ES2937713T3 - Adaptador para recipiente de cultivo celular - Google Patents

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Helmut Brod
Martin Poggel
Bernd Tscheschke
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Abstract

En el presente documento se describe un adaptador esterilizable para un recipiente de cultivo celular que comprende un cuerpo, una conexión superior y/o una tapa, al menos un puerto, un paso de ventilación, una conexión interna inferior adecuada para la conexión a un recipiente de cultivo celular y un dispositivo de retención celular. y/o un dispositivo de separación de células así como un dispositivo que comprende dicho adaptador esterilizable y un método para el cultivo de células usando dicho adaptador esterilizable. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Adaptador para recipiente de cultivo celular
Lo que se describe en el presente documento se refiere a un adaptador esterilizable para un recipiente de cultivo celular que comprende al menos un puerto que funciona como entrada y/o como salida de sustancias líquidas o gaseosas preferentemente que permite el cultivo de microorganismos y cultivos celulares en un recipiente de cultivo celular bajo condiciones de cultivo controlado mediante el uso de lote, lote alimentado o lote alimentado repetido y/o condiciones de cultivo continuo, por ejemplo condiciones de cultivo por perfusión.
En el cultivo de microorganismos y cultivos celulares, en particular de células de animales, plantas y humanos, se usan diversos tipos de biorreactores.
En los procesos biotecnológicos comerciales el cultivo celular normalmente se realiza en biorreactores grandes, totalmente equipados bajo condiciones controladas en términos de pH, concentración de oxígeno disuelto, nivel de líquido, temperatura y análisis de gases de escape. Los biorreactores totalmente equipados ofrecen puertos para la alimentación de soluciones nutritivas, adición de ácido y base para el control de pH o antiespumantes, así como también puertos para muestras o remoción continua de suspensión celular o caldo de fermentación. Las condiciones controladas en términos de pH, la temperatura y el suministro de oxígeno aseguran comparabilidad y reproducibilidad entre diferentes ensayos de cultivo celular, lo cual es importante para una calidad de producto consistente y confiable. Según el tipo de célula y el proceso que se va desarrollar y optimizar, se requerirán condiciones de cultivo por lote, lote alimentado, lote alimentado repetido, perfusión y/o condiciones de cultivo continuo, por ejemplo condiciones de cultivo por perfusión.
Para mejorar la calidad del producto y la eficiencia productiva, durante el desarrollo y optimización de dichos procesos biotecnológicos se necesitarán cambiar y adaptar una pluralidad de parámetros, tales como líneas celulares, medios y alimentos.
Cuando se cambian y adaptan los parámetros individuales para optimizar las condiciones de cultivo celular también se necesita una gran cantidad de biorreactores o los parámetros individuales solo se podrán analizar uno tras otro, que tendrá por resultado un tiempo de desarrollo de proceso ineficaz muy largo. Además, en ambos escenarios cada parámetro a evaluar requiere la configuración de un biorreactor de cultivo celular completo, totalmente equipado que tendrá por resultado costes extremadamente altos, en especial en el caso de condiciones de cultivo continuo.
El documento US 2015/218501 A1 describe un reactor para el cultivo de células que puede comprender un separador de células en el tanque del reactor.
El documento WO 2012/076442 A1 divulga un adaptador esterilizable para un recipiente de cultivo celular en matraz de agitación que comprende al menos un conector adecuado para atornillar en un recipiente de cultivo celular en matraz de agitación.
Por lo tanto, se necesita un sistema simplificado que permita un desarrollo de proceso de costes reducidos, más eficaz y más rápido con la perfecta funcionalidad de un biorreactor totalmente equipado en términos de control de proceso, alimentación, muestra y monitoreo.
Sorprendentemente se descubrió que este objetivo se puede lograr si se proporciona un adaptador esterilizable para un recipiente de cultivo celular, según se reivindica.
Por lo tanto en un primer aspecto del presente documento se proporciona un adaptador esterilizable para un recipiente de cultivo celular que comprende un cuerpo, una conexión superior y/o una tapa, al menos un puerto, un pasaje de ventilación, una conexión interna inferior apta para conectarse a un recipiente de cultivo celular y a un dispositivo de retención celular y/o a un dispositivo de separación celular.
En un segundo aspecto se proporciona un dispositivo que comprende un adaptador esterilizable según se describe anteriormente, un recipiente de cultivo celular y una tapa.
En otro aspecto en el presente documento se proporciona el uso del dispositivo descrito anteriormente.
Incluso en otro aspecto en el presente documento se proporciona un procedimiento de cultivo celular mediante el uso de un adaptador esterilizable y/o un dispositivo, según se describe anteriormente.
El experto comprenderá que los dibujos que se describen a continuación son solo para fines ilustrativos. Los dibujos no están destinados a limitar el alcance de la presente invención.
La fig. 1 muestra una perspectiva esquemática de un dispositivo que comprende un adaptador esterilizable y un dispositivo de retención celular.
La fig. 2 muestra una perspectiva esquemática de un adaptador esterilizable que comprende un sensor de nivel.
La fig. 3 muestra un adaptador esterilizable ejemplar desde arriba.
La fig. 4 muestra una vista lateral del dispositivo ejemplar de la fig. 3 que comprende un adaptador esterilizable y un recipiente de cultivo celular.
La fig. 5 muestra otra vista de un dispositivo ejemplar que comprende un adaptador esterilizable y un recipiente de cultivo celular.
La fig. 6 muestra una foto de un dispositivo de retención celular ejemplar, es decir una membrana de filtración.
La fig. 7 muestra una foto de un adaptador esterilizable ejemplar.
La fig. 8 muestra otro dispositivo ejemplar que comprende un modo de realización alternativo del adaptador esterilizable comparado con la fig. 4 y un recipiente de cultivo celular.
La fig. 9 muestra una perspectiva sobre los valores de fuga de partículas de poliacrilonitrilo (PAN-X) para tasas de perfusión de 20,8 ml/h y 41,6 ml/h determinadas para dispositivos de retención celular con diámetros internos de 4 mm, 6 mm y 10 mm.
La fig. 10A y B muestra una foto de una nstalación ejemplar del dispositivo de retención celular.
Se deja establecido que la terminología empleada en el presente documento solo tiene por objeto describir modos de realización particulares y no pretende ser restrictiva. Según se usa en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas las palabras “un” y “uno, una” denotan “uno, una o más”.
En el presente documento se describe un adaptador esterilizable para un recipiente de cultivo celular que comprende un cuerpo, una conexión superior y/o una tapa, al menos un puerto, un pasaje de ventilación, una conexión interna inferior apta para conectarse a un recipiente de cultivo celular y a un dispositivo de retención celular y/o a un dispositivo de separación celular.
El uso de este adaptador esterilizable en combinación con un matraz estándar para cultivo celular permite el cultivo celular bajo condiciones de cultivo continuo, por ejemplo condiciones de cultivo por perfusión. Además, el cultivo por lote, lote alimentado y lote alimentado repetido se puede realizar mediante el uso del adaptador esterilizable. En otras palabras, al emplear el adaptador esterilizable es posible realizar cultivo celular bajo condiciones reproducibles y comparables mediante el uso de recipientes estándar de cultivo celular, que se obtienen más fácilmente, son más fáciles de manejar y más económicos que los biorreactores totalmente equipados.
Gracias a la pequeña escala se reducen los costes de desarrollo y optimización de procesos biotecnológicos dado que se necesitan menos medios de cultivo y materiales y se reducen los requisitos en términos de equipo y tiempo invertido en el mantenimiento del cultivo.
Además, el dispositivo de retención celular y/o el dispositivo de separación celular hacen que el adaptador esterilizable descrito en este documento sea adecuado para el cultivo celular a pequeña escala. Gracias al dispositivo de retención celular que retiene las células que se cultivarán dentro del recipiente de cultivo celular, el cultivo celular por perfusión continua es factible incluso en una pequeña escala. Se aplica el mismo argumento si se usa un dispositivo de separación celular optimizado para pequeños volúmenes de cultivo. Por lo tanto, al emplear el adaptador esterilizable que se describe en el presente documento es posible realizar cultivo celular bajo condiciones reproducibles y comparables que permiten un desarrollo de proceso a costes reducidos, más eficaz y rápido posiblemente con la funcionalidad de un biorreactor totalmente equipado en términos de control de proceso, alimentación, muestra y monitoreo.
Según se usa en el presente documento, el término “lote” se refiere a una condición de cultivo, en la cual ningún medio de cultivo se agrega al cultivo celular y la remoción continua del medio de cultivo celular no ocurre durante el cultivo. En otras palabras, incluso bajo condiciones de cultivo por lote el medio de cultivo celular se puede remover en diferentes etapas durante el cultivo, por ejemplo durante el muestreo.
Según se usa en el presente documento, el término “ lote alimentado” se refiere a una condición de cultivo, en la cual el medio de cultivo celular se agrega al cultivo celular durante el cultivo, pero la remoción continua del medio del cultivo celular no ocurre durante el cultivo.
Según se usa en el presente documento, el término “lote alimentado repetido” se refiere a una condición de cultivo por lote alimentado, en la cual el medio de cultivo celular se remueve periódicamente en parte y posteriormente se agrega solución nutritiva.
Por ejemplo, la solución nutritiva puede ser una solución que contiene glucosa y dicha solución nutritiva se agrega hasta alcanzar nuevamente el nivel original del medio de cultivo celular.
Si el dispositivo de retención celular y/o el dispositivo de separación celular del adaptador esterilizable no se necesita durante el cultivo celular por lote, lote alimentado o lote alimentado repetido, este simplemente se podría cerrar o remover del adaptador esterilizable, ello dependerá del tipo de adaptador esterilizable empleado.
Según se usa en el presente documento, el término “continuo” se refiere a una condición de cultivo, en la cual una solución como el medio de cultivo se agrega al cultivo celular y se aspira del cultivo celular continuamente durante el cultivo.
Según se usa en el presente documento, el término “perfusión” se refiere a un tipo cultivo celular continuo, en el cual el medio de cultivo celular se agrega al cultivo celular y se remueve del cultivo celular continuamente durante el cultivo. Para mantener los niveles de densidad celular, al menos parte de las células cultivadas necesitan estar retenidas en el recipiente de cultivo celular o estar separadas del medio removido bajo condiciones de cultivo celular por perfusión. En caso de una separación fuera del recipiente de cultivo celular, las células serán devueltas al recipiente de cultivo celular una vez que hayan sido separadas de la solución aspirada. Además, bajo las condiciones de cultivo por perfusión generalmente se descarta una parte de las células cultivadas, es decir no se retienen en el recipiente de cultivo ni se devuelven al mismo, ello se hace para mantener un determinado objeto de densidad celular y remover las células no viables (“purga”).
Según se usa en el presente documento, el término “esterilizable” se refiere al hecho de que el material en cuestión puede ser abacteriano mediante un procedimiento conocido como por ejemplo la esterilización en autoclave, irradiación gamma o inactivación química.
El cuerpo del adaptador esterilizable comprende al menos un material seleccionado del grupo que consiste de materiales de acero inoxidable, sintéticos o semisintéticos como por ejemplo el poliéter éter cetona (PEEK), politetrafluoroetileno (PTFE), polifluoruro de vinilideno (PVDF) o elastómeros de silicona.
En un modo de realización preferido el cuerpo del adaptador esterilizable está hecho de poliéter éter cetona (PEEK).
Según se usa en el presente documento, el término “conexión superior” se refiere a la parte del dispositivo apta para adherirse a una tapa, por ejemplo a la tapa original del recipiente elegido para el cultivo celular.
Según se usa en el presente documento, el término “conexión interna inferior apta para conectarse a un recipiente de cultivo celular” se refiere a la parte del dispositivo apta para adherirse al recipiente de cultivo celular.
Por ejemplo, esta adhesión podría ser mediante inserción, adhesión o a rosca.
Según se usa en el presente documento, el término “pasaje de ventilación” se refiere a un componente que permite el intercambio de gas entre la fase gaseosa dentro del recipiente de cultivo y la conexión superior o la tapa del adaptador esterilizable y por último la atmósfera circundante, por ejemplo una incubadora o una sala de cultivo con temperatura controlada.
Según se usa en el presente documento, el término “puerto” o “conector” se refiere a una apertura mediante la cual se pueden agregar o remover sustancias desde el interior del recipiente de cultivo celular.
Por lo tanto, los puertos funcionan como entradas y/o salidas y sus formas, posiciones exactas, números y tamaños pueden variar según las exigencias del experimento.
Según se usa en el presente documento, el término “dispositivo de separación celular” se refiere a un componente, el cual separa las células del medio afuera del recipiente de cultivo celular. Por lo tanto, cuando se usa un dispositivo de separación celular al menos una parte de las células generalmente se devuelve al recipiente de cultivo celular luego de la separación a fin de mantener los niveles de densidad celular.
Según se usa en el presente documento, el término “dispositivo de retención celular” se refiere a un componente, el cual retiene las células mientras que permite la remoción de otras sustancias tales como el medio de cultivo celular del recipiente de cultivo celular.
En otras palabras, el dispositivo de retención celular retiene las células en el medio de cultivo presente en el recipiente de cultivo o retiene las células después de haber sido aspiradas junto con el medio de cultivo. No obstante, también en el segundo caso las células no dejan el recipiente de cultivo. En cambio, la retención celular, es decir la remoción celular del medio, se lleva a cabo dentro del recipiente de cultivo.
El uso de un dispositivo de retención celular se puede combinar con el uso de un dispositivo de separación celular.
Además, es posible emplear más de un dispositivo de retención y/o separación celular.
Ejemplos de un dispositivo de retención celular son los tubos que, por ejemplo, están hechos de materiales sintéticos, elastoméricos o metálicos. Ejemplos de un dispositivo de retención celular en forma de tubo hecho de material sintético son los tubos de plástico o los tubos de caucho de siliconas. Un ejemplo de un dispositivo de retención celular en forma de una membrana de retención celular es una membrana de retención celular hecha de por ejemplo hidrófila polietersulfona o polipropileno con un tamaño de poro entre 0,1 pm y 10 pm o una membrana de diafiltración pulsada.
En un modo de realización el dispositivo de retención celular en forma de un tubo de metal está hecho de acero inoxidable.
El uso de un tipo de dispositivo de retención celular se puede combinar con el uso de uno o más dispositivos de retención celular del mismo tipo o distinto.
El empleo de una membrana de diafiltración pulsada para la retención celular es conocido en la técnica (cf. Meier et al. 2014). En el caso de un matraz de agitación la membrana de dicho dispositivo se movería en el medio de cultivo celular durante la rotación.
Preferentemente, el dispositivo de retención celular retiene más del 80%, incluso más preferentemente más del 90% y mucho más preferentemente el 100% de las células que entran en contacto con el dispositivo de retención celular.
La tasa de retención celular se calcula al determinar la tasa de perfusión. La tasa de perfusión describe la cantidad de caldo de cultivo recolectado comparado con el volumen total de cultivo en el fermentador. Las unidades de la tasa de perfusión son volúmenes/día. La tasa de flujo de recolección se expresa en ml/min y el volumen en L (1.44 convierte ml/min a L/día).
En unidades de volúmenes/día:
1.44 F, H
T p e r f u s ió n V
Kwash
El valor Kwash describe el porcentaje de células viables perdidas en la recolección en unidades de %:
nH
Kwash = 100 —
n F
La concentración de célula viable en el flujo de recolección y en el biorreactor se especifica con nH y nH and nF, respectivamente. nH and nF, respectivamente. Kwash total describe el porcentaje de todas las células perdidas en la recolección.
En unidades de %:
Figure imgf000005_0001
La concentración total de célula en el flujo de recolección y en el biorreactor se especifica con nHtotal y nHtotal and n F , to t a l, respectivamente. Para determinar la cantidad de células en una muestra, estas se pueden contar con un contador de células comercialmente disponible como por ejemplo el “Analizador Cedex HiRes”, Roche Innovatis, Alemania.
El valor Kwash es preferentemente entre 20 % - 0,1 %, más preferentemente entre 10 % - 0,1 %, y mucho más preferentemente entre 2% - 0,1 %.
Según las células cultivadas y el recipiente de cultivo celular usado, la geometría del dispositivo de retención celular puede variar, por ejemplo el dispositivo de retención celular puede ser circular o rectangular.
Por consiguiente, según las células cultivadas y el recipiente de cultivo celular usado, puede variar el diámetro interno, la longitud, la forma y la figura del dispositivo de retención celular.
Las formas ejemplares de los dispositivos de retención celular, en especial las formas de los tubos elastoméricos, plásticos o metálicos que funcionan como dispositivos de retención celular, son rectas y/o curvas e inclinadas con un ángulo entre 10° y 90°, más preferentemente con un ángulo entre 60° y 80° y mucho más preferentemente con un ángulo de 70° - 75° con respecto a una línea horizontal.
En un modo de realización preferido el tubo que funciona como dispositivo de retención celular es recto e inclinado con un ángulo de inclinación entre 40° y 80°.
Por lo tanto, estos dispositivos de retención celular se benefician con la gravedad, es decir son fijadores de gravedad celular.
En otras palabras, el adaptador esterilizable para un recipiente de cultivo celular que se describe en el presente documento, en un modo de realización, se caracteriza en que al menos un dispositivo de retención celular es un fijador de gravedad celular.
Además, un dispositivo de retención celular, en especial un tubo empleado como dispositivo de retención celular, puede tener una forma cónica o cilíndrica.
Asimismo, un dispositivo de retención celular, en especial un tubo empleado como dispositivo de retención celular, puede tener un diámetro interno entre 2 mm y 20 mm, más preferentemente entre 2 mm y 12 mm, mucho más preferentemente entre 3 mm y 10 mm.
Además, un dispositivo de retención celular, en especial un tubo empleado como dispositivo de retención celular, puede tener una longitud entre 2 cm y 100 cm, más preferentemente entre 10 cm y 40 cm y mucho más preferentemente entre 12 y 30 cm.
En un modo de realización preferido el tubo usado como dispositivo de retención celular posee un diámetro interno entre 2 mm y 20 mm y una longitud de 30 cm.
Se prefiere dicho dispositivo de retención celular dado que asegura una tasa de retención celular constante, reduce el daño celular, se puede usar a lo largo de todo el periodo de cultivo celular y asegura que el tiempo de retención sea el adecuado.
En otro modo de realización preferido el dispositivo de retención celular hecho de tubo elastomérico es un tubo recto de silicona con un diámetro de 4,8 mm y una longitud de 163 mm.
En otro modo de realización preferido el dispositivo de retención celular se fabrica de acero inoxidable, posee una longitud de 20 cm - 24 cm, un diámetro interno de 8 mm - 12 mm y está inclinado con un ángulo de 70 - 75° con respecto a la línea horizontal.
Este modo de realización tiene el efecto de que el dispositivo de retención celular, aquí un fijador de gravedad celular, facilita el cultivo celular por perfusión en el cultivo celular a pequeña escala y a su vez obtiene y mantiene densidades celulares altas.
Estas densidades celulares altas también se obtienen y mantienen si el recipiente de cultivo celular sobre el cual se monta el adaptador esterilizable que comprende este modo de realización de un dispositivo de retención celular es un matraz de agitación, es decir el cultivo celular a pequeña escala se cultiva bajo condiciones de cultivo en agitación durante el movimiento de rotación orbital constante. Esto resulta sorprendente dado que, sin intención de limitarse a la teoría, se esperaba que el movimiento de rotación orbital constante interfiriera con la sedimentación celular en los dispositivos de retención celular que funcionan sobre la base de gravedad y por lo tanto no sería posible obtener y mantener densidades celulares altas.
Un ejemplo de este modo de realización es un dispositivo de retención celular fabricado de acero inoxidable con una longitud de 23,5 cm, un diámetro interno de 10 mm y un ángulo de inclinación de 74° con respecto a la línea horizontal.
Según se usa en el presente documento, el término “cultivo celular a pequeña escala” se refiere a cultivos celulares con un volumen de cultivo de 1 ml a 500 ml.
Preferentemente, el cultivo celular a pequeña escala tiene un volumen de cultivo de 90 a 170 ml.
Según se usa en el presente documento, el término “densidad celular alta” se refiere a una cantidad de células viables de 10 - 80 x 106 células/ml, como así también al hecho que el cultivo celular comienza con una densidad celular por debajo de 10 x 106 células/ml. Además, una vez que se alcanza el valor deseado de densidad celular alta, dicho valor se mantiene sustancialmente a lo largo de todo el periodo de cultivo celular. En un modo de realización, el cultivo celular de densidad celular alta posee una cantidad de células viables de 18 - 40 x 106 células/ml.
La densidad del cultivo celular depende de diversos factores, por ejemplo la cantidad inicial de células y su tasa de crecimiento, la tasa en la cual el medio de cultivo se agrega y se quita o la tasa de células recolectadas. Por ejemplo, eso se puede medir diariamente al retirar una muestra del cultivo y contar las células con un dispositivo para contar células como el Cedex HiRes. Como adición o alternativa, la densidad del cultivo celular se puede determinar al final del periodo del cultivo celular.
En un ejemplo se aplican las siguientes condiciones de cultivo: cantidad de células viables de 10 - 80 x 106 células/ml en el recipiente de cultivo celular, una tasa de células recolectadas de 0,01 - 5 x 106 células/ml y una tasa en la cual el medio de cultivo se agrega y se quita de 0,05 - 1,5 1/h en relación con el volumen de cultivo celular [volumen/volumen/h].
Por lo general los periodos de cultivo celular son de 4 a 8 semanas. Por lo tanto, resulta importante que no se necesite reemplazar el dispositivo de retención celular durante ese tiempo. Los motivos para reemplazar un dispositivo de retención celular son, entre otros, por bloqueo o fuga.
Además, el tiempo de residencia celular, es decir el tiempo que las células pasan dentro del dispositivo de retención celular, tiene que ser el adecuado para un determinado tipo de célula; de lo contrario las células podrían dañarse, por ejemplo por carecer de oxígeno y/o nutrientes o mediante formación de agregados.
Preferentemente, el dispositivo de separación celular retiene más del 80%, incluso más preferentemente más del 90% y mucho más preferentemente el 100% de las células que entran en contacto con el dispositivo de separación celular.
Ejemplos de dispositivos de separación celular son los fijadores de gravedad por canal inclinado, dispositivos de filtración o centrífugas. Dentro del presente texto, los fijadores de gravedad por canal inclinado se denominan “fijadores”.
En un modo de realización preferido, el dispositivo de separación celular es un fijador. En un modo de realización particularmente preferido, el fijador es un fijador preesterilizado que se usa por única vez y está hecho de material termoplástico y elastoméricos, según se describe en WO2013124326 A1 y WO2013124329 A1.
Este modo de realización permite la separación de células en volúmenes pequeños fuera del recipiente de cultivo celular.
En un modo de realización del adaptador esterilizable para un recipiente de cultivo que se describe en el presente documento, el recipiente de cultivo es un recipiente agitador también denominado matraz de agitación, es decir un recipiente que mientras se agita puede cultivar células de microorganismos, levaduras, plantas y animales.
En caso que el matraz de agitación se use para el cultivo, el adaptador esterilizable que se describe en el presente documento supera la necesidad de interrumpir el proceso de agitación para tomar muestras, agregar medios u otros componentes. Por lo tanto, el adaptador esterilizable permite condiciones de cultivo celular controlado y monitoreado en matraces de agitación sin interrupción y por lo tanto asegura condiciones de cultivo consistentes. Estas condiciones de cultivo consistente son un requisito para comparar diferentes ensayos de cultivo celular entre sí y por lo tanto adaptar parámetros individuales para optimizar las condiciones de cultivo celular.
Además, el cultivo paralelo de diversos matraces de agitación con adaptadores esterilizables según se describe en el presente documento montado sobre una plataforma de agitación en una incubadora reduce considerablemente los costes de cultivo y la complejidad, y por lo tanto permite un desarrollo de proceso a costes reducidos, más eficaz y más rápido, incluso bajo condiciones reproducibles y comparables.
Los matraces de agitación preferidos son los matraces Erlenmeyer.
El matraz de agitación preferentemente se agita cuando las condiciones de agitación son, por ejemplo, de 40 a 1000 rpm, más preferentemente de 100 a 500 rpm, mucho más preferentemente de 80 a 120 rpm.
Además, preferentemente se usa un radio de agitación entre 1 mm y 50 mm, más preferentemente entre 15 mm y 35 mm, mucho más preferentemente con 25 mm.
Además, preferentemente se emplea un matraz de agitación con un volumen total entre 50 ml y 5000 ml, más preferentemente entre 100 y 1000 ml, mucho más preferentemente con 500 ml.
Preferentemente el volumen de llenado relativo de un matraz de agitación se encuentra entre el 5% y el 50% del volumen total de dicho matraz de agitación, más preferentemente entre el 10% y el 30%, mucho más preferentemente es el 20%.
En un modo de realización, el adaptador esterilizable para un recipiente de cultivo celular que se describe en el presente documento es un adaptador esterilizable para un cultivo celular a pequeña escala.
Según se indica anteriormente, el término “cultivo celular a pequeña escala” se refiere a cultivos celulares con un volumen de cultivo de 1 ml a 500 ml.
Preferentemente, el cultivo celular a pequeña escala tiene un volumen de cultivo de 90 a 170 ml.
Mucho más preferentemente, el cultivo celular a pequeña escala tiene un volumen de cultivo de 100 - 145 ml.
Según se usa en el presente documento, el término “volumen de cultivo” se refiere al volumen total de solución nutritiva presente en el dispositivo que comprende el adaptador esterilizable y el recipiente de cultivo celular como así también en el dispositivo de retención y/o separación celular.
Los cultivos celulares con ese volumen pequeño permiten una reducción considerable de los costes de mantenimiento del cultivo celular, es decir los costes de los medios de cultivo celular, factores adicionales, personal que maneja los cultivos y requisitos en materia de espacio. Mediante el empleo del adaptador esterilizable que se describe en el presente documento, estos cultivos celulares a pequeña escala combinan la reducción de costes con la posibilidad de reproducibilidad y de manera fiable simula las condiciones de cultivo celular en un biorreactor convencional y por lo tanto mejora la calidad de datos. Esto es importante para poder ampliar los hallazgos realizados a pequeña escala en un laboratorio para los procesos de producción estándar.
Según se indicó anteriormente, cuando se usa un matraz de agitación se prefiere un adaptador esterilizable que comprende un dispositivo de retención celular en forma de un fijador de gravedad celular fabricado de acero inoxidable, con una longitud de 20 cm - 24 cm, un diámetro interno de 8 mm -12 mm y un ángulo de inclinación de 70 - 75° con respecto a una línea horizontal.
Este modo de realización tiene el efecto de que el dispositivo de retención celular facilita el cultivo celular por perfusión en un cultivo celular a pequeña escala y a su vez obtiene y mantiene densidades celulares altas.
Estas densidades celulares altas también se obtienen y mantienen si el recipiente del cultivo celular sobre el cual se monta el adaptador esterilizable que comprende este modo de realización de un dispositivo de retención celular es un matraz de agitación, es decir, el cultivo celular a pequeña escala se cultiva bajo condiciones de cultivo en agitación durante el movimiento de rotación orbital constante. Esto resulta sorprendente dado que, sin intención de limitarse a la teoría, se esperaba que el movimiento de rotación orbital constante interfiriera con la sedimentación celular en los dispositivos de retención celular que se beneficia de la gravedad y por lo tanto no sería posible obtener y mantener densidades celulares altas.
Normalmente, los diversos recipientes de cultivo celular sobre los cuales se montan adaptadores esterilizables se colocarán uno al lado del otro en la una plataforma de agitación.
Por lo general, el recipiente de cultivo celular sobre el cual se monta el adaptador esterilizable se cultivará en una incubadora, es decir un dispositivo que se usa para desarrollar y mantener cultivos microbiológicos o cultivos celulares, que mantiene de manera óptima la temperatura, la humedad y demás condiciones tales como el dióxido de carbono (CO2) y el contenido de oxígeno de la atmósfera interna. No obstante, también se pueden usar otros sistemas tales como la sala de cultivo controlado, la cual mantiene de manera óptima la temperatura, la humedad y demás condiciones tales como el dióxido de carbono (CO2) y el contenido de oxígeno de la atmósfera interna. En el caso de los matraces de agitación, el agitador se podría colocar en dicha sala.
El adaptador esterilizable que se describe en el presente documento se encuentra totalmente apto para montarse sobre un recipiente estándar de cultivo como por ejemplo un matraz de agitación. Esta combinación es apta para sistemas que alojan diversos cultivos en matraces de agitación, en los cuales la homogeneización de las células se garantiza en paralelo, lo cual es conocido en la técnica. Por lo tanto, en dicho sistema para establecer y mantener condiciones de cultivo tales como la temperatura, el contenido de dióxido de carbono, la frecuencia de agitación y el diámetro de agitación solo se requiere un disco central para la agitación, un control de temperatura central, un control de ventilación, etc. Por lo tanto, dicho arreglo es generalmente más económico y ahorra tiempo comparado con los biorreactores agitados que requieren un disco agitador separado, un control de temperatura, suministro de gas, por ejemplo un rociador, etc., para cada biorreactor. Mediante el uso del adaptador esterilizable queda superado el inconveniente de los cultivos en el matraz de agitación convencional por el que cada vez que se tiene que retirar una muestra o se debe agregar una solución de alimento se debe detener el agitador y los recipientes de cultivo deben sacarse de la incubadora y se debe quitar la tapa superior del matraz de agitación. En otras palabras, el cultivo en los matraces de agitación convencionales no se puede realizar de manera constante y por lo tanto las condiciones del ambiente reproducible, como por ejemplo la remoción necesaria de la incubadora y la apertura de la tapa superior cambian estas condiciones, por ejemplo en términos del valor de pH, el valor pO2, el valor pCO2, la potencia de entrada o la temperatura y cada cultivo celular se recupera solo e individualmente de estos cambios bruscos. Esto genera cambios metabólicos no reproducibles y también difíciles de predecir en las células cultivadas, lo que a su vez genera diferentes rendimientos del producto a nivel general o productos de calidad diferente. No obstante, al emplear el adaptador esterilizable las condiciones de cultivo, por ejemplo en matraces de agitación, se vuelven reproducibles y comparables con la condición de cultivo celular por lote, lote alimentado, lote alimentado repetido y/o condiciones de cultivo continuo, es decir condiciones de cultivo por perfusión. Esto incluso sucede en el cultivo celular a pequeña escala. Por lo tanto, el adaptador esterilizable asegura un proceso más eficaz al determinar los parámetros de aumento y a su vez reduce los costes.
En un modo de realización, el adaptador esterilizable que se describe en el presente documento además comprende al menos un sensor de nivel.
Según se usa en el presente documento, el término “sensor de nivel” se refiere a un transductor de medición que convierte las mediciones de nivel de líquidos en señales mecánicas, eléctricas o neumáticas que se pueden transmitir, procesar y grabar de manera conveniente. El sensor de nivel asegura que el nivel de líquido en el recipiente de cultivo celular, por ejemplo una solución nutritiva o un medio de cultivo celular, sea constante dentro del rango que toleran las células cultivadas y según las condiciones de cultivo.
El uso de un sensor de nivel facilita el cultivo celular a pequeña escala bajo condiciones de cultivo continuo, por ejemplo condiciones de cultivo por perfusión. Este es el caso, dado que los volúmenes de cultivo pequeño siempre corren el riesgo de que el recipiente de cultivo carezca o rebalse de líquido. Este riesgo se reduce mediante el monitoreo del nivel de líquido.
En caso que el nivel de líquido sea muy bajo o muy alto, por ejemplo en el caso de condiciones de cultivo por perfusión, se puede ajustar la tasa de flujo volumétrico según corresponda.
En un modo de realización, el sensor de nivel está conectado a un puerto.
En otro modo de realización el sensor de nivel se posiciona en el pasaje de ventilación del adaptador esterilizable. En otro modo de realización, el cuerpo del adaptador esterilizable comprende una inserción para un sensor de nivel, por ejemplo mediante un roscado y una conexión ajustada por abrazadera (Fig. 8).
En un modo de realización preferido, la medición del nivel de líquido en el recipiente de cultivo celular, y si fuese necesario el ajuste de la tasa de flujo volumétrica en el caso de un cultivo por perfusión, se realiza una vez al día. Una manera diferente de determinar el nivel de líquido es monitorear de manera exacta las sustancias, las cuales se agregan y quitan del recipiente de cultivo que incluye las muestras líquidas que se toman durante el cultivo. Este procedimiento se puede usar como complemento o como alternativa.
A fin de controlar estrechamente los niveles de líquidos especialmente en casos de condiciones de cultivo por perfusión, en el caso de los volúmenes de cultivo a escala pequeña también se puede emplear una combinación para determinar el nivel de líquido del cultivo celular mediante el monitoreo de sustancias agregadas y quitadas, empleando un sensor de nivel.
Ejemplos de sensores de nivel son los sensores flotantes, hidrostáticos, eléctricos, térmicos y ópticos. Estos se conocen en la técnica.
En un modo de realización preferido el adaptador esterilizable que se describe en el presente documento comprende al menos un electrodo y/o al menos una sonda de conductividad como sensor de nivel.
Ejemplos de dichos sensores de nivel son los sensores de nivel de capacidad y conductividad.
El principio operativo de un sensor de nivel de capacidad reside en el hecho que un aumento en el nivel de líquido genera una inmersión más profunda del electrodo de medición y por lo tanto aumenta su capacidad de transmisión. Por ejemplo la medición de esta capacidad establece el rendimiento del medidor de nivel.
Un sensor de nivel de conductividad, por otro lado, evalúa el cambio en la resistencia eléctrica del medio medido. Por ejemplo, esto se puede realizar evaluando el cambio de resistencia eléctrica entre dos sondas de conductividad o el cambio de resistencia eléctrica se evalúa entre la sonda de conductividad y otro objeto de metal, por ejemplo la pared del recipiente o el dispositivo de retención celular.
Preferentemente, el sensor de nivel monitorea el nivel de líquido durante el cultivo y asegura que dicho nivel sea constante dentro de un rango del ± 50% del volumen deseado, más preferentemente dentro de un rango del ± 10% del volumen deseado y mucho más preferentemente dentro de un rango del ± 5% del volumen deseado.
Por lo tanto, si el nivel está fuera de este rango se ajustan las condiciones, por ejemplo agregando más líquido o quitando menos líquido.
Un sensor de nivel de conductividad preferido es el “Nivel de Sensor DASGIP®” de Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania, que posee una longitud de 22 cm y un diámetro de 3 mm.
No existen límites respecto del tipo de células que se pueden cultivar mediante el uso del adaptador esterilizable, por ejemplo se puede usar para cultivar células microbianas, células de mamífero, células de insectos, células de levadores o células de plantas. En otras palabras, el término “cultivo celular” según se usa en el presente documento se refiere al cultivo de células microbianas, células de mamífero, células de insectos, células de levadores o células de plantas.
Preferentemente las células cultivadas son las células de mamífero.
Además, el adaptador esterilizable no solo se puede usar para cualquier tipo de cultivo celular, sino que también se puede usar para cualquier objeto del cultivo celular. Como se mencionó anteriormente, un objeto particularmente preferido es la optimización de condiciones de cultivo celular para optimizar los procesos biotecnológicos por ejemplo en términos de rendimiento del producto, calidad del producto o para reducir los costes de cultivo.
En este contexto, el término “biotecnológico” se refiere al uso de microorganismos o células tales como bacterias, levaduras, insectos, plantas o células de mamíferos para realizar procesos de fabricación específicos o industriales. Un ejemplo preferido de una conexión superior es un roscado externo superior, dado que el roscado posibilita una conexión rápida y confiable del adaptador esterilizable con una tapa apto, por ejemplo la tapa de un recipiente de cultivo celular apto a la cual el adaptador está sujeta.
El adaptador esterilizable también puede comprender una tapa en vez de, o además de, una conexión superior.
Preferentemente dicha tapa comprende una membrana que permite el intercambio de gas entre el interior del recipiente de cultivo celular y el ambiente, por ejemplo de una incubadora celular.
Según el recipiente de cultivo celular elegido para un experimento particular, el diámetro de la conexión superior y/o la tapa pueden variar.
En un modo de realización preferido del adaptador esterilizable que se describe en el presente documento, la conexión interna inferior, apta para conectarse con un recipiente de cultivo celular, es un roscado apto para enroscarse en una rosca, dado que el roscado posibilita una conexión rápida y confiable del adaptador esterilizable con un recipiente de cultivo celular apto, que posee el roscado correspondiente.
Según el recipiente de cultivo celular elegido para un experimento particular, el diámetro de la conexión interna inferior apta para conectarse a un recipiente de cultivo celular puede variar.
Por lo tanto, según el recipiente de cultivo celular elegido para un experimento particular, el diámetro y tamaño del adaptador esterilizable puede variar para que el adaptador esterilizable se ajuste al recipiente de cultivo celular y para que sea apto para la tapa original de dicho recipiente de cultivo celular.
En un modo de realización el adaptador esterilizable tiene una altura de 88 mm, un diámetro en la parte superior de 42 mm, un diámetro externo de 50 mm y un diámetro interno de 40 mm en la parte inferior, 4 puertos, cada uno con una longitud de 46 mm y un diámetro interno de 2 mm, como así también un pasaje de ventilación con un diámetro interno de 10 mm. Este modo de realización específico del adaptador esterilizable que se describe en el presente documento se refleja en la figura 7.
El adaptador esterilizable puede ser desechable, es decir, se puede usar una vez o puede reutilizarse.
Además, es posible que durante un experimento particular se modifique la condición del cultivo celular, por ejemplo las células que al principio se cultivaron bajo condiciones por lote alimentado posiblemente sigan bajo condiciones de cultivo por perfusión.
Las sustancias empleadas que se agregan y/o quitan mediante el adaptador esterilizable pueden estar en estado sólido, líquido o gaseoso. Preferentemente, las sustancias agregadas o quitadas son líquidos o gases.
En referencia a los puertos del adaptador esterilizable: generalmente, si un puerto determinado funciona en un experimento particular como entrada para una sustancia específica, no funcionará como entrada para otra sustancia o como salida.
No obstante, también es posible asignar más de una función a un puerto determinado, por ejemplo el medio de cultivo celular se puede agregar mediante un puerto específico y también las células que se cultivarán se pueden agregar mediante este puerto. Una manera de lograr esto es mediante el uso de un tubo en forma de “Y” conectado a un puerto, en el cual un brazo de la “Y” se usa para agregar medio de cultivo celular y un brazo para agregar células para cultivar.
Si durante el cultivo por lote no se usan todos los conectores, éstos se pueden equipar con filtros o se pueden sellar. Preferentemente, el adaptador esterilizable tiene de 2 a 20 puertos, más preferentemente, de 2 a 10, incluso más preferentemente de 4 a 8 puertos.
En un modo de realización preferido del adaptador esterilizable los puertos son rectos.
Alternativamente los puertos son curvos, por ejemplo en forma de “L”.
En otro modo de realización preferido del adaptador esterilizable los puertos se posicionan verticalmente o con una inclinación dentro del cuerpo del adaptador.
Preferentemente la inclinación está en un ángulo de 45°.
En un modo de realización preferido los puertos del adaptador son rectos. Por lo tanto, no hay espacio muerto dentro del puerto, por lo tanto se reduce el riesgo de que las sustancias agregadas o removidas queden en los puertos. Los puertos rectos por ejemplo pueden posicionarse verticalmente o en un ángulo de 45°.
Preferentemente los puertos del adaptador esterilizables tienen un diámetro interno de 1,5 - 3,5 mm, preferentemente 2,3 mm.
En un modo de realización preferido el adaptador esterilizable tiene 5 puertos. De estos cinco puertos cuatro tienen las mismas dimensiones con respecto a la longitud y diámetro, en tanto que el quinto puerto está configurado para permitir la salida del flujo de recolección mediante el dispositivo de retención celular.
Este modo de realización se puede combinar con el modo de realización que se describió anteriormente en el cual el cuerpo del adaptador esterilizable comprende una inserción para un sensor de nivel, por ejemplo mediante un roscado y una conexión ajustada por abrazadera. Dicha combinación tiene por resultado un adaptador esterilizable según se refleja en la figura 8.
Además, el diámetro externo del adaptador esterilizable puede ser más pequeño en las ubicaciones donde los puertos salen del cuerpo del adaptador esterilizable, según se muestra en la figura 4.
Si el adaptador esterilizable tiene más de un puerto, los puertos se pueden colocar a distancias iguales entre sí y/o en la misma posición relativa a la altura total del adaptador esterilizable.
En otro modo de realización preferida del adaptador esterilizable que se describe en el presente documento, el dispositivo de retención celular se conecta a al menos un puerto o se posiciona en el pasaje de ventilación del adaptador.
Según parámetros tales como el tipo de célula cultivada, el recipiente de cultivo celular elegido y el volumen de cultivo celular elegido, puede resultar ventajoso que el dispositivo de retención celular se posicione en el pasaje de ventilación del adaptador.
En dicho modo de realización, el dispositivo de retención celular preferentemente se monta sobre la tapa, la cual se usará con el adaptador esterilizable, antes de la esterilización, por ejemplo por esterilización en autoclave.
En un modo de realización el adaptador esterilizable que se describe en el presente documento comprende un dispositivo de retención celular y la superficie interna de dicho dispositivo de retención celular está modificada para mejorar las propiedades deslizantes del material de superficie elegido. Si la superficie y/o el dispositivo de retención celular está por ejemplo fabricado de acero inoxidable, dicha modificación de la superficie se puede lograr mediante, por ejemplo, electropulido y/o mediante pulido espejo. Si la superficie y/o el dispositivo de retención celular están por ejemplo fabricados de vidrio, la superficie de vidrio se puede modificar con respecto a sus propiedades hidrófobas y/o hidrofílicas. Los expertos también conocen otros procedimientos para modificar las superficies con otros materiales, por ejemplo, plásticos.
Sin intención de limitarse a la teoría, parece que especialmente en el caso de los dispositivos de retención celular que se benefician de la gravedad, es decir, fijadores de gravedad celular, la calidad de la superficie de la superficie interna influencia la tasa con la cual las células se deslizan hacia el dispositivo de retención celular. En otras palabras, cuando mejores sean las propiedades deslizantes de la superficie, mejores serán las características de la retención celular de un dispositivo de retención celular que se beneficia de la gravedad.
Por lo tanto, en otro modo de realización preferido el dispositivo de retención celular es un fijador de gravedad celular fabricado de acero inoxidable, posee una longitud de 20 cm - 24 cm, un diámetro interno de 8 mm - 12 mm y está inclinado a un ángulo de 70 - 75° con respecto a la línea horizontal y posee una superficie interior electropulida.
En un modo de realización preferido el adaptador esterilizable además comprende al menos un componente seleccionado del grupo que consiste de un tubo, un filtro, un tubo portaboquillas flexible, un conector roscado, un conector luer lock y una separación celular externa.
Preferentemente, el tubo portaboquillas flexible es de metal y tiene una longitud de aproximadamente 5 cm.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un dispositivo que comprende un adaptador esterilizable según se describió anteriormente y un recipiente de cultivo celular. Además, si el adaptador aún no comprende una tapa, el dispositivo preferentemente sí lo comprende.
Ejemplos de dichos dispositivos se reflejan en la figura 1 y en la figura 8.
En un modo de realización preferido el dispositivo es apto para un volumen de cultivo de 1 ml a 170 ml.
En un modo de realización especialmente preferido el dispositivo es apto para cultivar densidades celulares altas bajo condiciones de cultivo celular por perfusión en un volumen de cultivo de 100 ml a 145 ml.
Preferentemente el dispositivo es esterilizable en tu totalidad o en partes.
Preferentemente la tapa es la tapa original que pertenece al recipiente de cultivo celular del dispositivo.
Preferentemente el dispositivo además comprende un componente seleccionado del grupo que consiste de: al menos un sensor de pH, un electrodo de pH convencional, un sensor para la densidad óptica, un sensor para el oxígeno disuelto, un sensor de conductividad y/o de capacidad.
Incluso en otro aspecto la invención se refiere al uso del adaptador esterilizable y/o al dispositivo que se describe anteriormente para el cultivo de células por lote, lote alimentado, lote alimentado repetido y/o condiciones de cultivo continuo tales como las condiciones de cultivo por perfusión, en el cual en el caso de condiciones de cultivo por perfusión el adaptador comprende al menos 2 puertos.
En el caso del cultivo por perfusión, uno de al menos dos de los puertos podría usarse por ejemplo para agregar agentes de pH y medio de cultivo celular (“alimento”) y el otro de al menos dos de los puertos se podría emplear para quitar el medio de cultivo celular (“recolección”) y se podrían tomar muestras del flujo de recolección.
No obstante, en un modo de realización preferido de dicho uso el adaptador esterilizable comprende al menos cuatro puertos, dado que éste fácilmente permite cultivo bajo condiciones de cultivo por perfusión.
En otro modo de realización preferida de dicho uso el adaptador esterilizable comprende 5 puertos, 4 de los cuales son de dimensiones iguales con respecto a la longitud y diámetro, y el quinto puerto está configurado para permitir la salida del flujo de recolección mediante un dispositivo de retención celular fabricado de acero inoxidable con una longitud de 23,5 cm, un diámetro interno de 10 mm y un ángulo de inclinación de 74° con respecto a la línea horizontal.
En otro modo de realización de dicho uso el adaptador esterilizable comprende 5 puertos, uno de los cuales está configurado para permitir la salida del flujo de recolección mediante un dispositivo de retención celular, y un puerto se usa para la aireación activa de la cámara de aire que por lo tanto permite condiciones optimizadas para el cultivo celular en densidades celulares altas bajo condiciones de perfusión.
Incluso en otro modo de realización de dicho uso, el adaptador esterilizable comprende una inserción para un sensor de nivel.
En otro modo de realización de dicho uso el dispositivo de retención celular se posiciona en la fase líquida del recipiente de cultivo celular.
Por lo tanto, en un ejemplo de dicho uso el adaptador esterilizable comprende 5 puertos, uno de los cuales está configurado para permitir la salida del flujo de recolección mediante un dispositivo de retención celular, un puerto se usa para la aireación activa de la cámara de aire y el dispositivo de retención celular se posiciona en la fase líquida del recipiente de cultivo celular.
En un modo de realización preferido de dicho uso el adaptador esterilizable y/o el dispositivo que se describen en el presente documento se usan para un cultivo celular por perfusión bajo condiciones de agitación, es decir por movimiento de rotación orbital constante.
Incluso en otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para el cultivo de células por lote, lote alimentado, lote alimentado repetido y/o continuo tales como las condiciones de cultivo por perfusión.
En un modo de realización preferido del procedimiento para el cultivo celular, el procedimiento también comprende la detección del nivel de líquido.
Por ejemplo, el nivel de líquido se puede detectar mediante el uso de un sensor de capacidad o mediante el monitoreo del peso equilibrado de las sustancias que se agregan y quitan del recipiente de cultivo celular.
La detección del nivel de líquido facilita el cultivo celular a pequeña escala bajo condiciones de cultivo continuo, por ejemplo condiciones de cultivo por perfusión. Este es el caso, dado que los volúmenes de cultivo pequeño siempre corren el riesgo de que el cultivo se agote o rebalse del medio de cultivo celular. Este riesgo se reduce mediante el monitoreo del nivel del medio del cultivo celular.
Además, asegurar un nivel de líquido constante también facilita el control de otros parámetros de cultivo, como por ejemplo la concentración de oxígeno disuelto.
En un modo de realización preferido del procedimiento de cultivo celular el adaptador esterilizable comprende al menos dos puertos y el procedimiento de cultivo celular es un cultivo celular por perfusión.
La figura 1 muestra una perspectiva esquemática de un adaptador esterilizable y un dispositivo que comprende dicho adaptador esterilizable, es decir un recipiente de cultivo celular y una tapa, según se describe en el presente documento. En detalle, se refleja un adaptador (1) esterilizable para un recipiente (8) de cultivo celular. El adaptador esterilizable en este ejemplo comprende un cuerpo (14), un roscado externo superior (4) cuatro puertos (2a-d), un pasaje de ventilación (3), un roscado interno apto para enroscarse en una rosca (6) y un dispositivo (5) de retención celular que se beneficia de la gravedad. En este ejemplo el adaptador (1) esterilizable se posiciona sobre un recipiente (8) de cultivo celular y se cierra con la tapa original (7) de dicho recipiente de cultivo celular. El recipiente de cultivo celular contiene un medio de cultivo celular (9) que comprende las células que se cultivarán (11). Además, el recipiente de cultivo celular comprende un sensor de pH y un sensor de oxígeno disuelto (10) que indica el cambio en el valor de pH y la tensión de oxígeno disuelto.
Este adaptador esterilizable se puede usar de la siguiente manera:
En este ejemplo el recipiente (8) de cultivo celular es un matraz de agitación preesterilizado de 250 ml que comprende una tapa, la cual permite la ventilación a través de una membrana. Además, el adaptador (1) esterilizable fue por esterilización en autoclave. La función de los puertos 2a-2d en este ejemplo es la siguiente: el puerto 2a permite la adición de células que cultivarán, el puerto 2b permite la adición del medio de cultivo celular, el puerto 2c permite la recolección del medio de cultivo celular y por lo tanto se conecta al dispositivo (5) de retención celular. Por último, el puerto 2d permite que se tomen muestras durante el periodo de cultivo. Además, en este ejemplo cada puerto tiene un tubo portaboquillas flexible de metal. Según los requisitos establecidos, se agregan tubos y/o filtros estériles a los puertos dentro o fuera del recipiente de cultivo, ello para asegurar un ambiente de cultivo estéril dentro del recipiente de cultivo celular.
Antes de establecer el cultivo celular, bajo condiciones estériles se quita la tapa (7) del matraz de agitación. Luego, el adaptador (1) esterilizable se enrosca con el recipiente de cultivo celular mediante el roscado interno apto para enroscarse en una rosca (6) y la tapa (7) se enrosca con el adaptador (1) esterilizable. Posteriormente, todo el dispositivo se traslada a la cámara de cultivo celular, aquí una incubadora, en la cual las células se cultivan bajo condiciones aptas en modo de cultivo por perfusión.
En el siguiente paso 100 ml del medio de cultivo celular (9) se agrega mediante el puerto (2b) y las células a cultivar (11) se agregan mediante el puerto (2a) al recipiente (8) de cultivo celular.
Por último, se inicia el cultivo celular por perfusión, en el cual se agrega constantemente medio de cultivo mediante el puerto (2b) y se aspira mediante el puerto (2c), mientras que el dispositivo de retención celular retiene las células que se cultivarán en el medio.
En este ejemplo, el nivel del medio de cultivo celular se puede detectar mediante el monitoreo del peso equilibrado de las sustancias que se agregan y quitan del recipiente de cultivo celular.
En general, el uso del adaptador que se describe en el presente documento permite el cultivo celular como cultivo por perfusión en un cultivo celular a pequeña escala con un volumen de cultivo de 100 ml.
La figura 2 muestra una perspectiva esquemática de un adaptador esterilizable y un dispositivo que comprende dicho adaptador esterilizable, es decir un recipiente de cultivo celular y una tapa, según se describe en el presente documento. En detalle, se refleja un adaptador (1) esterilizable para un recipiente (8) de cultivo celular. En este ejemplo, el adaptador esterilizable comprende un cuerpo, un roscado externo superior (4) cuatro puertos (2a-d), un pasaje de ventilación (3) (el intercambio de gas se indica con las flechas punteadas), un roscado interno apto para enroscarse en una rosca (6), un dispositivo (5) de retención celular aquí un fijador de gravedad celular, un sensor (12) de nivel, en este caso un electrodo de conductividad, y una tapa (7). En este ejemplo el adaptador (1) esterilizable se posiciona sobre un recipiente (8) de cultivo celular. El recipiente de cultivo celular contiene un medio de cultivo celular (9) que comprende las células que se cultivarán (11). Además, el recipiente de cultivo celular comprende detectores de sensores de pH (10) que indican un cambio en el valor de pH.
Antes de establecer el cultivo celular, la tapa (7) con el sensor (12) de nivel se quitan del matraz de agitación bajo condiciones estériles. Luego, el adaptador (1) esterilizable se enrosca con el recipiente de cultivo celular mediante el roscado interno apto para enroscarse en una rosca (6) y la tapa (7) se enrosca con el adaptador (1) esterilizable. Posteriormente, todo el dispositivo se traslada a la cámara de cultivo celular, aquí una incubadora, en la cual las células se cultivan bajo condiciones aptas en modo de cultivo por perfusión.
En el siguiente paso 100 ml del medio de cultivo celular (9) se agrega mediante el puerto (2b) y las células a cultivar (11) se agregan mediante el puerto (2a) al recipiente (8) de cultivo celular.
Por último, se inicia el cultivo celular por perfusión, en el cual se agrega constantemente medio de cultivo mediante el puerto (2b) y se aspira mediante el puerto (2c), mientras que el dispositivo de retención celular retiene las células que se cultivarán en el medio. En este ejemplo, el recipiente (8) de cultivo celular es un matraz de agitación y las células se cultivan a 120 rpm (indicado por la flecha en semicírculo) en un movimiento de rotación orbital constante.
Durante el cultivo, se monitorea el nivel del medio de cultivo celular mediante el sensor (12) de nivel y, en caso de ser necesario, se modifican las condiciones, por ejemplo agregando o quitando más medio de cultivo, lo que asegura que el nivel del medio de cultivo celular sea constante dentro de un margen estrecho.
En general, el uso del adaptador que se describe en el presente documento permite el cultivo celular como cultivo por perfusión en un cultivo celular a pequeña escala con un volumen de cultivo de 100 ml.
La fig. 3 muestra un dispositivo ejemplar que comprende un adaptador esterilizable y un recipiente de cultivo celular desde arriba.
En detalle, se refleja un adaptador (1) esterilizable para un recipiente (8) de cultivo celular. Además, también se muestran los cuatro puertos (2a-d), el pasaje de ventilación (3) y el cuerpo del adaptador (14). Asimismo, en este ejemplo de un adaptador esterilizable, los cuatro puertos se colocan a distancias iguales entre sí.
La fig. 4 muestra una vista lateral de un dispositivo ejemplar que comprende un adaptador esterilizable y un recipiente de cultivo celular.
En detalle, se refleja un adaptador (1) esterilizable para un recipiente (8) de cultivo celular. En esta vista, solo se muestran los tres puertos 2a-c, como los cuatro puertos ubicados en el eje visual, dado que en este ejemplo de un adaptador esterilizable los cuatro puertos se colocan a distancias iguales entre sí. Además, los cuatro puertos también están colocados en la misma posición relativa a la altura total del adaptador esterilizable. En este ejemplo, los puertos terminan en la parte superior del recipiente (8) de cultivo celular y no se extienden hasta el recipiente (8) de cultivo celular como es el caso en el dispositivo ejemplar que se refleja en la figura 2. Además, también se reflejan el pasaje de ventilación (3), el cuerpo (13) y el medio de cultivo celular (9) que comprende las células que se cultivarán.
La fig. 5 muestra otra vista de un dispositivo ejemplar que comprende un adaptador esterilizable y un recipiente de cultivo celular. Se ilustra un adaptador (1) esterilizable para un recipiente (8) de cultivo celular que comprende un cuerpo (13) y una tapa (7) para el adaptador esterilizable, el cual en el ejemplo es la tapa original del recipiente de cultivo celular. En esta vista, se ilustran los tres puertos 2a, 2b, y 2d.
La fig. 6 muestra una imagen de un dispositivo de retención celular ejemplar, es decir un cuerpo de filtración. Consiste de dos partes entre las cuales se coloca el material de filtración. Para estabilizar el material de filtración también se colocó un disco de estabilización en el cuerpo de filtración. El material de filtración empleado era un prefiltro de 20 pm y un material de filtro de 10pm, es decir un filtro de micras.
La figura 7 muestra una imagen de un adaptador esterilizable ejemplar que comprende una conexión superior, un roscado y cuatro puertos de los cuales se pueden ver dos.
La fig. 8 muestra otro dispositivo ejemplar que comprende un adaptador esterilizable y un recipiente de cultivo celular. En detalle, se refleja un adaptador (1) esterilizable para un recipiente (8) de cultivo celular. En este ejemplo el adaptador esterilizable comprendía un cuerpo (14), un roscado externo superior, cinco puertos (2a-e), un pasaje de ventilación (3), un roscado interno apto para enroscarse en una rosca (6), un sensor (12) de nivel, en este caso un electrodo de conductividad, y un dispositivo de retención celular, aquí un fijador de gravedad celular (5), con una inclinación de 74° con respecto a una línea horizontal (ángulo a). En este ejemplo el adaptador (1) esterilizable se posicionó sobre un recipiente (8) de cultivo celular, aquí un matraz de agitación, y se cerró con la tapa original (7) de dicho recipiente de cultivo celular mediante un roscado externo superior (4). El recipiente de cultivo celular contenía un medio de cultivo celular (9) que comprendía las células a cultivar (11). Además, el recipiente de cultivo celular comprendía un sensor de pH y un sensor de oxígeno disuelto (10) que indica el cambio en el valor de pH y la tensión de oxígeno disuelto.
En este ejemplo las funciones asignadas a los primeros cuatro puertos (2a-d), los cuales tienen dimensiones iguales con respecto a la longitud y al diámetro fueron
1) muestra e inoculación,
2) adición de alimento
3) adición base
4) aireación activa de la cámara de aire
Se configuró otro puerto (2e) que permite la salida del flujo de recolección mediante el dispositivo (5) de retención celular.
Además, en este ejemplo el cuerpo (14) del adaptador esterilizable comprendía una inserción para un sensor (12) de nivel mediante un roscado y una conexión ajustada por abrazadera.
Dado que en este ejemplo el adaptador esterilizable comprendía una tapa (7) con una membrana que permitía el intercambio de gas entre el interior del recipiente de cultivo celular y el ambiente, mediante dicha membrana se liberó la salida de gas para mantener un ambiente de cultivo contenido dentro del matraz de cultivo.
Además, el aire proporcionado se filtró con un filtro de 0,2 pm.
La figura 9 muestra el resultado de un experimento con partículas de poliacrilonitrilo (PAN-X).
Análogo al término kwash que se usa para especificar el porcentaje de células viables que se pierden en la recolección, la fuga de partículas [%] se usó para especificar la cantidad de partículas en la línea de recolección con respecto a la cantidad de partículas en el sistema reactor. Se usó un término diferente porque los valores para la fuga de partículas no se comparan directamente con los valores para kwash. En detalle, el % de fuga de PAN-X para las tasas de perfusión de 41,6 ml/h y 20,8 ml/h se determinó por la inclinación (74°) de dispositivos de retención celular con diámetros internos de 4 mm, 6 mm y 10 mm en el sistema biorreactor por perfusión que se muestra en la figura 8.
La figura 10 muestra la instalación de un dispositivo de retención celular en forma de un fijador de gravedad celular.
Ejemplos:
Ejemplo 1 Experimentos iniciales
Se probó el dispositivo de la figura 4 que comprende el adaptador esterilizable bajo condiciones de cultivo por perfusión. En detalle, el adaptador esterilizable empleado tenía una conexión superior, un roscado externo superior, al cual se enroscó la tapa original del recipiente de cultivo celular y como conexión interna inferior un roscado mediante el cual se enroscaba el adaptador con el recipiente de cultivo celular. Asimismo, el adaptador esterilizable tenía 4 puertos rectos posicionados verticalmente, un pasaje de ventilación, un sensor de nivel y un dispositivo de retención celular, aquí un fijador de gravedad celular, en este caso un tubo elastomérico. El dispositivo de retención celular se conectó a uno de los puertos. Además, los puertos estaban equipados con componentes tales como tubos, filtros, tubos portaboquillas flexibles, conector roscado y conector luer lock, según corresponda.
Antes de usarlo, el adaptador esterilizable se esterilizó mediante esterilización a vapor. Posteriormente, el dispositivo de retención celular se enroscó al dispositivo de retención celular y los demás componentes se ensamblaron según un banco de trabajo estéril (banco limpio).
En este ejemplo del adaptador esterilizable que se describe en el presente documento el factor VIII de coagulación humana recombinante (ADNr) expresado en células de riñón de crías de hámsters (BHK) son células que se cultivaron durante varias semanas. Las condiciones de cultivo se establecieron a una temperatura de incubadora de 36,5°C, y a una frecuencia de agitación de la plataforma de agitación de las incubadoras de 100 revoluciones por minuto (rpm), que luego de un tiempo se cambió a 120 rpm- para aumentar la transferencia de oxígeno. Además, el nivel de CO2 de la incubadora se fijó en 4,5%, el nivel de humedad de la incubadora se fijó en 80% y el nivel de líquido, es decir el nivel de llenado del recipiente de cultivo celular, se fijo en 150 ml. Asimismo, en el comienzo el nivel de pH era 7,0, el cual después de un tiempo cambió a 6,8.
El cultivo se realizó en una incubadora que comprende una plataforma de agitación para recipientes de cultivo celular que usan un control del fermentador Da Sg IP® que incluye un software de control DASGIP® (Da SGIP®, Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania).
Los resultados mostraron que mediante el uso del adaptador esterilizable que se describe en el presente documento el cultivo celular bajo condiciones de cultivo por perfusión es posible a pequeña escala y que los datos metabólicos generados (datos que no se muestran) son comparables con los datos de los fermentadores para la producción.
Ejemplo 2 Evaluación de diferentes dispositivos de retención celular
En un experimento distinto, diversos tubos de longitud y forma diferente se probaron como dispositivos de retención celular, según se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1
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En este ejemplo el FVIII expresado en células BHK se cultivó durante varios días. El cultivo celular se realizó en matraces de agitación de 500 ml con un volumen útil de 150 ml. Las condiciones de cultivo se fijaron a una temperatura de incubadora de 36,5°C y a una frecuencia de la incubadora de 80 a 100 revoluciones por minuto. Además, el nivel de CO2 de la incubadora se fijó en 4,5% y el nivel de humedad en la incubadora se fijó en 80%. Asimismo, el punto de pH era 6,8 y la concentración de oxígeno disuelto fue > 10%.
Los resultados demostraron que en este ajuste el tubo de acero inoxidable recto e inclinado a 70° con un diámetro interno de 4,86 mm y una longitud de 300 mm ha dado especialmente buenos resultados con respecto a la retención celular.
Ejemplo 3 - Evaluación adicional de dispositivos de retención celular especialmente para densidades celulares altas
A fin de evaluar más a fondo qué geometrías de dispositivos de retención celular que se benefician de la gravedad podían ser especialmente aptas para obtener y mantener densidades celulares altas, se usó un sistema de partículas de poliacrilonitrilo (PAN-X). Los parámetros físicos de este sistema de partículas PAN-X se determinaron antes de que el sistema fuese usado para la evaluación del rendimiento de los dispositivos de retención celular (no se muestran datos).
Se investigaron diversas geometrías de dispositivos de retención celular con respecto a sus niveles de fuga. Los valores de fuga altos indican que se lavan muchas partículas PAN-X.
Sorprendentemente se descubrió que el dispositivo de retención celular inclinado con un diámetro interno de 10 mm alcanzó valores de fuga por debajo del 5% (Fig. 9) bajo condiciones de cultivo por agitación. El hallazgo fue inesperado dado que, sin limitarse a la teoría, se esperaba que el movimiento de rotación orbital constante del matraz de agitación interfiriera con la sedimentación y por lo tanto no sería posible alcanzar valores de fuga pequeños.
Ejemplo 4 - Evaluación de diferentes dispositivos de retención celular en forma de fijadores de gravedad celular durante el cultivo por perfusión.
Para evaluar en términos de funcionalidad, esterilidad y practicabilidad el adaptador esterilizable que se describe en el presente documento se realizó un ensayo de cultivo con tres geometrías diferentes del dispositivo de retención celular. Se probó por duplicado cada geometría del dispositivo de retención celular a fin de evaluar las siguientes características del sistema:
• rendimiento de retención celular del dispositivo de retención celular
• aptitud del sistema de cultivo para la operación estéril a largo plazo,
• capacidad de transferencia de oxígeno del reactor con el dispositivo de retención celular,
• exactitud del sistema de control de nivel con una sonda de conductividad como sensor de nivel,
• funcionalidad del sistema de control de pH mediante el uso de sensores ópticos.
Por lo tanto, se han construido seis adaptadores esterilizables. Cada uno equipado con 5 puertos, a los cuales se les asignaron las siguientes funciones:
1. muestra e inoculación,
2. adición de alimento
3. adición base
4. aireación
5. retención celular/recolección
En este ejemplo el puerto para el dispositivo de retención celular comprendía un orificio que a su vez comprendía un inserto para insertar el dispositivo de retención celular, aquí un roscado. Luego de la inserción, es decir un enroscado, el dispositivo de retención celular se fijó con dos roscados: uno para la fijación alrededor del diámetro externo del dispositivo de retención celular y uno para fijación descendiente del dispositivo de retención celular. El puerto tenía un diámetro externo de 15 mm, mientras que el dispositivo de retención celular tenía un diámetro externo de 12 mm.
Además, en este ejemplo el cuerpo del adaptador esterilizable comprendía una inserción para un sensor de nivel, aquí una sonda de conductividad integrada para el control de nivel, mediante un roscado y una conexión ajustada por abrazadera. El dispositivo de retención celular se usó como segundo electrodo junto con el sensor de conductividad para permitir un control del nivel de llenado.
La liberación de gas se realizó mediante una membrana sobre la tapa del adaptador esterilizable para mantener un ambiente de cultivo contenido dentro del matraz de cultivo.
Se probaron por duplicado tres dispositivos de retención celular de acero inoxidable con una longitud de 23,5 y un ángulo de inclinación de 74° con respecto a la línea horizontal, la cual difería en su diámetro interno.
Un montaje completo de un matraz de agitación y un adaptador esterilizable que comprende el dispositivo de retención celular respectivo como así también los componentes para el medio de cultivo celular que ingresa y que sale, como así también el control de nivel, el control de pH, la adición base y la transferencia de oxígeno a continuación se denominará unidad.
La aireación de una unidad, inicialmente realizada mediante el intercambio pasivo de gas mediante la membrana del adaptador esterilizable, se activó para aireación activa de la cámara de aire luego de un tiempo de cultivo de siete días. El volumen combinado del cultivo deseado del dispositivo de retención celular y del recipiente de cultivo celular fue 140 ml. El pH se controló únicamente por el ajuste de la concentración de CO2 en la entrada de gas.
No hubo contaminación durante el todo el periodo de cultivo que duró 23 días.
El rendimiento de retención celular se evaluó mediante la densidad de células viables (DCV) y los valores k-wash que se determinaron durante el cultivo (no se muestran datos).
La DCV en las últimas etapas del cultivo es un buen indicador para el rendimiento de la retención celular. Durante dicho tiempo, la carga de células en el dispositivo de retención celular alcanzó valores máximos debido a la alta densidad de células viables en el matraz de agitación. Si el rendimiento de la retención celular durante la perfusión no resulta suficiente, las células del recipiente de cultivo se lavan y la densidad celular disminuye. Se trató de un efecto claramente visible para los dispositivos de retención celular con un diámetro interno de 4 y 6 mm. La DCV en estas unidades primero aumentó a un nivel determinado de densidad celular y luego volvió a disminuir. Ninguna de estas unidades pudo alcanzar la densidad celular crítica de 20 x 106 células/ml. En cambio, las dos unidades que estaban equipadas con dispositivos de retención celular con un diámetro interno de 10 mm, la DCV crítica de 20 x 106 células/ml se excedió y permaneció constante a aproximadamente 25 x 106 células/ml durante más de 10 días. Por lo tanto, al emplear dispositivos de retención celular con un diámetro interno de 10 mm fue posible obtener y mantener densidades celulares que son comparables con las densidades celulares que se logran en la producción por biorreactores.
En otras palabras, los resultados inesperados de los experimentos por partículas PAN-X podrían confirmar e incluso superar las expectativas de las condiciones de cultivo celular ya que es la primera vez que se demuestra un sistema de perfusión a escala pequeña para alcanzar una densidad celular alta durante las condiciones de cultivo por perfusión, es decir durante operaciones continuas verdaderas.
Por lo tanto, sorprendentemente el adaptador esterilizable que se describe en el presente, comprende un dispositivo de retención celular relativamente simple, apto para retener células bajo condiciones de cultivo por perfusión durante el movimiento de rotación orbital constante e incluso bajo estas condiciones permite obtener y mantener densidades celulares altas.
Además, el posicionamiento exacto del dispositivo de retención celular parece tener el efecto de optimizar el procedimiento para el cultivo celular. Sin limitarse a la teoría, se considera que este hallazgo se debe al hecho que el posicionamiento del dispositivo de retención celular en la fase líquida del recipiente de cultivo reduce o previene el ingreso de burbujas de gas a dicho dispositivo, lo cual en caso contrario podría interferir con la sedimentación celular.
Para posicionar de manera exacta el dispositivo de retención celular en el recipiente de cultivo, el dispositivo se montó a una distancia de 4 mm del anillo interno en la parte inferior del matraz de agitación, según se muestra en la figura 10. El posicionamiento se llevó a cabo con un vástago de medición (cf. Figura 10). El dispositivo de retención celular finalmente se fijó mediante el enroscado ajustado de la abrazadera.
Ejemplo 5- Evaluación de comparabilidad de los atributos de los cultivos a pequeña escala con los biorreactores convencionales
Los resultados de los experimentos de cultivo celular que se describen anteriormente se usaron para especificar el diseño óptimo del adaptador del cultivo celular para obtener y mantener densidades celulares altas. La segunda serie de experimentos de cultivo celular se realizó con 8 dispositivos de retención celular idénticos (fijadores de gravedad celular) y se enfocó en la evaluación de la comparabilidad entre los 8 cultivos idénticos y en la comparabilidad de los atributos del desempeño del cultivo celular con cultivos celulares a gran escala en biorreactores convencionales.
Durante el segundo ensayo de cultivo, solo se usó aireación activa de la cámara de aire para la ventilación de los matraces. A diferencia del primer cultivo, solo se usaron dispositivos de retención celular con un diámetro interno de 10 mm.
Para reducir la variación del volumen de llenado, los límites del sensor de nivel se optimizaron a 100 j S y 200 j S. Con estas configuraciones la diferencia entre el volumen de llenado máximo y mínimo fue solo del 7%. Además, el montaje del sensor de nivel se estabilizó con la adhesión de un segundo anillo O aparte del anillo O que se usa convencionalmente. Esto trajo por resultado más precisión en el volumen de llenado promedio de 104 mm. Con estos límites de conductividad y el montaje del sensor para un nivel estable, el desvío del volumen de llenado y el volumen de llenado absoluto han sido optimizados.
Todos los resultados demostraron que todas las unidades de cultivo pudieron alcanzar densidades de células viables de más de 20x106 células/ml y se mostró que en general los atributos de los cultivos a escala pequeña generados en estos experimentos son comparables con aquellos realizados en biorreactores convencionales.
En otras palabras, un dispositivo que comprende el adaptador esterilizable que se describe en el presente documento permite un desarrollo de un proceso a costes reducidos, más eficaz y más rápido con la funcionalidad de un biorreactor totalmente equipado en términos de control de proceso, alimentación, muestra y monitoreo.
Referencias:
Meier et al. (2014) «Quasi-continuous fermentation in a reverse-flow diafiltration bioreactor», Biochemical Engineering Journal, Volumen 91, 15 de octubre de 2014, páginas 265-275.
WO2013124326 A1
WO2013124329 A1

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un adaptador (1) esterilizable para un recipiente (8) de cultivo celular que comprende
• un cuerpo (14, 13)
• una conexión superior y/o una tapa,
• al menos un puerto (2),
• un pasaje de ventilación (3),
• una conexión interna inferior adecuada para la conexión a un recipiente de cultivo celular y
• al menos un dispositivo (5) de retención de células, que retiene las células mientras permite que otras sustancias, tales como el medio de cultivo celular, se eliminan del recipiente de cultivo celular y que está conectado con al menos un puerto,
y en el que el recipiente (8) de cultivo celular es un matraz de agitación, el adaptador (1) esterilizable es un adaptador esterilizable para un cultivo celular a pequeña escala, con un volumen de cultivo de 1 ml a 500 ml y en el que el al menos un dispositivo (5) de retención celular (5) es un fijador de gravedad celular y está inclinado con un ángulo entre 60° y 80° con respecto a una línea horizontal.
3. A sterilizable adapter (1) for a cell culture vessel (8) according to any one of the preceding claims, wherein the upper connection is an upper external screw thread (4) and/or the lower internal connection suitable for connection to a cell culture vessel is a screw thread suitable for screwing in a screw thread (6).
2. Un adaptador (1) esterilizable para un recipiente (8) de cultivo celular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además al menos un sensor (12) de nivel.
3. Un adaptador (1) esterilizable para un recipiente (8) de cultivo celular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la conexión superior es un roscado externo superior (4) y/o la conexión interna inferior adecuada para la conexión a un recipiente de cultivo celular es un roscado adecuado para enroscarse en una rosca (6).
4. Un adaptador (1) esterilizable para un recipiente (8) de cultivo celular según la reivindicación 2, en el que al menos un dispositivo (5) de retención celular está posicionado en la fase líquida del recipiente de cultivo (8).
5. Un dispositivo que comprende un adaptador (1) esterilizable según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, un recipiente (8) de cultivo celular y una tapa (7).
6. Uso de un dispositivo según la reivindicación 5 para el cultivo de células bajo condiciones de cultivo por perfusión, en el que el adaptador (1) comprende al menos 2 puertos (2).
7. Uso según la reivindicación 6 en el que el adaptador (1) esterilizable comprende 5 puertos (2a-e), 4 de los cuales (2a-d) son de iguales dimensiones con respecto a longitud y diámetro, otro puerto (2e) está configurado para permitir la salida del flujo de cosecha a través de al menos un dispositivo (5) de retención celular fabricado en acero inoxidable con una longitud de 23,5 cm, un diámetro interior de 10 mm y un ángulo de inclinación de 74° con respecto a una línea horizontal.
8. Uso según la reivindicación 7, en el que el cuerpo del adaptador (14) esterilizable comprende una inserción para un sensor (12) de nivel.
9. Uso según las reivindicaciones 6-8, en el que el dispositivo (5) de retención celular se coloca en la fase líquida del recipiente (8) de cultivo celular.
10. Uso según las reivindicaciones 6-9, en el que el cultivo celular por perfusión se lleva a cabo bajo condiciones de agitación.
11. Un procedimiento para el cultivo celular bajo condiciones de agitación utilizando un adaptador (1) esterilizable según las reivindicaciones 1-4 y/o un dispositivo según la reivindicación 5, en el que el cultivo celular es un cultivo celular por perfusión a pequeña escala.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el cultivo celular es un cultivo celular de alta densidad celular.
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