CN103881984A - 无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法及其药品制剂生产方法 - Google Patents

Abstract

一种无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法，包括如下步骤：（1）细胞扩增；（2）生物反应器接种，培养液灌注培养和细胞再扩增；将从转瓶收获的细胞接种到生物反应器内进行培养；培养液的pH和溶氧(DO)值由生物反应器的控制器通过pH和溶氧探头来自动控制；其中，pH控制在6.5-8.2之间，DO控制在15%-75%之间；培养液的温度由生物反应器平台内的电加热器来自动控制在36–37℃之间；摇摆速度控制在15–20rpm之间，摇摆角度控制在8-15度之间；（3）细胞的稀释和转送到大体积的生物反应器；（4）重组腺病毒感染和扩增。本发明公开了一种基于无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法，该方法可以实现大规模工业化，安全和经济有效的GMP生产重组腺病毒产品。

Description

无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法及其药品制剂生产方法

【技术领域】

本发明属于生物制药工艺领域，特别是涉及重组腺病毒基因治疗产品GMP大规模生产的方法和过程。

【背景技术】

经过几十年的研究和发展，基因治疗领域已有了长足的发展，并实现了产品突破。深圳赛百诺基因技术公司的今又生重组腺病毒p53产品和荷兰UniQure公司的Glybera重组腺相关病毒（AAV）产品已先后得到政府医药监管机构的批准上市。今又生产品是由复制缺陷型5型腺病毒载体与人p53基因重组的肿瘤基因治疗制品。研究表明，p53基因指导合成p53蛋白，在正常组织中，p53蛋白的表达量很低，在受到DNA损伤等刺激时，p53蛋白表达量升高，发挥细胞增殖调控作用，抑制细胞分裂，诱导细胞凋亡；不同类型的肿瘤中，p53基因突变频率可达50～60%。本品瘤内注射，可通过腺病毒感染将p53基因导入肿瘤细胞，表达p53蛋白，从而发挥抑制细胞分裂，诱导肿瘤细胞凋亡的作用。传统的实验室基因治疗产品的制备方法已不能满足基因治疗产品GMP大规模产业化的要求。迫切需要开发能满足GMP生产技术要求的大规模生产方法和过程。

【发明内容】

本发明的发明目的是开发一种全新的大规模生产重组腺病毒方法，并将该方法与重组腺病毒药品制剂的生产相结合，成功实现重组腺病毒p53产品的产业化。

本发明是通过以下的技术方案来实现的:一种无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法，包括如下步骤：

（1）细胞扩增

取1x10⁷到1x10⁸个无血清悬浮细胞工作细胞库的细胞，融化后接种到细胞培养用转瓶内，接种密度为3x10⁴到9x10⁴/毫升；在37℃,5%二氧化碳孵箱内培养；所述细胞培养用转瓶的摇转速度在50–150rpm；培养细胞密度到约2x10⁶/毫升时，用新鲜培养液稀释细胞浓度到2x10⁵/毫升，并扩增到更大的转瓶内，继续培养；重复上述细胞扩增的操作，直到用于接种的细胞量达到2x10⁹以上；

（2）生物反应器接种，培养液灌注培养和细胞再扩增

将从转瓶收获的细胞接种到生物反应器内进行培养；培养液的pH和溶氧(DO)值由生物反应器的控制器通过pH和溶氧探头来自动控制；其中，pH控制在6.5-8.2之间，DO控制在15%-75%之间；培养液的温度由生物反应器平台内的电加热器来自动控制在36–37℃之间；摇摆速度控制在15–20rpm之间，摇摆角度控制在8-15度之间；

当细胞在生物反应器内生长到浓度至2.0-3.0x10⁶/毫升时，开始培养液灌注培养，来不断的提供养分和排除细胞代谢有害副产品；在灌注培养时，用过的培养液，通过过滤膜底部的细小空隙和过滤膜连接的乳胶管，被抽出生物反应器到废液桶内；细胞被保留在反应器内；生物反应器的重量控制系统会同时将同等重量的新鲜培养液，经过另外一个乳胶管输入到反应器内，以保持细胞培养体积的恒定；调节培养液灌注量来保持生物反应器内培养液的葡萄糖浓度不低于1.5g/升；

（3）细胞的稀释和转送到大体积的生物反应器继续培养细胞；当细胞浓度达到1.0x10⁷/毫升时，将细胞从当前的生物反应器转送到十倍体积的用于重组腺病毒的感染的下一个生物反应器；该生物反应器预先已加有了90升新鲜培养液；此处对细胞进行十倍新鲜培养液稀释的目的是为了保证细胞在下一步重组腺病毒的感染和扩增过程中的活性和提供充分的营养。稀释后细胞浓度约1.0x10⁶/毫升，重组腺病毒感染的最佳细胞浓度。在转送到大体积的生物反应器后，首先让稀释后的细胞在生物反应器内隔夜培养，以保证细胞在重组腺病毒感染时处于最佳的活性状态。培养液的pH和溶氧(DO)值有生物反应器的控制器通过pH和溶氧探头来自动控制；pH控制在6.5-8.2之间；DO控制在15%-75%之间；培养液的温度通过生物反应器的电加系统来自动控制在36–37℃之间；生物反应器的摇摆速度控制在10–15rpm之间，摇摆角度控制在8-15度之间，如果采用搅拌式生物反应器，则搅拌速度控制在50-100rpm之间。

（4）重组腺病毒感染和扩增

取重组腺病毒的工作病毒库病毒来感染生物反应器内的细胞；病毒感染复数控制在10–100vp/细胞之间。病毒感染后，细胞培养参数维持不变。病毒感染过程中不需要再添加新鲜培养液；培养4天，重组腺病毒会释放到培养液内；从反应器内收获含有重组腺病毒的培养液。

可选的，在收获前向反应器内加入1%(终浓度)的Tween-20，搅拌0.5-1小时，来确保细胞的裂解和病毒全部释放到培养液内。

所述重组腺病毒的生产细胞是具有无血清悬浮培养特性的SBN-293SFS克隆细胞，该细胞的生产方法为：从美国的Invitrogen公司购买293F细胞（#11625-019），用无血清的CD293培养液在转瓶内悬浮培养和扩增293F细胞，当取得了一定量的细胞后，将细胞冷冻；细胞冷冻液采用CD293+10%DMSO，细胞浓度1-5x10⁷/毫升；用可编程细胞冷冻箱来冷冻细胞；然后存放在液氮罐的上汽层备用。为了保证细胞的纯度和稳定性，采用终点稀释方法对细胞进行克隆筛选，所得到的细胞克隆取名为SBN-293SFS细胞。

进一步地，所述无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法进一步包括重组腺病毒培养液滤清和浓缩，首先将收获的重组腺病毒培养液用0.65μm的切向流微滤系统过滤，除去细胞碎片等大的杂质；再将滤清的收集液用另外一个300KDMWCO的切向流超滤系统浓缩约10–50倍；对浓缩的收集液进一步进行渗滤处理，将收集液转化到另外一个缓冲液内，渗滤系数在3-10之间；切向流超滤浓缩和渗滤过程压力参数控制在5-20psi之间。

所述无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法进一步包括核酸酶处理步骤，可选的，为了提高核酸酶处理的效率，可以在加入核酸酶前，用缓冲液稀释浓缩和渗滤过的收集液。本步骤采用的核酸酶为Benzonase^TM，将Benzonase^TM加入到用缓冲液稀释过的浓缩和渗滤的收集液，来降解游离的核酸分子；剂量在10-20u/毫升之间；降解处理在37℃的水浴中进行1个小时。

所述无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法进一步包括全自动离子交换柱层析分离纯化步骤；在室温的条件下，用阴离子交换柱层析分离纯化Benzonase^TM处理过的重组腺病毒收集液，纯化过程采用Unicorn软件控制的全自动的纯化系统；将阴离子交换树脂（eg.Sepharose Q XL）装柱于BPG300的柱子内，装柱体积约6升；在使用柱子前，先对柱子进行HETP(HeightEquivalent to Theoretical Plate)检测，以保障柱子的性能是合格的；在上柱前，首先用1.0N的NaOH溶液对纯化系统和装有阴离子交换树脂的柱子进行消毒处理；处理后的柱子首先用A缓冲液（20mM Tris,pH8.0）平衡；柱子平衡后，开始将重组腺病毒收集液上柱；上柱后，用5-8倍柱体积的A缓冲液清洗柱子直到UV吸收值降到底线为止；紧接着用30倍柱体积的A缓冲液到B缓冲液（20mM Tris,pH8.0,2M NaCl）的线性NaCl梯度来洗脱吸附在柱子上的重组腺病毒；在洗脱过程中Unicorn软件通过对280nm的UV吸收值的自动监测来确定重组腺病毒峰的出现；当280nm的UV吸收值升到0.1AU时纯化的重组腺病毒峰会自动的接收到一个消毒无菌的瓶子内；当280nm的UV吸收值降到0.2AU时，停止接收；之后，依次用碱液，缓冲液，和酸液，缓冲液洗涤柱子和纯化系统；最后将柱子和纯化系统存放于0.01N NaOH的存储液内。

一种无血清悬浮细胞生产重组腺病毒药品制剂生产方法，包括，首先将柱层析纯化后的重组腺病毒用小型的300KD MWCO的切向流超滤系统(eg.Millipore Pellicon系统)进一步浓缩，以达到重组腺病毒产品的病毒滴度的指标(eg.1x10¹²vp/毫升)；然后用重组腺病毒产品的配液(eg.20mMTris-HCl,pH8.0,含有10%的甘油)进一步进行渗滤；渗滤系数在10-15之间，以确保纯化的重组腺病毒完全转换到产品的配液内，并保证产品的稳定性；切向流超滤浓缩和渗滤过程压力参数控制在5-10psi之间；用0.22μm无菌过滤器过滤配液后的重组腺病毒来生产产品的无菌散装药液；对无菌散装药液取样，质检检测；无菌散装药液可以暂时存放在-80C的冻箱内；合格的无菌散装药液再用于重组腺病毒药品制剂的瓶装。

将要瓶装的一批或多批无菌散装药液在室温下过夜融冻，再次用0.22μm无菌过滤器过滤来生产无菌的装瓶药液。

本发明的技术方案有益效果在于：本发明公开了一种基于无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法，该方法可以实现大规模工业化，安全和经济有效的GMP生产重组腺病毒产品。

【附图说明】

图1为本发明的方法流程图；

图2为灌注浪式生物反应器的结构和工作原理图；

图3为SBN-293SFS细胞在转瓶内悬浮培养的生长曲线；

图4为SBN-293SFS细胞在浪式Wave-20灌注生物反应器的生长曲线；

图5为柱层析分离纯化过程记录图。

【具体实施方式】

下面结合附图和实施例进一步具体说明本发明的技术方案。

参照图1所示实施例1，一种无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法，包括如下步骤：

1、细胞扩增

取1只无血清悬浮细胞工作细胞库的细胞管，细胞量约1x10⁷到1x10⁸。细胞融化后接种到细胞培养用转瓶内，接种密度约3x10⁴到9x10⁴/毫升。在37℃,5%二氧化碳孵箱内培养。转瓶的摇转速度在50–150rpm。培养细胞密度到约2x10⁶/毫升时，用新鲜培养液稀释细胞浓度到2x10⁵/毫升，并扩增到更大的转瓶内，继续培养。重复细胞扩增的操作，直到有足够量的细胞用于接种生物反应器。

2、生物反应器接种，培养液灌注培养和细胞再扩增

采用了简单，有效的灌注培养无血清悬浮细胞的浪式生物反应器（eg.WaveBioreactor,GE Healthcare,USA）来进行高密度大规模的细胞培养。图2显示了灌注浪式生物反应器的结构和工作原理。浪式生物反应器采用连续的平缓摇摆运动来达到细胞培养的混合和供氧，对细胞不会产生剪切损伤，十分适合细胞的无血清悬浮培养。在浪式生物反应器的细胞培养袋内安装一个过滤膜，就形成了一个可以用于灌注培养的浪式生物反应器。在细胞培养过程中，过滤膜悬浮在培养液的表面，并随着培养液的浪式运动，而来回的浮动，可以有效的防止过滤膜在培养液关注的堵塞。浪式生物反应器的细胞培养袋是无菌的，直接可以使用而不许要进一步的消毒处理。将细胞培养袋安放在Wave-20浪式生物反应器的平台后，通过细胞培养袋上的接种乳胶管，首先加入9升的无血清培养液（eg,CD-293,Invitrogen）。将从转瓶收获的细胞接种到生物反应器内进行培养。细胞接种量约2x10⁹。培养液的pH和溶氧(DO)值有生物反应器的控制器通过pH和溶氧探头来自动控制。pH控制在6.5-8.2之间。DO控制在15%-75%之间。培养液的温度有生物反应器平台内的电加热器来自动控制在36-37C之间。摇摆速度控制在15–20rpm之间，摇摆角度控制在8-15度之间。

当细胞在浪式生物反应器内生长到浓度至2.0-3.0x10⁶/毫升时，开始培养液灌注培养，来不断的提供养分和排除细胞代谢有害副产品。在灌注培养时，用过的培养液，通过过滤膜底部的细小空隙和过滤膜连接的乳胶管，被抽出生物反应器到废液桶内。细胞被保留在反应器内。生物反应器的重量控制系统会同时将同等重量的新鲜培养液，经过另外一个乳胶管输入到反应器内，以保持细胞培养体积的恒定。调节培养液灌注量来保持生物反应器内培养液的葡萄糖浓度不低于1.5g/升。继续培养细胞。当细胞浓度达到1.0x10⁷/毫升时，将细胞从Wave-20生物反应器转送到大约十倍体积的用于重组腺病毒的感染的下一个生物反应器，比如Wave-200或其他的搅拌式生物反应器。

3、细胞的稀释和转送到大体积的生物反应器

当细胞浓度在Wave-20浪式生物反应器内达到1.0x10⁷/毫升时，将细胞从Wave-20生物反应器转送到预先已加有了90升新鲜培养液的下一个大体积的生物反应器中。这下一个大体积的生物反应器可以是Wave-200或其他的搅拌式生物反应器。

对细胞进行十倍新鲜培养液稀释的目的是为了保证细胞在下一步重组腺病毒的感染和扩增过程中的活性和提供充分的营养。稀释后细胞浓度约1.0x10⁶/毫升，重组腺病毒感染的最佳细胞浓度。在转送到大体积的生物反应器后，首先让稀释后的细胞在生物反应器内隔夜培养，已保证细胞在重组腺病毒感染时处于最佳的活性状态。

培养液的pH和溶氧(DO)值有生物反应器的控制器通过pH和溶氧探头来自动控制。pH控制在6.5-8.2之间。DO控制在15%-75%之间。培养液的温度通过生物反应器的电加系统来自动控制在36-37C之间。Wave-200生物反应器的摇摆速度控制在10–15rpm之间，摇摆角度控制在8-15度之间。如果采用搅拌式生物反应器，搅拌速度控制在50-100rpm之间。

4、重组腺病毒感染和扩增

取重组腺病毒的工作病毒库病毒来感染生物反应器内的细胞。病毒感染复数控制在10–100vp/细胞之间。病毒感染后，细胞培养参数维持不变。病毒感染过程中不需要再添加新鲜培养液。培养4天，重组腺病毒会释放到培养液内。在收获前可以向反应器内加入1%(终浓度)的Tween-20，搅拌0.5-1小时，来确保细胞的裂解和病毒全部释放到培养液内。从反应器内收获含有重组腺病毒的培养液，用于下一步的处理纯化。

5、重组腺病毒培养液滤清和浓缩

首先将收获的重组腺病毒培养液用0.65μm的切向流微滤系统过滤，除去细胞碎片等大的杂质。再将滤清的收集液用另外一个300KD MWCO的切向流超滤系统浓缩约10–50倍。对浓缩的收集液进一步进行渗滤处理，将收集液转化到另外一个缓冲液内，以方便接下来的核酸酶处理和离子交换柱层析分离纯化。渗滤系数在3-10之间。切向流超滤浓缩和渗滤过程压力参数控制在5-20psi之间。为了提高核酸酶处理的效率，可以在加入核酸酶前，用缓冲液稀释浓缩和渗滤过的收集液。

6、核酸酶处理

本过程采用了Benzonase^TM，一个广泛用于生物制品生产过程的广谱内核酸酶。将Benzonase^TM加入到用缓冲液稀释过的浓缩和渗滤的收集液，来降解游离的核酸分子。剂量在10-20u/毫升之间。降解处理在37℃的水浴中进行1个小时。

7、全自动离子交换柱层析分离纯化

在室温的条件下，用阴离子交换柱层析分离纯化Benzonase^TM处理过的重组腺病毒收集液。纯化过程采用Unicorn软件控制的全自动的纯化系统。将阴离子交换树脂（eg.Sepharose Q XL）装柱于BPG300的柱子内，装柱体积约6升。在使用柱子前，先对柱子进行HETP(Height Equivalent to TheoreticalPlate)检测，以保障柱子的性能是合格的。在上柱前，首先用1.0N的NaOH溶液对纯化系统和装有阴离子交换树脂的柱子进行消毒处理。处理后的柱子首先用A缓冲液（20mM Tris,pH8.0）平衡。柱子平衡后，开始将重组腺病毒收集液上柱。上柱后，用5-8倍柱体积的A缓冲液清洗柱子直到UV吸收值降到底线为止。紧接着用30倍柱体积的A缓冲液到B缓冲液（20mM Tris,pH8.0,2M NaCl）的线性NaCl梯度来洗脱吸附在柱子上的重组腺病毒。在洗脱过程中Unicorn软件通过对280nm的UV吸收值的自动监测来确定重组腺病毒峰的出现。当280nm的UV吸收值升到0.1AU时纯化的重组腺病毒峰会自动的接受到一个消毒无菌的瓶子内。当280nm的UV吸收值降到0.2AU时，停止接受。之后，依次用碱液，缓冲液，和酸液，缓冲液洗涤柱子和纯化系统。最后将柱子和纯化系统存放于0.01N NaOH的存储液内。

8、产品配制和瓶装

首先将柱层析纯化后的重组腺病毒用小型的300KD MWCO的切向流超滤系统(eg.Millipore Pellicon系统)进一步浓缩，以达到重组腺病毒产品的病毒滴度的指标(eg.1x10¹²vp/毫升)。然后用重组腺病毒产品的配液(eg.20mM Tris-HCl,pH8.0,含有10%的甘油)进一步进行渗滤。渗滤系数在10-15之间，以确保纯化的重组腺病毒完全转换到产品的配液内，并保证产品的稳定性。切向流超滤浓缩和渗滤过程压力参数控制在5-10psi之间。用0.22μm无菌过滤器过滤配液后的重组腺病毒来生产产品的无菌散装药液。对无菌散装药液取样，质检检测。无菌散装药液可以斩时存放在-80℃的冻箱内。合格的无菌散装药液再用于重组腺病毒药品制剂的瓶装。

将要瓶装的一批或多批无菌散装药液在室温下过夜融冻。再次用0.22μm无菌过滤器过滤来生产无菌的装瓶药液。从无菌的装瓶药液取样用于质检检测后,用自动灌装机将无菌的装瓶药液按产品要求进行瓶装，加瓶塞和扎盖。灌装结束后，对重组腺病毒的制剂产品抽样进行质检检测。合格的产品由质保批准用于临床使用。

实施例2，从美国的Invitrogen公司购买293F细胞（#11625-019）。用无血清的CD293培养液在转瓶内悬浮培养和扩增293F细胞。当取得了一定量的细胞后，将细胞冷冻。细胞冷冻液采用CD293+10%DMSO，细胞浓度1-5x10⁷/毫升。用可编程细胞冷冻箱来冷冻细胞。然后存放在液氮罐的上汽层备用。

为了保证细胞的纯度和稳定性，采用终点稀释方法对细胞进行克隆筛选。所得到的细胞克隆取名为SBN-293SFS细胞。用无血清的CD293培养液在转瓶内悬浮培养和扩增SBN-293SFS细胞。当取得了一定量的细胞后，将细胞冷冻。细胞冷冻液采用CD293+10%DMSO，细胞浓度1-5x10⁷/毫升。用可编程细胞冷冻箱来冷冻细胞。然后存放在液氮罐的上汽层备用。

融解一个SBN-293SFS细胞管，接种到加有100毫升CD293培养液的转瓶内。在37C，10%CO₂培养箱内培养。转瓶转动速度90rpm。图3显示了用无血清的CD293培养液在转瓶内悬浮培养SBN-293SFS细胞的生长曲线。

SBN-293SFS细胞在无血清的CD293培养液内显示了良好的活性和生长速度，适合于大规模细胞培养。

将培养了6天的SBN-293SFS细胞，转移到离心管内。在1200rpm下离心，去掉用过的培养液，用新鲜的CD293培养液重新悬浮细胞，细胞浓度1x10⁶/毫升。用用过的培养液重新悬浮细胞，细胞浓度1x10⁶/毫升，做对照。将100毫升的细胞悬浮液加入到500毫升的转瓶内。用重组腺病毒感染，感染复数50病毒颗粒/细胞。在37^oC，10%CO₂培养箱内培养4天。转瓶转动速度90rpm。向细胞培养液内加入Tween-20，终浓度1%。再培养0.5-1小时。收集含有病毒的培养液。用HPLC检测方法分析确定培养液内的病毒浓度。表1显示了重组腺病毒的浓度和生产率。

表1重组腺病毒的浓度和生产率

在病毒感染时用新鲜CD293培养液悬浮细胞，大大地提高了重组腺病毒的生产率（高10倍）。所达到的重组腺病毒的生产率和文献报道的在传统的有血清贴壁293细胞中的重组腺病毒的生产率，50,000–100,000(病毒颗粒/细胞)，相当。此试验结果证实了无血清悬浮SBN-293SFS细胞具有良好的生产重组腺病毒的能力。在病毒感染时为SBN-293SFS细胞提供新鲜的CD293培养液是保证重组腺病毒生产能力的一个重要因素。

实施例3：用浪式Wave-20灌注生物反应器大规模高密度培养SBN-293SFS细胞和重组腺病毒的感染。

为了避免在无菌条件下离心大量细胞培养液的复杂性，我们采取了用新鲜CD293培养液来稀释高密度的SBN-293SFS细胞，稀释倍数约十倍，的放大方法来在重组腺病毒感染前为细胞提供足够的新鲜培养液。我们采用了浪式Wave-20灌注生物反应器来大规模高密度地培养SBN-293SFS细胞。细胞浓度可以达到或高于1x10⁷/毫升。当细胞浓度达到1x10⁷/毫升后，加入新鲜CD293培养液将细胞稀释到1x10⁶/毫升，并同时将细胞培养液转送到另外一个更大体积的生物反应器进行重组腺病毒的感染和生产。

融解一个SBN-293SFS细胞管，接种到加有100毫升CD293培养液的转瓶内。在37℃，10%CO₂培养箱内培养。转瓶转动速度90rpm。培养6天后，细胞浓度高于2x10⁶/毫升时，用900毫升新鲜CD293培养液稀释细胞到1000毫升，并转到一个2000毫升的转瓶内，继续在37℃，10%CO₂培养箱内培养。转瓶转动速度依然为90rpm。再培养5-6天后，细胞浓度高于2x10⁶/毫升时，将细胞培养液接种到已加入了9升的CD293培养液的Wave-20灌注生物反应器，继续培养扩增细胞。pH控制在6.5-8.2之间。DO控制在15%-75%之间。培养液的温度控制在36–37℃之间。摇摆速度控制在15–20rpm之间，摇摆角度控制在8-15度之间。当细胞浓度达到或高于2x10⁶/毫升时，开始培养液灌注。调节培养液灌注量来保持生物反应器内培养液的葡萄糖浓度不低于1.0g/升。继续培养细胞。当细胞浓度达到1.0x10⁷/毫升时，从反应器中取出100毫升细胞培养液，用900毫升新鲜CD293培养液稀释到1000毫升，并转到一个2000毫升的转瓶内。放入37℃，10%CO₂的培养箱内培养，培养隔夜。转瓶转动速度为90rpm。第二天，用重组腺病毒感染，感染复数50病毒颗粒/细胞。在37℃，10%CO2培养箱内培养4天。转瓶转动速度90rpm。向细胞培养液内加入Tween-20，终浓度1%。再培养0.5-1小时。收集含有病毒的培养液。用HPLC检测方法分析确定培养液内的病毒浓度。图4显示了SBN-293SFS细胞在浪式Wave-20灌注生物反应器的生长曲线。

用浪式Wave-20灌注生物反应器成功地实现了大规模高密度灌注培养SBN-293SFS细胞。在培养了10天后细胞浓度达到了1.2x10⁷/毫升，活性95%，总细胞量达到了1.2x10¹¹，细胞生长率和在转瓶培养时类似。表2显示了重组腺病毒的浓度和生产率。

表2重组腺病毒的浓度和生产率

用新鲜CD293培养液稀释用Wave-20灌注生物反应器培养的高密度SBN-293SFS细胞，用于重组腺病毒感染，达到了类似用离心换液方法所取得的病毒生产率。这一结果表明，在重组腺病毒感染前，用新鲜CD293培养液稀释(10倍)高密度的细胞培养液，是一个有效可行的生产放大方法。

实施例4：用浪式Wave-20灌注生物反应器大规模高密度培养SBN-293SFS细胞和100升重组腺病毒的感染和生产和离子交换柱层析分离纯化。

在证实了浪式Wave-20灌注生物反应器大规模高密度培养SBN-293SFS细胞和稀释细胞用于重组腺病毒感染的可行性后，对Wave-20灌注生物反应器培养的细胞全部用重组腺病毒进行了感染，总体积100升。感染复数50病毒颗粒/细胞。生物反应器pH控制在6.5-8.2之间，DO控制在15%-75%之间，培养液的温度控制在36-37℃之间，摇摆速度控制在15–20rpm之间，摇摆角度控制在8-15度之间。培养4天后，向细胞培养液内加入Tween-20，终浓度1%。再培养0.5-1小时。收集含有病毒的培养液。将所有的收集液汇总在一起进行分离纯化。用HPLC检测方法分析确定所收集的培养液内的病毒浓度和总产量。表3显示了重组腺病毒的浓度和总产量。

表3重组腺病毒的浓度和总产量

病毒生产量的数据证实了在扩大生产过程中，依然保持了病毒的高生产率。

将过滤，浓缩和Benzonase^TM处理过的重组腺病毒收集液，用装柱在BPG300柱子内的Sepharose Q XL阴离子交换树脂进行柱层析分离纯化。柱体积约6升。整个纯化过程采用全自动的Unicorn软件控制。图5显示了柱层析分离纯化过程记录图。

将收集的纯化病毒峰用小型的300KD MWCO的切向流超滤系统(MilliporePellicon系统)进一步浓缩到1x10¹²vp/毫升，然后用重组腺病毒产品的配液(20mM Tris-HCl,pH8.0,含有10%的甘油)进一步进行渗滤，渗滤系数为12，以确保纯化的重组腺病毒完全转换到产品的配液内，以保证产品的稳定性。切向流超滤浓缩和渗滤过程压力参数控制在5-10psi之间。用0.22μm无菌过滤器过滤配液后的重组腺病毒来生产产品的无菌病毒原液。对无菌原药液取样，质检检测。将无菌原药液斩时存放在-80C的冻箱内。合格的无菌原药液再用于重组腺病毒药品制剂的瓶装。表4显示了分离纯化过程重组腺病毒的产量和回收率。

表4分离纯化过程重组腺病毒的产量和回收率

从反应器病毒收集液到生产出无菌病毒原药液的总回收率为41%。其中绝大部分的病毒丢失在阴离子交换树脂柱层析分离纯化步骤，其步骤病毒回收率为52%。其他的生产步骤的病毒回收率都保持在良好的85%以上。

Claims (8)

1.一种无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法，包括如下步骤：

（1）细胞扩增

取1x10⁷到1x10⁸个无血清悬浮细胞工作细胞库的细胞，融化后接种到细胞培养用转瓶内，接种密度为3x10⁴到9x10⁴/毫升；在37℃,5%二氧化碳孵箱内培养；所述细胞培养用转瓶的摇转速度在50–150rpm；培养细胞密度到2x10⁶/毫升时，用新鲜培养液稀释细胞浓度到2x10⁵/毫升，并扩增到更大的转瓶内，继续培养；重复上述细胞扩增的操作，直到用于接种的细胞量达到2x10⁹以上；

（2）生物反应器接种，培养液灌注培养和细胞再扩增

将从转瓶收获的细胞接种到生物反应器内进行培养；培养液的pH和溶氧DO值由生物反应器的控制器通过pH和溶氧探头来自动控制；其中，pH控制在6.5-8.2之间，DO值控制在15%-75%之间；培养液的温度由生物反应器平台内的电加热器来自动控制在36–37℃之间；摇摆速度控制在15–20rpm之间，摇摆角度控制在8-15度之间；

当细胞在生物反应器内生长到浓度至2.0-3.0x10⁶/毫升时，开始培养液灌注培养，来不断的提供养分和排除细胞代谢有害副产品；在灌注培养时，用过的培养液，通过过滤膜底部的细小空隙和过滤膜连接的乳胶管，被抽出生物反应器到废液桶内；细胞被保留在反应器内；生物反应器的重量控制系统会同时将同等重量的新鲜培养液，经过另外一个乳胶管输入到反应器内，以保持细胞培养体积的恒定；调节培养液灌注量来保持生物反应器内培养液的葡萄糖浓度不低于1.5g/升；

（3）细胞的稀释和转送到大体积的生物反应器

继续培养细胞；当细胞浓度达到1.0x10⁷/毫升时，将细胞从当前的生物反应器转送到十倍体积的用于重组腺病毒的感染的下一个生物反应器；该生物反应器预先已加有了90升新鲜培养液；

培养液的pH和溶氧DO值有生物反应器的控制器通过pH和溶氧探头来自动控制；pH控制在6.5-8.2之间；DO控制在15%-75%之间；培养液的温度通过生物反应器的电加系统来自动控制在36–37℃之间；生物反应器的摇摆速度控制在10–15rpm之间，摇摆角度控制在8-15度之间，如果采用搅拌式生物反应器，则搅拌速度控制在50-100rpm之间；

（4）重组腺病毒感染和扩增

取重组腺病毒的工作病毒库病毒来感染生物反应器内的细胞；病毒感染复数控制在10–100vp/细胞之间，病毒感染后，细胞培养参数维持不变，病毒感染过程中不需要再添加新鲜培养液；培养4天，重组腺病毒会释放到培养液内；从反应器内收获含有重组腺病毒的培养液。

2.根据权利要求1所述的无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法，其特征在于，在收获前向反应器内加入终浓度为1%的Tween-20，搅拌0.5-1小时，来确保细胞的裂解和病毒全部释放到培养液内。

3.如权利要求1或2所述的无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法，其特征在于：所述重组腺病毒的生产细胞是具有无血清悬浮培养特性的SBN-293SFS克隆细胞，该细胞的生产方法为：从美国的Invitrogen公司购买293F细胞，用无血清的CD293培养液在转瓶内悬浮培养和扩增293F细胞，当取得了一定量的细胞后，将细胞冷冻；细胞冷冻液采用CD293+10%DMSO，细胞浓度1-5x10⁷/毫升；用可编程细胞冷冻箱来冷冻细胞；然后存放在液氮罐的上汽层备用。为了保证细胞的纯度和稳定性，采用终点稀释方法对细胞进行克隆筛选，所得到的细胞克隆取名为SBN-293SFS细胞。

4.根据权利要求1或2所述的无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法，其特征在于，所述方法进一步包括重组腺病毒培养液滤清和浓缩，首先将收获的重组腺病毒培养液用0.65μm的切向流微滤系统过滤，除去细胞碎片等大的杂质；再将滤清的收集液用另外一个300KD MWCO的切向流超滤系统浓缩约10–50倍；对浓缩的收集液进一步进行渗滤处理，将收集液转化到另外一个缓冲液内，渗滤系数在3-10之间；切向流超滤浓缩和渗滤过程压力参数控制在5-20psi之间，为了提高核酸酶处理的效率，在加入核酸酶前，用缓冲液稀释浓缩和渗滤过的收集液。

5.根据权利要求4所述的无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法，其特征在于所述方法进一步包括核酸酶处理步骤，本步骤采用的核酸酶为Benzonase^TM，将Benzonase^TM加入到用缓冲液稀释过的浓缩和渗滤的收集液，来降解游离的核酸分子；剂量在10-20u/毫升之间；降解处理在37℃的水浴中进行1个小时。

6.根据权利要求5所述的无血清悬浮细胞生产重组腺病毒的方法，其特征在于所述方法进一步包括全自动离子交换柱层析分离纯化步骤；在室温的条件下，用阴离子交换柱层析分离纯化Benzonase^TM处理过的重组腺病毒收集液，纯化过程采用Unicorn软件控制的全自动的纯化系统；将阴离子交换树脂装柱于BPG300的柱子内，装柱体积约6升；在使用柱子前，先对柱子进行HETP检测，以保障柱子的性能是合格的；在上柱前，首先用1.0N的NaOH溶液对纯化系统和装有阴离子交换树脂的柱子进行消毒处理；处理后的柱子首先用A缓冲液平衡；柱子平衡后，开始将重组腺病毒收集液上柱；上柱后，用5-8倍柱体积的A缓冲液清洗柱子直到UV吸收值降到底线为止；紧接着用30倍柱体积的A缓冲液到B缓冲液的线性NaCl梯度来洗脱吸附在柱子上的重组腺病毒；在洗脱过程中Unicorn软件通过对280nm的UV吸收值的自动监测来确定重组腺病毒峰的出现；当280nm的UV吸收值升到0.1AU时纯化的重组腺病毒峰会自动的接受到一个消毒无菌的瓶子内；当280nm的UV吸收值降到0.2AU时，停止接受；之后，依次用碱液，缓冲液，和酸液，缓冲液洗涤柱子和纯化系统；最后将柱子和纯化系统存放于0.01N NaOH的存储液内。

7.一种无血清悬浮细胞生产重组腺病毒药品制剂生产方法，包括，首先将柱层析纯化后的重组腺病毒用小型的300KD MWCO的切向流超滤系统进一步浓缩，以达到重组腺病毒产品的病毒滴度的指标；然后用重组腺病毒产品的配液进一步进行渗滤；渗滤系数在10-15之间，以确保纯化的重组腺病毒完全转换到产品的配液内，并保证产品的稳定性；切向流超滤浓缩和渗滤过程压力参数控制在5-10psi之间；用0.22μm无菌过滤器过滤配液后的重组腺病毒来生产产品的无菌散装药液；对无菌散装药液取样，质检检测；无菌散装药液可以暂时存放在-80℃的冻箱内；合格的无菌散装药液再用于重组腺病毒药品制剂的瓶装。

8.如权利要求7所述的无血清悬浮细胞生产重组腺病毒药品制剂生产方法，其特征在于，将要瓶装的一批或多批无菌散装药液在室温下过夜融冻，再次用0.22μm无菌过滤器过滤来生产无菌的装瓶药液。

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