 절차에 의해 유발된 표준 반응기의 정지 시간은 특히 짧은 이용 기간 및 빈번한 제품 교체의 경우에, 반응기 이용 가능성의 크기 정도일 수 있다. 영향을 받는 프로세스 단계들은 생물공학적 생산의 USP에서는, 예를 들어 배지 생산 및 발효의 단계, 및 DSP에서는 가용화, 동결, 해동, pH 조정, 침전, 결정화, 완충제 교체 및 바이러스 비활성화이다.

최대 청결성 및 멸균성을 보장하면서 생산 설비의 신속하고 융통성 있는 재충전의 요구에 부합하기 위해, 1회용 반응기의 디자인이 시장에서 지속적인 증가하는 관심을 받고 있다.

WO 2007/121958 A1 및 WO 2010/127689는 세포 및 미생물을 배양하기 위한 이러한 1회용 반응기를 설명하고 있다. 일 바람직한 실시양태에서, 이 반응기는 안정한, 바람직하게는 다층 폴리머 재료 파우치로 이루어진다. 변형 가능한 1회용 반응기는 이를 지지하는 용기에 의해 수용된다. 이 프로세스에서, 1회용 반응기는 바람직하게는 정면으로부터 용기 내로 도입된다. 용기는 구동 유닛에 연결된다. 구동 유닛에 의해, 1회용 반응기를 포함하는 용기는 용기의 고정, 바람직하게는 수직인 축 둘레로 회전-진동 운동하게 된다. 1회용 반응기의 정사각형 디자인 형상 및/또는 1회용 반응기 내의 내부 장치에 의해, 진동-회전의 경우에, 반응기 내용물 내로의 높은 일의 도입이 성취될 수 있고, 따라서 1회용 반응기는 세포 및 미생물을 배양하기 위한 표면 가스 처리를 갖는 발효기로서 사용될 수 있다. 반응기를 공급하고 모니터링하기 위한 내부 장치는 연결 플레이트를 거쳐 반응기의 저부에서 측면에 장착된다. 이들 반응기는 10 L 초과의 반응기 체적에서 주로 사용된다.

더 소형의 반응기 체적에 대해, 적절한 용기를 포함하는 반응기 파우치의 제조는 너무 복잡하다.

소형의 1회용 반응기에서의 과제는 가능한 한 소형이고 저가인 형태의 센서 기술, 혼합 기술, 반응기의 온도 제어 및 공급을 성취하는 것이다.

소형의 교반형 1회용 반응기는 종래 기술로부터 공지되어 있다.

사토리우스 스테딤 바이오테크(Sartorius Stedim Biotech)는 그의 유니버셀(Universel)® SU(http://www.sartorius-stedim.com/Biotechnology/Fermentation_Technologies/Reusable_Bioreactors/Data_Sheets/Data_UniVessel_SU_SBI2033-e.pdf)로 반응기 탱크가 원통형인 교반형 1회용 반응기를 제공한다. 1회용 반응기는 혼합을 위해, 교반기를 갖고, 아래로부터의 가스 공급을 위해, 교반기 아래에 L-스파저를 갖는다. 덮개를 통해, 교반기 구동부가 상부 구동식 구동 액슬(axle), 센서 기술(온도, pH(화학), 산소(화학)), 가스 공간을 위한 가스 공급 및 가스 처분, 및 또한 도관을 통한 공급 및 샘플링에 의해 보장된다. 덮개는 클램프 연결부에 의해 반응기 탱크에 체결되고, O 링에 의해 반응기 탱크에 대해 멸균 방식으로 밀봉된다. 교반기 구동부는 2개의 립 밀봉부에 의해 밀봉된다. pH 및 산소 함량을 모니터링하기 위한 센서 기술은 또한 반응기 탱크의 저부에서 광전 센서 패치에 의해 성취될 수 있다. 작동을 위해, 반응기 탱크는 특정 용기 내에 고정 위치되고, 이 용기는 홀더 링과, 센서 패치를 판독하기 위한 광전 센서 시스템을 갖는 풋(foot)을 구비한다.

이 반응기 시스템 및/또는 시장에서 입수 가능한 유사한 반응기 시스템의 단점은 이들 교반형 시스템이 덮개 내에 이동 내부 장치 및 또한 복잡한 멸균 밀봉 시스템을 필요로 하고, 높은 전단력의 견지에서, 예를 들어 줄기 세포와 같은 매우 민감한 세포의 배양을 위해 덜 적합하다는 것이다.

종래 기술로부터 계속하여, 본 발명의 목적은 청결하고 멸균된 구성 요소의 제공시에 시간, 장비 및 인력의 견지에서 비용을 감소시키는 높은 청결성 및 멸균성의 요건을 갖는 프로세스를 수행하기 위한 저-전단 시스템을 제공하는 것이다. 시스템은 10 mL 내지 20 L의 프로세스 체적, 특히 50 mL 내지 10 L, 특히 바람직하게는 250 mL 내지 3 L 작동 체적에 대해 사용 가능할 것이다. 이 시스템은 약학 산업의 높은 요구에 부합하고, 취급이 간단하고 직관적이며, 저가일 것이다. 이 시스템은 프로세스 챔버로부터 물질의 누설에 기인하는 안전 위험을 최소로 감소시킬 것이다. 이 시스템은 반응기 내용물의 충분한 혼합을 허용하고, 미생물의 배양 및 세포 배양을 위해 적합하고, 프로세스에서, 액체 영양소 배지 및 특히 기체 물질과 배양 배지의 충분한 공급 및 처분을 보장할 것이다. 이 시스템은 생물반응기 내에서, 세포 산물, 특히 인간 또는 동물 체세포; 줄기 세포, 혈액 세포, 천연 킬러 세포(NK 세포)와 같은 백혈구, 조직 세포 또는 예를 들어 모노클로날 항체, 단백질, 효소와 같은 제약 활성 성분과 같은 세포 산물의 생산을 위한 프로세스 개발을 위해 적합할 것이다.

본 발명에 따르면, 상기 목적은 반응기 내부를 경계 한정하기 위한 치수적으로 안정한 각진 플라스틱 병의 사용에 의해 성취되고, 플라스틱 병은 저부, 벽, 내부 및 내부로의 하나 이상의 접근부, 바람직하게는 피라미드형 내향 오목형 저부, 넓은 목 및/또는 좌표에 의해 규정된 부위에서 병의 하부 영역에 장착된 하나 이상의 센서 패치를 갖는다.

본 발명은 따라서 먼저 세포, 특히 민감한 세포 및 예를 들어 줄기 세포, 혈액 세포 또는 조직 세포와 같은 (마이크로)지지부 상에서 성장하는 세포의 배양을 위한 생물반응기 탱크로서 치수적으로 안정한 각진 플라스틱 병의 용도에 관한 것으로서, 플라스틱 병은 저부, 벽, 내부 및 내부로의 하나 이상의 폐쇄 가능한 접근부, 특히 병목부를 갖는다. 일반적으로, 플라스틱 병의 내부에서, 하나 이상의 센서 패치가 좌표에 의해 규정된 부위에서 하부 영역에서 하나 이상의 벽 상에 장착된다.

본 발명은 또한 저부, 벽, 내부 및 특히 덮개에 의해 폐쇄 가능한 하나 이상의 병목부 및/또는 하나 이상의 통로를 포함하는, 내부로의 하나 이상의 폐쇄 가능한 접근부를 갖는 치수적으로 안정한 각진 플라스틱 병을 포함하고, 하나 이상의 센서 패치가 내부에, 플라스틱 병의 하부 영역의 하나 이상의 벽 상에, 좌표에 의해 규정된 부위에 장착된 것인 반응기 탱크에 관한 것이다. 바람직하게는, 통로는 덮개 내에 수용된다.

형광성 착색층으로 구성되는 지지부-고정된 센서 패치가 시장에서 입수 가능하고(예를 들어, 프리센스(Presens), 와이에스아이(YSI)로부터), 예를 들어 병 벽에 부착될 수 있다. 일반적으로, 적어도 하나의 pH 센서 패치 및 하나의 산소 센서 패치가 사용된다.

대안적으로, 반응기 탱크 또는 생물반응기는 병 벽 상에 또는 덮개 내에, 바람직하게는 덮개 내에서, 전기 화학식 센서, 바람직하게는 예를 들어 US 20120067724 A1에 따른 1회용 센서를 위한 통로를 갖는다.

반응기가 약학 산업의 멸균성 요건에 부합할 수 있게 하기 위해, 플라스틱 병은 일반적으로 감마-멸균 가능한 플라스틱 재료로부터 제조된다. 본 발명에 따른 반응기 탱크는 바람직하게는 작동 중에 반응기 탱크 내로의 투시를 허용하는 단층 또는 다층 투명 폴리머 재료로부터 제조된다.

플라스틱 또는 유리는 또한 비교적 저가로 가공될 수도 있는 비교적 저가의 재료이다. 사용된 반응기 탱크의 처분 및 새로운 1회용 반응기 탱크의 사용은 따라서 특히, 새로운 1회용 반응기 탱크를 사용할 때, 복잡한 세정 및 세정 검증이 생략되기 때문에 사용된 반응기 탱크를 세정하는 것보다 더 경제적이다. 본 발명에 따른 반응기 탱크는 클린룸에서 제조되거나 세정되고, 바람직하게는 멸균-패킹된다.

본 발명에 따른 반응기 탱크는 치수적으로 안정하다. 본 발명에 따른 반응기 탱크를 위한 적합한 재료 또는 재료 조합은 모두 통상의 기술자에 알려진 모든 세포 생물학적 적합성 재료, 특히 유리, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에테르케톤(PEEK), PVC, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 및 폴리카르보네이트이다. 0.1 mm 내지 5 mm의 벽 두께가 바람직하고, 0.5 내지 2 mm의 벽 두께가 특히 바람직하다.

병 재료는 일반적으로 종래 기술로부터 공지된 연신 블로우 성형법에 의해 원하는 형태가 된다.

반응기 탱크의 또는 플라스틱 병의 단면은 바람직하게는 n-각형의 형상을 갖고, 여기서 n은 3 내지 12의 범위, 바람직하게는 3 내지 6의 범위, 매우 특히 바람직하게는 3 내지 4의 범위이고, 가장 바람직하게는 n은 4이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 반응기 탱크 또는 플라스틱 병의 측벽은 45° 내지 120°의 각도를 이루는 편평한 표면으로서 적어도 부분적으로 형성된다. 바람직하게는, 반응기의 측벽은 다면체를 형성하고, 병목부는 표면들 중 하나 상에 장착된다.

바람직하게는, 반응기 탱크 또는 플라스틱 병은 모서리 길이(H, b 및 c)를 갖는 입방형이고, 여기서 H는 높이이고, b는 폭이고, c는 플라스틱 병의 깊이이고, b ≤ c ≤ H이다. 넓은 목이 통상적으로 작은 표면들 중 하나 상에 장착되고, 그에 대향하는 표면은 반응기 탱크의 저부로서 역할을 한다. 본 발명에 따른 반응기 탱크 또는 플라스틱 병은 0.5 내지 4, 바람직하게는 1 내지 3, 특히 바람직하게는 1.5 내지 2.5의 범위의 최대 폭(b) 및 깊이(c)에 대한 병 높이(H)의 비를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 반응기 탱크는 정사각형 병 단면 모서리 길이 a = c = D를 갖는다.

반응기의 더 양호한 혼합 및 감소된 시작 체적을 위해, 반응기 탱크 및/또는 플라스틱 병은 일반적으로 내향 오목형 저부를 갖는다. 저부의 구성에 있어서, WO 2010/127689의 교시가 참조로서 혼입되어 있다. 저부는 특히 내향-지향된 4면체의 형상, 내향-지향된 피라미드, 포물면의 형상 또는 벨 형상을 갖는다. 특히 바람직하게는, 저부는 피라미드형으로 형성된다. 오목부의 높이(h_w)는 저부 단면의 원형 등가 직경(D_k)의 0.01배 내지 1배의 범위이다. 바람직하게는, 원형 등가 직경(D_k)에 대한 오목부의 높이(h_w)는 3% 내지 100%의 범위, 특히 바람직하게는 5% 내지 30%의 범위, 매우 특히 바람직하게는 10% 내지 20%의 범위이다.

본 발명에 따른 반응기 탱크는 그 외부벽을 거쳐 가열되고/거나 냉각될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 플라스틱 병 또는 반응기 탱크의 저부의 외부에는, 가열 표면과 외피 표면의 포지티브 연결에 기인하여, 매우 효율적인 열 운반이 성취될 수 있는 1회용 가열 매트가 적용된다. 이 방식으로, 가열 표면은 저부 표면으로 축소될 수 있다. 이 목적으로, 이 가열 매트는 일반적으로 저부의 외부에 접착식으로 연결된다. 일반적으로, 작은 체적 및 따라서 높은 비열교환 표면적을 갖는 반응기 내의 가열 매트의 스위칭 오프가 충분히 신속한 냉각을 유도하기 때문에, 반응기 탱크는 추가의 냉각을 필요로 하지 않는다. 필요하다면, 예를 들어 비교적 낮은 발효 온도에서의 그리고 비교적 높은 호흡 열에서의 미생물 적용의 경우에, 반응기 탱크 또는 탱크 홀더의 측면 표면에 펠티에 요소(Peltier element)를 장착함으로써 추가의 냉각이 적용 가능할 것이다.

본 발명에 따른 반응기 탱크는 바람직하게는 화학적, 생물학적, 생화학적 및/또는 물리적 프로세스를 수행하기 위해 외부로부터 밀봉될 수 있는 챔버이다. 특히, 반응기 탱크는 세포 및/또는 미생물을 배양하기 위한 멸균 챔버를 제공하는 역할을 한다. 본 발명에 따른 반응기 탱크의 바람직한 실시양태에서, 이 목적으로 반응기 탱크의 병목부는 덮개에 의해 긴밀하게 폐쇄되고, 여기서 덮개는 반응기 탱크를 위한 가스 및 액체 공급 및 제거를 위한 적어도 통로 및/또는 연결부를 갖는다. 본 발명에 따르면, 덮개는 구동 액슬을 위한 통로를 갖지 않는다[도 2 내지 도 5]. 덮개는 본 발명에 따른 반응기 탱크의 추가 요소이다. 바람직하게는, 연결된 가스 라인은 멸균 필터가 장착되어 있고, 오프-가스 라인의 멸균 필터는 바람직하게는 응축물을 필터 표면으로부터 떨어져 있게 하기 위해 가열 매트가 장착되어 있다. 대안적으로, 필터 상에 응축물을 회피하기 위한 오프-가스는 예를 들어 필름 재료로부터 제조된 열 전달 표면에 적용되는 전자 냉각 요소(예를 들어, 펠티에 요소)를 거쳐, 오프-가스 냉각기로 더 낮은 이슬점(응축 온도 < 주위 온도)으로 냉각될 수 있다.

게다가, 덮개는, 필요하다면,

- 하나 이상의 전자, 광전 또는 전기 화학 센서, 특히 US 2012/0067724 A1으로부터의 1회용 전기 화학 센서 또는 온도 제어를 위한 PT100 저항 센서 및/또는 수준 제어를 위한 또는 세포 밀도 측정을 위한 정전용량 센서,

- 내부 세포 분리기 및/또는

- 샘플링 시스템

을 포함하는 군으로부터의 요소를 위한 추가 통로 및/또는 연결부를 포함할 수 있다.

반응기 탱크는 적용에 따라, 상기 요소들 중 하나 이상이 적절하게 장착되어 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 덮개는 스토퍼 및 리테이너 슬리브로 구성된다. 스토퍼는 일반적으로 폴리에테르 에테르 케톤, 열가소성 물질 또는 실리콘의 군으로부터 선택된 플라스틱으로 제조된다. 일반적으로, 스토퍼는 1회용 스토퍼로서 제조되고, 특정 실시양태에서는 대안적으로 재사용 가능하다.

바람직하게는, 스토퍼는 폐쇄를 위해 반응기의 목 내에 도입되고, 주연부 상에 장착된 O-링 밀봉부에 의해 병목의 내부에 대해 밀봉되고, 예를 들어 나사-장착 가능한 리테이너 너트와 같은 개별 로킹 수단에 의해, 병목부의 나사산 상에 나사 결합되거나 클램핑 링으로 클램프된다. 대안적으로, 병목부 내에 도입된 스토퍼는 병 개구 상에 적용된 밀봉 립에 의해 밀봉되고 개별 나사-장착 가능한 리테이너 슬리브로 클램프되고 플라스틱 병 상에 나사 결합될 수 있다. 추가 대안은 플라스틱 병 상에 나사 결합되고 O 링에 의해 병목부 및/또는 병 개구로부터 밀봉되는 스토퍼로서 동일한 통로를 함유하는 덮개이다. 바람직하게는, 병목부 내에 압박된 스토퍼가 사용되는데, 이 스토퍼는 병목부 상에 O-링 밀봉부로 밀봉되고 플라스틱 병 상의 개별 나사-장착 가능 리테이너 너트로 단단히 나사 결합된다[도 2]. 본 실시양태는 덮개가 회전될 때의 경우에서와 같이, O 링이 적은 기계적 응력을 갖고 가요성 관형 라인의 어떠한 비틀림도 발생하지 않는 장점을 갖는다.

반응기 탱크는 덮개와 함께 바람직하게는 1회용 요소로서 구성되는데, 즉 바람직하게는 사용 후에 전체 반응기 탱크를 세정하지 않고, 폐기하도록 의도된다. 따라서, 반응기 탱크는 바람직하게는 멸균 반응 챔버를 제공하기 위해 필요한 필수적인 요소만을 포함한다.

플라스틱 병은 일반적으로 1회용 물품으로서 제조되어 사용된다.

민감한 세포의 배양 또는 임상적 세포 산물의 제조를 위해, 가스는 바람직하게는 표면을 거쳐서만 공급된다. 이 경우에, 덮개는 기포화 가스 도입 요소를 위한 통로를 갖지 않고, 본 발명에 따른 반응기 탱크는 기포화 가스 도입을 위한 내부 장치를 갖지 않는다. 대형 발효기까지의 규모에 초점을 맞춘 프로세스 개발의 맥락에서, 높은 세포 밀도를 갖는 관류 방법을 위해 그리고 미생물 프로세스를 위해, 부가의 미시적 규모 또는 거시적 규모 가스 도입을 위한 설비가 제공될 수 있다(예를 들어, 상부로부터 용기 벽에 접착식으로 적용된 소결체 및 덮개를 거쳐 가요성 관형 라인에 의해 공급됨). 바람직하게는, 본 발명에 따른 반응기는 저가의 요소로부터 완전히 제조될 수도 있고, 이에 의해 1회용 시스템으로서 반응기의 사용을 허용한다. 대안적으로, 모든 고가의 요소가 재사용 가능한 덮개 내에 일체화되고, 단지 반응기 탱크만이 1회용 요소로서 사용된다.

반응기의 특정 실시양태에서, 세포 보유를 위해 반응기 탱크 내의 셀 분리기가 사용된다. 본 발명에 따르면, 내부 세포 분리기는 중앙 수직 분리기 및 세포로부터 유리된 흡인 배양 용액에 의한 제거를 위한 수집기를 갖는 분리기 헤드에 의해 형성되고, 여기서 덮개는 수집기를 위한 통로를 갖고, 세포 분리기는 덮개에 회전 가능하게 장착되거나 정적으로 고정된다. 튜브 및 분리기 헤드는 상이한 길이, 기하학적 형상(원추형 및 직선형) 및 직경을 가질 수 있고, 다양한 튜브 내부 장치(원추 및 링 내부 장치, 유동 정렬기)를 가질 수 있다. 특정 실시양태가 도 6 내지 도 8에 도시되어 있다. 세포 분리기는 강, 유리 또는 플라스틱으로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 세포 분리기는 예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에테르 케톤 및/또는 폴리카르보네이트와 같은 플라스틱으로 제조되고 1회용 요소로서 사용된다.

따라서, 본 발명은 또한 중앙 수직 분리기 튜브 및 흡인에 의해 무세포 배지를 제거하기 위한 수집기를 갖는 분리기 헤드에 의해 형성된 생물반응기를 위한 내부 수직 세포 분리기에 관한 것이고, 여기서 세포 분리기는 반응기 탱크를 위한 덮개에 고정되거나 회전 가능하게 장착되고, 덮개는 수집기를 위한 통로를 갖는다.

세포 분리기가 사용되면, 반응기 탱크는 일반적으로 덮개에 체결된 미리 제조된 세포 분리기가 병목부를 통해 도입될 수 있게 하기 위해, 넓은 목을 갖는다. 세포 분리기가 덮개에 이동식으로 고정되면(= 회전 가능하게 장착됨), 그 관성에 기인하여 반응기 탱크의 회전 운동에 의해 단지 최소로만 영향을 받게 된다. 그 결과, 도 10에 도시된 바와 같이, 분리기에 의해 침강 챔버 내로 전달되어 침강 프로세스와 간섭하는 원형 유동이 회피되고, 보유가 상당히 개선된다.

세포 분리기는 바람직하게는 세포 분리기의 내부 및 외부 영역이 실질적으로 대응 수축부에 의해 서로로부터 분리되는 이러한 방식으로 설계된다. 이 방식으로, 양호하게 혼합된 외부 챔버로부터 침강 구역 내로의 침강과 간섭하는 유동의 전달이 감소된다. 달리 말하면, 세포 분리기의 내부 체적은 외부 체적(= 배양 체적) 내의 유동에 의해 가능한 한 적게 영향을 받을 것이지만, 보유된 세포의 혼합된 공급된 반응기 영역 내로의 역-운반이 보장 유지되어야 한다.

바람직하게는, 내부 세포 분리기는, 단면 모서리 길이 D = 120 mm, H = 235 mm의 치수를 갖는 반응기 탱크에 대해, 40 mm 내지 200 mm, 특히 90 내지 190 mm, 바람직하게는 190 mm의 분리기 길이(l)(370)를 갖는 분리기 튜브(310)를 갖는다(도 6 및 도 7). 일반적으로, 0.2 내지 0.9, 바람직하게는 0.5 내지 0.9, 특히 0.8의 비(l/H)가 사용된다.

분리기 튜브는 튜브 직경(d)(350)을 갖는 원형 단면을 갖고, 병 단면 에지 길이(D)에 대한 튜브 직경(d)의 비는 일반적으로 0.25 내지 0.90, 특히 0.5 내지 0.85, 바람직하게는 0.83이다. 튜브 직경(d)은 분리기 표면적을 성취하기 위해 세포 보유에 있어 중요하다.

세포 분리기가 병 내로 즉시 도입될 수 있는 이러한 방식으로 병목부 및 세포 분리기 단면을 선택하는 것이 바람직하다. 이는 특히 무균 실험대 하에서 감마-멸균된 반응기 탱크에 연결되는 재사용 가능한 오토클레이브 사용 가능 덮개가 사용될 때 필요하다.

생물반응기의 제1 실시양태에서, 가스 도입은 표면을 거쳐서만 진행된다(도 6 및 도 7). 이 목적으로, 분리기의 튜브 직경(d)(350)은 하기 식 (I)에 의해 규정된 표면을 거쳐 가스가 공급되는 배양 체적(V_K)과 하기 식 (II)에 의해 규정된 분리기 체적(V_A)의 비가 0.01 내지 10, 바람직하게는 0.2 내지 2이도록 하는 방식으로 선택된다.

세포 분리기의 추가 파라미터는

으로 정의된 분리 면적(= 정화 면적)(A) 및 또한 정화 영역 로딩 v = q/A이고, 여기서 q는 채취 스트림이다.

분리기 헤드에는, 흡인에 의한 무세포 배양 용액을 제거하기 위한 수집기(320)가 부위되어 있다. 일반적으로, 튜브 직경(d)에 대한 수집기 직경(dv)(360)의 비(dv/d)는 0.1 내지 0.8, 바람직하게는 0.3 내지 0.5이다.

바람직하게는, 수집기(320)는 원추형 형상을 갖는다. 이 형상은 더 많은 공간이 덮개를 거쳐 추가 요소(센서, 샘플링 라인 등)를 도입하기 위해 이용 가능하다는 장점을 갖는다. 마찬가지로, 가스-도입 영역이 더 약간 축소된다.

바람직하게는, 반응기 탱크 내의 분리기는 0.75 내지 0.9의 분리 튜브로부터의 저부 간격(s)에 대한 분리기 길이(l)의 비(l/s)를 갖고 사용된다.

분리 튜브 및 수집기(320) 내의 내부 장치는 바람직하게는 세포 분리기를 갖지 않는다.

모델 입자 PAN-X에 의한 유체역학적 연구에서, 상이한 튜브 길이 기하학적 형상(원추형/직선형 헤드) 및 직경 및 또한 다양한 튜브 내부 장치(원추 및 고리 내부 장치, 유동 정렬기 등)를 갖는 튜브가 덮개 내에 정적으로 내장된다. 현재 이용 가능한 실험에 따르면, 3 W/m3의 전력 입력(P/V_K)에서 0.025 < v[m/h] < 0.2의 정화 영역 로딩(v)의 범위에서 고체를 위한 정적으로 설치된(= 동시 회전하는) 내부 세포 분리기가 정적 외부 시스템(예를 들어, 플레이트 분리기, 수직 유동 침강 탱크)(도 13)에 대한 상당한 보유도를 갖는다.

특히, 본 발명에 따른 세포 분리기는 예를 들어 >> 3 W/m3의 상당히 보다 높은 전력 도입 범위(P/V_K)에서, 지지 재료의 침수 속도에 따라 사용 가능한 지지부-고정된 세포와 같은 즉시 침강 가능한 입자의 배양을 위해 적용 가능하다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 반응기는 게다가 자동 샘플링 요소를 갖는다.

제1 실시양태에서, 샘플링 요소는 덮개를 통해 안내된 수용 라인으로 이루어진다(= 덮개 샘플링 요소, 도 10 참조). 반응기 외부에서, 라인은 클램프 및 핀치 밸브에 의해 차단될 수 있다. 인접하는 Y 편을 거쳐, 먼저 감압에 의한 발효기로부터 샘플의 흡인 및 과압에 의한 샘플링 준비 스테이션으로의 후속의 운반에 의한 수직 제거가 진행된다. 이 Y-형 샘플링 요소는 가요성 관형 라인, 핀치 밸브, 멸균 필터 및 과압 공급부 및 감압 공급부로 이루어진 자동 샘플링 모듈을 성취하기 위해 특히 유리하다. 일반적으로, 플라스틱으로 제조된 상업적으로 입수 가능한 라인, 밸브 및 Y 편이 사용되어, 따라서 덮개 내에 일체화될 수 있는 샘플링 요소가 1회용 요소로서 제공되어 사용될 수 있다. Y-형 샘플링 요소의 기본 원리는 WO 2007/121887에 설명되어 있고, 참조로서 혼입되어 있으며, 2개의 뷰렛이 샘플의 운반 및 분취를 보장하기 위해 작동된다. 샘플 제거 후에, 샘플링 요소는 EtOH로 멸균되고 건조된다. 바람직하게는, 샘플 인출 요소의 오염을 방지하기 위해 공기 및 EtOH를 위한 필터 요소가 내장된다. 바람직하게는, 샘플링 요소는 바이엘 테크놀로지 서비시즈 게엠베하(Bayer Technology Services GmbH)로부터의 자동화된 분석을 위한 베이크로매트-플랫폼(BayChromat-Platform)에 결합된다.

추가 실시양태에서, 반응기 탱크는 저부벽 상에, 특히 센서(센서 패치 또는 전기 화학 센서)에 대향하는 벽 상에, 샘플링 시스템을 장착하기 위한 저부에 근접한 영역에서 통로 및/또는 연결부를 갖는다. 통로 및/또는 삽입부의 예는 특히 표준화된 잉골드(Ingold) 스터브 - 또는 PG13,5-나사산 스터브이다. 적합한 샘플링 시스템은 예를 들어 DE102008033286 A1에 설명되어 있다.

본 발명에 따른 반응기 탱크 내의 혼합은 주기적으로 방향을 변경하는 반응기 탱크 회전을 거쳐 진행되는데, 이는 플라스틱 병의 각진 형상과 조합하여 반응기 내용물의 표면으로의 내향 지향된 파형 유동을 유발한다. 반응기 운동의 구성을 위해, WO 2010/127689의 교시가 참조로서 혼입되어 있다.

반응기를 작동하기 위해, 특히 세포 및/또는 미생물을 배양하기 위해 요구되는 모든 나머지 요소, 특히 주기적으로 방향을 변경하는 반응기 탱크 회전을 생성하기 위한 구동 유닛 및 센서 패치를 판독하기 위한 광전 센서 시스템이 주변 장치에 의해 제공되고 재사용 가능하다. 종래 기술에서 일반적으로 하나의 코히어런트 유닛인 반응기는 따라서 본 발명의 경우에 바람직하게는 이들의 기능에 따라 구성된 개별 부분으로 분할된다.

따라서, 본 발명에 따른 반응기의 추가 요소는 주변 장치이다. 특히, 주변 장치로서, 하나 이상의 반응기 탱크 홀더를 갖는 반응기 탱크 수용 주변 장치가 사용되고, 여기서 반응기 탱크 및 반응기 탱크 홀더는, 반응기 탱크가 반응기 탱크 홀더 내로 도입되고/거나 특히 거기서 클램프될 수 있고, 액체-충전 상태로 이에 의해 지지되도록 하는 방식으로 전체 시스템의 개별 부분으로서, 서로 맞춰진다.

본 발명에 따른 반응기 탱크를 수용하기 위한 반응기 탱크 수용 주변 장치는 본 발명에 따른 반응기의 추가 요소이고, 적어도 이하의 요소를 포함한다.

- 각각의 경우에 반응기 탱크에 적응된 풋프린트 및 하나 이상의 측방향 고정 요소를 포함하는 하나의 반응기 탱크를 수용하기 위한 하나 이상의 반응기 탱크 홀더. 예를 들어, 반응기 탱크 홀더는 고정 플레이트 및 측방향 클램핑 아암 또는 클램핑 표면을 갖는다.

- 예를 들어, 스텝퍼 모터와 같은 주기적으로 방향을 변경하는 회전 운동을 수행하기 위한 구동 유닛이 반응기 탱크 홀더에, 특히 반응기 탱크 홀더의 고정 플레이트에 연결된다. 바람직하게는, 모터와 구동부의 직접적인 결합을 갖는 기어장치를 갖지 않는 스텝퍼 모터가 사용된다. 구동 유닛에 의해, 반응기 탱크는 반응기 탱크 자체로의 구동 유닛의 직접적인 결합이 요구되지 않도록 하는 방식으로, 그 고정된 수직축 둘레로 주기적으로 방향을 변경하는 회전 운동 상태가 될 수 있다. 바람직하게는, 반응기 운동을 구현하기 위해, 기어가 없는 스텝퍼 모터가 사용된다. 이러한 장치는 매우 적은 노이즈의 장점을 갖는다. 바람직하게는, 구동 유닛은 제어 유닛에 의해 제어 가능하다. 일반적으로, 제어부는 구동 유닛의 부분이다.

- 좌표에 의해 규정된 반응기 탱크의 위치에서 측면에 장착된 센서 패치, 특히 pH 송신기 및/또는 산소 함량 송신기를 판독하기 위해, 반응기 탱크 홀더 상에, 특히 측방향 체결 요소들 중 하나 상에 설치된 하나 이상의 광전 센서 시스템. 광 여기 및 검출 유닛의 센서로의 직접적인 결합에 의해, 평가 가능한 측정 신호를 생성하고 따라서 래디컬을 생성하기 위한 광 강도는 상당히 감소될 수도 있고, 이는 센서 패치의 연장된 사용 수명을 위해 유리한 것으로 입증되었다.

본 발명에 따르면, 데이터 전송은 차등 직렬 인터페이스를 거쳐 유선 방식으로 및/또는 예를 들어 WLAN의 블루투스와 같은 라디오에 의해 무선 방식으로 처리된다. 바람직하게는, 광전 센서 시스템은 강건한 데이터 전송 및 전자기 간섭에 대한 높은 내성에 기인하여, EIA485/RS485 유형의 대칭 신호 전달을 위한 차등 직렬 인터페이스를 갖는다. 개선된 데이터 전송을 위해, 특히 무간섭 데이터 전송을 허용하기 때문에, 모터와 구동부의 직접 결합을 갖는 기어가 없는 스텝퍼 모터가 특히 유리한 것으로서 확인되었다.

도 11은 반응기 탱크 수용 주변 장치를 포함하는 반응기의 특정 실시양태를 도시한다.

바람직하게는, 반응기에 적응된 풋프린트는 반응기 프레임이 다양한 크기의 반응기에 적용 가능도록 하는 방식으로 교환 가능하거나 적응 가능하다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 반응기의 사용 및 반응기 탱크 및 또한 세포 및/또는 미생물의 배양을 위한 방법에 관한 것이다.

반응기 탱크에서, 작동 중에, 반응기 탱크폭에 대한 액체 수준의 비는 바람직하게는 0.05 내지 2, 특히 바람직하게는 0.1 내지 1이고, 액체 수준은 세포의 성장에 따른 보충 공급의 결과로서 변경될 수 있다. 게다가, 반응기 탱크는 그의 바람직한 유체역학적 및 프로세싱 특성을 유지하면서, 발포체 형성의 경우에 멸균 필터를 구비한 가스 배출 라인에 대한 충분한 간격을 보장하기 위해, 적어도 5% 내지 50% 액체 높이, 바람직하게는 적어도 25% 액체 높이의 액체 수준(= 최대 수준 180, H_L)과 반응기 탱크 사이의 충분한 헤드 공간을 갖고 작동된다. 충전 수준의 제어를 위해, 일반적으로 충전 수준 제어를 위한 정전용량 센서가 덮개를 통해 또는 용기벽들 중 하나 상에 사용된다.

양호한 혼합 및/또는 운반 프로세스의 충분한 강화를 성취하기 위해, 비교적 작은 각도 진폭이 반응기의 회전-진동 운동을 위해 충분하다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 특히, 반응기의 3600° 회전(즉, 10 회전과 동등함)을 성취할 필요가 거의 없고, 따라서 정적 주변부에 진동 및 회전 반응기를 결합하기 위해(예를 들어, 배지 및 가스, 전기 에너지 및 전기 신호를 공급 및 제거하기 위해) 구조적으로 복잡한 해결책에 대한 요구가 존재하지 않는다.

본 발명에 따른 사용에 있어서, 반응기 탱크는 2° ≤ ｜α｜ ≤ 3600°, 바람직하게는 20° ≤ ｜α｜ ≤ 180°, 특히 바람직하게는 45° ≤ ｜α｜ ≤ 90°의 범위의 각도 진폭(α)에서 회전-진동 방식으로 이동되고, 여기서 ±5°의 편차가 존재할 수도 있다. 특히, ｜α｜= 60°가 표면을 거쳐 가스가 공급되는 특히 저전단 생물반응기의 사용시에 매우 특히 바람직한 것으로 고려된다. 따라서, 전체적으로, 진동 운동은 2｜α｜의 각도를 통해 스위핑된다.

실험은 전력 입력이 상승될 때, 반응기 내에 이동 상태가 설정될 수 있으며, 여기서 가스 기포가 반응기 배지 내로 도입되는 것을 발견했다. 가스 기포는 P/V_K > 10 W/m³의 전력 입력으로부터 흡인된다. 기포화 가스 도입에 의해 손상되지 않는 세포 및/또는 미생물에 대해, 가스 공급의 매우 간단한 증가가 이 방식으로 성취될 수 있다. 바람직하게는 저부 영역에 설치된 소결된 튜브를 통한 추가의 기포화 가스 도입을 거쳐, 물질 운반이 상당히 개선될 수 있다. 회전 진동에 의해 발생된 유동은 스파저로부터 마이크로 기포의 온건한 탈착 및 따라서 큰 위상 계면(a) 또는 큰 물질 전달 계수(k_La)를 보장한다.

본 발명이 도면을 참조하여 그러나 도시된 실시양태에 본 발명을 한정하지 않고, 이하에 더 상세히 설명될 것이다.

<도면의 간단한 설명>

도 1은 본 발명에 따른 반응기 탱크 및 반응기 탱크 홀더의 바람직한 실시양태의 측면 종방향 단면을 측면도로 개략적으로 도시한다.

도 2는 상부로부터 스토퍼 열가소성 디자인의 개략도를 도시한다.

도 3은 보유 슬리브(120) 및 O-링 밀봉부(140)로 체결된 호스 노즐(135)을 갖는 스토퍼 실리콘 디자인의 개략 단면도를 도시한다.

도 4는 보유 슬리브(120)로 체결되고 밀봉 립(140b)에 의해 밀봉된 스토퍼 실리콘 디자인을 통한 단면을 정면도로 개략적으로 도시한다.

도 5는 호스 노즐(135)을 갖는 나사-장착 가능한 플라스틱 덮개를 통한 단면을 정면도로 개략적으로 도시한다.

도 6은 종방향 단면에서 직선형 상부(=급격한 단면 수축부)를 갖는 직선형 관형 분리기를 정면도로 개략적으로 도시한다.

도 7은 직선형 상부를 갖는 직선형 관형 분리기를 평면도로 개략적으로 도시한다.

도 8은 직선형 상부(=급격한 단면 수축부) 및 유동 인버터를 갖는 직선형 관형 분리기를 정면도로 개략적으로 도시한다.

도 9는 원추형 헤드를 갖고 덮개 내에 정적으로 체결되어 있는 직선형 관형 분리기를 갖는 반응기가 예로서 도시되어 있는, 라인을 포함하는 실험 구조체를 개략적으로 도시한다.

도 10은 덮개를 통해 안내된 샘플 흡입 라인(1110)을 갖는 자동화 덮개 샘플링 요소의 개략 구조체를 도시하고, 이 샘플 흡입 라인은 Y 편(1170)을 통해 완전한 자동 인출 및 액체의 플러그형 운반을 위한 자동화 플랫폼(1190)으로의 샘플 라인(1120)과 그리고 또한 공기 공급 및 ETOH 세정 및 멸균을 위한 추가 라인(1210)에 연결되어 있다.

도 11은 반응기 탱크 수용 주변 장치와 함께 반응기 탱크의 특정 실시양태를 도시한다.

도 12는 도 6 및 도 7에 따른 정적 및 동시 회전 분리기의 비교시에 실험 결과 R = f(P/V)를 도시하고, 동시 회전 변형예에 대조적으로, 심지어 비교적 고전력 입력 P/V_K > 3 W/m3에서도 양호한 입자 보유를 보장하는 회전 가능하게 장착된 침강 튜브의 매우 놀라운 필요성을 검증한다.

도 13은 다른 침강 분리기에 관한 비교 실험을 도시한다.

8, 9: 포트(ID 2mm, OD 3mm, 포트 길이: 15 mm)
10 내지 15: 포트[ID 3mm, OD 4mm, 포트 길이: 15 mm, 양측에 호스 노즐을 갖는 포트(10)]
16, 17: PG 13.5 포트
18: ID 4 mm를 갖는 PG 13.5에 동일한 유형의 포트
100: 용기
101: 회전축
110: 병목부
120: 리테이너 너트/리테이너 슬리브
120b: 나사-장착 가능 덮개
130: 스토퍼
135: 호스 노즐
136: 실리콘 튜브
140: O-링
140b: 밀봉 립
140c: 밀봉부
150: 스터브
160: 저부
170: 가스 분배기
180: 충전 수준(H_L)
185: 병 높이(H)
186: 병 단면(D)
190: 병 벽
198: 배양 체적(V_B)
200: 가스 공급
210: 멸균 필터
220: 가스 제거
230: 멸균 필터
240: 배지
250: 첨가제
260: 채취
261: PG 13.5 스터브(덮개 도입)
270: 필터 가열기(12년 1월 19일)
280: 측면 샘플링(12년 1월 19일)
290: 센서 포트(chem.)(12년 1월 19일)
300: 침강기 세포 분리기
310: 침강기 튜브/실린더
320: 수집기/원추
330: 수집기 피팅/유동 인버터
331: 개구
332: 간극
333: 침강 제거부
340: 출구/제거 튜브
350: 튜브 직경(d)
360: 수집기 직경(d_V)
370: 분리기 길이(l)
380: 저부로부터 거리(s)
390: 충전 수준
395: 분리기 체적(V_A)
400: 홀더
410: 열전도 요소
420: 진동
430: 가열 매트
610: pH 측정
611: pH 스폿
620: pO₂ 측정
621: pO₂ 스폿
630: 온도 측정
640: 충전 수준 측정
700: 모터를 갖는 구동 유닛
710: 광전 측정 시스템
720: 제어 캐비넷
730: 온도 측정
740: 회전 손잡이
750: 디스플레이
760: 반응기 프레임
900: 샘플 밸브
910: 리테이너 너트
911: 밀봉부
912: 튜브
921: 역류 방지 밸브
922: 역류 방지 밸브
923: 멤브레인
930: 샘플 라인
931: 샘플
950: 퍼지 라인
951: 멸균 필터
952: 가스
953: 증기
960: 샘플 분배
970: 압력 라인
971: 감압
972: 과압
980: pH 측정
981: pH 센서
982: 완충제
983: 폐기물
990: 커플러(루어-로크(Luer-Lock))
1100: 덮개 샘플링 요소
1110: 샘플 흡입 라인
1120: 샘플 라인
1130: 클램프
1140: 액체 필터
1150: 공기 필터
1160: 감압기
1170: Y 편
1180: 핀치 밸브
1190: 예를 들어, EP-1439472 A1 및 EP-2013328A2로부터 공지된 바와 같은 액체의 완전 자동화 인출, 운반, 샘플 준비 및 후속의 분석을 위한 자동화 플랫폼(베이크로매트®)
1200: 세정액의 공급
1210: 공기 공급
<실시예>
생물반응기 병
단면 모서리 길이 D = 120 mm, 높이 H = 235 mm를 갖는 정사각형 단면과 105 mm의 목 단면 직경을 갖는 원형 병목부(110)를 갖는 1회용 플라스틱 병이 용기(100)로서 역할을 하였다. 용기는 라운딩된 모서리를 가졌지만(도 6 및 도 7), 이는 시스템의 특성에 거의 영향을 미치지 않았다. 구동은 병 홀더 상에 직접 작용하는 스텝퍼 모터를 사용하여 수행되었다(도 11).
세포 분리기(300)가 관류 시스템으로서 생물반응기를 작동하기 위해 용기(100) 내에 내장되었다(도 9). 세포 분리기(300)는 70 mm의 튜브 직경(d = 350)을 갖는 원통형 분리기 튜브(310)에 수직으로 연결된 덮개(120b)를 통해 안내된 흡인 튜브(340)를 포함하였고, 흡인 튜브(340)와 분리기 튜브(310)의 상부 영역 사이의 전이 영역은 채취 스트림 수집기(320)를 형성하였고 분리기 체적(V_A)은 분리기 튜브(310)의 저부에서 개방되어 있는 하부 부분을 형성하였다(도 7).
이동 밀봉부를 생략하기 위해, 흡인 튜브(340)가 덮개(120b) 내에 일체로 고정되었고, 따라서 생물반응기의 고정축(101) 주위에 주기적으로 방향을 변경하는 회전 운동(또한 진동 이동이라 칭함)을 따랐다(동시 회전하는 실시양태). 비교 실험을 위해, 대안적으로, 흡인 튜브(340)는 스탠드에 체결되었고, 이들 실험에서 세포 분리기(300)가 이어서 정적으로 사용되었다.
관류 작업에 있어서, 분리기 튜브(310)는 용기 내에 위치된 현탁액 내로 돌출되었다(충전도(390) > 저부로부터의 간격(s)(380)).
채취 스트림 수집기(320)에 부착된 관류 펌프(왓은 앤 말로우(Watson & Marlow)로부터의 연동식 펌프)에 의해, 현탁액은 저부로부터 분리기 튜브(310)의 분리기 체적(V_A) 내로 흡인에 의해 인출되었다. 분리기 튜브(310) 내에서, 현탁액은 상승되었고 세포/입자의 침강에 의해 정화되었다(수직 분리). 입자들은 분리기 체적에서 다시 배양 체적(V_K) 내로 하향 유동 방향에 대해 낙하하였다(도 7). 정화된 용액은 분리기 튜브(310)의 채취 스트림 수집기(320)로부터 수집되었고 흡인 튜브(340)를 거쳐 제거되었다.
분리기 튜브의 정화 영역(A)은 그 원형 단면에 대응하고, 식 III에 따라 계산된다.
PAN-X 연구:
입자 시스템 PAN-X(폴리아크릴로니트릴, 드라론 게엠베하(Dralon GmbH)로부터의 구형 입자)가 세포 배양에 있어서 일체형 세포 분리기를 갖는 본 발명에 따른 반응기 병의 분리 성능의 연구를 위한 모델 입자로서 사용되었다.
물리적 특성의 본질을 시험하기 위해, 입경 분포 및 입자 낙하 속도가 비교되었는데, 이는 이들이 침강의 결정 팩터이기 때문이다.
입경 분포는 레이저 회절법을 통해 결정되었다(마스터사이저(Mastersizer) 2000, 작동 지침에 따라 측정됨). 결과는 μm 단위의 입경에 대한 함수로서, 총 체적에 기초하여 % 단위로 입자 체적으로서 플롯팅되었다. 최빈값(X_Mod)은 어느 입경이 체적 관점에서 가장 빈번하게 표현되는지를 나타내고, 대략 21 μm였다.
낙하 속도는 침강 균형을 사용하여 분석되었다. 이를 위해, 실험에서 사용된 것과 동일한 농도를 갖는 현탁액이 제조되었다. PAN-X는 탈염수[= 완전히 무이온(CIF)수] 내에 현탁되었고, 대략 3 g/l의 질량 농도 또는 체적당 0.88의 체적 농도를 가졌다. 20℃의 온도가 분석을 위해 선택되었다. 실험 조건 하에서 측정된 0.129 m/h 내지 0.137 m/h의 낙하 속도(v_s)가 다양한 PAN-X 배치에서 결정되었고, 방해받지 않은 침강의 조건에 대응한다.
CHO 세포는 예를 들어 0.0145 m/h의 침강 속도를 갖고[Searles J A, Todd P, Kompala D S, Biotechnol Prog (1994) 10: 198-206] 따라서 비교적 느리게 침강하는 세포이다. 하이브리도마 세포주 AB2-143.2는 0.029 m/h의 침강 속도를 갖는다[Wang Z, Belovich J M (2010) Biotechnol Prog 26 (5): 1361-1366].
모델 현탁액의 제조를 위해, 3 g의 PAN-X가 계량되었고 자기 교반기를 사용하여 1000 ml의 CIF 수 내에 현탁되었다. 샘플링을 위해, 채취 스트림이 측정 실린더 내에 수집되었고, 방출된 체적은 제2 연동식 펌프에 의해 충전 수준 H/D = 1까지 CIF 수로 대체되었다.
달리 언급되지 않으면, 모든 실험은 이하의 표준 파라미터에 따라 수행되었다.
가속도 a = 1000°/s²(P/V = 11.12 W/m³)
동시 회전 분리기
정화 영역 로딩 v = 0.1 m/h
저부로부터의 거리 s = 70 mm
입자 농도의 중량 측정식 결정: 채취 스트림 내의 입자 농도는 규정된 체적의 채취 스트림을 여과하고(흡인에 의해 여과) 이후에 건식 균형(drying balance)에 의해 필터를 건조하고 계량함으로써 중량 측정식으로 결정되었다.
다양한 분리기 길이(l)(= 370)에서 보유도에 대한 가속도 또는 전력 입력의 효과가 결정되었다. 이 목적으로, 정적 분리기 및 동시 회전 분리기에 의한 실험이 비교되었다(결과에 대해 도 12 참조). 도 6 및 도 7에 따른 급격한 단면 수축부를 갖는 채취 스트림 수집기가 직경 d = 70 mm를 갖는 분리기 튜브 상에 설치되었다. 600 내지 2000°/s²의 가속도에서 90 mm 및 170 mm의 분리기의 길이(L)가 연구되었다.
최대 P/V = 50 W/m³의 다양한 전력 입력(P/V) 및 정화 영역 로딩 v = 0.1 m/h에서 PAN 모델 입자의 보유시의 성능의 비교는 보유도(R)가 분리기 튜브의 동시 회전 설치에 의한 생물반응기 내로의 증가하는 전력 입력에 따라 감소되었다는 것을 나타내었고, 보유도는 분리기의 증가된 길이(L)에 의해 상당히 유리하게 영향을 받는다.
추가 실험에서, 다양한 채취 스트림 수집기의 효과는 분리기 길이 l = 108 mm 및 P/V = 11.12 W/m³의 전력 입력(a = 1000°/s²) 및 v = 0.1 m/h에 대해 연구되었다. 분리기 길이 l = 58 mm 및 54°의 개구각을 갖는 도 8에 따른 원추형 단면 수축부를 갖는 채취 스트림 수집기의 직경비 d_v/d = 5/70을 갖는 도 6 및 도 7에 따른 급격한 단면 수축부를 갖는 채취 스트림 수집기(또한 더 간단히 수집기라 칭함)가 동시 회전을 위해 생물반응기의 덮개(120b) 내에 내장되었다. 결과는 원추형 채취 스트림 수집기의 명백한 장점을 나타내었다. 이 분리기의 보유 성능은 총 실험 범위에서 90 내지 143 mm의 분리기 길이(l)에서 놀랍게도 사실상 일정하였다. 급격한 팽창을 갖는 채취 스트림 수집기에서, 분리기 성능은 90 내지 170 mm의 분리기 길이(l)의 증가에 따라 증가하였지만, 원추형 단면 수축부의 성능을 완전히 성취하지 않았다.
저부로부터의 거리의 효과:
저부로부터의 거리의 조사를 위해, 도 6 및 도 7에 따른 간단한 채취 스트림 수집기 및 분리기 길이 l = 90 mm를 갖는 분리기 튜브가 사용되었다. 분리기 튜브는 10 내지 90 mm의 저부로부터의 거리(s)를 갖도록 조정되었다. P/V = 11 W/m³ 및 v = 0.1 m/h의 표준 실험 조건 하에서, 저부로부터의 거리의 어떠한 효과도 10 < s [mm] < 70의 저부로부터의 거리의 영역에서 d = 70 mm 및 l = 90 mm의 분리기 튜브에 의해 관찰될 수 없었다. s > 70 mm를 초과할 때까지 저부로부터의 거리의 효과는 가시화되지 않았다.
정화 영역 로딩의 효과:
분리기 튜브의 정화 영역 로딩(v)은 수직으로 상승하는 배지의 속도에 대응하고, 식 IV에 따르면, 입자 보유에 대한 직접적인 효과를 갖는다. 정화 영역 로딩의 효과는 도 6 및 도 7에 따른 분리기 튜브(d = 70 mm, l = 170 mm)에 대해 연구되었다. 분리기 튜브는 저부로부터의 거리 s = 70 mm를 갖고 동시 회전하도록 병 덮개 내에 고정되었다. 반응기는 3.43 W/m³(a = 600°/s²)의 전력 입력 및 v = 0.025 m/h 내지 v = 0.2 m/h의 정화 영역 로딩에서 작동되었다. 0.025 < v [m/h] < 0.2로 연구된 로딩 범위에서, 보유도(R)는 분리기의 영역 로딩 또는 상승 속도(v)의 증가에 따라 사실상 선형으로 증가한다. 이 결과는 분리기의 특성에 기인할 뿐만 아니라, 사용된 모델 현탁액의 침강 특성에도 기인한다. PAN-X 입자는 광범위하게 분포된 입경 및 낙하 속도를 갖는 다분산 현탁액으로서 이용 가능하다. 따라서, 사실상 단분산 세포 현탁액 내의 보유 특성은 더 가파르고 더 작은 상승 속도로 시프트된 코스를 갖는 것으로 가정된다.
다양한 분리 시스템의 성능의 비교가 정화 영역 로딩에 대한 보유도(R)의 형태로 도 13에 도시되어 있다. 8 cm² 및 39 cm²(내부 튜브 1 및 2)의 분리기 면적을 갖는 P/V_K

3 W/m³의 전력 입력에서 동시 회전하도록 반응기 탱크 내에 설치된 2개의 수직 분리기가 전통적인 수직 분리 탱크, EP1451290에 따른 경사진 채널 분리기 및 EP12001121.8에 따른 입방형 분리기와 같은 정적 외부 중력 분리기 변형예들과 비교되었다. 실험 결과들은 입방형 분리기에 대한 약간의 장점을 갖는 0.025 내지 0.2 m/h로 연구된 정화 영역 로딩의 전체 영역에 비한 모든 분리기의 사실상 등가의 보유 성능을 검증하고 있다.
본 발명으로 이어진 연구는 유럽 지역 개발 기금(European Fund for Regional Development: EFRD)의 맥락에서 재정적 지원 협의 "Bio.NRW: ProCell - Innovative platform technologies for integrated process development with cell cultures"에 따라 장려되었다.

Claims

저부, 벽, 내부 및 내부로의 하나 이상의 접근부를 갖는 치수적으로 안정한 각진 플라스틱 병의 세포의 배양을 위한 생물반응기 탱크로서의 용도.
저부, 벽, 내부 및 상기 내부로의 하나 이상의 폐쇄 가능한 접근부를 갖는 치수적으로 안정한 정사각형 플라스틱 병을 포함하고, 상기 폐쇄 가능한 접근부는 하나 이상의 병목부 및/또는 하나 이상의 통로로 이루어지고, 하나 이상의 센서 패치가 상기 내부에, 상기 플라스틱 병의 하부 영역의 하나 이상의 벽 상에, 좌표에 의해 규정된 부위에 장착된 것인 반응기 탱크.
저부, 벽, 내부 및 하나 이상의 폐쇄 가능한 접근부를 갖는 치수적으로 안정한 각진 플라스틱 병을 포함하고, 상기 폐쇄 가능한 접근부는 하나 이상의 병목부로 이루어지고, 상기 병목부는 덮개에 의해 폐쇄되고, 상기 덮개는 반응기 탱크 내외로의 가스 및 액체 공급 및 제거를 위한 통로 및/또는 연결부를 갖고, 구동 액슬을 위한 통로를 갖지 않는 것인 반응기 탱크.
제3항에 있어서, 가스 제거를 위해, 가열 매트를 갖는 멸균 필터가 구비된 가스 배출 라인이 상기 덮개를 통해 안내되는 것인 반응기 탱크.
제3항 또는 제4항에 있어서, 하나 이상의 전자, 광전 또는 전기 화학 센서가 상기 덮개를 통해 안내되는 것인 반응기 탱크.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 내부 수직 세포 분리기를 더 포함하고, 상기 내부 수직 세포 분리기 자체는
a. 관형 직경(d)을 갖는 원형 단면을 갖는 중앙 수직 분리기로서, 병 단면 모서리 길이(D)에 대한 관형 직경(d)의 비가 0.25 내지 0.90인 중앙 수직 분리기, 및
b. 세포로부터 유리된 흡인 배양 용액에 의한 제거를 위한 수집기를 갖는 분리기 헤드
를 포함하며, 상기 세포 분리기는 상기 반응기 탱크의 덮개에 정적으로 고정되거나, 회전할 수 있도록 장착되고, 상기 수집기는 상기 덮개를 통해 안내되는 것인 반응기 탱크.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 1회용 샘플링 요소를 더 포함하고, 상기 1회용 샘플링 요소는 상기 반응기 탱크의 벽 상에 또는 덮개 상에 설치되고 Y 편(1170)을 거쳐 샘플 운반 라인(1120)에 연결되는 샘플링 흡인 라인(1110)을 갖고, 상기 샘플 운반 라인에 의해 샘플링 라인이 액체의 완전 자동화된 멸균 인출을 위한 자동화 플랫폼(1190)에 연결되고, 샘플 운반은 상기 Y 편에 연결된 공기 공급부(1210)에 의해 지지되는 것인 반응기 탱크.
- 저부, 벽, 내부 및 내부로의 하나 이상의 폐쇄 가능한 접근부를 갖는 치수적으로 안정한 각진 플라스틱 병에 의해 형성되고, 상기 폐쇄 가능한 접근부는 하나 이상의 병목부 및/또는 하나 이상의 통로로 이루어진 것인 반응기 탱크, 및
- 상기 반응기 탱크를 수용하기 위한 반응기 탱크 수용 주변 장치
를 포함하며, 상기 반응기 탱크 수용 주변 장치는
- 상기 반응기 탱크에 적응된 풋프린트 및 하나 이상의 측방향 체결 요소를 갖는 하나의 반응기 탱크를 각각의 경우에 수용하기 위한 하나 이상의 반응기 탱크 홀더,
- 주기적으로 방향을 변경하는 회전 운동을 수행하기 위해 상기 반응기 탱크 홀더에 연결된 구동 유닛
으로 이루어진 것인 반응기.
제8항에 있어서, 하나 이상의 센서 패치가 상기 플라스틱 병의 하부 영역에서 하나 이상의 벽 상에, 좌표에 의해 규정된 부위에 장착되고, 상기 반응기 탱크 홀더 상에, 상기 센서 패치의 여기 및 판독을 위한 하나 이상의 광전 센서 시스템이 직접 또는 광학 도파관에 의해 고정된 것인 반응기.
제9항에 있어서, 상기 광전 센서 시스템이 차등 직렬 인터페이스를 거쳐 유선 방식으로 및/또는 라디오를 거쳐 무선 방식으로 수집된 데이터를 전송하는 것인 반응기.
제10항에 있어서, 상기 구동 유닛이 모터와 구동부의 직접 결합을 갖는 기어장치가 없는 스텝핑 모터인 반응기.
제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응기 탱크의 폐쇄 가능한 접근부가 병목부이고, 덮개에 의해 폐쇄되며, 덮개는 상기 반응기 탱크의 가스 및 액체 공급을 위한 통로 및/또는 연결부를 갖고, 구동 액슬을 위한 통로를 갖지 않는 것인 반응기.
- 반응기 탱크에 적응된 풋프린트 및 하나 이상의 측방향 체결 요소를 갖는 하나의 반응기 탱크를 각각의 경우에 수용하기 위한 하나 이상의 반응기 탱크 홀더,
- 좌표에 의해 규정된 반응기 탱크의 위치 상에 측방향으로 장착된 센서 패치를 판독하기 위해 상기 반응기 탱크 홀더에 체결된 하나 이상의 광전 센서 시스템,
- 주기적으로 방향을 변경하는 회전 운동을 수행하기 위해 상기 반응기 탱크 홀더에 연결된 구동 유닛으로서, 모터 및 구동부의 직접적인 결합을 갖는 기어가 없는 스텝퍼 모터인 구동 유닛
을 포함하는, 반응기 탱크를 수용하기 위한 반응기 탱크 수용 주변 장치.
반응기 탱크를 > 10 W/m³의 전력 도입에서 그 고정 수직축 주위에 2° ≤ ｜α｜ ≤ 3600°의 범위의 각도 진폭(α)을 갖는 주기적으로 방향을 변경하는 회전 운동 상태가 되게 하는, 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 반응기 내에서의 세포의 배양 방법.
제14항에 있어서, 0.01 내지 100 cm/h의 낙하 속도를 특징으로 하고, 반응기 탱크가 중앙 수직 분리기 튜브 및 흡인에 의해 무세포 배지를 제거하기 위한 수집기를 갖는 분리기 헤드에 의해 형성되는 내부 수직 세포 분리기를 갖고, 상기 세포 분리기가 정적으로 또는 회전 가능하게 장착된 반응기 탱크를 위한 덮개 상에 체결되고, 상기 수집기는 상기 덮개를 통해 안내되고, 상기 세포 분리기를 사용하여 세포로부터 분리되는 배양 용액이 흡인에 의해 상기 반응기 탱크로부터 제거되는 것인, 세포의 배양 방법.