CN113355297A - 一种灌流式培养全悬浮mdck细胞生产重组禽流感病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种灌流式培养全悬浮MDCK细胞生产重组禽流感病毒的方法，包括：(a)当培养系统中全悬浮MDCK细胞的密度达到7×10⁶‑10×10⁶个/mL时，补充培养液将所述MDCK细胞的密度调整至3.5×10⁶‑5×10⁶个/mL；(b)接入重组禽流感病毒种毒，进行病毒扩增培养；(c)当病毒血凝价HA≥1:512时，分离并收获病毒液；(d)向所述培养系统中补入新鲜培养液，继续培养；(e)重复步骤(c)‑(d)进行病毒液的多次分离和收获，直至所述培养系统中细胞密度低于2×10⁶个/mL后终止收获。本发明方法可稳定实现连续增殖重组禽流感病毒，一次性接入种毒，可连续收获3‑4批次病毒。

Description

一种灌流式培养全悬浮MDCK细胞生产重组禽流感病毒的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种灌流式培养全悬浮MDCK细胞生产重组禽流感病毒的方法。

背景技术

相对于传统的批次培养和补料批次培养方式，连续灌注培养能用更小的设备表达更多的产物，同时还能有效改善产品质量，因此，目前的现有技术中广泛应用连续流工艺(灌流式)培养模式。在连续流工艺培养模式中，补料营养成分连续加入，有害代谢产物会及时去除，从而使得细胞在长时间内维持高密度培养和高活率，这样不仅让细胞处于平衡稳定状态，增殖的产物具备高度一致性，连续地进行病毒的增殖与收获也能最大程度的保证产品的稳定性。

从禽流感病毒的增殖特性来看，一般将病毒增殖分为四个过程：病毒的吸附、穿膜和脱壳——病毒基因组的复制及其他成分合成——病毒粒子的装配——病毒的出芽和释放。病毒成熟的最后一步是靠宿主的蛋白酶将HA(血凝素)裂解为HA1和HA2，使病毒粒子具有感染性，而且这一过程可在细胞外完成，此时剩余的细胞还可以支撑病毒的再次感染、装配、出芽释放。基于病毒的这种特性，可以实现一次性接入种毒，连续多批次从反应器收获病毒。

然而，现有的利用全悬浮MDCK细胞增殖重组禽流感病毒使用的是批次培养的方法，一批次细胞培养好之后接入种毒，培养到收获时间时一次性全部收获，收获的病毒液中还含有大量的健康细胞没有被有效利用，反而后期还要通过纯化的手段去除这些细胞，病毒液才能得以使用。此种方法生产重组禽流感灭活疫苗一方面需要足够数量的大型反应器来实现，硬件设备的投入较大，培养一批次全悬浮细胞只能进行一批次的病毒增殖，收获一批次病毒液就需要准备一次反应器，消耗大量的人力与能耗；另一方面，批次培养的细胞如果出现差异和不稳定的情况，增殖病毒的批间差异就会较大，造成疫苗质量的不稳定。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灌流式培养全悬浮MDCK细胞生产重组禽流感病毒的方法，本发明的方法可在5升-1000升反应器上以稳定实现连续增殖重组禽流感病毒，培养一批次细胞、一次性接入种毒，可连续收获3-4批次病毒。

本发明提供的技术方案如下：

一种灌流式培养全悬浮MDCK细胞生产重组禽流感病毒的方法，包括：

(a)当培养系统中全悬浮MDCK细胞的密度达到7×10⁶-10×10⁶个/mL时，补充培养液将所述MDCK细胞的密度调整至3.5×10⁶-5×10⁶个/mL；

(b)接入重组禽流感病毒种毒，进行病毒扩增培养；

(c)当病毒血凝价HA≥1:512时，分离并收获病毒液；

(d)向所述培养系统中补入新鲜培养液，继续培养；

(e)重复步骤(c)-(d)进行病毒液的多次分离和收获，直至所述培养系统中细胞密度低于2×10⁶个/mL后终止收获。

灌注培养是在当细胞密度达到一定浓度后，将培养液部分收获并截留细胞，同时补入相应新鲜培养基，降低培养过程中毒副产物的浓度从而延长培养时间，在培养过程中连续不断地收获产物。

在一个实施方案中，在所述步骤(c)中，分离病毒液后将健康细胞留至所述培养系统中，留下的细胞液的体积为原体积的1/30-1/40。

在一个实施方案中，所述步骤(c)中，分离并收获病毒液的方法包括：降温沉降法抽取病毒液上清或使用微膜过滤细胞截留设备收获病毒液。

在一个实施方案中，所述降温沉降法抽取病毒液上清包括将反应系统的温度降至10℃-15℃，静置沉降2-4小时；

静置沉降结束后，当细胞数低于0.5×10⁵个/mL时抽取上清进行病毒液收获。

在一个实施方案中，所述降温沉降法抽取病毒液上清具体包括：

准备反应器的同时在反应器上安装抽取上清的装置，安装位置在反应器的下1/30-1/40处；

待病毒病毒血凝价HA≥1:512时，关闭反应器的自动培养模式，使用冷媒将反应器温度降至10-15℃(温度过低细胞损伤较大不利于后期复苏，温度过高影响细胞沉降速度；根据反应器的大小不同此过程需要30-60分钟)，关闭搅拌，使反应器内保持静置状态，依据反应器的大小不同沉降时间在2-4小时；

静置时间到后先取样进行细胞计数，细胞数低于0.5×105个/mL时即可抽取上清进行病毒液收获。收获完毕后补充培养液至原体积，同时加入胰酶开始下一批病毒液的培养。

在一个实施方案中，微膜过滤细胞截留设备可以使用交替式切向流(ATF)过滤的搅拌罐生物反应器，以ATF系统进行灌流。以1000升反应器为例，使用ATF10系统每小时的排出病毒液的速度在200升左右，一台ATF10大概需要5个小时完成，建议实际操作过程中1000升反应器配备两台ATF10进行操作，保证在3小时之内完成。使用ATF系统时需要开启搅拌，开启通气、pH控制，建议将温度降至15℃左右(减缓细胞的代谢)。

在一个实施方案中，向所述培养系统中补入新鲜细胞培养液，继续培养，补入新鲜培养液置换旧的培养基，通过补充新鲜培养基，同时去除耗竭培养基，维持生物反应器内恒定的体积。培养基灌流速率高于细胞生产速率，细胞需被截留在生物反应器内。使用连续灌流，细胞可生长至更高的细胞密度。

在一个实施方案中，所述步骤(b)中，接入的重组禽流感病毒中毒为所述培养系统中细胞液总体积的0.001％-0.01％。

在一个实施方案中，所述步骤(b)中，在接入重组禽流感病毒种毒的同时，还添加胰蛋白酶；优选地，所述胰蛋白的添加量为3-8μg/mL。

在一个实施方案中，所述步骤(b)中，在接入重组禽流感病毒种毒后，进行病毒扩增培养的条件为pH值6.9-7.3，溶氧30-50％，温度32-35℃。

在一个实施方案中，在所述步骤(d)中，向所述培养系统中补入新鲜细胞培养液的量为使得细胞液的体积达到分离前的原始体积。

在一个优选的实施方案中，所述培养液包括细胞培养液或接毒维持液中的一种或多种；

在一个优选的实施方案中，所述培养液为所述细胞培养液和所述接毒维持液的混合物；优选1:1体积比的混合物。细胞培养液包括以下成分：生物素1～10×10^-8M、氯化钙1～5×10^-3M、硫酸铜2.8～12.8×10^-9M、氰钴胺1～10×10^-7M、D-泛酸钙2～8×10^-5M、D-葡萄糖1.6～2.0×10^-2M、硫酸亚铁2～10×10^-6M、叶酸0.5～1.5×10^-4M、谷胱甘肽3.5～9.5×10^{- 7}M、氢化可的松3～7×10^-8M、次黄嘌呤1～5×10^-5M、肌醇1～10×10^-5M、硝酸铁0.3～2×10^{- 7}M、L-丙氨酸1～20×10^-5M、L-精氨酸1～20×10^-4M、L-天冬酰胺1～20×10^-5M、L-天冬氨酸1～20×10^-5M、L-半胱氨酸0.1～10×10^-4M、L-胱氨酸0.1～10×10^-4M、L-谷氨酸1～20×10^{- 5}M、L-谷氨酰胺1～10×10^-3M、甘氨酸1～10×10^-4M、L-组氨酸0.5～10×10^-4M、L-异亮氨酸0.5～10×10^-4M、L-亮氨酸0.5～10×10^-4M、L-赖氨酸1～20×10^-4M、L-蛋氨酸1～10×10^-4M、L-苯丙氨酸1～10×10^-4M、L-脯氨酸0.1～10×10-4M、L-丝氨酸1～20×10^-4M、L-苏氨酸1～20×10^-4M、L-色氨酸1～20×10^-5M、L-酪氨酸1～10×10^-4M、L-缬氨酸1～20×10^-4M、硫辛酸1～20×10^-7M、氯化镁1～20×10^-5M、硫酸镁1～20×10^-4M、烟酰胺1～20×10^-5M、对氨基苯甲酸0.5～5g、氯化钾1～10×10^-3M、腐胺1～10×10^-7M、吡多辛1～10×10^-7M、核黄素1～10×10^-7M、碳酸氢钠1～10×10^-2M、氯化钠0.5～10×10^-1M、磷酸氢二钠1～10×10^-4M、磷酸二氢钠1～10×10^-4M、丙酮酸钠0.1～10×10^-3M、硫胺素1～20×10-6M、胸腺嘧啶脱氧核苷0.5～10×10^-6M、硫酸锌0.1～10×10^-6M、氯化胆碱0.1～10×10^-4M、胰岛素5～15mg、转铁蛋白5～15mg、三典甲状腺氨酸1～20×10^-12M以及二硫苏糖醇1～20×10^-6M。与细胞培养液相比，接毒维持液的营养成分较低。在一个实施方案中，与上述细胞培养液相比，接毒维持液中，各个氨基酸类组分的使用量减少50％，此外，增加剪切力保护剂和抗细胞结团剂。在一个具体的实施方案中，剪切力保护剂的浓度为1000～2000mg/L；抗细胞结团剂的浓度为60～80mg/L；优选地，剪切力保护剂可选如：Pluronic F-68；抗细胞结团剂可选如：硫酸葡聚糖。

在一个实施方案中，可单独使用细胞培养液，也可单独使用接毒维持液，也可是两者1：1混合。

采用细胞培养液和接毒维持液1：1混合，主要是为了保证一代毒的血凝价达到要求，又能保证细胞的正常增殖需要。

在一个实施方案中，在所述步骤(d)中，还包括添加胰蛋白酶；优选地，所述胰蛋白的添加量为3-8μg/mL。

在本发明技术方案中，当所述培养系统中细胞密度低于2×10⁶个/mL后终止收获，也即当所述培养系统中剩余细胞不能够支撑病毒增殖，达不到所要求的毒价为止。

在一个实施方案中，所述培养系统为灌流式细胞培养生物反应器。

在本发明的实施方案中，所述重组禽流感病毒选自H5亚型重组禽流感病毒或H7亚型重组禽流感病毒。

本发明从生物反应器接种细胞量、灌流速度、分离病毒液后留至培养系统中健康细胞量的控制以及细胞培养液等方面优化MDCK细胞的培养条件，能得到较高的细胞密度并获得高毒力的病毒收获液。

本发明灌流连续培养中参数对的病毒增殖与收获的影响：

(1)既要保证一代毒的HA≥1:512，又要保证一代毒收获后还有不低于300万个/mL的细胞可继续进行2代、3代的连续增殖，要从三个方面进行控制：1、接毒时保证初始的细胞密度300万个/mL-400万个/mL，细胞数太低2代、3代培养时无法保证毒价；细胞数太高1代毒的毒价有可能无法达到HA≥1:512。

(2)接毒时补充营养液的种类，如果像批次培养时补充接毒维持液，只能保证1代毒毒价合格，由于接毒维持液的营养成分不够，剩余的细胞数难以维持2代、3代的培养。如果接毒时单纯补充细胞营养液，细胞增殖过快，病毒得不到有效感染，会造成1代毒毒价难以达标。所以我们采用细胞营养液和接毒维持液搭配使用，1：1混合，能够有效解决以上问题。

(3)收获后剩余体积必须控制在原体积1/30-1/40，能够控制在1/40，并且使95％以上的细胞还留在反应器内。这样即可以保证种毒的含量不至于过多，又有足够的细胞用来增殖病毒。

有益效果：

基于禽流感病毒的增殖特性，病毒成熟的最后一步靠宿主的蛋白酶将HA裂解为HA1和HA2使粒子具有感染性可在细胞外完成，此时剩余的细胞还可以支撑病毒多批次连续的感染、装配、出芽释放，直至剩余细胞不能够支撑病毒增殖，达不到所要求的毒价为止。可实现一次性接入种毒，连续多批次从反应器收获病毒。灌注式连续培养的工艺更适宜禽流感病毒的增殖。

本发明的方法可在短时间内用更小的设备表达更多的产物，减少大设备的投入，显著的降低能耗和减少碳排放，节约时间成本。以1000升反应器为例，使用现有单批次培养的模式，1000升健康细胞培养需要2天，病毒培养需要2-3天，整体来说得到1000升病毒液所需的工艺周期为4-5天。而使用本发明所述方法，细胞培养周期也同样是2天，以连续收获3批病毒液计算，4-5天即可收获2900升左右抗原，整体来说得到1000升病毒液所需的工艺周期为6-7天。如果使用现有的单批次培养的方法收获2900升的病毒液，则需要12-15天时间，这还不包括批与批之间设备的清洗、准备、灭菌时间。而如果使用批次培养在6-7天的时间收获2900升病毒液，就需要更大的反应器等设备的投入，厂房空间也需相应增大。

本发明的灌流连续培养模式中，补料营养成分连续加入，有害代谢产物会及时去除，从而使得细胞在长时间内维持相应密度和活率；培养1批次细胞增殖3-4批次病毒，培养病毒的均一性显著提升，也进一步提升了产品质量。

使用连续灌流系统，使细胞稳定的处在较好的营养环境中，有害代谢废物浓度积累较低；反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，目标产品回收率高。

本发明病毒批间差异小，质量可控性强。使用方法简单，便于大规模产业化。在一批次培养的细胞上实现3-4批次的病毒增殖与收获，同比产量增加了3-4倍。短时间内用更小的设备表达更多的产物，减少大设备的投入。显著的降低能耗和减少碳排放，节约大量的时间成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明灌流连续培养病毒的流程图；

图2为现用批次培养病毒的流程图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1.在全悬浮MDCK细胞上灌流式连续增殖重组禽流感病毒

1.1使用无血清全悬浮的方法培养MDCK细胞

MDCK细胞依次用胎牛血清含量为8％、5％、2％的DMEM/F12培养基传代培养；然后依次用DMEM/F12培养基与低血清培养基按照体积比为1:1、1:5、0:1混合培养液培养，消化、离心，得到的细胞用低血清培养基以转速为20-30r/min进行摇床培养，逐步提高摇床转速，至得到完全失去黏附瓶壁能力的细胞，即为低血清悬浮培养的细胞株；收集细胞，逐步提高无血清培养基的含量，生长稳定后，得到无血清悬浮培养的MDCK细胞。

将无血清悬浮培养的MDCK细胞进行细胞扩增培养。当MDCK细胞密度培养至700万个/mL左右时，补充接毒液(细胞培养液和接毒维持液1:1的混合物)，将细胞密度调整至350万个/mL，即可按细胞液总体积的0.001％的量接入种毒，接毒时加入胰蛋白酶的量3μg/mL，接毒后设定反应器控制参数：pH值6.9、溶氧30％、温度32℃、搅拌转速根据反应器的转速进行调整，进行接毒阶段培养。

1.2病毒液与细胞分离

病毒培养2-3天后，当病毒血凝价HA≥1:512时，采取降温沉降抽取上清(病毒液)或是使用微膜过滤细胞截留设备(ATF)收获病毒液，将健康细胞留至反应器内，留下细胞的体积为原体积的1/30。

1.3再次培养

向反应器中补充接毒液至原有体积，无需再次接入种毒，只需加入胰蛋白酶3μg/mL，调整好病毒培养参数继续培养0.5-1天，当病毒液HA≥1:512时，使用上述1.2的方法收获病毒液，当剩余细胞密度低于200万个/mL后即可终止连续收获，如此循环操作可连续收获3-4批次，收获后的病毒经灭活后可配制重组禽流感灭活疫苗。

实施例2.在全悬浮MDCK细胞上灌流式连续增殖重组禽流感病毒

1.1使用无血清全悬浮的方法培养MDCK细胞

培养无血清全悬浮MDCK细胞的方法同实施例1。

当MDCK细胞密度培养至1000万个/mL左右时，补充接毒液，将细胞密度调整至500万个/mL，即可按细胞液总体积的0.01％的量接入种毒，接毒时加入胰蛋白酶的量8μg/mL，接毒后设定反应器控制参数：pH值7.3、溶氧50％、温度35℃、搅拌转速根据反应器的转速进行调整，进行接毒阶段培养。

1.2病毒液与细胞分离

病毒培养2-3天后，当病毒血凝价HA≥1:512时，采取降温沉降抽取上清(病毒液)或是使用微膜过滤细胞截留设备(ATF)收获病毒液，将健康细胞留至反应器内，留下细胞的体积为原体积的1/40。

1.3再次培养

向反应器中补充接毒液至原有体积，无需再次接入种毒，只需加入胰蛋白酶8μg/mL，调整好病毒培养参数继续培养0.5-1天，当病毒液HA≥1:512时，使用上述1.2的方法收获病毒液，当剩余细胞密度低于200万个/毫mL后即可终止连续收获，如此循环操作可连续收获3-4批次，收获后的病毒经灭活后可配制重组禽流感灭活疫苗。

对比例1.现用批次培养病毒的方法

(1)制备无血清全悬浮MDCK细胞；培养无血清全悬浮MDCK细胞的方法同实施例1。

(2)接入重组禽流感病毒种毒，接毒细胞数300万个/mL-400万个/mL；接毒量MOI10^-3-10^-4、0.001％-0.0001％；

(3)培养48-72小时收获病毒。

对比例2.现用批次培养病毒与本发明灌流连续培养病毒的比较

图1为本发明灌流连续培养病毒的流程图。图2为现用批次培养病毒的流程图。

使用重组禽流感病毒灭活疫苗(H5+H7)制苗用的三个毒株(H5N1Re-11株/H5N1Re-12株/H7N9 H7-Re3株)，分别采用两种方法在1000升反应器上培养病毒进行对比，其中表1为培养病毒的国家标准；表2为现用批次培养病毒情况；表3为发明灌流连续培养病毒情况。

表1培养病毒的国家标准

血凝价HA	纯净性
		HA≥1:256	无菌检验合格

表2现用批次培养病毒情况

表3发明灌流连续培养病毒情况

由此可见，本发明的灌流连续培养可以实现3-4批次的病毒增殖与收获，同比产量增加了3-4倍。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种灌流式培养全悬浮MDCK细胞生产重组禽流感病毒的方法，其特征在于，包括：

(a)当培养系统中全悬浮MDCK细胞的密度达到7×10⁶-10×10⁶个/mL时，补充培养液将所述MDCK细胞的密度调整至3.5×10⁶-5×10⁶个/mL；

(b)接入重组禽流感病毒种毒，进行病毒扩增培养；

(c)当病毒血凝价HA≥1:512时，分离并收获病毒液；

(d)向所述培养系统中补入新鲜培养液，继续培养；

(e)重复步骤(c)-(d)进行病毒液的多次分离和收获，直至所述培养系统中细胞密度低于2×10⁶个/mL后终止收获。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(c)中，分离病毒液后将健康细胞留至所述培养系统中，留下的细胞液的体积为原体积的1/30-1/40。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，分离并收获病毒液的方法包括：降温沉降法抽取病毒液上清或使用微膜过滤细胞截留设备收获病毒液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述降温沉降法抽取病毒液上清包括：将反应系统的温度降至10℃-15℃，静置沉降2-4小时；

静置沉降结束后，当细胞数低于0.5×10⁵个/mL时抽取上清进行病毒液收获。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，所述重组禽流感病毒种毒的接入量为所述培养系统中细胞液总体积的0.001％-0.01％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，在接入所述重组禽流感病毒种毒的同时，还添加胰蛋白酶；优选地，所述胰蛋白的添加量为3-8μg/mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，所述病毒扩增培养的条件为pH值6.9-7.3，溶氧30-50％，温度32-35℃。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(d)中，向所述培养系统中补入新鲜细培养液的量为使得细胞液的体积达到分离前的原始体积；

优选地，所述培养液包括细胞培养液或接毒维持液中的一种或多种；

更优选地，所述培养液为所述细胞培养液和所述接毒维持液的混合物；优选体积比1:1的混合物。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(d)中，还包括添加胰蛋白酶；优选地，所述胰蛋白的添加量为3-8μg/mL。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述培养系统为灌流式细胞培养生物反应器。

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