CN108998344A - 一种连续大规模生产重组腺病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种连续大规模生产重组腺病毒的方法，包括以下步骤：步骤一、细胞培养；步骤二、细胞培养袋培养；步骤三、腺病毒大规模扩增；步骤四、纯化；其中，步骤二和步骤三中的细胞培养袋均置于摇床中并于恒温箱培养；细胞培养袋培养条件为温度37℃，PH7.2，摇摆速度10‑20rpm，摇床角度7‑9°。本发明通过改善细胞生长环境，减少通气对细胞的伤害，增加溶氧效果，解决传统工艺中细胞消化困难及分离转移困难问题，进而解决贴壁细胞的放大培养问题和连续生产问题，解决细胞冻融裂解困难，将贴壁细胞用填充有片状载体的细胞培养袋和摇床培养，减小机械剪切力对细胞的损伤，提高细胞的生长密度，从而提高细胞的总产量，进而提高腺病毒的产量。

Description

一种连续大规模生产重组腺病毒的方法

技术领域

本发明涉及生产重组腺病毒及腺相关病毒的技术领域，具体的说是涉及一种连续大规模生产重组腺病毒的方法。

背景技术

腺病毒载体转基因效率高，体外实验通常接近100％的转导效率；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限；容易制得高滴度病毒载体，在细胞培养物中重组病毒滴度可达(10E+11)/ml；进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，安全性高。因而，腺病毒载体在基因治疗临床试验方面有了越来越多的应用，成为继逆转录病毒载体之后广泛应用且最具前景的病毒载体。

目前针对腺病毒的大规模生产中，多采用细胞工厂，微载体，细胞罐结合片状载体，WAVE结合微载体的贴壁培养方式方式及WAVE，细胞罐悬浮培养方式。细胞工厂，不能有效监测细胞生长情况，微载体，细胞罐结合片状载体，WAVE结合微载体的贴壁培养方式方式细胞难以消化，且消化后难以分离或需要借助外部装置才能分离，进而造成扩大培养困难，增加污染的概率。而且以上方式不能连续生产。悬浮培养技术尚不成熟。细胞产量，腺病毒产量相对贴壁细胞较低。且从贴壁细胞驯化到悬浮培养细胞，周期较差，细胞相对稳定性较差。对于WAVE中增加溶氧的方式为表层通气。

本工艺采用表通和底部通气同时进行，极大的增加了溶氧效果。同时解决了气泡在液面破裂带来细胞损伤问题。更进一步由于在细胞培养袋中填充了载体，使得细胞在液体中的路径变长，极大改善了大规模培养中溶氧不足的问题。

发明内容

为解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种连续大规模生产重组腺病毒的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种连续大规模生产重组腺病毒的方法，包括以下步骤：

步骤一、细胞培养：将冻存细胞复苏、培养、传代；

步骤二、细胞培养袋培养：将步骤一中所述传代后的细胞，以1-4E+5个/ml的接种密度及1L的接种体积接种到3L的细胞培养袋中，并采用灌注培养；

当细胞培养袋内的细胞日耗糖为4-9g时，将细胞培养袋内的培养液放出，并加入PBS清洗1-3次后，加入胰酶消化，当细胞培养袋内出现絮状物且溶液浑浊时，加入细胞生长培养液终止消化，混匀，重悬后，取样，计数；

步骤三、腺病毒大规模扩增：步骤二中重悬后的细胞一部分继续留在3L的细胞培养袋培养，提供种细胞或用于腺病毒毒种扩增；另一部分接种到30L细胞培养袋进行放大培养，30L细胞培养袋接种细胞个数为1-4E+9个，接种密度1-4E+5个/ml，采用灌注培养；当细胞培养袋内的细胞日耗糖为40-90g时，细胞总量为5.3-12.6E+10个时，接种腺病毒，腺病毒感染宿主细胞的MOI为20-30；当病毒浓度达到10¹⁰vp/ml时开始连续收集病毒，直到细胞培养袋内病毒浓度低于10¹⁰vp/ml时，将细胞培养袋内病毒液排尽并收集，然后向细胞培养袋加入PBS溶液，连着细胞培养袋一起放入-80℃和37℃反复冻融3次，收集细胞培养袋内的冻融液，用PBS冲洗2次，并收集冲洗液；取样，测量病毒浓度；

步骤四、纯化：将步骤三中收集的病毒液、冻融液及冲洗液一起通过离心、超滤、核酸水解、凝胶过滤层析进行分离纯化，得到的纯化液进行检测并保存；

其中，步骤二和步骤三中的细胞培养袋均置于摇床中并于恒温箱培养，且对细胞培养袋内同时进行上部和底部通气；细胞培养袋培养条件为温度37℃，PH7.2，摇摆速度10-20rpm，摇床角度7-9°。

上述技术方案中，步骤二和步骤三中的细胞培养袋内均填充有片状载体，且片状载体的填充密度均为10-40g/L。

上述技术方案中，所述3L细胞培养袋和30L细胞培养袋的上方中间处均设有进气口和排气口，所述3L细胞培养袋和30L细胞培养袋上方侧边均还设有进液口和出液口。

上述技术方案中，所述细胞培养袋的进气口包括上进气口和下进气口，上进气口设置在细胞培养袋的上部，所述下进气口设置在细胞培养袋的底部。

上述技术方案中，所述3L细胞培养袋和30L细胞培养袋下方均还设有溶氧电极和PH电极。

上述技术方案中，步骤二中细胞生长培养液为含5％胎牛的DMEM培养液；步骤二和步骤三中细胞培养袋内的培养液均为DMEM无血清溶液。

上述技术方案中，所述细胞为HEK293细胞。

上述技术方案中，步骤三中接种腺病毒的具体方法为：将30L细胞培养袋内的细胞培养液排尽后，加入已预热到35℃的细胞培养液9L，用三通瓶通过无菌空气将已稀释的腺病毒液体1L压入到细胞培养袋中。

上述技术方案中，步骤二和步骤三中细胞接种到细胞培养袋后的具体操作方法为：

1)混匀：细胞培养袋接种细胞后，细胞培养袋内浑浊，显微镜下看到大量未贴壁细胞；将细胞培养袋放摇床上，摇床角度7°，通入5％CO2的混合气体，摇摆转速20rpm，温度37℃，混匀15-25分钟；

2)细胞贴壁：静置培养30min-2h观察袋内液体澄清度，直到液体澄清，细胞贴壁；

3)细胞培养：摇摆速度10rpm，温度37℃，摇床角度7°，通入5％CO2的混合气体；次日起，每日2次取样测糖，统计结果；

4)当糖浓度低于1g/L时，开始灌加培养。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、采用细胞培养袋替代大的生物反应器培养细胞，有以下优点：一、可以直接用胰酶消化，方便细胞转移，同时减少细胞培养工序，减小细胞污染和对细胞的损伤；二、可以通过对细胞培养袋进行冻融处理，收集细胞内的病毒。

2、采用片状载体填充的细胞培养袋，细胞培养密度高，相比同体积传统的生物反应器，成本低、产量高，降低操作成本和资金投入；同时通过细胞培养袋与摇床集成，为细胞培养袋内溶液提供波浪形搅拌，增加溶氧，并使得细胞培养袋内培养基分布均匀，同时波浪形搅拌的剪切力小，能减小对细胞损伤。

3、采用摇床，以及对细胞培养袋进行上部和底部同时通气，解决大规模培养中，溶氧效果不佳的问题。

本发明中，从细胞复苏培养到终产品的收获过程简单。本发明通过改善细胞生长环境，减少通气时对细胞的伤害，增加溶氧效果，解决传统相关工艺中细胞消化困难及分离转移困难问题，进而解决贴壁细胞的放大培养问题和连续生产问题，解决细胞冻融裂解困难，将贴壁细胞用填充有片状载体的细胞培养袋和摇床培养，减小机械剪切力对细胞的损伤，提高细胞的生长密度，从而提高细胞的总产量，进而提高病毒的产量，减少清洗验证环节，减少细胞传代中耗材及昂贵设备的用量和操作步骤，从而减少生产成本和细胞污染带来的巨大经济损失。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图；

图2为培养细胞培养袋的结构示意图；

图3为细胞培养袋培养细胞培养袋的应用示意图；

图4为细胞培养袋内细胞在载体上的生长图片；

附图标记说明：

1、细胞培养袋；11、载体；12、进气口；12a、上进气口；12b、下进气口；13、排气口；14、进液口；15、出液口；16、溶氧电极；17、PH电极；2、摇床；3、三气控制器；4、恒温箱。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合附图和具体实施方式，进一步阐述本发明是如何实施的。

如图1所示，本发明提供了一种连续大规模生产重组腺病毒的方法，包括以下步骤：

步骤一、细胞培养：

1)细胞复苏：将冻存HEK293细胞冻存管放到36-38℃的温水中速溶，用70％-75％酒精棉球擦拭冻存管表面消毒后，在超净工作台上打开管盖，吸出细胞悬液注入装有培养液的无菌离心管中，轻轻混匀，离心，弃上清后加入培养液重悬细胞，将重悬好的细胞加入到方瓶中，放入培养箱培养；

2)方瓶细胞传代：取1)中方瓶培养的需传代细胞，在超净工作台中打开方瓶，弃去培养液，加入PBS溶液洗涤一次后，加入消化液于方瓶中消化细胞，30-90s后加入细胞生长培养液中和，并用移液管吹散细胞，至细胞悬液充分混匀，分装到多个方瓶中，晃动方瓶使细胞均匀分散后，放入培养箱中培养；

步骤二、细胞培养袋培养：将4-5个步骤一中所述方瓶培养的传代细胞，共计1-4E+8个细胞，均接种到3L的细胞培养袋中(工作体积为1L)，采用灌注培养；当细胞培养袋内的细胞日耗糖为4-9g时，将细胞培养袋内的培养液放出，并加入PBS清洗1-3次后，加入胰酶消化，当细胞培养袋内出现絮状物且溶液浑浊时，加入细胞生长培养液终止消化，混匀，重悬后，取样，计数；

步骤三、腺病毒大规模扩增：步骤二中细胞一部分继续留在3L的细胞培养袋培养，提供种细胞或用于腺病毒毒种扩增；另一部分接种到30L细胞培养袋(工作体积为10L)进行放大培养，30L细胞培养袋接种细胞个数约为1-4E+9个，采用灌注培养；当细胞培养袋内的细胞日耗糖为40-50g时，细胞总量约为6-11E+10个时，接种腺病毒，腺病毒感染宿主细胞的MOI为20-30；当病毒浓度达到10¹⁰vp/ml时开始收集病毒，当细胞培养袋内病毒浓度低于10¹⁰vp/ml时，将袋内病毒液排尽，加入PBS溶液，连着细胞培养袋一起放入-80℃和37℃反复冻融3次，收集细胞培养袋内的冻融液；用PBS清洗，收集清洗液；取样，测量病毒浓度；

步骤四、纯化：将步骤三中收集的病毒液、冻融液及收集的清洗液一起依次通过离心、超滤、核酸水解、Souce 15Q或30Q(GE Healthcare)凝胶过滤层析进行分离纯化，得到的纯化液进行检测并保存，得重组腺病毒产品；

其中，步骤二和步骤三中的细胞培养袋均置于摇床中并于恒温箱培养，且对细胞培养袋内同时进行上部和底部通气，通入5％CO2的混合气体；细胞培养袋培养条件为温度37℃，PH7-7.2，摇摆速度10-20rpm，摇床角度7-9°。

本发明中，步骤二和步骤三中的细胞培养袋内均填充有片状载体，如图4所示，细胞袋内接种的HEK293细胞在片状载体上贴壁生长；所述片状载体可为专利名称为用于细胞培植的一次性固定床装置、专利申请号为201820246494.5中所公开的细胞载体，包含有若干个呈弧型连接的片状纤维叶片，且所述的若干个呈弧型连接的片状纤维叶片呈向外辐射张开设置，本发明中载体的填充密度均为10-40g/L。

本发明中，3L细胞培养袋和30L细胞培养袋结构相同，规格不同，如图2所示，细胞培养袋1内填充有片状载体11，细胞培养袋1的上方中间处均设有进气口12和排气口13，细胞培养袋1上方侧边均还设有进液口14和出液口15。其中，所述细胞培养袋1的进气口12包括上进气口12a和下进气口12b，上进气口12a设置在细胞培养袋1的上部，所述下进气口12b设置在细胞培养袋1的底部。

如图3所示，细胞培养袋用于接种细胞时，将细胞培养袋1放置在摇床2的托盘上，并通过三气控制器3给细胞培养袋1通气，通过细胞培养袋1上的进气口1并经过上进气口12a和下进气口12b同时给细胞培养袋1上部和底部同时通入5％CO2的混合气体，极大的增加了溶氧效果；同时解决了气泡在液面破裂带来细胞损伤问题。与此同时，将摇床2角度设置为7-9度，并将摇摆速度设置10-20rpm，放入37℃的温箱或细胞培养箱内。

另外，所述3L细胞培养袋和30L细胞培养袋下方均还设有溶氧电极16和PH电极17，用于对细胞培养袋内培养温度和PH的精准控制。

其中，摇床2为市场上生物实验常用的摇床，三气控制器3为气体混合器，可于市场上购置；可以将氧气、二氧化碳等气体通过三气控制器3来控制配比，并将配比好的混合气体通入细胞培养袋。

本发明中，步骤一中方瓶所用培养液为DMEM培养基；步骤二和步骤三中细胞生长培养液为含5％胎牛的DMEM培养液；步骤三和步骤四中细胞培养袋内的培养液均为DMEM无血清溶液。

本发明中，步骤三中接种腺病毒的具体方法为：将30L培养袋内的细胞培养液排尽后，加入已预热到35℃的细胞培养液9L，用三通瓶通过无菌空气将已稀释的腺病毒液体1L压入到细胞培养袋中。

本发明中，步骤二和步骤三中细胞接种到细胞培养袋后的具体操作方法为：

1)混匀：细胞培养袋接种细胞后，细胞培养袋内浑浊，显微镜下看到大量未贴壁细胞；将细胞培养袋放摇床上，摇床角度7°，通入5％CO2的混合气体，摇摆转速20rpm，温度37℃，混匀15-25分钟；

2)细胞贴壁：静置培养30min-2h观察袋内液体澄清度，直到液体澄清，细胞贴壁；

3)细胞培养：摇摆速度10rpm，温度37℃，摇床角度7°，通入5％CO2的混合气体；次日起，每日2次取样测糖，统计结果；

4)当糖浓度低于1g/L时，开始灌加培养。

实施例1

本实施例提供的一种连续大规模生产重组腺病毒的方法，包括以下步骤：

步骤一、细胞培养

1)细胞复苏：取一支HEK293细胞冻存管放到37℃的温水中速溶，待融化至只剩一小块冰核时立即取出，用70％-75％酒精棉球擦拭冻存管表面消毒后，在超净工作台上打开管盖，用5ml移液管吸出细胞悬液轻轻注入装有DMEM培养基的无菌离心管中，轻轻混匀；用5ml移液管将细胞冻存液吸到15ml离心管中，离心(800转/分钟，离心4分钟)，弃上清后，加DMEM培养基重悬细胞；将重悬好的细胞加入到方瓶中(取样，计数)，放入培养箱培养，培养箱条件：37℃，饱和湿度，5％CO2中培养，隔日观察。

2)方瓶细胞传代：取1)中方瓶培养的需传代的细胞，在超净工作台中打开方瓶，弃去培养液，沿方瓶壁轻轻加入适量PBS溶液洗涤一次，吸出PBS溶液弃去；加入适量消化液于方瓶中消化细胞，约1分钟后加入适量细胞生长培养液(加入细胞生长培养液的体积为消化液体积的1-3倍)中和，并用10ml移液管轻轻吹散细胞，至细胞悬液充分混匀；分装到多个方瓶中，轻轻晃动方瓶使细胞均匀分散，置于37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱中培养。

步骤二、细胞培养袋培养：将4-5个步骤一中所述方瓶培养的细胞消化，共计数个数为2.5E+8个细胞，均接种到3L的细胞培养袋(20g载体填充工作体积约为1L)中，采用灌注培养；其中，3L细胞培养袋置于摇床并于恒温箱箱中培养，且对细胞培养袋内同时进行上部和底部通气，通入5％CO2的混合气体；细胞培养袋提前一天加入500ml培养基预孵，培养的相关参数：温度37℃，溶氧设置为60％，PH7.2，摇摆速度20rpm，摇床角度8°。

每天两次通过葡萄糖检测试剂盒检测溶液中的糖浓度，糖浓度为1.5g/L时开始灌加，维持糖浓度为0.6-1.5g/L之间；3L的细胞培养袋内的细胞在第6日时，日耗糖到7.6±0.5g，将细胞培养袋内的培养液放出，加入1LPBS溶液清洗2次；清洗时，摇床摇摆速度调节到10rpm，流出液体接近澄清时，停止清洗；加入300mL胰酶消化，摇摆速度12rpm，当细胞培养袋内出现絮状物且溶液浑浊时，加入700mL细胞培养液终止消化，调节摇摆速度到30rpm，混匀，重悬。取样，计数，细胞总数为2.2E+10个。

步骤三、腺病毒及腺相关病毒大规模扩增：步骤二中细胞一部分继续留在3L的细胞培养袋中培养，可继续用于提供种细胞和用于腺病毒毒种扩增；另一部分(即取2.5E+9个细胞)接种到30L细胞培养袋(200g载体填充工作体积约为10L)进行放大培养，采用灌注培养；其中，30L细胞培养袋置于摇床并于培养箱中培养，且对细胞培养袋内同时进行上部和底部通气，通入5％CO2的混合气体；培养的相关参数：温度37℃，溶氧设置为60％，PH7.2，摇摆速度20rpm，摇床角度8°。

当细胞培养袋内的细胞日耗糖为80±5g，细胞总量约为1E+11个时，接种腺病毒。具体方法为：将培养袋内的细胞培养液排尽后，加入已预热到35℃的细胞培养液500mL，用三通瓶通过无菌空气将已稀释的腺病毒液体压入到细胞培养袋中，病毒感染宿主细胞的MOI为25，感染温度为35℃，6小时后37℃继续灌加培养，培养液为无血清培养液，溶氧设置为50％，PH7.2，摇摆速度20rpm，摇床角度8°。维持每天2次取样，测袋内病毒的浓度和收获的病毒液浓度，2天后袋内病毒浓度达到10¹⁰vp/ml时开始收集病毒；第7天时袋内的病毒浓度低于收获的病毒浓度，将袋内的病毒液排尽，加入500mLPBS溶液，连着细胞培养袋一起放入-80℃，在-80℃和37℃反复冻融3次，收集细胞培养袋内的冻融液；用PBS清洗，收集PBS清洗液。取样，测病毒的浓度，计算出病毒的总颗粒数为2.31E+15；细胞单产约为2.31E+4。将收集好的病毒液、冻融液及清洗液进行纯化。

步骤四、纯化：将收集的液体(病毒液、冻融液和清洗液)通过离心(4000rpm，4℃，离心12分钟)、超滤、核酸水解、Souce 15Q或30Q(GE Healthcare)凝胶过滤层析进行分离纯化，得到的腺病毒纯化液进行检测并保存，得重组腺病毒产品。

其中，步骤二和步骤三中细胞接种到细胞培养袋后的具体操作方法为：

1)混匀：细胞培养袋接种细胞后，细胞培养袋内浑浊，显微镜下看到大量未贴壁细胞；将细胞培养袋放摇床上，摇床角度7°，通入5％CO2的混合气体，摇摆转速20rpm，温度37℃，混匀15-25分钟；

2)细胞贴壁：静置培养30min-2h观察袋内液体澄清度，直到液体澄清，细胞贴壁；

3)细胞培养：摇摆速度10rpm，温度37℃，摇床角度7°，通入5％CO2的混合气体；次日起，每日2次取样测糖，统计结果；

4)当糖浓度低于1g/L时，灌加培养。

实施例2

本实施例与实施例1所述的连续大规模生产重组腺相关病毒的方法所采用的实验步骤类似，区别在于：

步骤二和步骤三中的细胞培养袋内的载体填充数为10g/L；

步骤二和步骤三中细胞接种密度为1E+5个/ml；

步骤二中3L细胞培养袋内细胞日耗糖4.0±0.5g，细胞扩大培养时，部分留在3L的细胞培养袋中培养，部分接种到30L细胞培养袋进行放大培养；

步骤三中30L细胞培养袋内细胞接种腺病毒时，日糖耗为40±5g，细胞总数为5.3E+10个；病毒感染宿主细胞的MOI为20；病毒的总颗粒数为1.3E+15；细胞单产约为2.45E+4。

实施例3

本实施例与实施例1所述的连续大规模生产重组腺相关病毒的方法类似，区别在于：

步骤二和步骤三中的细胞培养袋内的载体填充数为40g/L；

步骤二和步骤三中细胞接种数为4E+5个/ml；

步骤二中3L细胞培养袋内细胞日耗糖9.0±0.5g，细胞扩大培养时，部分留在3L的细胞培养袋中培养，部分接种到30L细胞培养袋进行放大培养；

步骤三中30L细胞培养袋内细胞接种腺病毒时，日糖耗为90.0±5g，细胞总数为1.26E+11个；病毒感染宿主细胞的MOI为20；病毒的总颗粒数为2.65E+15；细胞单产约为2.10E+4。

采用分光光度法和高效液相色谱法分析实施例1、实施例2和实施例3所得重组腺病毒产品的纯度，采用组织培养半数感染剂量方法测定所得病毒的感染滴度。统计实施例1、实施例2和实施例3中生产的重组腺相关病毒的性能，如表1所示：

表1实施例1至实施例3中生产的重组腺相关病毒的性能

检测项目	实施例1	实施例2	实施例3
				D260/D280	1.22	1.21	1.22
重组腺病毒纯度，％	96.2	96.4	96.1
				重组腺病毒滴度，TU/mL	3.87E+13	2.91E+13	4.15E+13
病毒颗粒数，vp/ml	9.01E+14	7.32E+14	9.87E+14
				比活性，％	4.3	4.0	4.2

由表1可知，本发明所采用的连续大规模生产重组腺病毒的方法所得的重组腺病毒，纯度在96.1以上；病毒滴度在E+13数量级；

本发明还提供了一种连续大规模生产重组腺相关病毒的方法，所提供方法与实施例1所述的连续大规模生产重组腺相关病毒的方法所采用的实验步骤类似，区别在于：

步骤三中30L细胞培养袋内细胞接种腺相关病毒时，日糖耗为42.2±5g，细胞总数为6.3E+10个；病毒感染宿主细胞的MOI为20；病毒的总数量为2.1E+15；细胞单产约为3.33E+4。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (9)

1.一种连续大规模生产重组腺病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、细胞培养：将冻存细胞复苏、培养、传代；

步骤二、细胞培养袋培养：将步骤一中所述传代后的细胞，以1-4E+5个/ml的接种密度及1L的接种体积接种到3L的细胞培养袋中，并采用灌注培养；

当细胞培养袋内的细胞日耗糖为4-9g时，将细胞培养袋内的培养液放出，并加入PBS清洗1-3次后，加入胰酶消化，当细胞培养袋内出现絮状物且溶液浑浊时，加入细胞生长培养液终止消化，混匀，重悬后，取样，计数；

步骤三、腺病毒大规模扩增：步骤二中重悬后的细胞一部分继续留在3L的细胞培养袋培养，提供种细胞或用于腺病毒毒种扩增；另一部分接种到30L细胞培养袋进行放大培养，30L细胞培养袋接种细胞个数为1-4E+9个，接种密度1-4E+5个/ml，采用灌注培养；当细胞培养袋内的细胞日耗糖为40-90g时，细胞总量为5.3-12.6E+10个时，接种腺病毒，腺病毒感染宿主细胞的MOI为20-30；当病毒浓度达到10¹⁰vp/ml时开始连续收集病毒，直到细胞培养袋内病毒浓度低于10¹⁰vp/ml时，将细胞培养袋内病毒液排尽并收集，然后向细胞培养袋加入PBS溶液，连着细胞培养袋一起放入-80℃和37℃反复冻融3次，收集细胞培养袋内的冻融液；用PBS冲洗2次，并收集冲洗液；

步骤四、纯化：将步骤三中收集的病毒液、冻融液及冲洗液一起通过离心、超滤、核酸水解、凝胶过滤层析进行分离纯化，得到的纯化液进行检测并保存；

其中，步骤二和步骤三中的细胞培养袋均置于摇床中并于恒温箱培养，且对细胞培养袋内同时进行上部和底部通气；细胞培养袋培养条件为温度37℃，PH7.2，摇摆速度10-20rpm，摇床角度7-9°。

2.根据权利要求1所述的一种连续大规模生产重组腺病毒的方法，其特征在于，步骤二和步骤三中的细胞培养袋内均填充有片状载体，且片状载体的填充密度均为10-40g/L。

3.根据权利要求1所述的一种连续大规模生产重组腺病毒的方法，其特征在于，所述3L细胞培养袋和30L细胞培养袋的上方中间处均设有进气口和排气口，所述3L细胞培养袋和30L细胞培养袋上方侧边均还设有进液口和出液口。

4.根据权利要求3所述的一种连续大规模生产重组腺病毒的方法，其特征在于，所述细胞培养袋的进气口包括上进气口和下进气口，上进气口设置在细胞培养袋的上部，所述下进气口设置在细胞培养袋的底部。

5.根据权利要求1所述的一种连续大规模生产重组腺病毒的方法，其特征在于，所述3L细胞培养袋和30L细胞培养袋下方均还设有溶氧电极和PH电极。

6.根据权利要求1所述的一种连续大规模生产重组腺病毒的方法，其特征在于，步骤二中细胞生长培养液为含5％胎牛的DMEM培养液；步骤二和步骤三中细胞培养袋内的培养液均为DMEM无血清溶液。

7.根据权利要求1所述的一种连续大规模生产重组腺病毒的方法，其特征在于，所述细胞为HEK293细胞。

8.根据权利要求1所述的一种连续大规模生产重组腺病毒的方法，其特征在于，步骤三中接种腺病毒的具体方法为：将30L细胞培养袋内的细胞培养液排尽后，加入已预热到35℃的细胞培养液9L，用三通瓶通过无菌空气将已稀释的腺病毒液体1L压入到细胞培养袋中。

9.根据权利要求1所述的一种连续大规模生产重组腺病毒的方法，其特征在于，步骤二和步骤三中细胞接种到细胞培养袋后的具体操作方法为：

1)混匀：细胞培养袋接种细胞后，细胞培养袋内浑浊，显微镜下看到大量未贴壁细胞；将细胞培养袋放摇床上，摇床角度7°，通入5％CO2的混合气体，摇摆转速20rpm，温度37℃，混匀15-25分钟；

2)细胞贴壁：静置培养30min-2h观察袋内液体澄清度，直到液体澄清，细胞贴壁；

3)细胞培养：摇摆速度10rpm，温度37℃，摇床角度7°，通入5％CO2的混合气体；次日起，每日2次取样测糖，统计结果；

4)当糖浓度低于1g/L时，开始灌加培养。