CN108866012A - 一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及兽用生物制品技术领域,提供了一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法,包括如下步骤:细胞复苏及扩增,片状载体处理,悬浮培养罐及片状载体灭菌,细胞上罐,细胞悬浮培养,含毒维持液配制,接毒,收毒。本发明的优点在于:本发明使用片状载体悬浮培养,劳动强度小、工艺简单、培养条件佳、成本低,通过片状载体悬浮培养出的细胞量非常大,先加入含少量胰酶的维持液,使一部分先病变,再通过换液的办法,加入含新胰酶的维持液,再促使一部分病变,重复此方法使细胞逐渐病变,可实现多次收获,并且生产出抗原病毒含量是传统生产工艺的10‑30倍。
Description
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域,尤其涉及一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法。
背景技术
目前猪流行性腹泻病毒(PEDV)的增殖大部分采用转瓶生产工艺,然而,传统的转瓶生产工艺却存在以下几点缺点:劳动强度大,工艺复杂,细胞增殖慢且数量少,无法提供最佳的pH、DO等条件,只能一次收获,收获的病毒含量低。因此,如若要大量增殖,则只能通过增加转瓶数量的方法,结果又导致车间生产所需设备、人员等需求更大。
目前,悬浮培养技术已生成兽用生物制品的热点,通过悬浮培养技术生产出的抗原具有病毒含量高、纯净性好等特点,广泛用于兽用生物制品。
然而,已有的猪流行性腹泻病毒(PEDV)悬浮培养生产工艺,虽使病毒含量有所提高,但收毒次数较少(只能一次收获),且生产成本较高。
据此,目前急需对现有技术改进,以提供一种劳动强度小、工艺简单、培养条件佳、细胞数高、成本低、抗原病毒含量高,且可实现多次收获的猪流行性腹泻病毒生产方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种劳动强度小、工艺简单、培养条件佳、细胞数高、成本低、抗原病毒含量高,且可实现多次收获的猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题:
一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法,包括如下步骤:
(1)细胞复苏及扩增
将冻存的Vero细胞复苏到T75细胞培养瓶中,并置于36-37℃温度下培养,长至单层致密后,用含0.25%胰酶的细胞分散液消化后,再加入含8-10%新生牛血清的DMEM细胞生长液传代培养,按1:(3-6)的比例逐级传代放大至3-15L转瓶内培养,转瓶按照1:(3-5)的传代比例扩传;
(2)片状载体处理
按照20-40g/L片状载体的比例,称量好所需的片状载体放入7-50L悬浮培养罐的载体框内,组装好悬浮培养罐,打入PBS缓冲液,使之充分浸泡到片状载体,10-15min后弃去PBS缓冲液,加入新的PBS缓冲液,并使其超过片状载体上界面10-15cm;
(3)悬浮培养罐及片状载体灭菌
按照悬浮培养的常规操作规程,对步骤(2)中含片状载体的7-50L悬浮培养罐进行121℃高温灭菌40-50min,冷却后取样做无菌检验;
(4)细胞上罐
将步骤(1)中3-15L转瓶内的Vero细胞消化下来,按终浓度(1-5)×106cells/mL的接种密度接种到步骤(3)中的7-50L悬浮培养罐内,设定温度37℃、pH 7.0-7.2、DO 30%-60%、转速50-100rpm,开始培养;
(5)细胞悬浮培养
开始培养后22-26h,取样测定培养液的含糖量,当含糖量低于8mmoL/L时,开始灌流培养;
(6)含毒维持液配制
取调好pH 7.0-7.4并预热的DMEM溶液,加入胰酶和猪流行性腹泻病毒PEDV毒种,使最终含胰酶5-10μg/mL、猪流行性腹泻病毒PEDV毒种1%-5%,混合均匀后,置于常温待用;
(7)接毒
当悬浮培养罐Vero细胞培养到72-96h时,停止培养,将生长液弃去,通过管道加入事先预热的PBS溶液,搅拌1-5min,弃去,再加入PBS搅拌1-5min,如此洗3-5次;然后再加入步骤(6)配制的含毒维持液,设定温度37℃、pH 7.2-7.4、DO 30%-60%、转速50-100rpm,开始病毒悬浮培养;
(8)收毒
A.当病毒悬浮培养至16-24h,进行第一次收获病毒液,收获体积为培养总体积的80%-90%,放-15℃以下冷库保存;
B.在一次收毒后的余下病毒悬浮培养液中加入含5-10μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养16-24h,进行第二次收获病毒液,收获体积为培养总体积的80%-90%,放-15℃以下冷库保存;
C.在二次收毒后的余下病毒悬浮培养液中再加入含5-10μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养16-24h,进行第三次收获病毒液,全部收完,放-15℃以下冷库保存;
其中,每个收次的病毒液,均测定一次病毒含量。
作为本发明的优选方式之一,所述步骤(1)中Vero细胞为非洲绿猴肾传代细胞,购于ATCC,由华中农业大学动物医学院预防兽医学实验室保管和供应。
作为本发明的优选方式之一,所述步骤(2)中片状载体直接购买自ESCO公司。
作为本发明的优选方式之一,所述步骤(3)中无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行。
作为本发明的优选方式之一,所述步骤(5)中通过罗氏血糖仪测定培养液的含糖量。
作为本发明的优选方式之一,所述步骤(5)中灌流培养的灌流速度根据培养液的含糖量进行增减调整。
作为本发明的优选方式之一,所述步骤(6)中猪流行性腹泻病毒PEDV具体为猪流行性腹泻病毒PEDV-AJ1102,即Porcine epidemic diarrhea virus PEDV-AJ1102,由华中农业大学提供,并由华中农业大学于2014年10月24日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏与登记,保藏编号为CCTCC V201433。
作为本发明的优选方式之一,所述步骤(6)中常温指20-25℃。
作为本发明的优选方式之一,所述步骤(8)的B步骤与C步骤中DMEM溶液的添加量均与前一次病毒液的收获量相同。
作为本发明的优选方式之一,所述步骤(8)中采用TCID50测定法检测病毒含量。
本发明相比现有技术的优点在于:本发明使用片状载体悬浮培养,劳动强度小、工艺简单、培养条件佳、成本低,通过片状载体悬浮培养出的细胞量非常大,先加入含少量胰酶的维持液,使一部分先病变,再通过换液的办法,加入含新胰酶的维持液,再促使一部分病变,重复此方法使细胞逐渐病变,实现多次收获;本发明方法在一定程度上实现了多次收获猪流行性腹泻病毒的先例,可作为优良的生产工艺方法广泛应用于兽用生物制品领域;同时,采用本发明方法生产出的抗原病毒含量更是传统生产工艺的10-30倍。
附图说明
图1是实施例1-3中猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法的工艺流程图。
本发明使用的细胞及毒株来源说明:
本发明使用的Vero细胞为非洲绿猴肾传代细胞,购于ATCC,由华中农业大学动物医学院预防兽医学实验室保管和供应。
本发明使用的猪流行性腹泻病毒PEDV具体为猪流行性腹泻病毒PEDV-AJ1102(Porcine epidemic diarrhea virus PEDV-AJ1102),由华中农业大学提供,并由华中农业大学于2014年10月24日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏与登记,经鉴定表现为存活,保藏编号为CCTCC V201433;中国典型培养物保藏中心的地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内,武汉大学保藏中心。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
如图1所示,本实施例的一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法,包括如下步骤:
(1)细胞复苏及扩增
将冻存的Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞,购于ATCC)复苏到T75细胞培养瓶中,并置于36℃温度下培养,长至单层致密后,用含0.25%胰酶的细胞分散液消化后,再加入含8%新生牛血清的DMEM细胞生长液传代培养,按1:3的比例逐级传代放大至3L转瓶内培养,转瓶按照1:3的传代比例扩传;
(2)片状载体处理
按照20g/L片状载体的比例,称量好所需的片状载体(购自ESCO公司)放入7L悬浮培养罐的载体框内,组装好悬浮培养罐,打入PBS缓冲液,使之充分浸泡到片状载体,10min后弃去PBS缓冲液,加入新的PBS缓冲液,并使其超过片状载体上界面10cm;
(3)悬浮培养罐及片状载体灭菌
按照悬浮培养的常规操作规程,对步骤(2)中含片状载体的7L悬浮培养罐进行121℃高温灭菌40min,冷却后取样做无菌检验,无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行;
(4)细胞上罐
将步骤(1)中3L转瓶内的Vero细胞消化下来,按终浓度1×106cells/mL的接种密度接种到步骤(3)中的7L悬浮培养罐内,设定温度37℃、pH 7.0、DO 30%、转速50rpm,开始培养;
(5)细胞悬浮培养
开始培养后22h,通过罗氏血糖仪取样测定培养液的含糖量,当含糖量低于8mmoL/L时,开始灌流培养,灌流速度根据培养液的含糖量进行增减调整;
(6)含毒维持液配制
取调好pH 7.0并预热的DMEM溶液,加入胰酶和猪流行性腹泻病毒PEDV毒种(猪流行性腹泻病毒AJ1102株),使最终含胰酶5μg/mL、猪流行性腹泻病毒PEDV毒种1%,混合均匀后,置于常温待用;
(7)接毒
当悬浮培养罐Vero细胞培养到72h时,停止培养,将生长液弃去,通过管道加入事先预热的PBS溶液,搅拌1min,弃去,再加入PBS搅拌1min,如此洗3次;然后再加入步骤(6)配制的含毒维持液,设定温度37℃、pH 7.2、DO 30%、转速50rpm,开始病毒悬浮培养;
(8)收毒
A.当病毒悬浮培养至24h,进行第一次收获病毒液,收获体积为培养总体积的80%,放-15℃以下冷库保存;
B.在一次收毒后的余下病毒悬浮培养液中加入含5μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养22h(DMEM溶液添加量与一次收毒液的收获量相同),进行第二次收获病毒液,收获体积为培养总体积的80%,放-15℃以下冷库保存;
C.在二次收毒后的余下病毒悬浮培养液中再加入含5μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养22h(DMEM溶液添加量与二次收毒液的收获量相同),进行第三次收获病毒液,全部收完,放-15℃以下冷库保存;
其中,每个收次的病毒液,均采用TCID50测定法检测一次病毒含量。
实施例2
如图1所示,本实施例的一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法,包括如下步骤:
(1)细胞复苏及扩增
将冻存的Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞,购于ATCC)复苏到T75细胞培养瓶中,并置于37℃温度下培养,长至单层致密后,用含0.25%胰酶的细胞分散液消化后,再加入含10%新生牛血清的DMEM细胞生长液传代培养,按1:6的比例逐级传代放大至15L转瓶内培养,转瓶按照1:5的传代比例扩传;
(2)片状载体处理
按照40g/L片状载体的比例,称量好所需的片状载体(购自ESCO公司)放入50L悬浮培养罐的载体框内,组装好悬浮培养罐,打入PBS缓冲液,使之充分浸泡到片状载体,15min后弃去PBS缓冲液,加入新的PBS缓冲液,并使其超过片状载体上界面15cm;
(3)悬浮培养罐及片状载体灭菌
按照悬浮培养的常规操作规程,对步骤(2)中含片状载体的50L悬浮培养罐进行121℃高温灭菌50min,冷却后取样做无菌检验,无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行;
(4)细胞上罐
将步骤(1)中15L转瓶内的Vero细胞消化下来,按终浓度5×106cells/mL的接种密度接种到步骤(3)中的50L悬浮培养罐内,设定温度37℃、pH 7.2、DO 60%、转速100rpm,开始培养;
(5)细胞悬浮培养
开始培养后26h,通过罗氏血糖仪取样测定培养液的含糖量,当含糖量低于8mmoL/L时,开始灌流培养,灌流速度根据培养液的含糖量进行增减调整;
(6)含毒维持液配制
取调好pH 7.4并预热的DMEM溶液,加入胰酶和猪流行性腹泻病毒PEDV毒种(猪流行性腹泻病毒AJ1102株),使最终含胰酶10μg/mL、猪流行性腹泻病毒PEDV毒种5%,混合均匀后,置于常温待用;
(7)接毒
当悬浮培养罐Vero细胞培养到96h时,停止培养,将生长液弃去,通过管道加入事先预热的PBS溶液,搅拌5min,弃去,再加入PBS搅拌5min,如此洗5次;然后再加入步骤(6)配制的含毒维持液,设定温度37℃、pH 7.4、DO 60%、转速100rpm,开始病毒悬浮培养;
(8)收毒
A.当病毒悬浮培养至24h,进行第一次收获病毒液,收获体积为培养总体积的90%,放-15℃以下冷库保存;
B.在一次收毒后的余下病毒悬浮培养液中加入含10μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养20h(DMEM溶液添加量与一次收毒液的收获量相同),进行第二次收获病毒液,收获体积为培养总体积的90%,放-15℃以下冷库保存;
C.在二次收毒后的余下病毒悬浮培养液中再加入含10μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养20h(DMEM溶液添加量与二次收毒液的收获量相同),进行第三次收获病毒液,全部收完,放-15℃以下冷库保存;
其中,每个收次的病毒液,均采用TCID50测定法检测一次病毒含量。
实施例3
如图1所示,本实施例的一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法,包括如下步骤:
(1)细胞复苏及扩增
将冻存的Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞,购于ATCC)复苏到T75细胞培养瓶中,并置于36.5℃温度下培养,长至单层致密后,用含0.25%胰酶的细胞分散液消化后,再加入含9%新生牛血清的DMEM细胞生长液传代培养,按1:4的比例逐级传代放大至10L转瓶内培养,转瓶按照1:4的传代比例扩传;
(2)片状载体处理
按照30g/L片状载体的比例,称量好所需的片状载体(购自ESCO公司)放入40L悬浮培养罐的载体框内,组装好悬浮培养罐,打入PBS缓冲液,使之充分浸泡到片状载体,12min后弃去PBS缓冲液,加入新的PBS缓冲液,并使其超过片状载体上界面13cm;
(3)悬浮培养罐及片状载体灭菌
按照悬浮培养的常规操作规程,对步骤(2)中含片状载体的40L悬浮培养罐进行121℃高温灭菌40min,冷却后取样做无菌检验,无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行;
(4)细胞上罐
将步骤(1)中10L转瓶内的Vero细胞消化下来,按终浓度3×106cells/mL的接种密度接种到步骤(3)中的40L悬浮培养罐内,设定温度37℃、pH 7.0、DO 45%、转速75rpm,开始培养;
(5)细胞悬浮培养
开始培养后24h,通过罗氏血糖仪取样测定培养液的含糖量,当含糖量低于8mmoL/L时,开始灌流培养,灌流速度根据培养液的含糖量进行增减调整;
(6)含毒维持液配制
取调好pH 7.2并预热的DMEM溶液,加入胰酶和猪流行性腹泻病毒PEDV毒种(猪流行性腹泻病毒AJ1102株),使最终含胰酶7.5μg/mL、猪流行性腹泻病毒PEDV毒种2.5%,混合均匀后,置于常温待用;
(7)接毒
当悬浮培养罐Vero细胞培养到90h时,停止培养,将生长液弃去,通过管道加入事先预热的PBS溶液,搅拌3min,弃去,再加入PBS搅拌3min,如此洗4次;然后再加入步骤(6)配制的含毒维持液,设定温度37℃、pH 7.1、DO 45%、转速75rpm,开始病毒悬浮培养;
(8)收毒
A.当病毒悬浮培养至24h,进行第一次收获病毒液,收获体积为培养总体积的85%,放-15℃以下冷库保存;
B.在一次收毒后的余下病毒悬浮培养液中加入含7.5μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养20h(DMEM溶液添加量与一次收毒液的收获量相同),进行第二次收获病毒液,收获体积为培养总体积的85%,放-15℃以下冷库保存;
C.在二次收毒后的余下病毒悬浮培养液中再加入含7.5μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养18h(DMEM溶液添加量与二次收毒液的收获量相同),进行第三次收获病毒液,全部收完,放-15℃以下冷库保存;
其中,每个收次的病毒液,均采用TCID50测定法检测一次病毒含量。
实施例4
本实施例用以说明采用实施例3方法所得的病毒液中抗原病毒含量测定结果。
采用实施例3方法进行连续4个批次(批号分别为:171103、171104、171205、171206)的病毒培养,各批次抗原病毒含量如表1所示。
表1 各批次的抗原病毒含量
由表1可知,采用本发明方法所得抗原病毒含量高,是传统生产工艺的10-30倍,并且,各批次所得的病毒含量稳定。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)细胞复苏及扩增
将冻存的Vero细胞复苏到T75细胞培养瓶中,并置于36-37℃温度下培养,长至单层致密后,用含0.25%胰酶的细胞分散液消化后,再加入含8-10%新生牛血清的DMEM细胞生长液传代培养,按1:(3-6)的比例逐级传代放大至3-15L转瓶内培养,转瓶按照1:(3-5)的传代比例扩传;
(2)片状载体处理
按照20-40g/L片状载体的比例,称量好所需的片状载体放入7-50L悬浮培养罐的载体框内,组装好悬浮培养罐,打入PBS缓冲液,使之充分浸泡到片状载体,10-15min后弃去PBS缓冲液,加入新的PBS缓冲液,并使其超过片状载体上界面10-15cm;
(3)悬浮培养罐及片状载体灭菌
按照悬浮培养的常规操作规程,对步骤(2)中含片状载体的7-50L悬浮培养罐进行121℃高温灭菌40-50min,冷却后取样做无菌检验;
(4)细胞上罐
将步骤(1)中3-15L转瓶内的Vero细胞消化下来,按终浓度(1-5)×106cells/mL的接种密度接种到步骤(3)中的7-50L悬浮培养罐内,设定温度37℃、pH 7.0-7.2、DO 30%-60%、转速50-100rpm,开始培养;
(5)细胞悬浮培养
开始培养后22-26h,取样测定培养液的含糖量,当含糖量低于8mmoL/L时,开始灌流培养;
(6)含毒维持液配制
取调好pH 7.0-7.4并预热的DMEM溶液,加入胰酶和猪流行性腹泻病毒PEDV毒种,使最终含胰酶5-10μg/mL、猪流行性腹泻病毒PEDV毒种1%-5%,混合均匀后,置于常温待用;
(7)接毒
当悬浮培养罐Vero细胞培养到72-96h时,停止培养,将生长液弃去,通过管道加入事先预热的PBS溶液,搅拌1-5min,弃去,再加入PBS搅拌1-5min,如此洗3-5次;然后再加入步骤(6)配制的含毒维持液,设定温度37℃、pH 7.2-7.4、DO 30%-60%、转速50-100rpm,开始病毒悬浮培养;
(8)收毒
A.当病毒悬浮培养至16-24h,进行第一次收获病毒液,收获体积为培养总体积的80%-90%,放-15℃以下冷库保存;
B.在一次收毒后的余下病毒悬浮培养液中加入含5-10μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养16-24h,进行第二次收获病毒液,收获体积为培养总体积的80%-90%,放-15℃以下冷库保存;
C.在二次收毒后的余下病毒悬浮培养液中再加入含5-10μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养16-24h,进行第三次收获病毒液,全部收完,放-15℃以下冷库保存;
其中,每个收次的病毒液,均测定一次病毒含量。
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法,其特征在于,所述步骤(1)中Vero细胞为非洲绿猴肾传代细胞,购于ATCC,由华中农业大学动物医学院预防兽医学实验室保管和供应。
3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法,其特征在于,所述步骤(2)中片状载体直接购买自ESCO公司。
4.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法,其特征在于,所述步骤(3)中无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行。
5.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法,其特征在于,所述步骤(5)中通过罗氏血糖仪测定培养液的含糖量。
6.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法,其特征在于,所述步骤(5)中灌流培养的灌流速度根据培养液的含糖量进行增减调整。
7.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法,其特征在于,所述步骤(6)中猪流行性腹泻病毒PEDV具体为猪流行性腹泻病毒PEDV-AJ1102,即Porcineepidemic diarrhea virus PEDV-AJ1102,由华中农业大学提供,并由华中农业大学于2014年10月24日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏与登记,保藏编号为CCTCC V201433。
8.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法,其特征在于,所述步骤(6)中常温指20-25℃。
9.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法,其特征在于,所述步骤(8)的B步骤与C步骤中DMEM溶液的添加量均与前一次病毒液的收获量相同。
10.根据权利要求9所述的猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法,其特征在于,所述步骤(8)中采用TCID50测定法检测病毒含量。
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