CN109735509A - 适用于片状载体袋的cef细胞生产狂犬病疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于片状载体袋的CEF细胞生产狂犬病疫苗的方法，包括以下步骤：(1)CEF细胞的制备；(2)在片状载体袋中原代培养CEF细胞；(3)接入狂犬疫苗病毒；(4)收获狂犬疫苗病毒液，即得狂犬疫苗原液。本发明采用片状载体袋直接进行原代CEF细胞培养，然后接入狂犬病毒，能大批量的培养所需原代CEF细胞，使得狂犬疫苗病毒的生产之初，即细胞培养开始阶段无需建库，直接购买SPF鸡胚，处理现用，操作方便，省时省力；并且采用CEF原代细胞生产狂犬病毒疫苗，解决了宿主细胞DNA残留问题。另外，片状载体袋通过前后或左右摆动来进行传质传氧，结合摆床在培养过程中静态和动态的结合，传质传氧效率高。

Description

适用于片状载体袋的CEF细胞生产狂犬病疫苗的方法

技术领域

本发明涉及生命科学领域，特别是细胞培养，病毒增殖方面。具体的说是涉及一种适用于片状载体袋的CEF细胞生产狂犬病疫苗的方法。

背景技术

目前，市场上CEF细胞生产狂犬病疫苗等产品所用设备多为玻璃或不锈钢的生物反应器来生产。而用玻璃和不锈钢生物反应器生产时，在前期细胞增殖阶段和种子细胞准备时需要大量的转瓶传代和消化工作和超大的空间。而使用片状载体袋生产就是用一台控制系统系统，控制一个摆床反应器，将片状载体袋放置到摆床上，连接好气体控制管道，用方瓶接入细胞，即可让细胞在上面高密度增殖和接毒。而且用CEF原代细胞生产狂犬病毒疫苗可以解决宿主细胞DNA残留问题。

另外，在现有微载体进行细胞培养时，多采用潮汐式运动进行传质传氧，例如安普公司是通过激流旋转式传质传氧，亦是一种湍流方式，这种在反应袋袋内消化加入胰酶拍打时难度大；艺思高公司潮汐反应器是通过潮长潮落方式传质传氧，它是通过一个蠕动泵将液体泵出来，然后另一个进液蠕动泵将液体泵进去；它是一种静态的交换，效率没有动态高。而本发明采用的片状载体袋是2D结构，它通过前后或左右摆动来进行传质传氧，结合摆床在培养过程中静态和动态的结合，传质传氧效率高。

发明内容

为解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种适用于片状载体袋的CEF细胞生产狂犬病疫苗的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明提供了一种适用于片状载体袋的CEF细胞生产狂犬病疫苗的方法，包括以下步骤：

(1)CEF细胞的制备

取9-10日龄的SPF鸡胚，制备鸡胚成纤维细胞，即CEF细胞；

(2)在片状载体袋中原代培养CEF细胞

(2.1)将无菌过滤好的含10％新生牛血清DMEM培养基无菌操作泵入片状载体袋，并将片状载体袋置于摆床中平衡过夜，其中，片状载体袋培养条件为温度37℃、PH7.2、溶解氧50％；摆床的摆床角度6-9°、速度10-30RPM；

(2.2)向(2.1)中的片状载体袋中接入(1)中准备好的CEF细胞，接种密度为4-8×E5/ml，并将摆床角度调至2-3°，速度调到5RPM，15min-2h后细胞逐渐贴到片状载体上；8-10h后将摆床角度调至6-9°、速度10-30RPM；

(3)接入狂犬疫苗病毒

摆床持续摆动，通过摆床摆动方式增加溶氧，并通过灌流方式或换液方式培养片状载体袋内的CEF细胞；每天取样测细胞糖耗，判断细胞生长状态，当细胞密度增长到3-5×E6/ml时，接入狂犬疫苗病毒，即CEF aG株狂犬病毒；

其中，CEF aG株狂犬病毒的获得方法为：将aG种子毒株(中国食品药品检定研究院)在VERO细胞传7-8代，筛选高滴度的病毒株，然后将该病毒株在5-7日龄SPF鸡胚卵黄囊接种，收取胚胎躯干研磨粉碎制成aG狂犬病毒鸡胚一代病毒，再将鸡胚一代病毒在CEF细胞上连续传代20次，收获病毒得到CEF aG株狂犬病毒工作种子批，即CEF aG株狂犬病毒；

(4)收获狂犬疫苗病毒液

接狂犬疫苗病毒后36-72h，CEF细胞变圆脱落，发生细胞病变，收获病毒液，加入终浓度0.025％β-丙内酯，4℃灭活24h，37℃水解2h后，并通过超滤浓缩、分子筛色谱柱纯化，即得狂犬疫苗原液。

上述技术方案中，步骤(1)中，鸡胚成纤维细胞的制备过程包括：

(1.1)取9-10日龄的SPF鸡胚，依次用酊碘、酒精棉球消毒后，用镊子将蛋壳击破，将鸡胚气室部，划破内膜，拉出鸡胚，放在已被干烤过的平皿中，去眼、脑、喙、翅、爪、内脏；

(1.2)用PBS反复洗坯体2-3次，用镊子夹入一个小锥形瓶内；

(1.3)用手术剪将胚体充分剪碎成1mm³的小块；

(1.4)将剪碎的胚体小块转入装有PBS的离心管中，充分混匀，静置2min后去除上清；

(1.5)然后向去除上清后的胚体小块中加入适量PBS缓冲液，然后加入加入含0.5％EDTA的0.25％胰酶适量，充分混匀，消化2-3min；

(1.6)当剪碎的胚体小块上呈明显粘稠的絮状时，用含10％新生牛血清的DMEM培养基终止消化；

(1.7)将(1.6)中终止消化的离心管1000RPM离心10min，弃上清，用含10％新生牛血清的DMEM培养基重悬离心管里面的细胞，并用4层纱布网通过漏斗过滤，收集滤液到细胞瓶中，并用台盼蓝计数。

上述技术方案中，步骤(2)中，所述片状载体袋的规格为2-1000L；所述片状载体袋中填充有片状载体，且片状载体的填充密度为5-50g/L。

上述技术方案中，步骤(3)中，以感染复数MOI为0.01-0.03接入狂犬疫苗病毒。

上述技术方案中，步骤(3)中，每天取样测细胞糖耗，当糖浓度低于1g/L时，采用灌流方式或换液方式培养；当片状载体袋内的细胞日耗糖为60-80g/L时，细胞密度增长到3-5×E6/ml时，接入狂犬疫苗病毒。

本发明是通过CEF细胞制备，将制备好的CEF细胞在片状载体袋倍增，然后接入狂犬病毒，待病变，然后收获病毒液灭活，然后浓缩纯化得到纯净的狂犬疫苗病毒。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明采用片状载体袋直接进行原代CEF细胞培养，然后接入狂犬病毒。培养的CEF细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态，与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。这为生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。

2、片状载体袋提供细胞贴壁，传质传氧的条件，能大批量的培养所需原代CEF细胞，从而使得狂犬疫苗病毒的生产之初，即细胞培养开始阶段无需建库，直接购买SPF鸡胚，现处理现用，操作方便，省时省力。

3、通过摆床规律摆动来传质传氧，片状载体在液体里面可以轻微移动，细胞贴附或者进入片状载体内部固定在载体上，这种湍流方式能更好的进行养分和气体交换，并且基本无剪切力，细胞无损伤。

4、本发明采用CEF原代细胞生产狂犬病毒疫苗，解决了宿主细胞DNA残留问题。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明是如何实施的。

本发明提供了一种适用于片状载体袋的CEF细胞生产狂犬病疫苗的方法，包括以下步骤：

(2)CEF细胞的制备

取9-10日龄的SPF鸡胚，制备鸡胚成纤维细胞，即CEF细胞；

(2)在片状载体袋中原代培养CEF细胞

(2.1)将无菌过滤好的含10％新生牛血清DMEM培养基无菌操作泵入片状载体袋，并将片状载体袋置于摆床中平衡过夜，其中，片状载体袋培养条件为温度37℃、PH7.2、溶解氧50％；摆床的摆床角度6-9°、速度10-30RPM；

(2.2)向(2.1)中的片状载体袋中接入(1)中准备好的CEF细胞，接种密度为4-8×E5/ml，并将摆床角度调至2-3°，速度调到5RPM，15min-2h后细胞逐渐贴到片状载体上；8-10h后将摆床角度调至6-9°、速度10-30RPM；

(3)接入狂犬疫苗病毒

摆床持续摆动，通过摆床摆动方式增加溶氧，并通过灌流方式或换液方式培养片状载体袋内的CEF细胞；每天取样测细胞糖耗，判断细胞生长状态，当细胞密度增长到3-5×E6/ml时，接入狂犬疫苗病毒；

(4)收获狂犬疫苗病毒液

接狂犬疫苗病毒后36-72h，CEF细胞变圆脱落，发生细胞病变，收获病毒液，加入终浓度0.025％β-丙内酯，4℃灭活24h，37℃2h水解β-丙内酯完全后，并通过超滤浓缩、分子筛色谱柱纯化，即得狂犬疫苗原液。

上述技术方案中，步骤(1)中，鸡胚成纤维细胞的制备过程包括：

(1.1)取9-10日龄的SPF鸡胚，用镊子将蛋壳击破，将鸡胚气室部依次用酊碘、酒精棉球消毒后；划破内膜，拉出鸡胚，放在已被干烤过的平皿中，去眼、脑、喙、翅、爪、内脏；

(1.2)用PBS反复洗坯体2-3次，用镊子夹入一个小锥形瓶内；

(1.3)用手术剪将胚体充分剪碎成1mm³的小块；

(1.4)将剪碎的胚体小块转入装有PBS的离心管中，充分混匀，静置2min后去除上清；

(1.5)然后向去除上清后的胚体小块中加入适量PBS缓冲液，然后加入加入含0.5％EDTA的0.25％胰酶适量，充分混匀，消化2-3min；

(1.6)当剪碎的胚体小块上呈明显粘稠的絮状时，用含10％新生牛血清的DMEM培养基终止消化；

(1.7)将(1.6)中终止消化的离心管1000RPM离心10min，弃上清，用含5％新生牛血清的DMEM培养基重悬离心管里面的细胞，并用4层纱布网通过漏斗过滤，收集滤液到细胞瓶中，并用台盼蓝计数。

本发明中，步骤(2)中，所述片状载体袋的规格为2-1000L；所述片状载体袋中填充有片状载体，所述片状载体可为专利名称为用于细胞培植的一次性固定床装置、专利申请号为201820246494.5中所公开的细胞载体，包含有若干个呈弧型连接的片状纤维叶片，且所述的若干个呈弧型连接的片状纤维叶片呈向外辐射张开设置，且本发明中片状载体的填充密度为5-50g/L。

本发明中，步骤(3)中，以感染复数MOI为0.01-0.03接入狂犬疫苗病毒。

本发明中，步骤(3)中，每天取样测细胞糖耗，当糖浓度低于1g/L时，采用灌流方式或换液方式培养；当片状载体袋内的细胞日耗糖为60-80g/L时，细胞密度增长到3-5×E6/ml时，接入狂犬疫苗病毒。

本发明采用CEF原代细胞生产狂犬病毒疫苗，区别于传代细胞在不停的传代，DNA不停的拷贝复制，易出现差错拷贝，在生产的过程中有更能多的DNA残留的问题；CEF原代细胞作为第一代，解决了宿主细胞DNA残留问题。

具体实施例：

(1)实验目的：验证片状载体袋培养CEF细胞；片状载体袋可消化放大转移；接入在CEF鸡胚细胞上传代2-3代的aG株狂犬疫苗病毒后能病毒增殖。

(2)实验材料：

3L载体培养袋1个。50L储液袋2个。控温摆床1台。SKC300控制系统1套。50ml烧杯4个。5L烧杯2个。玻璃棒1根。囊式滤器1个。500ml蓝盖瓶10个。蠕动泵1台。5ml移液管。10ml的移液管。电动移液枪。方瓶。显微镜。1ml ep管。5％CO2培养箱中培养。超净工作台。离心机。血球计数板。降温盒等。

0.25％胰酶2瓶，碳酸氢钠，DMEM培养基1桶，纯化水，Nacl，Kcl，KH2PO4，Na2HPO4，小牛血清(CCS)2瓶，15ml离心管，温度计，酒精，台盼蓝，EP管，50mL离心管。

SPF鸡胚，HEK293细胞，VERO细胞，HEK293t细胞，CHO细胞,，BHK细胞等各贴壁细胞。本次方案以SPF鸡胚制成CEF细胞为例。

(3)实验方法：

(一)溶液配制。

1.1培养基配方如表1所示：

表1 10％新生牛血清DMEM培养基标准配方(10L)

1.1.1准备工作：准备过滤需要的相关物品：储液桶，烧杯，过滤器，蠕动泵，丝光毛巾，储液瓶，并灭菌。

1.1.2量取DMEM培养基、新生牛血清，称取碳酸氢钠灭活，按培养基配方混合配置；

1.1.3将配置好的培养基过滤除菌；

1.2PBS配制

表2 PBS配方(10L)

1.2.1准备工作：准备过滤需要的相关物品：天平，称量勺，PH计，储液桶，烧杯，过滤器，蠕动泵，丝光毛巾，储液瓶，并灭菌。

1.2.2称取氯化钠、氯化钾，磷酸氢二钾，磷酸二氢钠按配方混合加入超纯水，先加到水到80％容积，然后加入稀盐酸将PH值调到7.4；

1.2.3将配置好的PBS过滤后高压灭菌；

(二)CEF细胞的制备。

2.1取9-10日龄的SPF鸡胚10个，将鸡胚气室部依次用酊碘、酒精棉球消毒。用镊子将蛋壳击破，划破内膜，拉出鸡胚，放在已被干烤过的平皿中，去眼、脑、喙、翅、爪、内脏。

2.2用PBS反复洗坯体2-3次，用镊子夹入一个小锥形瓶内。

2.3用手术剪将胚体充分剪碎，约1mm³的小块。

2.4将剪碎的胚体小块转入装有PBS的离心管中，充分混匀，静置2min后吸去上清。

2.5然后加入适量PBS缓冲液，然后加入加入含0.5％EDTA的0.25％胰酶适量，充分混匀。消化2-3min。

2.6剪碎的胚体上呈明显粘稠的絮状，用含5％新生牛血清的DMEM培养基终止消化。

2.7将上述终止消化的离心管1000RPM离心10min，弃上清，用含5％新生牛血清的DMEM培养基重悬离心管里面的细胞，并用4层纱布网通过漏斗过滤，收集滤液到细胞瓶中。用台盼蓝计数。

(三)CEF细胞片状载体袋培养，工艺开发及验证。

3.1平衡。片状载体袋的规格为5L，片状载体袋的应用具体为片状载体袋结合摆床、三气控制器的使用方式，专利名称为一种连续大规模生产重组腺病毒的方法、专利申请号2018108834940.0中公开的这种片状载体袋的使用方式：将细胞培养袋放置在摆床的托盘上，并通过三气控制器给细胞培养袋通气；

3.2接种细胞。

3.2.1细胞个数1.2E+9个，接种浓度4.8E+5。工作体积2.5L。

3.2.2接种参数：温度37℃，摇摆速度10rpm，摇床角度7°，50％DO。

3.2.3混匀：此时片状载体袋内浑浊，显微镜下看到大量未贴壁细胞。将片状载体袋放摇床上，溶解氧(DO)50％，摇摆转速20rpm。温度37℃。混匀15-25分钟。

3.2.4细胞贴壁：静置培养30min-2h观察袋内液体澄清。(注意记录此步操作的时间)

3.2.5细胞培养：摇摆度10rpm，温度37℃，摇床角度7°，DO50％。第二天开始，每天2次取样测糖。统计结果。

3.2.6当糖浓度低于1g/L时，换液。(也可以采取灌加培养)。

(四)细胞消化

当细胞日糖耗到10-20g/天时，放出培养基，加2LPBS清洗3次。再加1L胰酶消化10-30分钟。然后加入培养基终止消化。温度37℃，摇摆速度30rpm，摇床角度7°，DO50％。此步骤重复3-4次，收集消化下来的细胞，计数，约得到2.2E+10个(此步骤证明袋子片状载体袋子可以袋内消化，可以将细胞收集作为种子细胞进行更大规模的培养)

(五)接种并收获病毒

在步骤(三)时不消化，继续培养：当细胞日糖耗到16g/天时，接入CEF aG株狂犬病毒(滴度为10^6.85TCID50/ml)。

其中，CEF aG株狂犬病毒的获得方法为：将aG种子毒株(中国食品药品检定研究院)在VERO细胞传7-8代，筛选高滴度的病毒株，然后将该病毒株在5-7日龄SPF鸡胚卵黄囊接种，收取胚胎躯干研磨粉碎制成aG狂犬病毒鸡胚一代病毒，再将鸡胚一代病毒在CEF细胞上连续传代20次，收获病毒得到CEF aG株狂犬病毒工作种子批，即CEF aG株狂犬病毒；

收获：接种CEF aG株狂犬病毒72h(36-72H)细胞病变，收获病毒液。

灭活：将收获的病毒液加入终浓度0.025％β-丙内酯，4℃灭活24h，37℃水解2h，待β-丙内酯完全溶解。

浓缩：用0.5-1.0um滤芯过滤去除细胞残片，再用300KD膜胞10倍浓缩。

纯化：用凝胶色谱柱纯化，即可得到高质量的狂犬疫苗原液。

经检测，得到病毒滴度为5.72IU/ml狂犬病疫苗。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (5)

1.适用于片状载体袋的CEF细胞生产狂犬病疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)CEF细胞的制备

取9-10日龄的SPF鸡胚，制备鸡胚成纤维细胞，即CEF细胞；

(2)在片状载体袋中原代培养CEF细胞

(2.1)将无菌过滤好的含10％新生牛血清DMEM培养基无菌操作泵入片状载体袋，并将片状载体袋置于摆床中平衡过夜，其中，片状载体袋培养条件为温度37℃、PH7.2、溶解氧50％；摆床的摆床角度6-9°、速度10-30RPM；

(2.2)向(2.1)中的片状载体袋中接入(1)中准备好的CEF细胞，接种密度为4-8×E5/ml，并将摆床角度调至2-3°，速度调到5RPM，15min-2h后细胞逐渐贴到片状载体上；8-10h后将摆床角度调至6-9°、速度10-30RPM；

(3)接入狂犬疫苗病毒

摆床持续摆动，通过摆床摆动方式增加溶氧，并通过灌流方式或换液方式培养片状载体袋内的CEF细胞；每天取样测细胞糖耗，判断细胞生长状态，当细胞密度增长到3-5×E6/ml时，接入狂犬疫苗病毒；

(4)收获狂犬疫苗病毒液

接狂犬疫苗病毒后36-72h，CEF细胞变圆脱落，发生细胞病变，收获病毒液，加入终浓度0.025％β-丙内酯，4℃灭活24h，并通过超滤浓缩、分子筛色谱柱纯化，即得狂犬疫苗原液。

2.根据权利要求1所述的适用于片状载体袋的CEF细胞生产狂犬病疫苗的方法，其特征在于，步骤(1)中，鸡胚成纤维细胞的制备过程包括：

(1.1)取9-10日龄的SPF鸡胚，依次用酊碘、酒精棉球消毒后，用镊子将蛋壳击破，划破内膜，拉出鸡胚，放在已被干烤过的平皿中，去眼、脑、喙、翅、爪、内脏；

(1.2)用PBS反复洗坯体2-3次，用镊子夹入一个小锥形瓶内；

(1.3)用手术剪将胚体充分剪碎成1mm³的小块；

(1.4)将剪碎的胚体小块转入装有PBS的离心管中，充分混匀，静置2min后去除上清；

(1.5)然后向去除上清后的胚体小块中加入适量PBS缓冲液，然后加入加入含0.5％EDTA的0.25％胰酶适量，充分混匀，消化2-3min；

(1.6)当剪碎的胚体小块上呈明显粘稠的絮状时，用含10％新生牛血清的DMEM培养基终止消化；

(1.7)将(1.6)中终止消化的离心管1000RPM离心10min，弃上清，用含10％新生牛血清的DMEM培养基重悬离心管里面的细胞，并用4层纱布网通过漏斗过滤，收集滤液到细胞瓶中，并用台盼蓝计数。

3.根据权利要求1所述的适用于片状载体袋的CEF细胞生产狂犬病疫苗的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述片状载体袋的规格为2-1000L；所述片状载体袋中填充有片状载体，且片状载体的填充密度为5-50g/L。

4.根据权利要求1所述的适用于片状载体袋的CEF细胞生产狂犬病疫苗的方法，其特征在于，步骤(3)中，以感染复数MOI为0.01-0.03接入狂犬疫苗病毒。

5.根据权利要求1所述的适用于片状载体袋的CEF细胞生产狂犬病疫苗的方法，其特征在于，步骤(3)中，每天取样测细胞糖耗，当糖浓度低于1g/L时，采用灌流方式或换液方式培养；当片状载体袋内的细胞日耗糖为15-30g/L时，细胞密度增长到3-5×E6/ml时，接入工作种子批的狂犬疫苗病毒。