JP2021503290A - 液体培地を作製するための合理化された方法 - Google Patents
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Abstract
Description
i)pH、溶解度、および濃度に基づいて培地成分をグループ化することと、
ii)製剤中の構成成分に応じて特定のpHを標的とするように、アミノ酸の遊離塩基形態または塩形態を変換することと、
iii)前記グループの最適な可溶化を可能にする順序でグループの添加を行うことと、を含み、
得られた液体培地は、上記のステップi)、ii)およびiii)を用いて調製されていない培地と比較して、該グループを可溶化するためにより少ない酸および/または塩基の添加を必要とする、方法を提供する(ステップi)、ii)およびiii)は、合理化された方法を形成する)。
1.細胞細胞培地
細胞培養培地は、いくつかの成分から構成され、これらの成分は培地ごとに異なる。細胞培養培地は、完全な製剤、すなわち、細胞を培養するために補充を必要としない細胞培養培地であってもよいか、あるいは不完全な製剤であってもよく、すなわち、細胞培養培地が、補充を必要とし得るか、もしくは不完全な製剤を補充するためのサプリメントとして使用され得るか、または完全な製剤の場合、細胞培養性能もしくは培養結果(力価)を改善し得る。
細胞培養培地成分は、典型的には、炭水化物、アミノ酸、塩、微量元素、およびビタミンを含む。哺乳動物細胞の場合、細胞培養培地に使用される主な炭水化物はグルコースであり、日常的に5〜25nM補充される。Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell−Based Therapies,51(Sadettin Ozturk and Wei−Shou Hu eds.,Taylor and Francis Group 2006)を参照されたい。グルコースに加えて、ガラクトース、フルクトース、もしくはマンノース等の任意のヘキソース、またはこれらの組み合わせも使用され得る。加えて、哺乳動物細胞も主要なエネルギー源としてグルタミンを使用し得る。グルタミンは、他のアミノ酸よりも高い濃度で含まれることが多い(2〜8mM)。しかしながら、上記のように、グルタミンは自然に分解してアンモニアを形成する可能性があり、特定の細胞株はアンモニアをより迅速に産生するが、それは毒性である。したがって、細胞培養培地中の有毒なアンモニアの蓄積を減少させるために、グルタミン酸およびグルタミンジペプチドが、グルタミンの代替物として使用されてきた。
アミノ酸は、培養される細胞の代謝機能を維持するために細胞培養培地において重要である。細胞培養培地は、典型的には、必須アミノ酸(すなわち、通常、哺乳動物によってインビボでは合成されないアミノ酸)および特定の非必須アミノ酸を含む。非必須アミノ酸は、典型的には、細胞株がアミノ酸を合成できない場合、または細胞株が最大の増殖を支持するのに十分な量のアミノ酸を産生できない場合に、細胞培養培地に含められる。例示的なアミノ酸として、L−アラニン、L−アルギニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−システイン、L−グルタミン酸、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−ヒドロキシプロリン、L−セリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、およびL−バリンが挙げられる。本開示における方法は、例えば表1に示されるような特性に基づいて、アミノ酸を分類することに関する。そのような分類は周知である。しかしながら、本開示は、濃縮技術を用いる以前に使用されていた方法の細胞培養増殖および力価の性能を損なうことなく、pHおよび濃度でアミノ酸をグループ化してマッチングさせ、酸または塩基の添加を減少させるまたは排除して所望のpHを達成するためにそれらの添加をマッチングさせることを目的としている。培地濃縮技術は、例えば、米国特許出願第5474931号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。アミノ酸の例示的な分類を下の表1に示すが、アミノ酸はそれらの酸性、塩基性、または中性の特性に基づいてグループ化されている。液体培地を調製する一方で、アミノ酸グループの滴定、ならびにpHおよび濃度に基づくグループのマッチングにより、5474931号に記載されるほど多くの酸および/または塩基を添加することなく、また以下の例に示すように、所望のpHを達成することができる。
塩は、等張状態を維持し、浸透圧の不均衡を防ぐために細胞培養培地に添加される。標準的な哺乳動物細胞培養培地の浸透圧は約300mOsm/kgであるが、多くの細胞株がこの値の約10%の変動に耐えることができる。いくつかの昆虫細胞培養物の浸透圧は300mOsm/kgよりも高い傾向があり、これは300mOsm/kgよりも0.5%、1%、2〜5%、5〜10%、10〜15%、15〜20%、20〜25%、25〜30%高くてもよい。細胞培養培地に最も一般的に使用される塩は、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO4 2-、PO4 3-、およびHCO3 -(例えば、CaCl2、KCl、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4)を含む。したがって、特定の細胞型を培養するための細胞培養培地の所望の浸透圧は、当該技術分野で既知の方法を用いて、当業者によって経験的に決定されてもよい。
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるUS2005/0287666に記載されるように、血清中に微量で存在する他の無機元素が細胞培養培地に含まれてもよい。それらは、Mn、Cu、Zn、Mo、Va、Se、Fe、Ca、Mg、Si、およびNiを含む。それほど頻繁ではないが、細胞培養培地に添加されてきた他の無機元素として、Al、Ag、Ba、Br、Cd、Co、Cr、F、Ge、J、Rb、およびZrが挙げられる。これらの元素の多くは、酵素活性に関与する。それらは、CaCl2、Fe(N03)3、MgCl2、MgSO4、MnCl2、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4、等の塩、ならびにセレン、バナジウム、および亜鉛等の微量元素のイオンの形態で提供され得る。これらの微量元素は、様々な形態で、好ましくはNa2SeO3,NH4VO3等の塩の形態で提供され得る。これらの無機塩および微量元素は、例えばSigma(Saint Louis,Missouri)から商業的に入手することができる。
ビタミンは、典型的には、補因子として細胞によって使用される。各細胞株のビタミン要件は大きく異なるが、細胞培養培地が血清をほとんどもしくはまったく含まない場合、または細胞を高密度で増殖させる場合、一般的に余分のビタミンが必要とされる。例示的なビタミンとして、ビオチン、塩化コリン、葉酸、i−イノシトール、ニコチンアミド、D−Ca++-パントテン酸、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、ナイアシンアミド、A、B6、B12、C、D3、E、K、およびp−アミノ安息香酸(PABA)が挙げられる。
凝固した血液の上清である血清は、細胞の増殖および/または生産性を促進する構成成分を提供するために、細胞培養培地に使用され得る。これらの血清成分には、接着因子、微量栄養素(例えば、微量元素)、増殖因子(例えば、ホルモン、プロテアーゼ)、および保護エレメント(例、抗毒素、抗酸化剤、抗プロテアーゼ)が含まれる。血清は、ウシまたはウマを含む様々な動物源から入手可能である。細胞培養培地に含まれる場合、血清は、典型的には5〜10%の濃度で添加される。特定の細胞培養培地は無血清である。
血清の非存在下でまたは血清低減培地中で細胞増殖を促進するために、以下のポリペプチドのうちの1つ以上を細胞培養培地に添加することができる:例えば、酸性FGFおよび塩基性FGFを含む線維芽細胞増殖因子(FGF)、インスリン、インスリン様増殖因子(IGF)、上皮増殖因子(EGF)、神経成長因子(NGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、ならびにTGFαおよびTGFβを含むトランスフォーミング増殖因子(TGF)、サイトカイン、例えば、インターロイキン1、2、6、顆粒球刺激因子、白血球抑制因子(LIF)。
1つ以上の脂質を細胞培養培地に添加することもできる。血清は、典型的には、脂肪酸(リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ポリエン酸、および/または各炭素原子が分岐もしくは非分岐である12、14、16、18、20、または24炭素原子の脂肪酸)、リン脂質、レシチン(ホスファチジルコリン)、およびコレステロール等の脂質を含有する。代替的に、これらの脂質のうちの1つ以上がサプリメントとして無血清培地に含まれてもよい。ホスファチジン酸およびリゾホスファチジン酸は、MDCK、マウス上皮、および他の腎細胞株等の特定の足場依存性細胞の増殖を促進する一方で、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルイノシトールは、無血清培地中でヒト線維芽細胞の増殖を促進する。エタノールアミンおよびコレステロールも、特定の細胞株の増殖を促進することが示されている。特定の実施形態において、細胞培養培地は脂質を含有しない。
ウシ血清アルブミン(BSA)またはトランスフェリン等の1つ以上の担体タンパク質を、細胞培養培地に添加することもできる。担体タンパク質は、特定の栄養素または微量元素の輸送に役立ち得る。BSAは、典型的には、水溶液に不溶性であるリノール酸およびオレイン酸等の脂質の担体として用いられる。加えて、BSAは、Fe、Cu、Ni等の特定の金属の担体としても機能し得る。タンパク質不含製剤では、シクロデキストリン等の、BSAの非動物由来代替物が脂質担体として使用され得る。トランスフェリンは、細胞膜を横切る鉄の輸送に関与する。特定の場合において、下流の治療用途のために生成される生成物にとって望ましい細胞の培養(例えば、異種不含(XF)培養において等)のために、ヒト血清アルブミンが必要であり得る。他の場合において、組換えヒト血清アルブミンは、細胞を培養するために細胞培養培地において使用され得る。特定の場合において、細胞の動物由来成分不含(AOF)培養を提供するために、組換えヒト血清アルブミンは、植物、藻類、または真菌供給源、例えば、イネ、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ、さらには酵母等に由来し得る。タンパク質不含製剤では、トランスフェリンを、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるWO98/08934に記載されるような第二鉄塩および/もしくは第一鉄塩で、または参照によりその全体が本明細書に組み込まれるUS2007/0254358に記載さるようなヒドロキシピリジン誘導体で置き換えることができる。さらに、タンパク質不含製剤では、インスリンを、亜鉛、バナジウム、または他の適切な二価塩で置き換えることができる。
足場依存性細胞の基質への付着を促進するのを助けるために、フィブロネクチン、ラミニン、およびプロネクチン等の1つ以上の付着タンパク質を細胞培養培地に添加することもできる。
細胞培養培地は、必要に応じて、1つ以上の緩衝剤を含み得る。好適な緩衝剤には、N−¥[2−ヒドロキシエチル]−ピペラジン−N’−[2−エタンスルホン酸](HEPES)、MOPS、MES、ホスフェート、重炭酸、及び細胞培養用途に使用するのに好適な他の緩衝剤が含まれるが、これらに限定されない。好適な緩衝剤は、培養される細胞に対して実質的な細胞毒性がない緩衝能を提供するものである。好適な緩衝剤の選択は、細胞培養の分野の当業者の範囲内である。
ポリアニオンまたはポリカチオン化合物は、細胞が凝集するのを防ぎ、懸濁液中の細胞の増殖を促進し得る。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるWO98/08934を参照されたい。例示的なポリアニオン化合物として、ヘパリン、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、多硫酸、プロテオグリカン等のポリスルホン化またはポリ硫酸化化合物が挙げられる。
伝統的な濃縮法
1×液体は、米国特許第5,474,931号に詳述される「濃縮」技術を用いて調製することができる。この「濃縮」法では、(表2〜5に示すような)構成成分または成分を溶液中で調製して保存することができる。好ましくは、成分は濃縮溶液中でグループ化され、保存される。例えば、グループ化は、表1に示されるアミノ酸成分のグループであり得る。表2の成分の例示的なグループ化は、以下の通りであり得る:i)1つのグループとして酸可溶性アミノ酸、ii)反応性、濃度、および適合性に基づいて一緒にグループ化された特定のビタミンおよび塩、iii)溶解度特性に従ってグループ化された微量金属、iv)反応性、濃度、および適合性に基づいて一緒にグループ化されたプルロニック、グルコース、緩衝剤、他のビタミンおよび塩。
一方、「合理化された」技術を用いて調製された液体は以下を行う:
(a)構成成分を可溶化するためにより少ない酸および/もしくは塩基の添加を必要とし、かつ/または
(b)酸および/もしくは塩基の添加による金属汚染物質を減少させ、かつ/または、
(c)金属のロット間のばらつきが少なく、
(d)調製する必要のある(側)溶液が少ないため、かつ構成成分の最適化されたグループ化に起因して、より少ない調合時間を必要とする。濃縮法の広範なpHおよび溶解度を有する構成成分を十分に可溶化するためには、さらなる時間が必要である。
バッチ間の変動、高タンパク質含有量、汚染物質(例えば、ウイルス、マイコプラズマ、プリオン)のリスク、限られた入手可能性、および高コストを含む血清に関連する潜在的な問題が、無血清培地の生産を推進してきた。さらに、血清を補充した培地で増殖した細胞に見られる発現レベルと比較して、無血清培地で増殖した細胞からは、改善されたレベルの組換えタンパク質発現を得ることができる(Battista,P.J.et al.,Am.Biotech Lab.s12:64−68(1994))。
無血清培地は、血清を含有する細胞培養培地と比較して少量のタンパク質を含有する。しかしながら、無血清培地は、アルブミン、フェチュイン、様々なホルモン、および他のタンパク質を含む、様々な動物由来成分の1つ以上をなおも含有し得る。タンパク質の存在により、組換えタンパク質の精製が困難になり、時間がかかり、かつ高価になり、生成物の収量および/または純度の低下ももたらされ得る。したがって、一実施形態において、細胞培養培地はタンパク質を含まない。
細胞の流加培養は、典型的には、高い製品濃度および容積生産性を目指して、細胞濃度を増加させるためおよび培養寿命を延長するために、タンパク質等の生体分子の工業的生産に用いられる。流加培養は、基礎培地へのグルコース、アミノ酸等の、細胞によって迅速に利用される栄養素を含み得る供給物の形態の、1つ以上の栄養素の制御された添加を伴う。栄養素(複数可)は、栄養素の枯渇および副産物の蓄積を妨げようとすることによって、pH、浸透圧、およびCO2濃度等の重要なパラメータを、最適な産物の発現のために細胞増殖を促進するかまたは細胞死を最小限に抑えるレベル内に制御するのに役立つ。Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell−Based Therapies,349−386(Sadettin Ozturk and Wei−Shou Hu eds.,Taylor and Francis Group 2006)を参照されたい。その場合にも、流加培養は、最終的には細胞生存率と適合しない、高濃度の阻害性代謝物および高い浸透圧をもたらすことが多い。流加培養では、典型的には、基礎培地を使用してバッチ様式で特定の時点まで細胞を増殖させる。その後、量の増加または培養物の希釈を最小限に抑えながら、栄養素を提供するために単一または複数の栄養素の濃縮溶液を含む培地サプリメント(濃縮供給物)が添加される。培地サプリメントが基礎培地に追加されると、例えば、より迅速な細胞増殖、倍加時間の短縮、より高い達成可能な細胞密度、またはタンパク質、例えば、抗体もしくは治療的な関心対象である他のタンパク質等の生体分子のより高い生産量もしくは収量によって示されるように、細胞培養が改善される。
基礎培地は、典型的には、細胞培養の維持のために使用され、アミノ酸、ビタミン、有機および無機塩、糖、ならびに他の構成成分を含む多くの成分を含むことができ、各成分は、インビトロで細胞培養を支持する量で存在する。細菌および古細菌培養を含む原核細胞培養、ウイルス培養、植物細胞培養、昆虫細胞培養、哺乳動物細胞培養に有用な基礎培地は、小ペプチドとともに使用することができる。基礎培地の例には、イーグル基礎培地(BME)、イーグル最小必須培地(EMEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、グラスゴー改変イーグル培地(GMEM)、ジョクリック改変イーグル培地、α改変イーグル培地、ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地、フィッシャー培地、ライボビッツL−15培地、トロウェルT−8培地、ウィリアムズ培地E、Biggers培地、コンノート医学研究所(CMRL)1066培地、HamのF10培地、HamのF12培地、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、MCDB 104、MCDB 110、MCDB 153、ミディアム199、NCTC 135ミディアム、およびウェイマスのミディアムMB 752/1が含まれる。CHO細胞の場合、好ましい基本培地には、CDCHO(商標)、CD OptiCHO(商標)、およびDynamis(商標)培地(全てLife Technologies,Corp.、Carlsbad,CA)が含まれる。CHO細胞のための好ましい濃縮供給サプリメントとして、EfficientFeed(商標)A+AGT(商標)(Invitrogenカタログ番号A25023)、EfficientFeed(商標)B+AGT(商標)(Invitrogenカタログ番号25030)、Feed(商標)Kit A+、B+、C+(Invitrogenカタログ番号A3315801)、EfficientFeed(商標)C+AGT(商標)(Invitrogenカタログ番号A25031、Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示は、合理化された方法に従って調製される液体培地中で細胞を培養するための方法を対象とし、細胞は、一次上皮細胞(例えば、ケラチノサイト、子宮頚部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞、および網膜上皮細胞)、ならびに樹立細胞系およびそれらの株(例えば、CHO細胞、293胚性腎臓細胞、BHK細胞、MRC−5、2BSおよび他を含むワクチン産生のための二倍体細胞、ハイブリドーマ、HeLa子宮頚部上皮細胞、およびPER−C6網膜細胞、MDBK(NBL−1)細胞、911細胞、CRFK細胞、MDCK細胞、BeWo細胞、Chang細胞、Detroit 562細胞、HeLa 229細胞、HeLa S3細胞、Hep−2細胞、KB細胞、LS180細胞、LS174T細胞、NCI−H−548細胞、RPMI 2650細胞、SW−13細胞、T24細胞、WI−28 VA13、2RA細胞、WISH細胞、BS−C−I細胞、LLC−MK2細胞、クローンM−3細胞、1−10細胞、RAG細胞、TCMK−1細胞、Y−1細胞、LLC−PK1細胞、PK(15)細胞、GH1細胞、GH3細胞、L2細胞、LLC−RC 256細胞、MH1C1細胞、XC細胞、MDOK細胞、VSW細胞、およびTH−I、B1細胞、またはそれらの誘導体)、任意の組織もしくは器官(心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織(脳、脊髄)、肺、血管組織(動脈、静脈、毛細血管)、リンパ組織(リンパ腺、咽頭扁桃、扁桃腺、骨髄、および血液)、脾臓を含むが、これらに限定されない)に由来する線維芽細胞、ならびに線維芽細胞および繊維芽細胞様細胞系(例えば、CHO細胞、TRG−2細胞、IMR−33細胞、Don細胞、GHK−21細胞、シトルリン血症細胞、Dempsey細胞、Detroit 551細胞、Detroit 510細胞、Detroit 525細胞、Detroit 529細胞、Detroit 532細胞、Detroit 539細胞、Detroit 548細胞、Detroit 573細胞、HEL 299細胞、IMR−90細胞、MRC−5細胞、WI−38細胞、WI−26細胞、MiCl1細胞、CV−1細胞、COS−1細胞、COS−3細胞、COS−7細胞、Vero細胞、DBS−FrhL−2細胞、BALB/3T3細胞、F9細胞、SV−T2細胞、M−MSV−BALB/3T3細胞、K−BALB細胞、BLO−11細胞、NOR−10細胞、C3H/IOTI/2細胞、HSDM1C3細胞、KLN2O5細胞、McCoy細胞、マウスL細胞、株2071(マウスL)細胞、L−M株(マウスL)細胞、L−MTK-(マウスL)細胞、NCTCクローン2472および2555、SCC−PSA1細胞、Swiss/3T3細胞、インドホエジカ細胞、SIRC細胞、CII細胞、ならびにJensen細胞、Sp2/0、NS0、NS1細胞、またはこれらの誘導体)、幹細胞、iPSC細胞等を含む。上記細胞のいずれも、組換え産物、タンパク質もしくは組換えタンパク質、融合産物もしくはタンパク質、抗体もしくは抗体断片、融合もしくは修飾抗体、ウイルスまたはウイルス産物もしくはウイルス成分、VLP(ウイルス様粒子)、細胞、核酸、脂質、ホルモン、ステロイド、あるいは糖タンパク質を発現するように遺伝子操作することができる。
現在の一般的な液体製造プロセスは、アミノ酸等の分類上のグループの構成成分を可溶化するために大量の酸および塩基を用いる。このプロセスにはいくつかの欠点がある。酸および塩基の過剰な使用は、金属汚染物質、および培地成分に対する潜在的な変更または損傷に起因するロット間のばらつきと関連している。バイオプロダクション産業は、細胞培養培地中の金属濃度の一貫性および制御の欠如、ならびに金属による潜在的な細胞毒性について懸念を表明している。加えて、規制当局は、より良好な廃棄および環境問題のために、より低いレベルの重金属が製品に含まれることを要求している。
最初に、所望のpHでの最適な溶解度について構成成分を評価した。次いで、構成成分を、構成成分カテゴリ、例えば、アミノ酸、ビタミン、塩、糖、微量金属、緩衝剤、および感受性または反応性の構成成分を含むグループにグループ化した。感受性または反応性グループにはこれらの構成成分が含まれるが、これらのみには限定されない:すなわち、ポリアミン、反応性塩化マグネシウム、塩化コリン、吸湿性グルコース、およびプルロニック。これらの構成成分のいくつかは、長い混合時間のために、不良な可溶性またはpHドリフトを呈する場合がある。
1)製剤中の構成成分に応じて特定のpHを標的とするように、アミノ酸の遊離塩基形態/塩形態を変更および変換する。
2)アミノ酸グループを、酸性、塩基性、および中性グループのpHに従って複数のサブグループに変更し、理論上の溶解度、pH、およびベンチトップ試験に基づいて添加順序を最適化する。調合タンクへのアミノグループ添加の例示的な順序は、次の通りに決定された:1)酸性、2)塩基性、および3)中性。
3)所望の最終標的pHを達成するように、等モルのリン酸塩形態を全ての二塩基性リン酸ナトリウムから一塩基性形態と二塩基性形態の組み合わせに変換する。
4)必要に応じて、等モルのスペルミン形態を塩酸スペルミンに変換する。
5)不要な側溶液を取り出し、メイン調合タンクへの直接添加として組み込む(すなわち、溶液の代わりに、構成成分がそれらの天然の形態で直接添加された)。
6)1つの完全な微量元素溶液(微量元素溶液の組み合わせ)を作製および添加することにより、現在の複数回の微量元側溶液のメイン調合タンクへの添加を変更する。
7)葉酸の可溶化プロセス(溶解限界を超える)を、新たに調製されたpH溶液から最小限の水酸化ナトリウム可溶化側溶液に変更する。
8)鉄およびEDTAの濃度に基づいて酸の添加を標的とする、新しい、新たに調製された鉄キレート化溶液の最良実施例を組み入れた。
9)塩化コリン(吸湿性)を取り出して別のグループに入れるようにビタミングループを変更する。
10)グルコースを独自の新しいグループに入れるよう変更する(潜在的な反応性および最も頻繁なカスタム変更)。
11)最終的な理論上の塩化ナトリウムの約85%を含む、より高い濃度の塩グループを作成した。(以前は浸透圧調整のためのみに添加されていた。)
12)約7.5%のプルロニック側溶液を作製して、タンク内での発泡を最小限に抑え、可溶化するための混合時間を短縮する。(以前は最後に直接添加されていた)。
Claims (22)
- 液体培地を作製する方法であって、
i)pH、溶解度、および濃度に基づいて培地成分をグループ化することと、
ii)製剤中の構成成分に応じて特定のpHを標的とするように、アミノ酸の遊離塩基形態/塩形態を変換することと、
iii)前記グループの最適な可溶化を可能にする順序で前記グループの添加を行うことと、を含み、
得られた液体培地は、上記のステップi)、ii)およびiii)を用いて調製されていない培地と比較して、前記グループを可溶化するためにより少ない酸および/または塩基の添加を必要とする、方法。 - 前記得られた液体培地は、前記液体培地の調製に請求項1に記載のステップi)、ii)およびiii)を用いない別の方法によって調製された液体培地と比較して、
(a)前記構成成分を可溶化するためにより少ない酸および/もしくは塩基の添加を必要とし、かつ/または
(b)酸および/もしくは塩基の添加による金属汚染物質を減少させ、かつ/または
(c)金属のロット間のばらつきが少なく、
(d)調製する必要のある溶液が少ないため、より少ない調合時間を必要とする、
請求項1に記載の液体培地を作製する方法。 - 金属の前記ロット間のばらつきは、最大10%未満である、請求項1または2に記載の液体培地を作製する方法。
- 全金属濃度のロット間のばらつきは、約0.001%未満、約0.01%未満、約0.1%未満、約1%未満、約1〜2%未満、約1〜3%未満、約1〜4%未満、約1〜5%未満、約1〜6%未満、約1〜10%未満、約1〜20%未満、約1〜30%未満、約1〜40%未満、約1〜50%未満、約1〜60%未満、約1〜70%未満、%、約1〜80%未満、または約1〜90%未満である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の液体培地を作製する方法。
- 様々な液体ロット間の任意の金属濃度に関するロット間のばらつきは、約0.001%未満、約0.01%未満、約0.1%未満、約1%未満、約2%未満、約3%未満、約4%未満、約5%未満、約6%未満、約10%未満、約15%未満、約20%未満、約30%未満、約40%未満、約50%未満、約0.001〜1%未満、約0.001〜5%未満、約0.001〜10%未満、約1〜10%未満、約10〜20%未満、約20〜30%未満、約30〜40%未満、約40〜50%未満、約50〜100%未満、約50〜90%未満、約50〜80%未満、約50〜70%未満、約50〜60%未満等である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の液体培地を作製する方法。
- 使用される酸および塩基の体積の減少は、約10〜40倍である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の液体培地を作製する方法。
- 使用される酸および塩基の体積の減少は、約22倍である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の液体培地を作製する方法。
- 12N濃酸の使用は、前記方法において排除される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の液体培地を作製する方法。
- 1つ以上の汚染金属の減少は、任意の他の方法によって調製された液体培地と比較して、請求項1に記載の方法によって調製した結果得られた液体において約0.0001%〜100%であった、請求項1〜8のいずれか一項に記載の液体培地を作製する方法。
- 1つ以上の汚染金属の減少は、任意の他の方法によって調製された液体培地と比較して、請求項1に記載の方法によって調製した結果得られた液体において約0.0001%〜0.001%、約0.0001%〜0.01%、約0.0001%〜0.1%、約0.0001%〜1%、約0.0001%〜2%、約0.0001%〜3%、約0.0001%〜4%、約0.0001%〜5%、約0.0001%〜10%、約1%〜5%、約1%〜10%、約1%〜15%、約1%〜20%、約1%〜25%、約1%〜35%、約10〜20%、約10〜30%、約10〜40%、約10〜50%、約10〜60%、約10〜70%、約10〜80%、約10〜90%、約10〜100%である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の液体培地を作製する方法。
- 減少する金属は、Cr、Fe、Mg、Cu、Mn、Ni、Zn、Mo、AlおよびCaからなる群から選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の液体培地を作製する方法。
- 金属汚染%は、任意の他の方法によって調製された液体培地と比較して、Crで約40〜100%、Feで約0.01〜20%、Cuで約0.1〜15%、Mnで約0.25〜60%、Niで約5〜100%、Znで約5%、およびMoで約15%減少する、請求項11に記載の液体培地を作製する方法。
- 細胞を培養するための方法であって、請求項1に従って調製された液体細胞培養培地中に細胞を接触させることを含む、方法。
- 前記液体細胞培養培地は無血清である、請求項13に記載の方法。
- 前記液体細胞培養培地はタンパク質不含である、請求項13または14に記載の方法。
- 前記液体細胞培養培地は、別の方法によって調製された液体培地よりも低い金属レベルを有する、請求項13または14に記載の方法。
- 前記細胞は、初代上皮細胞(例えば、ケラチノサイト、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞および網膜上皮細胞)、確立された細胞株およびそれらの株、遺伝子組み換え細胞、二倍体細胞、ハイブリオーマ、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、HEK293細胞、TRG−2細胞、IMR−33細胞、Don細胞、GHK−21細胞、シトルリン血症細胞、デンプシー細胞、Detroit 551細胞、Detroit 510細胞、Detroit 525細胞、Detroit 529細胞、Detroit 532細胞、Detroit 539細胞、Detroit 548細胞、Detroit 573細胞、HEL 299細胞、IMR−90細胞、MRC−5細胞、WI−38細胞、WI−26細胞、MiCl1細胞、CV−1細胞、COS−1細胞、COS−3細胞、COS−7細胞、Vero細胞、DBS−FrhL−2細胞、BALB/3T3細胞、F9細胞、SV−T2細胞、M−MSV−BALB/3T3細胞、K−BALB細胞、BLO−11細胞、NOR−10細胞、C3H/IOTI/2細胞、HSDM1C3細胞、KLN2O5細胞、McCoy細胞、マウスL細胞、株2071(マウスL)細胞、L−M株(マウスL)細胞、L−MTK-(マウスL)細胞、NCTCクローン2472および2555、SCC−PSA1細胞、スイス/3T3細胞、インドホエジカ細胞、SIRC細胞、CII細胞、およびJensen細胞、Sp2/0、NS0、NS1細胞またはそれらの誘導体、およびiPSC細胞からなる群から選択される、請求項13〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、組換え産物、タンパク質もしくは組換えタンパク質、融合産物もしくはタンパク質、抗体もしくは抗体断片、融合もしくは修飾抗体、ウイルスまたはウイルス産物もしくはウイルス成分、VLP(ウイルス様粒子)、細胞、核酸、脂質、ホルモン、ステロイド、あるいは糖タンパク質を発現する、請求項13〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項3 13〜18に従って調製される液体培地において生物学的産物を作製するための方法であって、前記生物学的産物は、組換え産物、タンパク質もしくは組換えタンパク質、融合産物もしくはタンパク質、抗体もしくは抗体断片、融合もしくは修飾抗体、ウイルスまたはウイルス産物もしくはウイルス成分、VLP(ウイルス様粒子)、細胞、核酸、脂質、ホルモン、ステロイド、あるいは糖タンパク質である、方法。
- 別の方法を用いて調製された液体培地と比較して、減少した金属汚染物質を含み、かつ/または金属のロット間のばらつきの低減を示し、その構成成分を可溶化するために酸および/または塩基の添加を用いる、液体細胞培養培地。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法に従って調製される、液体細胞培養培地。
- キットまたは組み合わせであって、(i)請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法に従って調製された液体細胞培養培地と、(ii)細胞と、必要に応じて、(iii)細胞培養サプリメントまたは添加剤と、を含む、キットまたは組み合わせ。
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