TWI770040B - 細胞培養容器的可消毒接合器、可消毒裝置的用途以及用於在搖動條件下細胞培養的方法 - Google Patents

細胞培養容器的可消毒接合器、可消毒裝置的用途以及用於在搖動條件下細胞培養的方法 Download PDF

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Abstract

本發明揭露用於一細胞培養容器的可消毒接合器，包含一本體、一上連接部及/或一蓋、至少一埠、一通風通道、一下內部連接部(適於連接至一細胞培養容器)及一細胞保留裝置及/或細胞分離裝置，及一裝置包含該可消毒接合器以及使用該可消毒接合器用於細胞培養之方法。

Description

細胞培養容器的可消毒接合器、可消毒裝置的用途以及用於在搖動條件下細胞培養的方法
本發明有關一種細胞培養容器的一可消毒接合器，包含至少一埠，其做為較佳為液體的或氣體的物質之入口及/或出口，允許在受控制的培養條件下使用批次(batch)、饋料批次(fed-batch)、重複饋料批次(repeated fed-batch)及/或連續培養條件(continuous cultivation conditions)(例如灌注培養條件(perfusion culture conditions))，於一細胞培養容器中的微生物及細胞培養物培養。
在微生物及細胞培養物的培養中，特別是動物、植物及人類細胞，使用各種類型的生物反應器(bioreactor)。
在工業生物技術製程中，通常在大的、裝備齊全的生物反應器中，在受控制的條件下(pH、溶解氧濃度(dissolved oxygen concentration)、液位、溫度及廢氣分析(offgas analysis))執行細胞培養。裝備齊全的生物反 應器供給數個埠，用於饋送培養液(nutrient solutions)、用於控制pH的酸鹼添加劑(addition of acid and base for pH control)或消泡劑(antifoam agents)；以及數個埠，用於取樣(sampling)或連續移除細胞懸浮(cell suspension)或發酵液(fermentation broth)。pH、溫度及氧氣供應的受控制條件確保不同的細胞培養之間的相似性(comparability)及再現性(reproducibility)，這對於一一致的及可靠的產品質量是重要的。依據細胞種類及待發展與優化的製程，需要批次、饋料批次、重複饋料批次、灌注及或連續培養條件，例如灌注培養條件。
在這種生物技術製成的發展及優化期間，為了增強產品品質及產生效率，複數個參數(諸如細胞株(cell lines)、介質(media)及饋料(feeds))需要改變及調整。
當改變及調整各個參數以為了優化細胞培養條件時，需要大量的生物反應器，或者各個參數僅能一個接一個地被分析，導致非常長的無效率製程發展時間。再者，在這兩種方案中，每一待測參數需要設定完整的、裝備齊全的細胞培養生物反應器，這導致極高的成本，特別是用於連續培養條件。
因此，需要一簡化的系統(其理想上允許一較快的、更有效率的及減少成本的製程發展)，在製程控制、饋料、取樣及監測方面的功能裝備齊全的生物反應器。
令人驚訝的是，此目標能藉由提供如後所述的一細胞培養容器的可消毒接合器而能達成。
因此，在一第一方面，提供一細胞培養容器的可消毒接合器， 包含一本體、一上連接部及/或一蓋、至少一埠、一通風通道、一下內部連接部(適於連接至一細胞培養容器)及一細胞保留裝置及/或細胞分離裝置。
在一第二方面，提供一裝置，包含一如前所述的可消毒接合器、一細胞培養容器及一蓋。
在另一方面，提供了如前所述的裝置之用途(use)。
又另一方面，提供一細胞培養方法，使用一如前所述的可消毒接合器及/或一如前所述的裝置。
1:可消毒接合器
2a:埠
2b:埠
2c:埠
2d:埠
2e:埠
3:通風通道
4:上外部螺紋
5:細胞保留裝置/重力細胞沉降器
6:螺紋
7:蓋
8:細胞培養容器/搖瓶
9:細胞培養介質
10:pH感測器位置/溶解氧感測器位置
11:細胞
12:位準感測器
13:本體
14:本體
熟悉本領域技術之人士應了解，如後之圖式僅用以示意本發明之目的。圖式非意在限縮本發明的範圍。
圖1圖示一裝置，包含一可消毒接合器以及一細胞保留裝置。
圖2圖示一可消毒接合器，包含一位準感測器(level sensor)。
圖3顯示一示範性可消毒接合器(由上往下看)。
圖4顯示圖3的示範性裝置的側視圖，包含一可消毒接合器以及一細胞培養容器。
圖5顯示另一示範性裝置，包含一可消毒接合器以及一細胞培養容器。
圖6顯示一示範性細胞保留裝置，例如一濾膜(filtration membrane)。
圖7顯示一示範性可消毒接合器。
圖8顯示另一示範性裝置，包含一可消毒接合器的替代實施 例(相似於圖4)以及一細胞培養容器。
圖9顯示一概圖，表示灌注率在20.8mL/h及41.6mL/h時的聚丙烯腈微粒(polyacrylonitrile particle)洩漏值，其係由內直徑為4mm、6mm及10mm的細胞保留裝置測定。
圖10A以及圖10B顯示細胞保留裝置的一示範性設備(installation)。
應了解的是，本文使用的術語僅為描述特定實施例之目的，非用以限制本發明。如本案說明書及申請專利範圍中的用語「一」表示「一或多個」。
本發明提供一細胞培養容器的可消毒接合器，包含一本體、一上連接部及/或一蓋、至少一埠、一通風通道、一下內部連接部(適於連接至一細胞培養容器)及一細胞保留裝置及/或細胞分離裝置。
用這種可消毒接合器結合一標準細胞培養燒瓶(flask)，允許在連續培養條件(例如灌注培養條件)下的細胞培養。另外，饋料批次、重複饋料批次、批次培養可使用可消毒接合器執行。易言之，經由利用可消毒接合器能夠使用標準細胞培養容器在再現及相似的條件下執行細胞培養，這標準細胞培養容器比裝備齊全的生物反應器更容易獲得、更容易處理且更有成本效益。
由於小規模，因為需要較少的培養介質和材料，且在儀器和花費在培養維護上的時間要求被最小化，開發和優化生物技術製程的成本降低。
再者，因為細胞保留裝置及/或細胞分離裝置使本文描述的 可消毒接合器適於小規模的細胞培養，可消毒接合器尤其不同於習知裝置。由於細胞保留裝置將細胞保留在細胞培養容器內培養，即使是小規模的連續灌注細胞培養亦是可行的。若使用優化的一細胞分離裝置以用於小培養體積，亦同樣適用。因此，經由利用本文所述的可消毒接合器，能夠在可再現及相似的條件下執行細胞培養，允許更快、更有效率且成本降低的製程發展，且功能上在製程控制、饋料、取樣及監測方面裝備齊全的生物反應器。
本文所使用的術語「批次」指一種培養條件，其中不會將細胞培養介質加入細胞培養，且在培養期間，不會發生細胞培養介質的連續移除。易言之，在批次種類培養條件下，在培養期間(例如取樣期間)，細胞培養介質可在不同時間點被移除。
本文所使用的術語「饋料批次」指一種培養條件，其中在培養期間，將細胞培養介質加入細胞培養，但在培養期間，不會發生細胞培養介質的連續移除。
本文所使用的術語「重複饋料批次」指一種饋料批次培養條件，其中細胞培養介質係週期性地部分移除且隨後加入培養液。
例如，培養液可以是含葡萄糖的溶液，且加入培養液直到再達到細胞培養介質的原位準(original level)。
若在細胞培養期間，在批次、饋料批次或重複饋料批次條件下，不需要可消毒接合器的細胞保留裝置及/或細胞分離裝置，則依據所利用的可消毒接合器的種類，可能會單純地關閉或從可消毒接合器上移除。
本文所使用的術語「連續」指一種培養條件，其中將諸如細胞培養介質的溶液加入細胞培養且在培養期間從細胞培養連續地吸出(aspirated)。
本文所使用的術語「灌注」指一種連續細胞培養，其中將細胞培養介質加入細胞培養且在培養期間從細胞培養連續地移除。為了維持細胞密度位準(cell density level)，在灌注細胞培養條件下，至少部分的培養細胞需要保留在細胞培養容器或從移除的介質分離。在細胞培養容器外分離的情況下，一旦細胞從被吸出的溶液分離，細胞會回到細胞培養容器。另外，在灌注細胞條件下，通常將部分的培養細胞丟棄(即不會保留在培養容器中或回到培養容器)係為了維持一給定標的細胞密度且移除非活性細胞(non-viable cells)(清除(purge))。
本文所使用的術語「可消毒」指所討論的材料可被習知方法殺菌，諸如高壓蒸氣滅菌(autoclaving)、伽瑪射線(gamma irradiation)或化學去活化(chemical inactivation)。
可消毒接合器的本體包含至少一選自下列群組的材料：不銹鋼(stainless steel)、合成(synthetic)及/或半合成材料，諸如聚醚醚酮纖維(polyether ether ketone；PEEK)、聚四氟乙烯(poly tetra fluor ethylene；PTFE)、聚偏二氟乙烯(poly vinylidene di fluoride；PVDF)或矽氧樹脂(silicone)彈性體。
在一較佳實施例中，可消毒接合器的本體係由聚醚醚酮纖維製成。
本文所使用的術語「上連結部」指裝置的部分，其適於附接至一蓋，例如至所選擇的細胞培養容器的原蓋(original lid)。
本文所使用的術語「下內部連接部適於連接至一細胞培養容器」指適於附接至細胞培養容器的裝置的部分。
此附接可例如是經由插入、黏合(bonding)或螺接(screwing)。
本文所使用的術語「通風通道」指一部件，允許氣體於細胞培養容器內的氣相以及可消毒接合器的上連接部或蓋、以及最後的周圍環境(例如：一恆溫箱(incubator)或一溫度受控制的培養室)之間的氣體交換。
本文所使用的術語「埠」或「連接器」指一開口，物質可透過開口被加入細胞培養容器或從細胞培養容器內移除。
因此，數個埠做為入口及/或出口且其形狀、其精確的位置、其數量及其尺寸可依據實驗需要而變異。
本文所使用的術語「細胞分離裝置」指一部件，其將細胞從細胞培養容器外的介質分離。因此，當使用一細胞分離裝置時，為了維持細胞密度位準，在分離之後，至少一部分的細胞會回到細胞培養容器。
本文所使用的術語「細胞保留裝置」指一部件，其阻擋細胞，同時允許其他物質(例如細胞培養介質)從細胞培養容器移除。
易言之，細胞保留裝置會將細胞保留在培養容器中的培養介質或者在細胞與培養介質一起被吸出之後保留細胞。然而，在第二種狀況下，細胞亦不會離開培養容器。反而是在培養容器內實行細胞保留(即細胞從介質移除)。
細胞保留裝置的用途可與細胞分離裝置的用途結合。
再者，可以利用超過一個細胞保留及/或細胞分離裝置。
細胞保留裝置的示範例係一管件，由合成、彈性或金屬構造材料製成。由合成構造材料製成的細胞保留裝置係一管件的形式，其示範例為一塑膠管件或矽膠管件。為一膜形式用於細胞保留的細胞保留裝置之示範例係一膜(用於細胞保留)，由例如親水性的聚醚碸(hydrophilic polyethersulfone)或聚丙烯(polypropylene)製成，具有一在0.1μm以及10μm之間的孔(pore)尺寸或一脈衝透析過濾膜(pulsed diafiltration membrane)。
在一實施例中，為一金屬管件形式的細胞保留裝置係由不銹鋼(stainless steel)製成。
細胞保留裝置的一種用途可以與相同種類或不同種類的一種或多種其他細胞保留裝置之用途結合。
利用一脈衝透析過濾膜以用於細胞保留在本發明領域中係習知的(詳細請參Meier等，2014)。在搖瓶的狀況下，在旋轉期間，這一裝置的膜係攜帶(carried along)在細胞培養介質中。
較佳地，細胞保留裝置保留接觸細胞保留裝置超過80%、更佳地為超過90%、最佳地為100%的細胞。
細胞保留率(cell retention rate)係經由確定灌注率(perfusion rate)來計算。灌注率描述被收穫的培養物生長量(the amount of culture broth harvested)相比於在酵原中的培養物總體積。灌注率的單位係volumes/day。收穫流率係ml/min且體積係L(1.44轉換為ml/min至L/day)。
在「volumes/day」的單位中：
Figure 106125207-A0305-02-0010-1
K wash
Kwash值描述活細胞流失在收穫之百分比，在百分比的單位中：
Figure 106125207-A0305-02-0010-6
在收穫流中以及生物反應器中的活細胞濃度係分別指定為n H 以及n F 。K wash,total 描述全部細胞在收穫中流失的百分比。
在百分比的單位中：
Figure 106125207-A0305-02-0010-3
在收穫流中以及生物反應器中的全部細胞濃度係分別指定為n H,total 以及n F,total 。為了確定樣本中的細胞數量，可用市面上可獲得的細胞計數器(cell counter；例如：”Cedex HiRes Analyzer”,Roche Innovatis,Germany)去計算細胞。
Kwash值較佳在20%至0.1%之間，更佳在10%至0.1%之間，最佳在2%至0.1%之間。
依據培養的細胞及使用的細胞培養容器，細胞保留裝置的幾何形狀可變異，例如細胞保留裝置可為球形的或矩形的。
因此，依據培養的細胞及使用的細胞培養容器，細胞保留裝置的內直徑、長度、形狀的形式可變異。
細胞保留裝置的示範例形式(特別是用彈性、塑膠或金屬管件形式做為細胞保留裝置)係筆直的及/或彎曲的及/或筆直的且相對於一水平線以一10°到90°之間的角度傾斜、更佳地為60°到80°之間的角度傾斜、最佳地為70°到75°之間的角度傾斜。
在一較佳的實施例中，做為細胞保留裝置的管件係筆直的且以一40°到80°之間的傾斜角傾斜。
因此，這些細胞保留裝置利用重力，例如其為重力細胞沉降器(gravity cell settlers)。
易言之，用於描述於本文的細胞培養容器的可消毒接合器係一實施例，特徵在於至少一細胞保留裝置係一重力細胞沉降器。
再者，一細胞保留裝置，特別是一用為細胞保留裝置的管件，可具有一圓錐形的或圓柱形的形狀。
再者，一細胞保留裝置，特別是一用為細胞保留裝置的管件，可具有在2mm及20mm之間、更佳為2mm及12mm之間、最佳為3mm 及10mm之間的一內直徑。
另外，一細胞保留裝置，特別是一用為細胞保留裝置的管件，可具有在2cm及100cm之間、更佳為10cm及40cm之間、最佳為12cm及30cm之間的一長度。
在一較佳的實施例中，做為細胞保留裝置的管件具有一在2mm及20mm之間的內直徑以及30cm的長度。
當細胞保留裝置確保一固定的細胞保留率、將細胞傷害最小化、可以使用超過整個細胞培養週期且確保保留時間是足夠的，這種細胞保留裝置係較佳的。
在另一較佳的實施例中，由彈性管件製成的細胞保留裝置係一筆直的矽氧樹脂管件，具有一4.8mm的直徑且一163mm的長度。
在一另一較佳的實施例中，細胞保留裝置係由不銹鋼製成，具有一20cm到24cm的長度、一8mm到12mm的內直徑且相對於一水平線傾斜75°到75°之角度。
這實施例具有效應，即細胞保留裝置(在此為重力細胞沉降器)助於在小規模的細胞培養中灌注細胞培養，同時獲得且維持高細胞密度。
若其上安裝有可消毒接合器(包含細胞保留裝置的此實施例)的細胞培養容器係一搖瓶，即在固定的軌道旋轉運動期間(constant orbital rotational movement)，小規模細胞培養係在搖動培養條件(shaking culture conditions)之下培養，則獲得及維持這些高細胞密度。這是令人驚訝的，因為不希望被理論束縛，預計固定的軌道旋轉運動將干涉在重力作用下工作的細胞保留裝置中的細胞沉澱(cell sedimentation)，且因此無法獲得且維持高細胞密度。
這實施例的一示範例係一細胞保留裝置，由不銹鋼製成，具有一23.5cm的長度、一10mm的內直徑及相對於一水平線為74°的傾斜角。
本文所使用的術語「小規模細胞培養」指具有一培養體積為1ml到500ml的細胞培養物。
較佳地，小規模細胞培養具有一培養體積90到170ml。
本文所使用的術語「高細胞密度」指活細胞數量為10-80 x 106cells/ml，以及開始細胞培養時係以一10 x 106cells/ml之下的細胞密度。再者，一但到達高細胞密度的期望值，其能維持整個細胞培養週期。在一實施例中，高細胞密度細胞培養具有一18-40 x 106cells/ml的活細胞數量。
細胞培養密度取決於數個因素，例如開始細胞數量(the starting cell number)、細胞生長率(the growth rate of the cells)、加入及移除培養介質的比率或收穫細胞率(the harvest cell rate)。其可藉由從培養取出一樣本並以一細胞計數裝置(如Cedex HiRes)來計數細胞而每日測量。替代地或者另外，可以在細胞培養培養週期結束時確定細胞培養密度。
在一實施例中，應用下列培養條件：在細胞培養容器的活細胞數量為10-80 x 106cells/ml、一收穫細胞率為0.01-5 x 106cells/mL且加入及移除培養介質的比率或收穫細胞率為0.05-1.5l/h(相對於細胞培養體積：volume/volume/h)。
典型的細胞培養週期為4至8週。因此，在這段時間內，重要的是，細胞保留裝置不需被替換。替換細胞保留裝置的理由尤其係阻塞或洩漏。
再者，細胞停留時間(cell residence time)(即細胞在細胞保留裝置內所花費的時間)對於給定細胞類型必須是足夠的，否則細胞可能受到 傷害(例如藉由耗盡氧氣及/或培養素或經由聚集體形成(aggregate formation))。
較佳地，細胞分離裝置阻擋超過80%、更佳地為超過90%且最佳地為100%的細胞去接觸細胞分離裝置。
細胞分離裝置的示範例係傾斜通道重力沉降器、過濾裝置或離心機。傾斜通道重力沉降器在本文中係指「沉降器」。
在一較佳實施例中，細胞分離裝置係一沉降器。在一特別較佳實施例中，沉降器係一預先消毒單一使用的沉降器，由熱塑性及彈性材料構造製成(如WO 2013124326 A1及WO 2013124329 A1所描述)。
這實施例允許在細胞培養容器外的小體積細胞分離。
在一本文所描述的用於培養容器的可消毒接合器之實施例中，培養容器係一搖動器容器(shaker vessel)，亦係搖瓶(shake flask)，即一適於在搖動時培養微生物、酵母(yeast)、植物及動物細胞的容器。
在搖瓶用於培養的情況下，本文所描述的可消毒接合器克服了中斷(interrupt)用於取樣、加入介質或其他部件的搖動過程之需要。因此，可消毒接合器能確保在搖瓶中的受控制且受監測的細胞培養條件而不被中斷，且因此確保一致的培養條件。這些一致的培養條件係比較彼此不同的細胞培養運行之前提，且因此調整個別參數以優化細胞培養條件。
再者，在一恆溫箱中，以本文所述的可消毒接合器，其安裝於一搖動平台(shaking platform)上，數個搖瓶的併行培養(parallel culture)會大量地降低培養成本以及複雜性，從而允許一更快、更有效率以及降低成本的製程發展(在可再現及相似性的條件下)。
較佳的搖瓶係艾氏燒瓶(Erlenmeyer flasks)。
搖瓶較佳地係以例如搖動條件為40到1000rpm、更佳為100 到500rpm、最佳為80到120rpm搖動。
再者，較佳的一搖動半徑在1mm及50mm之間、更佳為15mm到35mm之間、最佳為25mm。
再者，搖瓶較佳地係利用一總體積在50ml及5000ml之間、更佳為100ml及1000ml之間、最佳為500ml。
搖瓶的相對填充體積(relative filling volume)較佳地為燒瓶總體積的5%及50%之間、更佳為10%及30%之間、最佳為20%。
在一實施例中，本文所描述用於細胞培養容器的可消毒接合器係一用於小規模細胞培養的可消毒接合器。
如前所述，本文所使用的術語「小規模培養」係指以一培養體積為1ml到500ml的細胞培養物。
較佳地，小規模細胞培養具有一90到170ml的培養體積。
最佳小規模細胞培養具有一100到145ml的培養體積。
本文的術語「培養體積」指裝置中的培養液總體機，包含可消毒接合器及細胞培養容器且在細胞保留及/或細胞分離裝置中。
有這種小體積的細胞培養物允許對細胞培養物維持的成本大量減少，如細胞培養介質、額外因素、處理培養物的人員及空間需求的成本。經由利用本文所述的可消毒接合器，這些小規模細胞培養物結合了成本降低與可再現的可能性以可靠地模擬在一習用生物反應器中的細胞培養條件，藉以增強數據品質。對於將一小實驗室規模的成果擴增到標準製造製程(standard production processes)來說是重要的。
如前所述，當使用一搖瓶時，一可消毒接合器包含一以重力細胞沉降器為形式的細胞保留裝置，其由不銹鋼製成，具有一20cm到24cm的長度、一8mm到12mm的內直徑、一相對於水平線為70°到75°的傾斜 角係較佳的。
這實施例具有效應，即細胞保留裝置助於在一小規模細胞培養中的灌注細胞培養，同時獲得及維持高細胞密度。
若其上安裝有可消毒接合器(包含細胞保留裝置的此實施例)的細胞培養容器係一搖瓶，即在固定的軌道旋轉運動期間，小規模細胞培養係在搖動培養條件之下培養，則獲得及維持這些高細胞密度。這是令人驚訝的(不希望被理論束縛)，因為預計固定的軌道旋轉運動將干涉在重力作用下的細胞保留裝置中的細胞沉澱，且因此無法獲得且維持高細胞密度。
典型地，其上安裝有可消毒接合器的數個細胞培養容器緊鄰彼此地被放置在一搖動平台上。
通常，其上安裝有可消毒接合器的細胞培養容器會在一恆溫箱中培養(即一用以生長及維持微生物的培養物或細胞培養物之裝置)，其維持理想的溫度、溼度及其他條件，諸如二氧化碳及大氣內的氧氣含量。然而，亦可使用其他系統，諸如一受控的培養室(controlled cultivation room)，維持理想的溫度、溼度及其他條件，諸如二氧化碳及大氣內的氧氣含量。在這情況的搖瓶，搖動器(shaker)可被放置在這種室中。
本文所述的可消毒接合器係特別適合安裝在一標準培養容器(如搖瓶)上。這種組合適於收容(host)數個搖瓶培養物(shake flask cultures)的系統，其中確保細胞的均質化(homogenization)併行，此為習知技術。因此，在此一系統中，建立以及維持培養條件(諸如溫度、二氧化碳含量、搖動頻率以及搖動直徑)僅需要一用於搖動(agitation)的中央驅動器、一中央溫度控制器、一通風控制器等。因此，此一配置相較於攪動的生物反應器(stirred bioreactor)(其需要一獨立的攪拌器驅動器(stirrer drive)、一溫度控制器、氣體供應器(如一噴灑器)以用於每一生物反應器)係典型地更有成本效益且節 省時間。經由使用可消毒接合器，習用的搖瓶培養物的缺點：「每次當要取出一樣本或要加入一饋料液時，要停止搖動器、培養容器要從恆溫箱拿出以及要移除搖瓶的頂蓋」能被克服。易言之，習知搖瓶中的培養無法在恆定條件中執行且因此可再現的環境條件(已為必要)從恆溫箱移除且頂蓋的開口改變這些條件(pH值、pO2值、pCO2值、能量輸入或溫度，且每一細胞培養物從這些突然的改變中慢慢地且單獨地恢復)。這造成所培養的細胞的難以預測性及不可再現的代謝改變(non-reproducible metabolic changes)，接著造成不同的總體產品的產生或產品品質。然而，經由使用可消毒接合器，用於細胞培養條件的培養條件(例如在搖瓶中)成為可再現的且相似的，諸如批次、饋料批次、重複饋料批次及/或連續培養條件(例如灌注培養條件)。甚至小規模的細胞培養亦可。因此，可消毒接合器在規模擴增的確定參數中確保一更有效率的製程同時降低成本。
在一實施例中，本文所描述的可消毒接合器進一步包含至少一位準感測器。
本文所使用的術語「位準感測器」係指一測量變換器(measuring transducer)，其將液體的位準測量轉換為機械的、電的或氣的信號，其能接著被方便地傳送、處理及記錄。位準感測器確保細胞培養容器中的液體位準(如培養液或細胞培養介質)係在給定的培養條件下所培養的細胞所能耐受的一固定的範圍內。
使用位準感測器助於在連續培養條件下(如灌注培養條件)的小規模細胞培養。因為小培養體積的情況下總有培養容器有液體耗盡或過度填充的風險。此風險經由監測液位而最小化。
在液位太低或太高的情況下，例如為灌注培養條件下，體積流率可因此調整。
在一實施例中，位準感測器係連接至一埠。
在另一實施例中，位準感測器係定位在可消毒接合器的通風通道中。
在一另一實施例中，可消毒接合器的本體包含用於一位準感測器的插入件，例如經由一螺紋及一緊夾具連接(tight clamp connection)(如圖8所示)。
在一較佳的實施例中，細胞培養容器中的液位的測量及若必要的話，在灌注培養的情況下，體積流率的調整係每日實行一次。
確定液位的一個不同的方式係精確地監測物質，其加入培養容器或從培養容器移除，包含在培養期間取出的液體樣本。這方法可補充或為替代使用。
在小規模培養體積的情況下，也可以經由監測加入和移除的物質來確定細胞培養的液位，利用位準感測器來嚴密地控制液位，特別是在灌注培養條件下。
位準感測器的示範例為浮動的、靜水的(hydrostatic)、電的、熱的且光學的感測器。這些皆為本發明領域的習知技術。
本文所述的可消毒接合器的一較佳實施例中，包含至少一電極及/或至少一導電探針(conductive probe)做為位準感測器。
這種位準感測器的示範例為容量及導電位準感測器(capacity and conductivity level sensors)。
容量位準感測器的工作原則在於，液位的增加造成測量電極更深的浸入(immersion)，且因此增加其容量信號。此測量容量例如為設定位準計(level meter)的輸出。
另一方面，導電位準感測器估量該測量的介質之電阻變化。 這可例如經由估量兩個導電探針之間的電阻變化來實行，或估量導電探針及另一金屬物件(例如容器壁或細胞保留裝置)之間的電阻變化。
較佳地，位準感測器在培養期間監測液位且確保液位在所欲體積的±50%的範圍內係固定的，更佳地係在所欲體積的±10%的範圍內，且最佳地係在所欲體積的±5%的範圍內。
因此，若液位在此範圍之外，要調整條件，例如經由加入更多液體或移除少的液體。
較佳的導電位準感測器係德國漢堡Eppendorf AG公司的「DASGIP® Levelsensor」，其具有一22cm的長度及一3mm的直徑。
使用可消毒接合器培養的細胞種類並沒有限制，例如，其可被用於培養微生物細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或植物細胞。易言之，本文所使用的術語「細胞培養」指培養微生物細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或植物細胞。
較佳地，培養的細胞為哺乳動物細胞。
再者，可消毒接合器不僅能用於任何種類的細胞培養，還能用於任何細胞培養目的(culture purpose)。一特別地較佳目的(如前所述)係細胞培養條件的優化，用以優化生物技術製程，例如產品產量、產品品質，或用以降低培養成本。
本文中的術語「生物技術」指使用微生物或細胞，諸如細菌、酵母、昆蟲、植物或哺乳動物細胞去實行特定的工業或製造製程。
一上連接部的較佳示範例係一上外部螺紋，因為螺紋助於將可消毒接合器與適合的蓋(例如接合器附接的適合的細胞培養容器的蓋)的快速和可靠的連接。
可消毒接合器亦可包含一蓋以替代上連接部。
較佳地，蓋包含一膜，其允許氣體細胞培養容器內部及環境(例如細胞恆溫箱)之間的氣體交換。
依據用於一給定環境的細胞培養容器，上連接部及/或蓋的直徑可變異。
本文所描述的可消毒接合器的一較佳實施例中，適於連接至一細胞培養容器的下連接部係螺紋，其適於螺接一螺紋，因為螺紋助於可消毒接合器與適合的細胞培養容器(具有一相對應的螺紋)之快速且可靠的連接。
依據選定用於一給定實驗的細胞培養容器，適於連接至一細胞培養容器的下內部連接部的直徑可變異。
因此，依據選定用於一給定實驗的細胞培養容器，可消毒接合器的直徑以及尺寸可變異，為了使可消毒接合器配合細胞培養容器且能適於給定的細胞培養容器的原蓋。
在一實施例中，可消毒接合器具有一88mm的高度、頂端的一42mm的直徑、一底端為50mm外直徑及一40mm的內直徑、四個埠，每個埠具有一46mm的長度、一2mm的內直徑及一具有一內直徑為10mm的通風通道。於此描述的特定的可消毒接合器之實施例係描繪於圖7。
可消毒接合器係可丟棄式(例如一次性使用)或可再使用。
再者，在一給定實驗期間，細胞培養條件係可以改變的，即數個細胞係首次在饋料批次條件下培養，接著在灌注條件下培養。
經由可消毒接合器加入及/或移除的使用的物質可以是固態、液態或氣態。較佳地，加入或移除的物質係液體或氣體。
參閱可消毒接合器的埠，通常，若一給定埠做為一給定實驗 的用於特定物質的入口，其不會做為另一物質的入口或出口。
然而，亦可給予超過一個功能給一給定埠，例如細胞培養介質可經由一特定的埠加入且待培養的細胞亦能經由此埠加入。達成此目的之一種方式係通過使用一連接至埠的消毒過的”Y”型管件，其中”Y”型管件的一臂係用於加入細胞培養介質且一臂係用於加入待培養的細胞。
若批次培養期間不使用全部的連接器，其可裝備有過濾器或被密封。
較佳地，可消毒接合器具有2至20個埠，更佳地有2至10個埠，甚至更佳地有4至8個埠。
在一較佳的可消毒接合器實施例中，埠係筆直的。
替代地，埠係彎曲的，例如「L」型。
在另一較佳的可消毒接合器實施例中，埠係垂直地(或傾斜)定位在接合器的本體中。
較佳地，該傾斜為一45°的角度。
在一較佳的實施例中，接合器的埠係筆直的。因此，埠內沒有無效空間(dead space)，因此，將風險(加入或移除維持在埠內的物質)最小化。筆直的埠能例如垂直地定位或在一45°的角度。
較佳地，可消毒接合器的埠具有一1.5至3.5mm的內直徑，較佳地為2.3mm。
在一較佳實施例中，可消毒接合器具有五個埠。這五個埠中，有四個埠在長度及直徑為同樣尺寸，同時第五個埠係組態以允許為收穫流(harvest stream)經由細胞保留裝置的出口(outlet)。
此實施例可與前述的實施例結合，其中可消毒接合器的本體包含一用於一位準感測器的插入件，例如經由一螺紋及一緊夾具連接。此 種結合導致如圖8所描繪的可消毒接合器。
再者，可消毒接合器的外部直徑可在埠離開可消毒接合器的本體之處更小(如圖4所示)。
若可消毒接合器具有超過一個的埠，這些埠可以彼此相同距離配置及/或相對於可消毒接合器的總高度相同位置。
本文所描述的可消毒接合器的另一較佳實施例，細胞保留裝置係連接至該至少一埠或細胞保留裝置係定位在接合器的通風通道。
依據參數，諸如培養的細胞種類、選定的細胞培養容器及選定的細胞培養體積，有利於細胞保留裝置定位於接合器的通風通道中。
在此種實施例中，細胞保留裝置係較佳地安裝至蓋，其在消毒(例如高壓蒸氣滅菌)之前與可消毒接合器使用。
在一實施例中，本文所述的可消毒接合器包含一細胞保留裝置且細胞保留裝置的內表面係經修改以為了進一步增強所選擇的表面材料的滑動特性(sliding properties)。若該表面及/或細胞保留裝置係例如以不銹鋼製成，該表面的修改可達成(例如經由電拋光(electropolishing)及/或鏡面拋光(mirror polishing))。若該表面及/或細胞保留裝置係例如以玻璃製成，玻璃表面可修改其疏水性(hydrophobic)及/或親水性(hydrophilic)的特性。修改表面的方法亦可用其他材料(例如熟知本發明技術領域人士中所習知的塑膠)。
不希望受到理論的束縛，似乎特別是在利用重力的細胞保留裝置(即重力細胞沉降器)的情況下，內表面的表面品質會影響細胞滑下細胞保留裝置的速率。易言之，較佳的表面滑動特性，利用重力的細胞保留裝置的細胞保留特徵較佳。
因此，在一另一較佳的實施例中，細胞保留裝置係一由不銹 鋼製成的重力細胞沉降器，具有一20cm至24cm的長度、一8mm至12mm的內直徑，相對於一水平線傾斜70°至75°的角度，且具有一電拋光內表面。
在一較佳實施例中，可消毒接合器另包含至少一部件，其選自下列所組成之群組：一管件、一過濾器、一軟管噴嘴(hose nozzle)、一螺紋連接器、一魯爾鎖連接器(luer lock connector)及一外部細胞分離。
較佳地，軟管噴嘴係一金屬軟管噴嘴，具有一約為5cm的長度。
在另一方面，本發明提供一裝置，其包含一如前所述的可消毒接合器及一細胞培養容器。再者，若接合器未包含一蓋，該裝置較佳地包含一蓋。
此種裝置的示範例係描繪於圖1及圖8。
在一較佳實施例中，裝置係適於用於一培養體積，其為1ml至170ml。
在一特別地較佳的實施例中，裝置係適於在灌注種類細胞培養條件(perfusion type cell culture conditions)下培養高細胞密度，且在一100ml至145ml的培養體積。
較佳地，整體的裝置或部分裝置係可消毒的。
較佳地，蓋係原屬於裝置的細胞培養容器的蓋。
較佳地，裝置另包含一部件，其選自下列所組成之群組：至少一pH感測器位置(pH sensor spot)、一習用的pH電極、一用於光學密度的感測器、一用於溶解氧的感測器、一導電感測器及/或一容量感測器。
在一又另一方面，本發明關於可消毒接合器的用途及/或本文前述的裝置，用以在批次、饋料批次、重複饋料批次及/或連續諸如灌注培養條件下培養細胞，其中在灌注培養條件的情況下，接合器包含至少2 個埠。
在灌注培養的情況下，至少二個埠中的其中一個能例如用以加入pH建立劑(pH set-up agents)以及細胞培養介質(饋料)，且至少二個埠中的另一個能被用以移除細胞培養介質(收穫)且樣本能從收穫流取出。
然而，在一該用途之較佳實施例中，該可消毒接合器包含至少四個埠，因其允許在灌注培養條件下的培養。
在另一該用途之較佳實施例中，該可消毒接合器包含五個埠，其中四個埠在長度及直徑上係相同尺寸，第五個埠係組態以允許為經由一細胞保留裝置的收穫流之出口，細胞保留裝置由不銹鋼製成，具有一23.5cm的長度、一10mm的內直徑以及一相對於一水平線傾斜74°的角度。
在另一該用途之較佳實施例中，該可消毒接合器包含五個埠，其中一個埠係組態以允許為經由一細胞保留裝置的收穫流之出口且一埠係用於主動的上部空間的通氣(active headspace aeration)，藉此允許用於灌注條件下高細胞密度的優化的細胞培養條件。
在另一該用途之較佳實施例中，該可消毒接合器包含一用於一位準感測器的插入件。
在另一該用途之較佳實施例中，細胞保留裝置係被定位在該細胞培養容器的液相中。
因此，在一該用途的示範例中，該可消毒接合器包含五個埠，其中一個埠係組態以允許為經由一細胞保留裝置的收穫流之出口，埠係用於主動的上部空間的通氣且細胞保留裝置被定位在該細胞培養容器的液相中。
在一該用途之較佳實施例中，該可消毒接合器及/或本文所描述的該裝置係在搖動條件(例如固定的軌道旋轉運動)之下用於一灌注細 胞培養。
在另一方面，本發明關於一種培養細胞的方法，在批次、饋料批次、重複饋料批次及/或連續(諸如灌注培養條件)條件下。
在一細胞培養方法的較佳實施例中，該方法進一步包含液位的偵測。
液位可例如經由使用一容量感測器偵測或經由監測物質的重量平衡(weight balance)，該物質係加入或從該細胞培養容器移除。
液位偵測助於在連續培養條件(如灌注培養條件)下的小規模細胞培養。此情況係，因為小培養體積總是有培養物耗盡或過度填充細胞培養介質的風險。其風險係經由監測細胞培養介質的位準而最小化。
再者，確保一固定的液位亦助於控制其他培養參數，諸如溶解氧濃度。
在一較佳的細胞培養方法之實施例，可消毒接合器包含至少二個埠且該細胞培養方法係一灌注細胞培養。
圖1圖示一可消毒接合器以及一包含此一可消毒接合器的裝置，即一細胞培養容器及一本文所述的蓋。具體而言，描繪一用於一細胞培養容器8的可消毒接合器1。在此示範例中的可消毒接合器包含一本體14、一上外部螺紋4四個埠(2a-d)、一通風通道3、一內部螺紋(適於螺接一螺紋6)及一細胞保留裝置5(其利用重力)。在此示範例中，可消毒接合器1係定位在一細胞培養容器8上且以該細胞保留裝置的原蓋7關閉。細胞保留裝置包含細胞培養介質9，其包含待培養的細胞11。再者，細胞培養容器包含一pH感測器位置及一溶解氧感測器位置10，其指示pH值及溶解氧張力的變化。
此可消毒接合器可被用為如下述的： 在此示範例中，細胞培養容器8係一預先消毒的250ml搖瓶，其包含一蓋，其允許經由一膜而通風。再者，可消毒接合器1已被高壓蒸氣滅菌。在此示範例中，埠(2a-d)的功能如後述：埠2a允許加入用以培養的細胞，埠2b允許加入細胞培養介質，埠2c允許收穫細胞培養介質且因此連接至細胞保留裝置5。最後，埠2d允許在細胞培養週期之期間拿走樣本。再者，在此示範例中，每一埠具有一金屬軟管噴嘴。依據給定需要，消毒管件及/或過濾器係加入至埠在培養容器內或在培養容器外，為了確保細胞培養容器內的消毒培養環境。
在建立細胞培養之前，蓋7在消毒條件下從搖動器瓶(shaker flask)移除。接著，可消毒接合器1係經由內部螺紋(適於螺接螺紋6)螺接至細胞培養容器上且蓋7螺接至可消毒接合器1上。之後，整個裝置被搬移至細胞培養室(cell cultivation chamber)(此為一恆溫箱)，其中在灌注培養模式中的適合條件下培養細胞。
在下個步驟中，100ml的細胞培養介質9經由埠2b加入且經由埠2a將待培養的細胞11加入細胞培養容器8。
最後，開始灌注細胞培養物，其中培養介質係連續地經由埠2b加入且經由埠2c吸出，同時細胞保留裝置保留待培養的細胞在介質中。
在此示範例中，經由監測物質的重量平衡去偵測細胞培養介質的位準，物質係加入或從細胞培養容器移除。
總體而言，使用本文所述的接合器因此使細胞培養為以100ml培養體積在小規模細胞培養中灌注培養。
圖2圖示一可消毒接合器及一包含此可消毒接合器的裝置，即一細胞培養容器以及本文所述的蓋。具體而言，描述一用於一細胞培養容器8的可消毒接合器1。在此示範例中的可消毒接合器包含一本體、一上 外部螺紋4四個埠(2a-d)、一通風通道3(藉由虛線的箭頭表示氣體交換)、一內部螺紋(適於螺接螺紋6)、一細胞保留裝置5(在此為一重力細胞沉降器)、一位準感測器12(在此示範例中為一傳導電極(conductivity electrode))以及一蓋7。在此示範例中，可消毒接合器1係定位在一細胞培養容器8上。細胞培養容器包含細胞培養介質9，其包含將待培養的細胞11。再者，細胞培養容器包含pH感測器位置10，其指示pH值的一變化。
在建立細胞培養之前，具有位準感測器12的蓋7係在消毒條件下從搖瓶移除。接著，可消毒接合器1係經由內部螺紋(適於螺接螺紋6)螺接至細胞培養容器上且蓋7螺接至可消毒接合器1上。之後，整個裝置被搬移至細胞培養室(此為一恆溫箱)，其中在灌注培養模式中的適合條件下培養細胞。
在下個步驟中，100ml的細胞培養介質9經由埠2b加入且經由埠2a將待培養的細胞11加入細胞培養容器8。
最後，開始灌注細胞培養物，其中培養介質係連續地經由埠2b加入且經由埠2c吸出，同時細胞保留裝置保留待培養的細胞在介質中。在此示範例中，細胞培養容器8係一搖瓶且這些細胞在一固定的軌道旋轉運動中以120rpm(以半圓形箭頭指示)培養。
在培養期間，細胞培養介質的位準係經由位準感測器12監測且若需要，條件係可調整，例如經由加入更多的培養介質或移除較少的培養介質以確保細胞培養介質的位準係固定在一狹窄範圍(narrow range)內。
總體而言，使用本文所述的接合器因此使細胞培養為以100ml培養體積在小規模細胞培養中灌注培養。
圖3顯示一示意裝置，包含一可消毒接合器以及一如上之細 胞培養容器。
具體而言，描述一用於一細胞培養容器8的可消毒接合器。再者，亦顯示四個埠(2a-d)、通風通道3以及接合器的本體14。此外，在此示範例的一可消毒接合器中，四個埠係以彼此相同距離配置。
圖4顯示一示意裝置的側視圖，包含一可消毒接合器以及一細胞培養容器。
具體而言，描述一用於一細胞培養容器8的可消毒接合器。在此圖中，僅顯示三個埠(2a-c)，因為第四個埠係位於視軸(visual axis)上，由於在此可消毒接合器的示範例中，四個埠係以彼此相同距離配置。此外，這四個埠相對於可消毒接合器的總高度亦係配置在同樣位置。在此示範例中，這些埠在細胞培養容器8的頂端終止且不延伸進入細胞培養容器8(如圖2描述的示範例裝置)。再者，亦描述通風通道3、本體13及細胞培養介質9，其包含待培養的數個細胞。
圖5顯示一示範例裝置的另一視圖，包含一可消毒接合器以及一細胞培養容器。所描述的是一用於一細胞培養容器8的可消毒接合器1，包含一本體13以及一用於可消毒接合器的蓋7，在此示範例中係細胞培養容器的原蓋。在此視圖中，描述三個埠2a、2b及2d。
圖6顯示一示範例的細胞保留裝置，即一過濾本體(filtration body)。其由兩個部分(在其之間放置過濾材料)組成。為了穩定過濾材料，亦放置一穩定盤(stabilization disk)至過濾本體。所使用的過濾材料係一20μm的預過濾器以及一10μm的過濾材料，即一超微過濾器(super micron filter)。
圖7顯示一示範例的可消毒接合器，包含一上連接部、一螺紋以及可見到四個埠中的兩個埠。
圖8顯示另一示範例裝置，包含一可消毒接合器以及一細胞培養容器。
具體而言，描述一用於一細胞培養容器8的可消毒接合器1。在此示範例中的可消毒接合器包含一本體14、一上外部螺紋、五個埠(2a-e)、一通風通道3、一內部螺紋(適於螺接螺紋6)、一位準感測器12(在此示範例中為一傳導電極)以及一細胞保留裝置(在此為一重力細胞沉降器5，相對於一水平線傾斜74°，角度α)。在此示範例中，可消毒接合器係定位在一細胞培養容器8(在此為一搖瓶)上且係經由一上外部螺紋4被細胞培養容器的原蓋7關閉。細胞培養容器包含細胞培養介質9，其包含待培養的細胞11。再者，細胞培養容器包含一pH感測器位置及一溶解氧感測器位置10，其指示pH值及溶解氧張力的變化。
在此示範例中，給予第一個四個埠(2a-d)(相關於長度以及直徑為相同的尺寸)的功能為：
1)取樣以及注射(inoculation)
2)饋料添加(feed addition)
3)鹼添加(base addition)
4)主動的上部空間的通氣
一另一埠2e係組態以允許為收穫流經由細胞保留裝置5之出口。
再者，在此示範例中，可消毒接合器的本體14包含一用於一位準感測器12的插入件，經由一螺紋以及一緊夾具連接。
由於在此示範例中的可消毒接合器包含一具有膜的蓋7，膜允許細胞培養容器的內部以及環境之間的氣體交換，出口氣體(outlet gas)經由膜釋放以維持培養瓶內包含的培養環境。
此外，所供應的氣體係以一0.2μm過濾器來過濾。
圖9顯示以聚丙烯腈微粒(PAN-X)為一實驗的結果。
類似於術語Kwash(用以指示在收穫中失掉的活細胞的百分比)，微粒洩漏「%」係用以指示有關於在反應器系統中的微粒量之在收穫線(harvest line)中的微粒量。因為微粒洩漏的值不能直接與Kwash值相比較，故使用一不同的術語。具體而言，在圖8所顯示的灌注生物反應器系統中以內直徑為4mm、6mm及10mm的細胞保留裝置(傾斜74°)，聚丙烯腈微粒洩漏「%」確定為41.6mL/h以及20.8mL/h的灌注率。
圖10A及10B顯示一細胞保留裝置的一設備，其形式為一重力細胞沉降器。
以下數個示範例為：
示範例1：初始實驗
包含可消毒接合器的圖4的裝置係在灌注培養條件下測試。具體而言，使用的可消毒接合器具有為上連接部的一上外部螺紋(細胞培養容器的原蓋係螺接於其上)以及為下內部連接部的一螺紋(接合器經由其而螺接至細胞培養容器上)。此外，可消毒接合器具有4筆直的、垂直地定位的埠、一通風通道、一位準感測器以及一細胞保留裝置(在此為細胞重力沉降器)，在此例中為一彈性管件。細胞保留裝置係連接至數個埠中之一個。再者，數個埠係適當地配合數個部件，諸如管件、過濾器、軟管噴嘴、螺紋連接器以及魯爾鎖連接器。
在使用之前，可消毒接合器係經由蒸氣消毒(steam sterilization)來消毒。之後，細胞保留裝置係螺接至細胞培養裝置上以及其他的部件係在一消毒工作台(workbench)(無塵工作台(cleanbench))。
在所述的可消毒接合器示範例中，表示為幼倉鼠腎細胞 (baby hamster kidney(BHK)cells)的人類重組凝血因子VIII(rFVIII)係培養數個星期。培養條件係設定在一36.5℃的恆溫箱溫度，以及一100rpm的恆溫箱搖動平台的搖動頻率，在一段時間後調整為120rpm以增加氧氣轉移。再者，恆溫箱的CO2位準係設定在4.5%，恆溫箱的溼度位準係設定在80%且液位(即細胞培養容器的填充位準)係設定在150ml。再者，起始的pH係設定在7.0，在一段時間後係調整至pH 6.8。
培養係在一恆溫箱實行，包含一搖動平台，用於細胞培養容器，使用一DASGIP®酵原(DASGIP®-fermenter)控制，其包含DASGIP®控制軟體(DASGIP®,EppendorfAG,Hamburg,Germany)。
結果顯示，經由使用本文描述的可消毒接合器，在灌注培養條件下的細胞培養係可以為小規模的且代謝產物(metabolite)的數據(數據未顯示)係可相當於酵原產生的數據。
示範例2：評估不同的細胞保留裝置
在不同的實驗中，測試了表1中所示的長度和形式不同的作為細胞保留裝置之各種管件。
Figure 106125207-A0305-02-0031-4
在此示範例中，rFVIII表示數個BHK細胞培養了數天。在 500ml的搖瓶中以一工作體積(working volume)為150ml執行細胞培養。培養條件係設定在一36.5℃的恆溫箱溫度以及恆溫箱的一搖動頻率為80至100rpm。再者，恆溫箱的二氧化碳位準係設定在4.5%以及恆溫箱的溼度位準係設定在80%。再者，pH設定值係在6.8且溶解氧濃度
Figure 106125207-A0305-02-0032-5
10%。
結果顯示，在此設定(具有一內直徑為4.86mm且長度為300mm的筆直的且傾斜70°之不銹鋼管件)中，能在細胞保留方面得到特別好的結果。
示範例3：進一步估量不同的細胞保留裝置(特別對於高細胞密度)
為了進一步估量利用重力的細胞保留裝置之何種幾何形狀會特別適於獲得且維持高密度細胞培養物，使用一聚丙烯腈微粒(PAN-X)系統。在系統係用於估量細胞保留裝置(數據未顯示)的性能之前，確定這種PAN-X微粒系統的物理參數。
對於細胞保留裝置的洩漏值而調查其數個幾何形狀。高洩漏值指示多個PAN-X微粒係被沖洗掉(washed out)。
令人驚訝地發現，具有一10mm內直徑的傾斜的細胞保留裝置在搖動培養條件之下到達5%(如圖9所示)以下的洩漏值。這發現是出人意料的(不希望被理論束縛)，因為預計的是，搖瓶的固定的軌道旋轉運動會干涉沉澱且因此不可能到達小的洩漏值。
示範例4：在灌注細胞培養期間估量不同的細胞保留裝置(以重力細胞沉降器的形式)
為評估本文所述的可消毒接合器之功能性、消毒及實用性，執行對三種不同幾何形狀的細胞保留裝置之一培養運行。每一細胞保留裝置幾何形狀係重複測試以評估系統的下列特徵：
‧細胞保留裝置的細胞保留性能
‧用於長效消毒操作的培養系統的適合性
‧具有細胞保留裝置的反應器的氧氣轉移能力(oxygen transfer capability)
‧具有一導電探針為位準感測器的位準控制系統的準確性
‧使用光學感測器點的pH控制系統的功能性
因此，建構六個可消毒接合器。每一者裝備5個埠，其被分配下列功能：
1.取樣以及注射
2.饋料添加
3.鹼添加
4.通氣
5.細胞保留/收穫
在此示範例中，用於細胞保留裝置的埠包含一孔(bore)，孔包含一用於插入細胞保留裝置的插入件(在此為一螺紋)。在插入後(即螺旋進入)，細胞保留裝置係以兩個螺釘固定，一用以繞著細胞保留裝置的外直徑固定，一用以往下固定細胞保留裝置。埠具有一15mm的外直徑，而細胞保留裝置具有一12mm的外直徑。
再者，在此示範例中，可消毒接合器的本體包含一用於位準感測器(在此為一用於位準感測器的經整合的導電探針)的插入件，其經由一螺紋以及一緊夾具連接。細胞保留裝置係用為與導電感測器結合的第二電極以允許填充位準的一控制。
出口氣體係經由可消毒接合器的蓋上的一膜而釋放以維持培養瓶內包含的一培養環境。
三個不銹鋼細胞保留裝置具有一23.5cm的長度以及一相對於一水平線為74°角度傾斜，在重複測試時有其不同的內直徑。
包括相應的細胞保留裝置以及用於細胞培養介質進出的部件以及水平控制、pH控制、鹼添加以及氧氣轉移的搖瓶以及可消毒接合器的完整組件在下文中被指做為單元(unit)。
單元(unit)的通氣(經由可消毒接合器的膜藉由被動氣體交換而初始實現)在7天的培養時間後被切換到主動的上部空間的通氣。細胞保留裝置以及細胞培養容器的所欲培養體積結合為140ml。僅藉由調整入口氣體中的二氧化碳濃度來控制pH值。
在整個23天的培養週期期間沒有產生污染物(contamination)。
細胞保留性能係經由活細胞密度(viable cell density；以下簡稱VCD)以及Kwash值(在培養期間確定)評估(數據未顯示)。
培養的較後階段的VCD係一細胞保留性能的良好指標。在此期間，由於搖瓶中的高細胞密度，細胞保留裝置中的細胞負荷(cell load)到達最大值。若在灌注期間，細胞保留性能係不充分的，細胞被沖洗出培養容器外且細胞密度下降(decline)。對於具有一內直徑為4及6mm的細胞保留裝置，這種效應是清晰可見的。在這些單元(unit)中的VCD，第一次增加至一個一定的細胞密度位準且接著再減少。這些單元(unit)都不能到達20 x 106cells/ml的臨界細胞密度(critical cell density)。相反地，裝備有具有一內直徑為10mm的細胞保留裝置的兩個單元(unit)，20 x 106cells/ml的臨界VCD係被超過以及維持固定在約25 x 106cells/ml超過10天的一個期間。因此，經由使用具有一內直徑為10mm的細胞保留裝置係能夠獲得以及維持相當於在產生生物反應器(production bioreactors)中達到的細胞密度。
易言之，PAN-X實驗的非預期的結果能被證實且甚至超過在細胞培養條件下的預期，因為這是首次，在灌注培養條件期間(即真實連續操作期間；truly continuous operation)，一小規模灌注系統顯示其到達高細胞密度。
因此，令人驚訝的是，本文描述的可消毒接合器包含一相當簡易的細胞保留裝置，係適於在灌注培養條件下、在固定的軌道旋轉運動期間用以保留細胞，且甚至允許在這些條件下獲得以及維持高細胞密度。
再者，細胞保留裝置的一精確的定位似能有優化細胞培養方法的效應。不希望受到理論的束縛，此發現被認為是由於細胞保留裝置在培養容器的液相中的一定位最小化或防止氣泡進入細胞保留裝置，否則這可能干涉細胞沉降。
為了精確地將細胞保留裝置定位在培養容器中，裝置係以一4mm的間隙(gap)安裝至搖瓶底部的內環(如圖10A所示)。定位係以一測量棒(measuring rod)實行(如圖10B所示)。細胞保留裝置係藉由緊固夾具的螺紋而最後固定。
示範例5：估量小規模培養物在習用生物反應器的相似性
前述細胞培養實驗的結果係用以指示細胞培養接合器的優化設計以獲得以及維持高細胞密度。第二組的細胞培養實驗係以八個一樣的細胞保留裝置(重力細胞沉降器)執行且聚焦在估量八個一樣的培養悟之間的相似性以及在習用生物反應器中的大規模細胞培養物之細胞培養性能的相似性。
在第二培養運行期間，僅使用主動的上部空間的通氣以用於搖瓶的通氣。相較於第一次培養，僅使用有一內直徑為10mm的細胞保留裝置。
為了降低填充體積的變化，位準感測器的閥值係優化至100μS以及200μS。以這些設定，最大填充體積以及最小填充體積的差別僅有7%。另外，除了習用的O型環之外，位準感測器的安裝係以一第二O型環來穩定。這導致一改良的平均填充體積(104ml)的準確性。以這些導電閥值以及穩定的位準感測器的安裝，填充體積以及絕對填充體積(absolute filling volume)的偏差係被優化。
總體而言，結果顯示所有的培養單元(unit)係能到達活細胞密度超過20 x106cells/ml，且顯示通常在這些實驗中產生的小規模培養物屬性與習知生物反應器中的相當。
易言之，包含本文所述的可消毒接合器的裝置，在製程控制、饋料、取樣及監測下，允許裝備齊全的生物反應器的功能更快、更有效率的且降低成本的製程發展。
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1:可消毒接合器
2a:埠
2b:埠
2c:埠
2d:埠
3:通風通道
4:上外部螺紋
5:細胞保留裝置/重力細胞沉降器
6:螺紋
7:蓋
8:細胞培養容器/搖瓶
9:細胞培養介質
10:pH感測器位置/溶解氧感測器位置
11:細胞
14:本體

Claims (13)

  1. 一種細胞培養容器的可消毒接合器，其包含一本體、一上連接部及/或一蓋、至少一埠、一通風通道、一下內部連接部(適於連接至一細胞培養容器)及至少一細胞保留裝置，以及其中該細胞培養容器係一搖瓶(shake flask)且該可消毒接合器係一用於一小規模細胞培養的可消毒接合器，具有一培養體積1ml到500ml，以及其中該至少一細胞保留裝置係一重力細胞沉降器(gravity cell settler)，以及係相對於一水平線以一10°及90°之間的角度傾斜。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之細胞培養容器的可消毒接合器，進一步包含至少一位準感測器(level sensor)。
  3. 如申請專利範圍第1至2項中任一項所述之細胞培養容器的可消毒接合器，其中該上連接部係一上外部螺紋(upper external screw thread)及/或該下內部連接部(適於連接至一細胞培養容器)係一適於螺接一螺紋的螺紋。
  4. 如申請專利範圍第1至2項中任一項所述之細胞培養容器的可消毒接合器，其中該至少一細胞保留裝置係連接至至少一埠。
  5. 如申請專利範圍第2項所述之細胞培養容器的可消毒接合器，其中該至少一細胞保留裝置係定位在該培養容器的一液相(liquid phase)中。
  6. 一種可消毒裝置，包含一如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之可消毒接合器、一細胞培養容器及一蓋。
  7. 一種如申請專利範圍第6項所述之裝置的用途，用於在灌注培養條件(perfusion culture conditions)下的細胞培養，其中該接合器包含至少二個埠。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該可消毒接合器包含五個埠，其中四個埠在長度及直徑上係相同尺寸，另一埠係組態以允許為經由至少一細胞保留裝置的收穫流(harvest stream)之出口，該細胞保留裝置為不銹鋼所製成，具有一23.5cm的長度、一10mm的內直徑以及一相對於一水平線為傾斜74°的角度。
  9. 如申請專利範圍第7至8項中任一項所述之用途，其中該可消毒接合器的本體包含一用於一位準感測器的插入件(insertion)。
  10. 如申請專利範圍第7至8項中任一項所述之用途，其中該細胞保留裝置係定位在該細胞培養容器的液相中。
  11. 如申請專利範圍第7至8項中任一項所述之用途，其中該灌注細胞培養係在搖動條件下實行。
  12. 一種用於在搖動條件下細胞培養的方法，使用一如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之可消毒接合器及/或一如申請專利範圍第6項所述之可消毒裝置，其中該細胞培養係一小規模灌注細胞培養。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該細胞培養係一高細胞密度的細胞培養。
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