CN104812888A - 一次性瓶式反应罐 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种设计为一次性元件的反应罐，包括盖子和/或固定在内部的可光电式读取的传感器贴片；涉及一种反应器，包括所述反应罐和反应罐接收外围设备，所述反应罐接收外围设备包括反应罐固定件和任选的用于读取所述传感器贴片的光电测量系统，其中所述反应罐固定件与用于使所述反应罐产生绕其中心垂直轴的旋转振荡运动的驱动单元相连；以及涉及所述设备用于培养细胞和/或微生物的用途。

Description

一次性瓶式反应罐

本发明涉及一种设计为具有盖子和/或固定在内部的可光电式读取的传感器贴片(sensor patch)的一次性元件的反应罐；涉及一种包括所述反应罐和反应罐接收外围设备的反应器，所述反应罐接收外围设备包括反应罐夹具和任选的用于读取所述传感器贴片的光电测量系统，其中所述反应罐夹具与用于使所述反应罐产生绕其中心垂直轴的旋转振荡运动的驱动单元相连；以及还涉及该设备用于培养细胞和/或微生物的用途。

在高度管制的药品生产的情况下，提供清洁和无菌的生物反应器需要在时间、技术和人员上的巨大支出。为了在多用途装置中或者在两个产品批次之间的产品变更期间可靠地避免交叉污染，除了清洁之外，需要高度复杂的清洁确认(cleaning validation)，该清洁确认在过程适应(process adaption)的情况下可能需要重复。

这不仅适用于上游加工(USP)，即在发酵罐中制备生物产品，还适用于下游加工(DSP)，即发酵产品的纯化。

在USP和DSP中，通常将压力容器用作搅拌和反应体系。尤其在发酵情况下，无菌环境对成功培养是必不可少的。对于分批发酵罐或补料分批发酵罐的灭菌，通常使用现场蒸汽(SIP)技术。在连续法过程中，为了确保足够长期的无菌，还使用高压灭菌技术，但是，该技术需要费力地将反应器运输至高压灭菌器，并且仅可用于相对小的反应器规模中。在发酵期间的污染风险在取样过程中和在运动的搅拌轴处尤为重要。在运动的搅拌轴处通常配备有复杂的密封系统(例如滑环密封件)。在没有发酵套的这种穿过情况下就能成功的技术因其较高的工艺稳定性(process robustness)而优选。

由制备过程导致的标准反应器的停机时间可以在反应器可用性的数量级内，特别是在短的使用周期和频繁的产品变更的情况下。受影响的方法步骤为，在生物技术生产的USP中，例如培养基生产步骤和发酵步骤；以及在DSP中，增溶、冷冻、解冻、pH调节、沉淀、结晶、缓冲液更换和病毒灭活。

为了满足生产装置快速灵活地重新装料的要求，在确保最大清洁度和无菌的同时，一次性反应器的设计正得到市场上持续增加的关注。

WO 2007/121958A1和WO 2010/127689记载了这种用于培养细胞和微生物的一次性反应器。在一个优选实施方案中，该一次性反应器由稳定的、优选多层的聚合体材料制成。可变形的一次性反应器由支撑它的容器所接纳。在该方法中，优选将所述可变形的一次性反应器自前面引入容器中。容器与驱动单元连接。通过驱动单元，将包括一次性反应器的容器置于绕容器固定的、优选垂直的轴线的旋转振荡运动中。通过一次性反应器的方形设计和/或一次性反应器的内构件，在振荡旋转运动的情况下，可以实现向反应器内容物的高功率输入，所以该一次性反应器可用作带有表面气体处理的发酵罐以用于培养细胞和微生物。用于供给和监控反应器的内构件通过连接板安装在反应器底部的侧面上。这些反应器主要在反应器体积大于10L时使用。

对于更小的反应器体积，包括合适容器的反应袋的生产过于复杂。

小的一次性反应器的挑战在于以尽可能紧凑且廉价的形式实现传感器技术、混合技术、温度控制和反应器的供给。

小的搅拌式一次性反应器从现有技术中已知。

赛多利斯斯泰迪公司(Sartorius Stedim Biotech)在其SU(http://www.sartorius-stedim.com/Biotechnology/Fermentation_Technologies/Reusable_Bioreactors/Data_Sheets/Data_UniVessel_SU_SBI2033-e.pdf)中提供了一种反应罐为圆柱形的搅拌式一次性反应器。该一次性反应器具有一个用于混合的搅拌器，并且在搅拌器下面具有一个用于从下面供给气体的L-分布器。通过盖子，通过顶部驱动的传动轴确保搅拌器驱动，通过导管确保传感器技术(温度、pH(化学)、氧(化学))、气体空间的气体供给和气体排出、以及其它供给和取样。所述盖子通过夹具连接件紧固在反应罐上，并通过O型环以无菌的方式对反应罐进行密封。搅拌器驱动使用2个唇式密封件密封。用于监控pH和氧含量的传感器技术还可通过位于反应罐底部的光电传感器贴片而实现。为了进行操作，将反应罐固定于特定的容器中，其中该容器具有支环和支座，所述支座带有用于读取传感器贴片的光电传感器系统。

市售可得的这种反应器体系和/或类似的反应器体系的缺点在于这些搅拌体系需要活动的内构件，并且在盖子中还需要复杂的无菌密封体系，从高剪切力来看，所述反应器体系不太适合培养非常敏感的细胞，例如干细胞。

从现有技术出发，所述目的是提供一种用于进行具有高清洁度和无菌要求的方法的低剪切系统，所述系统能够降低在提供清洁且无菌组件上的时间、设备和人员方面的支出。该系统应当可用于加工体积为10mL至20L、尤其是50mL至10L，且特别优选250mL至3L的工作体积。所述系统应当满足制药工业的高要求，简单且直观地操作，并且应当廉价。所述系统应当将因物质从处理腔室中的逸出而造成的安全风险降至最低。所述系统应当允许反应器内容物的充分混合，应当适合培养微生物和细胞培养物，并且在过程中，应当确保用液体营养培养基(liquidnutrient medium)对培养基(culture medium)进行充分的供给和特别是气态物质的清除。所述系统应当就像适合工艺开发一样适合生产细胞产品或药物活性成分，所述细胞产品特别是例如人体或动物体细胞的细胞产品：干细胞、血细胞、白细胞如天然杀伤细胞(NK细胞)、组织细胞，所述药物活性成分如单克隆抗体、蛋白质、生物反应器中的酶。

根据本发明，该目的通过使用用于界定反应器内部的尺寸稳定的有角塑料瓶而实现，其中所述塑料瓶具有底、壁、内部和至少一个通向内部的通路(access)，并且优选具有一个锥形内凹底、宽颈，和/或在由坐标定义的位点处具有一个或多个安装在瓶子下部区域的传感器贴片。

因此，本发明首先涉及尺寸稳定的有角塑料瓶作为生物反应罐用于培养细胞、尤其是敏感细胞和生长在(微)载体上的细胞(例如干细胞、血细胞或组织细胞)的用途，其中，所述塑料瓶具有底、壁、内部和至少一个可封闭的通向内部的通路，特别是瓶颈。通常，在塑料瓶的内部，在由坐标定义的位点处在一个或多个下部区域的壁上安装有一个或多个传感器贴片。

本发明还涉及一种包括尺寸稳定的有角塑料瓶的反应罐，所述塑料瓶具有底、壁、内部和至少一个可封闭的通向内部的通路(包括至少一个瓶颈，尤其是可由盖子封闭的瓶颈和/或至少一个通道(passage))，并且其中在内部，在由坐标定义的位点处在塑料瓶的一个或多个下部区域的壁上安装有一个或多个传感器贴片。优选地，通道容纳在盖中。

由荧光着色层制成的支撑固定的传感器贴片为市售可得的(例如购自Presens，YSI)，其可以固定到例如瓶壁上。通常，使用至少一个pH传感器贴片和一个氧传感器贴片。

或者，例如根据US 20120067724A1，反应罐或生物反应器在瓶壁上或者在盖中(优选在盖中)具有用于电化学传感器、优选一次性传感器的通道。

为使得反应器能够满足制药工业的无菌要求，通常由可γ-灭菌的塑料材料来制造塑料瓶。本发明的反应罐优选由在操作期间允许观察反应罐的单层或多层透明聚合物材料制造。

塑料或玻璃是相对廉价的材料，对其的处理也相对廉价。因此，对所使用的反应罐进行处置并使用新的一次性反应罐比清洁所使用的反应罐更加经济，特别是由于当使用新的一次性反应罐时，可省略复杂的清洁和清洁确认。本发明的反应罐在清洁室中制造或清洁，并且优选无菌包装。

本发明的反应罐尺寸稳定。本发明反应罐的合适材料或材料组合为本领域普通技术人员悉知的所有细胞生物相容材料，尤其是玻璃、聚乙烯、聚丙烯、聚醚酮(PEEK)、PVC、聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚碳酸酯。壁厚优选为0.1mm至5mm，并且特别优选0.5至2mm。

瓶材料通常通过现有技术中已知的拉伸吹塑成型法而制成所需的形式。

反应罐或塑料瓶的横截面优选具有n边形的形状，其中n在3至12的范围内、优选在3至6的范围内、非常特别优选在3至4的范围内，最优选地，n等于4。

优选地，本发明反应罐的或塑料瓶的侧壁至少部分地形成为以45°至120°的角度接触的平表面。优选地，反应器的侧壁形成多面体，其中，在一个表面上安装有瓶颈。

优选地，反应罐或塑料瓶是边长为H、b和c的立方体，其中H为塑料瓶的高度，b为塑料瓶的宽度且c为塑料瓶的深度，并且b≤c≤H。宽颈通常安装在一个小表面上，并且将与其相对的表面作为反应罐的底。本发明的反应罐或塑料瓶的瓶高H与宽度b和深度c的最大值的比例在0.5至4、优选1至3、特别优选1.5至2.5的范围内。在优选实施方案中，反应罐的方形瓶截面边长为a＝c＝D。

为了更好的混合反应器并降低初始体积，反应罐和/或塑料瓶通常具有内凹底。关于底的构造，以引证的方式纳入WO 2010/127689的教导。特别地，底的形状为指向内的四面体、指向内的锥体、抛物面的形状或钟形。特别优选地，底形成为锥体。凹形的高度h_w为底部横截面的圆形等效直径D_k的0.01倍至1倍。优选地，凹形的高度h_w为圆形等效直径D_k的3％至100％、特别优选地5％至30％、且非常特别优选地10％至20％。

本发明的反应罐可通过其外壁进行加热和/或冷却。在优选实施方案中，在塑料瓶或反应罐的底部外侧，施加一次性加热垫，由于加热表面与壳表面的正面接触，其可以实现非常有效的热传递。以此方式，可将加热表面减小至底部表面。为此，通常将该加热垫粘合地连接到底部外侧。通常，反应罐不需要另外的冷却，原因在于关闭具有小体积并由此的高比热交换表面积的反应器中的加热垫可导致足够快速的冷却。视需要，例如在相对低的发酵温度和相对高的呼吸热下应用微生物的情况中，可以通过在反应罐或罐夹具的侧面上安装珀耳帖(Peltier)元件来施加另外的冷却。

本发明的反应罐优选为可以从外面密封以进行化学、生物、生物化学和/或物理过程的腔室。特别地，反应罐用于提供无菌腔室以培养细胞和/或微生物。在本发明的反应罐的优选实施方案中，为此，反应罐的瓶颈通过盖子而紧密地封闭，其中盖子至少具有用于将气体和液体供给至反应罐并从反应罐中移出的通道和/或连接件。根据本发明，盖子不具有用于传动轴的通道[图2至5]。盖子是本发明反应罐的另一个元件。优选地，相连的气体管线配备有无菌过滤器，其中尾气管线的无菌过滤器优选配备有加热垫以使冷凝物远离过滤器表面。或者，为了避免在过滤器上冷凝，可以通过尾气冷却器——例如通过在由膜材料制成的传热表面上施用电子冷却元件(例如珀耳帖元件)——将尾气降温至较低的露点(冷凝温度<环境温度)。

此外，视需要，盖子可以包括其它通道和/或连接件以用于包括下列的元件：

-一个或多个电子、光电、或电化学传感器，尤其是US 2012/0067724A1中的一次性电化学传感器，或者用于温度控制的PT100电阻传感器，和/或用于液位控制或用于细胞密度测量的电容传感器。

-内部细胞分离器和/或

-取样系统。

取决于应用，反应罐适当地装配有一个或多个所述元件。

在本发明的优选实施方案中，盖子由塞子和固定套筒组成。塞子通常由选自聚醚醚酮、热塑性塑料或硅酮的塑料制成。通常，将塞子制成一次性塞子，在特别的实施方案中，或者，将塞子制成可重复使用的塞子。

优选地，将塞子插入反应器颈部以封闭，通过安装在外围的O型环密封件使瓶颈内部密封，并且通过单独的锁定装置(例如可螺纹安装的固定螺母)使塞子旋入瓶颈螺纹，或者用夹紧环(clamping ring)夹紧。或者，插入瓶颈的塞子可通过施用于瓶口的密封唇密封，并使用单独的可螺纹安装的固定套筒夹紧，并拧在塑料瓶上。另一个替代是包括与拧到塑料瓶上并通过O型环使瓶颈和/或瓶口密封的塞子相同通道的盖子。优选地，使用插入瓶颈的塞子，其通过O型环密封件使瓶颈密封，并且通过单独的可螺纹安装的固定螺母紧固地拧在塑料瓶上[图2]。该实施方案的优点在于O型环几乎没有机械应力，并且不会发生柔性管线的缠绕，而当换用盖子时却会发生上述情况。

优选将反应罐连同盖子一起构造成一次性元件，即优选在使用之后不旨在清洁整个反应罐，而是将其进行处理。因此，优选地，反应罐仅包括为提供无菌反应腔室所必需的基本元件。

塑料瓶通常作为一次性用品来生产和使用。

为了培养敏感细胞，或生产临床细胞产品，优选仅通过表面供给气体。在这种情况下，盖子不具有用于起泡气体引入元件的通道，并且本发明的反应罐不具有用于起泡气体引入的内构件。对于致力于放大至大型发酵罐的工艺发展的背景下的应用、具有高细胞密度的灌注法和微生物法而言，可以提供用于另外的微量或宏量的气体引入的装置(例如，由柔性管线通过盖子和粘合性地施用于容器壁的烧结体从上部提供)。优选地，本发明的反应器可以完全由廉价元件制造，因此允许将反应器用作一次性系统。或者，将全部的高值元件整合到可重复利用的盖子上，并仅将反应罐用作一次性元件。

在反应罐的特别实施方案中，为了截留细胞，在反应罐中使用细胞分离器。根据本发明，内部细胞分离器由中心垂直分离管(central verticalseparator tube)和分离头(separator head)形成，所述分离头具有用于通过抽吸而除去不含细胞的培养液的收集器，其中所述盖子具有用于所述收集器的通道，并且所述细胞分离器或者旋转地安装至盖子上，或者静态地固定在盖子上。管和分离头可以具有不同的长度、几何形状(锥形和直的)和直径，并且具有各种管内构件(锥形和环形内构件、流量校准器)。特别的实施方案示于图6至8中。细胞分离器可以由钢、玻璃或塑料制成。优选地，其由塑料制成并且用作一次性元件，所述塑料例如为聚乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚醚酮和/或聚碳酸酯。

因此本发明还涉及由中心垂直分离管和分离头形成的用作生物反应器的内部垂直细胞分离器，所述分离头具有用于通过抽吸而移除不含细胞的培养基的收集器，其中，所述细胞分离器固定至或旋转地安装至反应罐的盖子上，并且所述盖子具有用于收集器的通道。

如果使用细胞分离器，则反应罐通常具有宽颈，以便可通过瓶颈引入紧固在盖子上的预制的细胞分离器。如果细胞分离器可移动地固定(＝可旋转地安装)至盖子上，则因其惯性而仅最低限度地受反应罐旋转运动的影响。因此，避免了由分离器输送至沉降室的环流及其对沉降过程的干扰，并且显著改进了截留，如图10所示。

优选地，细胞分离器如此设计使得细胞分离器的内部和外部区域通过相应的收缩(constriction)而基本上彼此分开。以此方式，降低了从充分混合的外部腔室至沉降区的物流传输对沉降的干扰。换言之，细胞分离器的内部体积因外部体积(＝培养体积)的流动而所受的影响应该尽可能的小，但是必须仍然确保截留细胞向混合的供给反应器区域的逆向传输(back-transport)。

优选地，对于横截面边长的尺寸为D＝120mm、H＝235mm的反应罐而言，内部细胞分离器的分离管(310)的分离长度l(370)为40mm至200mm、特别地90至190mm、优选地190mm(图6和图7)。通常，所使用的l/H的比例为0.2至0.9、优选0.5至0.9、尤其是0.8。

分离管具有管径为d(350)的圆形横截面，其中管径d与瓶横截面边长D的比值通常为0.25至0.90、尤其是0.5至0.85、优选0.83。管径d对达到用于细胞截留的分离器表面积是重要的。

优选按照可以容易地将细胞分离器引入瓶中的方式来选择瓶颈和细胞分离器的横截面。特别地，当要使用可重复利用的在洁净台下被连接至经γ-灭菌的反应罐的高压灭菌盖时，这是必需的。

在生物反应器的第一个实施方案中，气体的引入仅通过表面进行(图6和图7)。为此，分离器的管径d(350)以下述方式进行选择：由式(I)定义的通过表面供给气体的培养体积V_k与由式(II)定义的分离体积V_A的比值为0.01至10、优选0.2至2。

$V_R=D^2*L-\frac{\mathrm{\&pi;}}{4}{d}^2(L-S)$      (I)

$V_A=\frac{\mathrm{\&pi;}}{4}{d}^{2}l$      (II)

细胞分离器的其它参数为定义成(III)的分离面积(＝澄清面积)A以及澄清面积负载v＝q/A，其中q为收获料流。

在分离头中，设置有用于通过抽吸而移出不含细胞的培养液的收集器(320)。通常，收集器的直径dv(360)与管径d的比值dv/d为0.1至0.8、优选0.3至0.5。

优选地，收集器(320)为锥形。这种形状的优势在于可以得到更多的空间以便通过盖子引入其它元件(传感器、取样管线等)。同时，更加略微地降低气体引入面积。

优选地，反应罐中的分离器所用的分离长度l与距离分离管的底部间距s的比值l/s为0.75至0.9。

优选地，在细胞分离器内省去分离管的内构件和收集器(320)。

在使用模型颗粒PAN-X进行的流体动力学研究中，研究了静态内置于盖上的管，所述管具有不同的管长、几何形状(锥形/直头)和直径，以及各种管内构件(锥形和环形内构件、液位校准器)。根据目前可得的实验，在功率输入P/V_K为3W/m³且澄清面积负载v为0.025<v[m/h]<0.2的范围内，用于固体的静态安装(＝同步旋转)的内部细胞分离器具有与静态外部系统(例如板式分离器、竖流式沉降池)相当的截留程度(图13)。

特别地，本发明的细胞分离器适用于培养容易沉降的颗粒，例如，取决于支撑材料的下沉速率，在相当高的功率输入范围P/V_K>>3W/m³内可使用的载体固定的细胞。

在本发明的特别实施方案中，本发明的反应器还带有自动取样元件。

在第一个实施方案中，取样元件包括被引导穿过盖子的接收管线(＝盖式取样元件，见图10)。在反应器外部，该管线可以通过夹具和夹管阀关闭。通过邻近的Y构件，首先以减压的方式通过从发酵罐中吸出样品而进行垂直的移除，随后以过压的方式将样品输送至取样制备站。该Y型取样元件特别有利于实现由柔性管线、夹管阀、无菌过滤器和过压供给以及减压供给所组成的自动取样模块。通常，使用由塑料制成的市售可得的管线、阀和Y构件，所以可提供可整合至盖中的取样元件并将其用作一次性元件。Y型取样元件的基本原理记载在WO 2007/121887中，并且以引证的方式纳入本说明书，其中启动两个滴定管以确保样品的传输和等分。在除去样品之后，将取样元件用EtOH灭菌并干燥。优选地，设置用于空气和EtOH的过滤元件以防止取样元件的污染。优选地，将取样元件连接至BayChromat-平台以便由拜耳技术服务公司(BayerTechnology Services GmbH)进行自动分析。

在其它实施方案中，在瓶壁上、特别是在与传感器(传感器贴片或电化学传感器)相对的壁上，反应罐在接近其底部的区域内具有通道和/或连接件以安装取样系统。通道和/或插入的实例特别为标准英格尔德接头(Ingold stub)或PG13,5-螺纹接头。适合的取样系统记载在例如DE102008033286A1中。

本发明的反应罐内的混合通过反应罐周期性改变旋转方向而进行，其与塑料瓶的角形形状结合而导致反应器内容物表面产生指向内的波状流动。关于反应器运动的配置，WO 2010/127689中的教导以引证的方式纳入本说明书。

为运行反应器所需的、特别是为培养细胞和/或微生物所需的所有剩余元件，特别是用于使反应罐产生周期性地改变旋转方向的驱动单元和用于读取传感器贴片的光电传感器系统由外围设备提供并且可以重复利用。因此，在目前的情况下，优选将反应器——在现有技术中其通常为一个相干单元(coherent unit)——分为根据它们的功能而配置的单独部件。

因此，本发明反应器的其他元件为外围设备。特别地，作为外围设备，使用具有一个或多个反应罐夹具的反应罐接收外围设备，其中所述反应罐和所述反应罐夹具——作为整个系统的不同部件——按照以下方式彼此匹配：可以将反应罐引入反应罐夹具中和/或特别是夹在其中，并由此以充满液体的状态被支撑。

本发明的用于接收反应罐的反应罐接收外围设备是本发明反应器的另一个元件，并且至少包括：

-一个或多个用于接收一个反应罐的反应罐夹具，在每种情况下，其包括适应于反应罐的覆盖区(footprint)和一个或多个横向固定元件。例如，反应罐夹具具有固定板和横向夹紧臂或夹紧面。

-用于实施周期性改变方向的旋转运动的驱动单元，例如将步进电动机连接至例如反应罐夹具、特别是反应罐夹具的固定板上。优选地，使用不具有与电动机和驱动直接耦合的齿轮的步进电动机。通过驱动单元，可以使反应罐绕其固定垂直轴作周期性改变方向的旋转运动，以此方式，无需将驱动单元直接耦合至反应罐本身。优选地，为了实现反应器运动，使用无齿轮的步进电动机。这种配置的优势在于噪声非常低。优选地，可以通过控制单元来控制驱动单元。通常，控制为驱动单元的一部分。

-一个或多个安装在反应罐夹具上、特别是安装在一个横向紧固元件上的用于读取安装在由坐标定义的反应罐位置的侧面上的传感器贴片(特别是pH传感器和/或氧含量传感器)的光电传感器系统。通过将光激发单元和检测单元直接耦合到传感器上，可以显著降低光照强度来产生可评估的测量信号并由此产生自由基，其证明为有利地延长传感器贴片的使用寿命。

根据本发明，数据传输通过差分串行接口和/或无线电(例如蓝牙或WLAN)以线结合(line-bound)的方式进行。优选地，考虑到健壮的数据传输和对电磁干扰的高耐受性，光电传感器系统具有用于对称信号传输的EIA485/RS485型差分串行接口。为改进数据传输，不具有与电动机与驱动直接耦合的齿轮的步进电动机被认为是特别有利的，这是因为其允许特别是无干扰的数据传输。

图11示出包括反应罐接收外围设备的反应器的具体实施方案。

优选地，适用于反应器的覆盖区以使反应器框架适用于各种尺寸的反应器的方式来进行替换或修改。

本发明还涉及本发明的反应器和反应罐的用途，以及还涉及一种培养细胞和/或微生物的方法。

在反应罐中，在操作期间，液位与反应罐宽度的比例优选为0.05至2、且特别优选0.1至1，其中，液位可因随细胞生长所进行的补充进给而发生变化。此外，在保证其优选的流体动力学特性和加工特性的同时，反应罐在反应罐顶部与液位(＝满液位180，H_L)之间具有足够的至少5％至50％液体高度、优选至少25％液体高度的顶部空间下运行，从而在形成泡沫的情况下，可确保在安装有无菌过滤器的排气管线上具有足够的空间。为了控制填充水平，通常使用穿过盖子或者位于容器的一个壁上的用于控制填充水平的电容传感器。

出人意料地发现，相对小的角度幅度足以用于反应器的旋转振荡运动，从而实现良好的混合和/或传输过程的充分强化。特别地，几乎不需要反应器达到3600°的旋转(这相当于10转)，所以不需要结构上复杂的解决方案以用于将振荡旋转的反应器连接到静态的周围环境处(例如用于进料和移除培养基和气体、电能和电信号)。

在本发明的用途中，反应罐以旋转振荡的方式在角度幅度α为2°≤|α|≤3600°、优选20°≤|α|≤180°、特别优选45°≤|α|≤90°范围内运动，其中可存在±5°的偏差。特别地，在使用特别是通过表面供给气体的低剪切生物反应器时，非常特别优选考虑|α|＝60°。因此，振荡运动总体上扫过2|α|的角度。

实验发现，当功率输入提高时，可在反应器中建立向反应器培养基中引入气泡的运动状态。从功率输入P/V_K>10W/m³时引入气泡。对于不会因鼓泡气体引入而受损害的细胞和/或微生物，可以此方式非常简单地实现气体供给的增加。通过优选安装在底部区域的烧结管来引入另外的鼓泡气体，可以显著提高质量传递。由旋转振荡产生的流动确保了微气泡从分布器上的平缓脱离和由此的大的相界面或者大的传质系数k_La。

在下文中，将参照附图对本发明进行更详细的描述，但是本发明不限于所示出的实施方案。

附图说明：

图1在侧视图中示意性示出本发明反应罐和反应罐夹具的优选实施方案的侧向纵截面图。图2从上方示出热塑性塞子的示意图。

图3示出具有用固定套筒(120)和O型环密封件(140)紧固的软管喷嘴(135)的硅酮型塞子的示意截面图。

图4在正视图中示意性示出用固定套筒(120)紧固并用密封唇(140b)密封的硅酮型塞子的截面图。

图5在正视图中示意性示出具有软管喷嘴(135)的可螺纹安装的塑料盖的截面图。

图6在正视图中示意性示出具有直顶(＝陡的横截面收缩)的直管式分离器的纵截面图。

图7在平面图中示意性示出具有直顶的直管式分离器。

图8在正视图中示意性示出具有直顶(＝陡的截面收缩)和换流器的直管式分离器。

图9示意性示出包括管线的实验结构，其中具有直管式分离器的反应器以实例的方式示出，所述分离器具有锥形头并且静态地固定于盖中。

图10示出具有通过盖子引导的取样吸入管线(1110)的自动化盖式取样元件的示意结构，该取样吸入管线通过Y型构件(1170)与样品管线(1120)连接以到达自动化平台(1190)，以便将液体全自动地取出并插件式传输(plug-type transport)，该取样吸入管线还连接于其它管线以用于空气供给以及ETOH清洁并消毒(1210)。

图11示出反应罐连同反应罐接收外围设备一起的具体实施方案。

图12示出在比较图6和图7的静态分离器和同步旋转分离器时的实验结果R＝f(P/V)，并且证实旋转安装沉降管的高度惊人的必要性，与同步旋转的变型相比，其即便在相对高的功率输入P/V_K>3W/m³下也能确保良好的颗粒截留。

图13示出关于其它沉降分离器的对比实验。

参考标记：

8、9端口(内径2mm，外径3mm，端口长：15mm)

10-15端口(内径3mm，外径4mm，端口长：15mm，端口10在两侧上带有软管喷嘴)

16、17PG(丝堵)13.5的端口

18与内径为4mm的PG(丝堵)13.5的端口类型相同

100  容器

101  旋转轴

110  瓶颈

120  固定螺母/固定套筒

120b 可螺纹安装的盖子

130  塞子

135  软管喷嘴

136  硅胶管

140  O型环

140b 密封唇

140c 密封件

150  接头

160  底部

170  气体分布器

180  填充水平H_L

185  瓶高H

186  瓶横截面D

190  瓶壁

198  培养体积V_B

200  气体供给

210  无菌过滤器

220  气体移除

230  无菌过滤器

240  培养基

250  添加剂

260  收获

261  丝堵13.5的接头(引入盖子)

270  过滤器加热器(19Jan 12)

280  侧向取样(19Jan 12)

290  传感器端口(化学)(19Jan 12)

300  沉降细胞分离器

310  沉降管/圆筒

320  收集器/圆锥

330  收集器配件/换流器

331  开口

332  间隙

333  移出的沉降物

340  出口/移出管

350  管径d

360  收集器直径d_V

370  分离长度l

380  距离底部的距离s

390  填充水平

395  分离体积V_A

400  夹具

410  导热元件

420  振荡

430  加热垫

610  pH测量

611  pH位点

620  pO₂测量

621  pO₂位点

630  温度测量

640  填充水平测量

700  电动机驱动单元

710  光电测量系统

720  控制柜

730  温度测量

740  旋钮

750  显示

760  反应器框架

900  取样阀

910  固定螺母

911  密封件

912  管

921  止回阀

922  止回阀

923  膜

930  取样管线

931  样品

950  净化管线

951  无菌过滤器

952  气体

953  蒸汽

960  样品分布

970  压力管线

971  减压

972  超压

980  pH测量

981  pH传感器

982  缓冲器

983  废液

990  耦合器(厄锁定)

1100 盖式取样元件

1110 取样吸入管线

1120 样品管线

1130 夹具

1140 液体过滤器

1150 空气过滤器

1160 减压器

1170 Y型构件

1180 夹管阀

1190 用于全自动地取出液体、输送、样品制备和随后的分析的自动化平台已知于例如EP-1439472 A1和EP-2013328 A2中

1200 清洁溶液的供给

1210 空气供给

实施例：

生物反应瓶

将具有方形横截面且横截面边长D＝120mm、高H＝235mm，以及具有颈部横截面直径为105mm的圆形瓶颈110的一次性塑料瓶用作容器100。该容器具有圆角边缘(图6和图7)；但是这几乎不影响该系统的特征。使用直接作用于瓶夹具上的步进电动机进行驱动(图11)。

在容器100内设置细胞分离器300，从而将生物反应器作为灌注系统来操作(图9)。细胞分离器300包括垂直通过连接至管径d(＝350)为70mm的圆柱形分离管310的盖子120b而引导的吸管340，其中在吸管340与分离管310顶部区域之间的过渡区域形成收获料流收集器320，并且分离体积V_A在分离管310底部形成下部开口(图7)。

为免除移动密封件，将吸管340整合固定到盖子120b上，并因此使其围绕生物反应器的固定轴(101)作周期性变换方向的旋转运动(也称为振荡运动)(同步旋转实施方案)。作为对比实验，替代地，将吸管340紧固到支架上；在这些实验中，然后静态地使用细胞分离器300。

在灌注操作中，将分离管310伸入到容器中的悬浮液中(填充水平390>底部间距s，380)。

通过连接在收获料流收集器320上的灌注泵(购自Watson&Marlow的蠕动泵)，通过抽吸将悬浮液从底部抽到分离管310的分离体积V_A中。在分离管310中，悬浮液上升并因细胞/颗粒的沉降而澄清(垂直分离)。颗粒沿与流动相反的方向向下落出分离体积，并回到培养体积V_k中(图7)。经澄清的溶液由分离管310的收获料流收集器320收集并经由吸管340移出。

分离管的澄清面积A对应于其圆形横截面并且根据公式III计算。

PAN-X研究：

将颗粒体系PAN-X(聚丙烯腈，购自Dralon GmbH的球形颗粒)用作模型颗粒以研究本发明的反应瓶使用整合的细胞分离器在细胞培养中的分离性能。

为了物理特性测试的一致性，比较了粒径分布和颗粒降落速度，这是因为它们是沉降的决定因素。

粒径分布由激光衍射法测定(Mastersizer 2000，根据操作说明来测量)。结果绘制为以总体积计的颗粒体积％作为粒径μm的函数。模态值X_Mod表明最常代表的体积方面的粒径，并且约为21μm。

使用沉降天平分析下降速率。为此，制备具有与在实验中所使用的悬浮液浓度相同的悬浮液。将PAN-X悬浮在脱盐水(＝完全无离子(CIF)的水)中，并使其具有约3g/l的质量浓度或者以体积计的0.88的体积浓度。选择在20℃的温度下进行分析。在实验条件下，在各种PAN-X批次中测量的下降速率v_s为0.129m/h至0.137m/h，并且符合非受阻沉降的条件。

例如，CHO细胞的沉降速率为0.0145m/h[Searles J A，Todd P，Kompala D S，Biotechnol Prog(1994)10：198-206]，并因此是相对缓慢的沉降细胞。杂交瘤细胞系AB2-143.2的沉降速率为0.029m/h[Wang Z，Belovich J M(2010)Biotechnol Prog 26(5)：1361-1366]。

为制备模型悬浮液，称出3g的PAN-X，并使用磁力搅拌器将其悬浮在1000ml的CIF水中。关于取样，将收获料流收集在量筒中，同时移走的体积以CIF水来代替，并由第二蠕动泵提升至H/D＝1的填充水平。

其中除非另有说明，所有实验都在以下标准参数下进行：

加速度a＝1000°/s²(P/V＝11.12W/m³)

同步旋转分离器

澄清面积负载v＝0.1m/h

距离底部的距离s＝70mm

颗粒浓度的重量分析测定法：通过过滤(抽滤)限定体积的收获料流，随后干燥并用干燥天平称重过滤器，以重量分析测定收获流中的颗粒浓度。

在各种分离长度l(＝370)上测定加速度或功率输入对截留度的影响。为此，比较了使用静态分离器和同步旋转分离器的实验(结果参见图12)。将图6和图7中的具有突变的截面收缩的收获料流收集器安装在直径d＝70mm的分离管上。在600至2000°/s²的加速度下对90mm和170mm的分离长度L进行了研究。

在各种功率输入P/V(最高达P/V＝50W/m³)并且澄清面积负载v＝0.1m/h时，对PAN模型颗粒截留性能的比较表明，截留度R随向安装有同步旋转分离管的生物反应器的功率输入的增加而降低，并且截留度通过增加的分离长度L而受到显著有利的影响。

在其它实验中，在分离长度l＝108mm、功率输入P/V＝11.12W/m³(a＝1000°/s²)且v＝0.1m/h下，研究了各种收获料流收集器的影响。将图6和7的具有突变的横截面收缩的收获料流收集器(也称为更简易的收集器)——其与图8的具有锥形横截面收缩(孔径角为54°且分离长度l＝58mm)的收获料流收集器的直径比dv/d＝5/70——置于生物反应器的盖子120b中以进行同步旋转。结果表明锥形收获料流收集器具有明显的优势。在分离长度l为90至143mm的整个实验范围内，该分离器的截留性能出人意料地几乎不变。在突然扩张的收获料流收集器中，其分离性能随分离长度l从90至170mm的增加而增加，但是没有完全达到锥形的截面收缩的性能。

距离底部的距离影响：

为研究距离底部的距离，使用具有图6和图7的简易收获料流收集器并且具有分离长度l＝90mm的分离管。将分离管调节至距离底部的距离s为10至90mm。在P/V＝11W/m³且v＝0.1m/h的标准实验条件下，当d＝70mm且l＝90mm的分离管在距离底部的距离为10<s[mm]<70的区域内时，未能观察到距离底部的距离影响。直到s>70mm以上时才观察到距离底部的距离影响。

澄清面积负载的影响：

分离管的澄清面积负载v对应于垂直上升的培养基的速率，并且根据公式IV，对颗粒截留具有直接的影响。研究了澄清面积负载对图6和图7的分离管(d＝70mm,l＝170mm)的影响。将分离管固定于瓶盖中以在与底部的距离s＝70mm时同步旋转。在3.43W/m³的功率输入(a＝600°/s²)和v＝0.025m/h至v＝0.2m/h的澄清面积负载的条件下操作反应器。在所研究的0.025<v[m/h]<0.2的负载范围内，截留度R几乎随分离器的面积负载或上升速率v的增加而线性下降。这种结果不仅归因于分离器的性能，还归因于所使用的模型悬浮液的沉降特性。PAN-X颗粒可作为具有宽粒径分布和下降速率的多分散悬浮液而获得。因此，可认为在几乎单分散的细胞悬浮液中，截留特性具有移向更陡和更小的上升速率的过程。

各种分离系统的性能的比较以“截留度R-澄清面积负载”的形式示于图13中。将安装在反应罐内以在P/V_K≈3W/m³的功率输入下以8cm²和39cm²的分离面积(内管1和2)同步旋转的两个垂直分离器与静态外部重力分离器的变型比较，所述静态外部重力分离器的变型例如为常规的垂直分离罐、根据EP 1451290所述的倾斜管式分离器和根据EP12001121.8所述的立方体分离器。实验结果证明所有分离器在所研究的0.025至0.2m/h澄清面积负载的整个范围内的截留性能几乎等同，而立方体分离器具有稍微的优势。

在欧洲区域发展基金(European Fund for Regional Development(EFRD))的背景下，根据财政援助协定“Bio.NRW：ProCell–Innovativeplatform technologies for integrated process development with cellcultures”促进了导致本发明的研究。

Claims (15)

1.具有底、壁、内部和至少一个内部轴的尺寸稳定的有角塑料瓶作为生物反应罐用于培养细胞的用途。

2.包括具有底、壁、内部和至少一个可封闭的通向内部的通路的尺寸稳定的方形塑料瓶的反应罐，其中所述可封闭的通路由至少一个瓶颈和/或至少一个通道组成，并且其中在内部，在由坐标定义的位点处在塑料瓶的一个或多个下部区域的壁上安装有一个或多个传感器贴片。

3.包括具有底、壁、内部和至少一个可封闭的通路的尺寸稳定的有角塑料瓶的反应罐，其中所述可封闭的通路由至少一个瓶颈组成，并且其中所述瓶颈通过盖子封闭，所述盖子具有用于将气体和液体供给至反应罐并从反应罐中移出的通道和/或连接件，但是不具有用于传动轴的通道。

4.权利要求3的反应罐，其中，为移出气体，将装配有带有加热垫的无菌过滤器的排气管线引导穿过所述盖子。

5.权利要求3至4任一项的反应罐，其中将一个或多个电子、光电或电化学传感器引导穿过所述盖子。

6.权利要求3至5任一项的反应罐，还包括内部垂直细胞分离器，其包括：

a.具有管径为d的圆形横截面的中心垂直分离管，其中管径d与瓶横截面边长D的比例为0.25至0.90，和

b.具有用于通过抽吸而移出不含细胞的培养液的收集器的分离头，其中将所述细胞分离器静态地固定于反应罐的盖中，或将其安装以能够旋转，并且将所述收集器引导穿过所述盖子。

7.权利要求3至6任一项的反应罐，还包括一次性取样元件，其中所述一次性取样元件具有安装在反应罐的壁上或者盖上的取样吸入管线(1110)，并且其通过Y型构件(1170)与样品输送管线(1120)连接，并通过所述样品输送管线(1120)而将取样管线连接至自动化平台(1190)以将液体全自动地无菌取出，其中所述样品输送通过连接至Y型构件的空气供给(1210)来支持。

8.反应器，其包括：

-由具有底、壁、内部和至少一个可封闭的通向内部的通路的尺寸稳定的有角塑料瓶形成的反应罐，其中所述可封闭的通路由至少一个瓶颈和/或至少一个通道组成，以及

-包括用于接收所述反应罐的反应罐接收外围设备，其中所述反应罐接收外围设备由下列部件组成：

-至少一个用于在每种情况下接收一个反应罐的反应罐夹具，其具有适应于所述反应罐的覆盖区和一个或多个横向固定元件，

-连接至所述反应罐夹具的驱动单元，其用于进行周期性改变方向的旋转运动。

9.权利要求8的反应器，其中在由坐标定义的位点处，将一个或多个传感器贴片安装在塑料瓶的一个或多个下部区域的壁上，并且其中，在所述反应罐夹具上，直接地固定或者通过光波导固定用于激发并读取所述传感器贴片的一个或多个光电传感器系统。

10.权利要求9的反应器，其中所述光电传感器系统通过差分串行接口和/或无线电以硬连线的方式来传输收集的数据。

11.权利要求10的反应器，其中驱动单元为不具有与电动机和驱动直接耦合的齿轮的步进电动机。

12.权利要求8至11任一项的反应器，其中所述反应罐的可封闭的通路为瓶颈并且通过盖子来封闭，所述盖子具有用于向所述反应罐供给气体和液体的通道和/或连接件，而不具有用于传动轴的通道。

13.用于接收反应罐的反应罐接收外围设备，其中所述反应罐接收外围设备包括：

-至少一个用于在每种情况下接收一个反应罐的反应罐夹具，其具有适应于所述反应罐的覆盖区和一个或多个横向固定元件，

-一个或多个紧固在所述反应罐夹具上的光电传感器系统，其用于读取在由坐标定义的反应罐的位置处横向安装的传感器贴片，

-连接至所述反应罐夹具的驱动单元，其用于进行周期性改变方向的旋转运动，其中所述驱动单元为不具有与电动机和驱动直接耦合的齿轮的步进电动机。

14.在权利要求8至12任一项的反应器中培养细胞的方法，其中在具有>10W/m³的功率输入时，使所述反应罐置于绕其固定垂直轴且角度幅度α在2°≤|α|≤3600°范围内的周期性改变方向的旋转运动中。

15.权利要求14的培养细胞的方法，其特征在于下降速率为0.01至100cm/h，其中所述反应罐具有由中心垂直分离管和分离头形成的内部垂直细胞分离器，所述分离头具有用于通过抽吸而除去不含细胞的培养基的收集器，其中将所述细胞分离器紧固在静态或旋转地安装在反应罐的盖子上，并且将所述收集器引导穿过所述盖子，其中通过抽吸从反应罐中移出使用所述细胞分离器而从细胞中分离出的培养液。