JPH06500703A - 培地濃縮物技術 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 培地濃縮物技術 発明の分野 本発明は細胞培地の分野に関し、具体的には濃縮した適合性処方組成物に選択的 にサブグループ化した培地成分に関する。上記濃縮処方組成物は安定で、細胞培 地を製造するのに使用することができる。

発明の背景 細胞培地は、制御された人工的試験管内環境の中で細胞を維持および成長させる のに必要な栄を物を提供する。細胞培地の特徴および組成は、個々の細胞の必要 条件によって変化し得る。重要なパラメーターは浸透圧モル濃度、ｐＨ１および 栄養処方を含む。

培地処方組成物は、動物、植物およびｉ菌細胞を含む多数の細胞型を成長させる のに使用されてきた。培地で成長した細胞は利用できる栄養物を異化し、モノク ローナル抗体、ホルモン、成長因子等のような有用な生物学的物質を産生する。

上記物質は治療学的用途を有し、岨換えＤＮＡ技術の出現で細胞はこれらの物質 を大量に産生ずるように操作することができる。すなわち、試験管内で細胞が成 長する能力は、細胞生理学の研究にだけ重要ではな（、それ以外の手段では費用 効率的な方法により得ることができない有用な物質の製造に必要である。

細胞培地処方組成物は文献で綿密に証明されており、多数の培地は市販されてい る。細胞培地の典型的な栄養物は、アミノ酸、塩、ビタミン、微量金属、糖、脂 肪および核酸を含む。しばしば、特に複合培地組成物では、安定性の問題は毒性 物質および／または必須栄養物の低い有効濃度を生じ、それにより培地の機能的 な有効期間が限定される。例えば、グルタミンは試験管内で塘乳顕の細胞の培養 で使用されるほとんど全ての培地の構成成分である。グルタミンは、ピロリドン カルボン酸およびアンモニアに自然に分解する。崩壊速度はｐＨおよびイオン条 件により影響されるが、細胞培地では、これらの分解物質の形成は避けることが できない（トリッノユ等、エクスペリメンタル・セル・リサーチ、第２８巻、第 ３６０−３６４頁（１９６２年））。

タンク等（イン・ヒドロ、第１４巻（８）、第７１５−７２２頁（１９７８年） ）は、過酸化水素のような米産物は細胞にとって致命的で、ダルベツコの修正イ ーグルの培地（ＤＭＥＭ）で産生されることを示した。リボフラビンおよびトリ プトファンまたはチロシンは光照射期間に過酸化水素を形成するのに必要な成分 である。はとんどの哺乳類の培地はリボフラビン、チロメンおよびトリプトファ ンを含むので、毒性光度物はほとんどの細胞培地で産生され得る。

これらの問題を避けるために、研究者は「必要に応じた」方式で培地を作り、培 地の長期間貯蔵を避けている。典型的には乾燥粉末型である市販の培地はスクラ ッチ、すなわち各栄養物をそれぞれ加えて培地を作る好便な別法として役立ち、 また液体培地に関する幾つかの安定性問題を避ける。しかしながら、製造者によ り供給されたこれらの慣用処方組成物を除いて、限定された市販培地しが入手で きない。

乾燥粉末培地処方組成物はある種の培地の貯蔵寿命をのばすことができるが、乾 燥粉末培地、特に大規模適用に関する多くの問題がある。大きい培地体積の製造 には乾燥粉末培地の貯蔵設備が必要であり、栄養物成分を混合および計量するの に必要な専門的な培地室はいうまでもない。乾燥粉末培地の腐食性のため、混合 タンクは定期的に取り替えなければならない。

生物学的物質の製造の費用を低くする必要がある。液体細胞培地を安定化させる 能率的で費用効率的な方法および１＠培地組成物を製造する好便な方法の発達は 細胞培地技術の分野において重要な発達になる。

発明の要約 本発明は、培地処方組成物を安定で適合性成分にサブグループ化する方法に関し 、その成分はサブグループにより異なるが、例えば水、酸、アルカリまたはアル コールを含む溶液中高濃度（１０倍−１００倍）でその後可溶化することができ る。任意の培地形成体は本発明の６種のサブグループの１種またはそれ以上に分 割することができる。具体的なサブグループは酸可溶性サブグループ、グルタミ ン含有サブグループ、アルカリ可溶性サブグループ、アルコール可溶性サブグル ープ、弱酸−塩基可溶性サブグループおよび補足剤含有サブグループを含む。

本発明によると、通常の技術者が、細胞培地の成分を各成分の物理的および化学 的特性（物理化学的特性）に基づいた本発明のサブグループの１種に分割するこ とができる。培地の成分は典型的にはアミノ酸、塩、ビタミン、微量金屑、糖、 脂肪、核酸等を含む。これらの成分は異なった溶解性および安定性特徴を有する 。

これらの特徴に基づいて、分類構成が培地成分の適合性サブグループ化を可能に させた。

本発明はすなわち、適合性培地成分をサブグループ化する方法に関する。この方 法でサブグループ化した培地成分は安定で、高濃度においても可溶性である。

サブグループを含む成分の上記濃縮溶液はその後、細胞の成長または維持に適し た希釈培地処方組成物を製造するのに使用することができる。濃縮培地処方組成 物（２−１０倍）または１倍細胞培地は、十分な量の濃縮サブグループ溶液と十 分な量の希釈剤（水、緩衝液等）を混合して本発明により製造することができる 。

すなわち本発明は、 （ａ）細胞培地の適合性成分を１またはそれ以上のサブグループに分割し、上記 サブグループは （ｉ）酸可溶性サブグループ、 （ｉｆ）弱酸−塩基可溶性サブグループ、（ｉ）グルタミン含有サブグループ、 （ｔｖ）アルコール可溶性サブグループ、（ｖ）アルカリ可溶性サブグループ、 および（ｖｉ）補足剤含有サブグループ を含み、 （ｂ）担体に適合性成分の各サブグループを溶解して、それぞれの担体中にサブ グループを含む濃縮溶液を得て、 （Ｃ）段階（ｂ）で得られた各サブグループの十分量を希釈剤の十分量と混合し て細胞培地を製造する ことを含む細胞培地を製造する方法を対象とする。

さらに、本発明は、 （ａ）ＲＰＭＩ−１６４０培地の成分を（ｉ）酸可溶性サブグループ、 （ｉｆ）弱酸−塩基可溶性サブグループ、および（Ｕグルタミン含有サブグルー プ に分割し、 （ｂ）担体に適合性成分の各サブグループを溶解して、それぞれの担体中にサブ グループを含む濃縮溶液を得て、 （Ｃ）段階（ｂ）で得られた各サブグループの十分量を希釈剤の十分量と混合し てＲＰＭＩ−１６４０培地を製造する ことを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を製造する方法を具体的に対象とする。

本方法はまた、Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地を作るのに使用することができる。すなわち 、ＤＭＥＭ培地の成分は、酸可溶性サブグループ、弱酸−塩基可溶性サブグルー プおよびグルタミン含有サブグループに分割することができ、それらは後に混合 および希釈して１倍製剤を得る。

本発明はさらに、溶液中グルタミンと二価金属カチオンと複合または混合するこ とによるグルタミンの安定化に関する。すなわち、本発明はグルタミンとグルタ ミンを安定化させるのに有効な量の二価カチオンを含む要素の組成物を対象とす る。

意外にも、本発明は劇的に費用が少ない培地の製造法を提供する。費用の減少は 次の要因による。本発明の培地濃縮物は１倍培地に必要な大きな撹拌タンクが必 要ではないので、ずっと小規模な製造設備で製造することができる。さらに、本 発明の培地濃縮物は、在庫品、貯蔵および労働費用を減少する「ちょうど間に合 う」製造技術を使用して、必要に応じて行う方式で製造することができる。培地 の製造および積み出しに必要な時間は６−８週間かられずか１日に減少すること ができる。さらに、本発明の培地濃縮物は、各サブグループ化した成分が容易に 溶解するので、ホールミル機を使用しないで製造することができる。さらに、本 発明の培地サブグループは室温で貯蔵することができ、冷蔵の必要がない。さら に、本発明は、先行技術により製造された多数のバッチのための多数の品質対照 試験と比較して、１種だけ品質対照試験が必要である多量の１倍培地（１００， ０００リツトルまたはそれ以上）を製造するのに使用することができる。重要な ことには、本発明の培地濃縮物は、サブグループ化した成分がより安定であるた め、バッチ間で一定している。すなわち、本発明は培地製剤の技術において大き く進第１図は、溶液中のし一グルタミン安定化を示す。Ｌ−グルタミンと二価カ チオンの様々な比率を試験し、Ｌ−グルタミンの安定性を決定した。

第２図は、濃縮したサブグループの十分量と水の十分量との連続した混合により 、１倍培地組成物としたＲＰＭＩ−１６４０培地のモニターした経時的ｐＨおよ び浸透圧モル濃度を示す。

第３図は、Ｌ−グルタミンおよびグルコースのモニターした経時レベルを示す。

試料は、濃縮したサブグループと水との連続混合の間に混合室から取られた。

第４図は、濃縮したサブグループを含む大きい容器からなるキットを示す。濃縮 したサブグループは混合および希釈することができ、培地総量１０．０００リツ トル後に続く記載では、細胞培地の分野で通常使用する多くの用語が広範囲に利 用される。明細書および請求の範囲の明確で矛盾のない理解および上記用語に与 えられるべき範囲を提供するために、次の定義が提供される。

監　「成分」という語は、化学的または生物学的源の何れかの任意の化合物を意 味し、それは細胞の成長または増殖を維持または促進するために細胞培地て使用 することができる。「成分」、「栄養物」および「成分」という語は互いに交換 して使用することができ、上記化合物を全て意味するということになる。細胞培 地で使用する典型的な成分は、アミノ酸、塩、金属、糖、脂肪、核酸、ホルモン 、ビタミン、脂肪酸、蛋白質等を含む。試験管内で細胞の成長を促進または維持 する他の成分は、個々の必要に応じて先行技術により選択することができる。

細胞培養　「細胞培養」により人工的、試験管内環境で維持、培養または成長し た細胞または組織を意味する。

培養容器　細胞の成長のための無菌環境を提供する様々な大きさのカラス、プラ スチックまたは金属の容器を「培養容器」と称する。

細胞培地　「細胞培地」または「培地」または「培地処方組成物」は、細胞を培 養または成長するための栄養溶液を意味する。上記培地を構成する成分は、培養 される細胞の型により変化し得ることができる。栄養組成物に加えて、浸透圧モ ル濃度およびｐＨが培地の重要なパラメーターと考えられる。

適合性成分　細胞培地に使用される各成分は、独特の物理的および化学的特徴を 有する。溶液で維持し、「安定した」組合わせを形成することができるこれらの 培地栄養物は、「適合性成分」を意味する。「適合性成分」は、成分が実質的に 毒性化合物に崩壊または分解しないかまたは、細胞培養により利用または異化す ることができない化合物に崩壊または分解しない場合、「安定」であると言える 。崩壊が検出されない場合または、１倍細胞培地製剤での同じ成分の分解と比較 して低速度で崩壊がおこる場合もまた、成分は「安定である」と考慮される。

例えば、１倍培地製剤のグルタミンはピロリドンカルボン酸およびアンモニアに 崩壊することが知られている。二価カチオンと混合したグルタミンは、経時的に 検出される分解がほとんどまたはないので「適合性成分」と考えられる。

安定性測定に加えて培地成分の適合性は、溶液の成分の「溶解性」により決定さ れる。「溶解性」または「可溶性」という語は、他の成分と溶液を形成する成分 の能力を意味する。すなわち成分は、測定または検出できる沈殿物を形成しない で溶液中に維持することができる場合適合する。すなわち、本書に記載されるよ うな「適合性成分」の語は、個々の培地成分の混合を意味し、その成分は濃縮ま たは１倍処方組成物の一方として溶液に混合される場合、「安定」であり、「可 溶性」である。

１倍処方組成物　細胞培地は多数の成分からなり、これらの成分は培地から培地 に及ぶ。「１倍製剤」は、細胞培地で見られるある種または全ての成分を含む任 意の水溶液を意味するということである。例えば、「１倍処方組成物」は細胞培 地またはその培地の成分の任意のサブグループを意味する。１倍溶液の成分の濃 縮物は、細胞を維持または成長するのに使用する細胞培養処方組成物で見られる その成分の濃度とほぼ同じである。細胞を成長させるのに使用する細胞培地は定 義によると１＠処方組成物である。多数の成分が存在する（ｊ！合合成成分サブ グループ中）場合、１倍処方組成物の各成分は、細胞培地のこれらの成分の濃度 とほぼ等しい濃度を有する。例えば、ＲＰＭＩ　１６４０培地はとりわけＬ−ア ルギニン０．２ｇ／Ｌ　Ｌ−アスパラギン０．０５ｇ／ＩおよびＬ−アスパラギ ン酸０．０２　ｇ／　ｌを含む。これらのアミノ酸の「１倍製剤」は本発明によ る適合性成分であり、溶液にこれらの成分とほぼ同じ濃度を含む。すなわち、「 １＠処方組成物」の意味する場合、溶液中の各成分が記載された細胞培地で見ら れるのと同じまたはほぼ同じ濃度を有することを意図する。１倍処方組成物の培 地成分の濃度は通常の技術に既知であり、「血清なしの動物細胞培養の培地、補 足剤および基質の製造方法」、アラン、アール、リス、ニューヨーク（１９８４ 年）を参照、それはその全体を本書に包含させる。しかしながら、浸透圧モル濃 度および／またはｐＨは、特に成分がわずかしか１倍処方組成物に含まれていな い場合、培地と比較して１倍処方組成物で異なる。

１０倍処方組成物　「１０＠処方組成物」は、その溶液の各成分が細胞培地の同 じ成分より約約１０倍濃縮した溶液を意味する。例えば、ＲＰＭＩ　１６４０培 地はとりわけＬ−グルタミン０．３　ｇ／　Ｉを含む。定義では、「１０倍処方 組成物」はグルタミン約３．０　ｇ／　ｌを含む。「１０倍処方組成物」は１倍 培地で見られる約１０倍の濃度で多数の付加的な成分を含むことができる。明ら かなように、「２５倍製剤」、「５０倍製剤」およびｒｌｏＯ倍製剤」は、１倍 細胞培地と比較してそれぞれ約２５．５０または１００倍濃度で成分を含む溶液 を示す。

再び、培地処方組成物および濃縮処方組成物の浸透圧モル濃度およびｐＨは変化 し得る。

Ａ　培地濃縮物技術 本発明の培地濃縮物技術は培地成分を、個々のサブグループにより異なるが、水 、水性酸、アルコールまたは水性アルカリのような担体の適当な量に溶解するこ とにより濃縮処方組成物（１０倍−１００倍）にその後可溶化することができる 安定で適合性成分にサブグループ化することに基づく。上記溶液を本書では「担 体」と称する。適当な条件下、これらのサブグループを再構成（混合）し、２倍 から１０倍のような濃縮した（１倍以上）細胞培地処方組成物を製造するかまた は、直接１倍細胞培地処方組成物を再構成することができる。本発明の濃縮物培 地技術は適合性成分、上記サブグループの液体濃縮物の製造、およびこれらの濃 縮サブグループの十分量と希釈剤の十分量とを混合して所望の培地処方組成物を 製造することに関する。

細胞培地処方組成物は、アミノ酸、塩、ビタミン、微量金属、糖、脂肪、核酸等 からなる。これらの各成分は異なった溶解性および安定性特性を有する。例えば 、アミノ酸（グルタミンを除く）は可溶性で、酸性条件下（ｐＨ約１．０）非常 に安定であるが、ビタミン（チアミンおよびアスコルビン酸を除く）は希酸また はアルカリ性条件下（ｐＨ４，０以上）可溶化する。培地成分の物理的特性に基 づいて、安定液体濃縮物を製造するのに使用することができる任意の培地処方組 成物をサブグループ化することを可能にする分類方式が開発された。

本発明は、任意の細胞培地からの適合性成分を分割することができる６種のサブ グループを定義する。既定の細胞培地の成分は本発明により定義された少なくと も１種のサブグループに分離することができる。適合性培地成分を含む各サブグ ループは液体担体に溶解または乾燥型で維持する。液体担体の型および分類した 成分を溶液に溶解するのに使用する方法は、サブグループにより変化し、ゎずか な日常的な試験で通常の技術者により決定することができる。

好ましくは、サブグループ化した成分を含む溶液は、１倍培地処方組成物の同じ 成分の濃度より濃縮している。分類された成分は好ましくは２５倍濃縮（２５倍 製剤）であり、さらに好ましくは５０倍濃縮（５０倍製剤）である。高濃縮処方 組成物は、成分か可溶性で安定のままであることが提供される。

いったん培地成分が６種のサブグループの１またはそれ以上に分割し、分離濃縮 溶液として製造するならば、各濃縮物の適当な（十分な）量を希釈剤と混合して １倍培地製剤を製造する。典型的に、使用した希釈剤は水であるが、緩衝液、生 理食塩水溶液を含む他の溶液または個々の培地成分を含む他の水溶液は、本発明 により使用することがてきる。

本発明の培地は典型的に、細胞培地の不要な汚染を防止するために滅菌する。

滅菌は例えば、濃縮成分を混合した後に無菌培養培地を製造する殺菌により遂行 することができる。別法としては、各４！サブグループを滅菌して環菌溶液とし て貯蔵することができる。これらの無菌濃縮物はその後、無菌希釈剤と混合して 濃縮１倍無菌培地処方組成物を製造することができる。

多数の通常使用される滅菌技術の１種は、本発明の濃縮サブグループまたは培地 製剤を滅菌するのに使用することができる。滅菌技術は滅菌する溶液の特性によ り変化し得る。本発明による典型的な滅菌技術は、熱および／または濾過滅菌を 含む。他の滅菌の型は通常の技術の１種で容易に明らかである。

Ｂ、培地の型 細胞培地の任意の型を本発明により作ることができる。培地処方組成物は文献で よく知られおり、そのうち多くは市販されている。新規培地処方組成物および修 正された既知培地処方組成物は本発明により製造することができる。すなわち、 培地成分は本発明で定義したように適合性サブグループに分割することができる 。

これらの成分のサブグループはその後溶液状態で濃縮され、所望ならば滅菌する ことができる。

本発明により製造することができる細胞培地の例は、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６ ４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＩＭＤＭ、ＭＥＭ、Ｍ１９９、マツコイ５ＡおよびＦ １２栄養素混合物（ギブコ／プリル、カタログおよびレファレンス・ガイド（１ ９９０年））を含むが、これに限定されるものではない。

すなわち本発明は、適合性成分の１またはそれ以上の濃縮溶液を作る方法を提供 し、その成分の十分な量が希釈剤の十分な量と組合わせて混合される場合、細胞 培地を製造することができる。

細胞培地に使用される任意の成分は、本発明の６種のサブグループを１またはそ れ以上に分割することができる。本書に記載され、各サブグループにより含まれ る成分のリストは全てを含むものではないが、当業者は、成分の物理化学的特性 を知っているので、どのサブグループがその成分と適合する他の成分を含むかを 容易に決定することができる。別法としては、新規成分の特性を知られていない 場合、日常の試験を好ましいサブグループに決定するのに使用することができる 。例えば、本発明により定義されるような特定の培地成分を含む各サブグループ は、新規成分を補足することができる。新規成分は、結果として生ずる濃縮溶液 が可溶性で安定である場合、特定のサブグループに適合する。試験培地製造と培 地濃縮物技術によって作られない対照培地と比較することにより、当業者が好ま しいサブグループをさらに決定することができる。細胞の成長特徴、毒性物置の 形成および培地の貯蔵寿命は適合性成分の指標として使用することができる。

独特の物理化学的特性を有する特定の成分は、場合により、任意のサブグルーブ の成分と適合することができないことがある。この場合には、別個のサブグルー プとしてこの成分を維持する必要があり得るっ上記成分は、十分な量の濃縮サブ グループを希釈剤と混合する場合に所望の１倍培地（本成分を含む）が製造され るように、適当な濃度で希釈剤に加えることができる。別法としては、不適合性 成分を別個の濃縮溶液として加えることができる。すなわち、本発明は、本発明 で定義される以外の付加的なサブグループの開発を考慮しているが、そのサブグ ループは本書で定義された任意のサブグループと適合することができない付加的 な成分を安定化および可溶化するものである。

いくつかの成分を１種以上のサブグループに含ませることができることは、以下 に記載した各サブグループを示す成分のリストから明らかである。特定の成分が ２種またはそれ以上のサブグループに適合することを示す場合、その成分の総量 が最終培地製剤と一致する限り、その成分は様々な濃度でこれらのサブグループ の１種またはそれ以上に含むことができる。唯一の限定は、加えた成分の量が特 定のサブグループにおいて他の成分の溶解性または安定性に悪影響しないことで ある。異なった培地を製造するのに必要なサブグループの数および型は、成分の 複雑性および／または成分の物理化学的特性により変化し得る。１種以上のサブ グループへの成分の重複は、こうして任意の培地を製造する万能分類方式を通常 の当業者に提供する。

Ｃ酸可溶性サブグループ 酸可溶性サブグループに置いた培地成分は全てのアミノ酸（グルタミンを除く） 、チアミン、アスコルビン酸、鉄（Ｉ［［）化合物、鉄（ＩＮ）化合物、プリン 、グルタチオンおよび一塩基性リン酸ナトリウムを含む。これらの成分は酸性（ ｐＨ約Ｏ−１，０）で可溶性で、これらの条件下非常に安定である。

Ｄおよび／またはＬ−アミノ酸は両方とも本発明の酸可溶性サブグループに含む ことができる。典型的に、培地はＬ−アミノ酸を含む。所望の培地製剤が必要と する場合、グルタミンを除いて任意の組合わせの１種またはそれ以上のアミノ酸 を酸可溶性サブグループに含むことができる。グルタミンは具体的に、グルタミ ン含有ザブグループに含まれる。すなわち、本発明の酸可溶性サブグループに含 むことができるアミノ酸は、所望の培地の必要条件により異なるが、グリシン、 アラニン、バリ〉、ロイノン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システィン 、ンスチン、メチオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジ ン、アルギニン、フェニルアラニン、チロノン、プロリン、ヒドロキシプロリン 、ヒスチジンおよびトリプトファンを含む。アミノ酸誘導体は、その誘導体が本 サブグループの他の成分および特有な細胞培養の維持または増殖に適合するなら ば酸可溶性グループに含むことができる。

本発明の酸可溶性サブグループに含むことができる他の成分は、チアミン（ビタ ミンＢ１）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、プリン類（グアニンおよびアデニ ン）およびグルタチオンを含む。上記化合物の誘導体はよく知られており、その 誘導体が本サブグループに含まれる他の成分および特定の細胞培養の維持または 増殖にもはや適合しない程には、物理化学的特性を変化しないならば、酸可溶性 グループに含むことができる。

鉄（ＩＩＩ）および鉄（ＩＩ）化合物は、培地製剤が必要な場合、同様に本サブ グループに置（ことができる、太サブグループに含まれる他の成分の存在下で安 定で可溶性である上記鉄（］１ｌＩ）および鉄（Ｉ［）化合物は、当業者によっ て容易に決定することができる。上記鉄（ＩＩＩ）化合物の例は、Ｆｅ　（ＮＯ ｘ）　３、Ｆｅ５０．およびＦｅＣｌ３を含むが、これに限定されるものではな い。

所望の培地処方組成物の成分である任意の一塩基リン酸塩は、酸可溶性サブグル ープの中に含むことができる。典型的なリン酸塩の例は、ＮａＨ２ＰＯ４および ＫＨ２ＰＯ４のような一塩基リン酸塩を含むが、これに限定されるものではない 。

本発明の酸可溶性サブグループは、特定の培地の必要に応じて、上記記載の適合 性成分の様々な組合わせを含むことができる。すなわち、本発明の分類構成にり 、所望の培地で見られ酸性溶液に適合する成分が選択される。いったん本方法で 分割すると、典型的に乾燥粉末型（脱水）のこれらの成分は、ｐＨ約０−１．０ の酸性溶液で溶解する。生じた溶液はａ厚であるのが好ましい（１０倍−１００ 倍）。すなわち、酸性溶液中の成分は、１倍培地処方組成物で見られる同じ成分 よりも濃縮されている。

明らかなように、ａ縮酸可溶性サブグループは、同じ培地の製造ごとに組成、浸 透圧モル濃度およびｐＨがわずかに変化し得る。さらに、酸可溶性サブグループ は１つの培地と次のものとでは異なる。このことは他のサブグループでも同様で ある。本発明は、酸可溶性培地成分を含む安定な製品を製造する手段を提供する 。上記製品は成分の乾燥粉末混合物として維持することができるが、好ましくは 濃縮溶液として維持する。典型的に、酸可溶性サブグループを含む濃縮溶液は多 数のよく知られた技術の１種により滅菌されるっり、グルタミン含有サブグルー プ グルタミンは液体培地で不安定な成分と考えられている（トリ・ノンよ１、ノー ・エル、エクスベリメンタル・セル・リサーチ、第２８巻、第３６０−３６４頁 （１９６２年）、オズターク、ニス・ニス等、バイオテクノロジカル・プログレ ス、第６巻、第１２１−１２８頁（１９９０年））。溶液中では、グルタミンは カルボン酸およびアンモニアに分解する。本発明による培地濃縮技術の出現がグ ルタミンの安定化の製造を提供する。すなわち、グルタミンを含む細胞培地は他 のサブグループに加えてグルタミン含有サブグループを製造することにより作る ことができる。

本発明によると、グルタミン（ＤおよびＬ型両方）は、１種またはそれ以上の二 価カチオンの添加により溶液中で安定化することができる。Ｃａ”、Ｍｇ“２、 Ｍｎ″２、Ｚ−２およびＣｕ−２のような任意の二価カチオンをグルタミンを安 定化するのに使用することができる。Ｎ１ｇＣ１２、ＣａＣｌ２、Ｃａ（ＮＯ３ ）ｚおよびＭｇ５Ｏ，を含む（しかし、これに限定されるものではない）容易に 入手できる多くの塩は、これらの二価カチオンを供給することができる。すなわ ち、任意の適合性カル／ラム塩、マグネシウム塩および／またはマンガン塩は、 このサブグループに含む二とができる。上記塩はほとんどの任意培地の典型的な 成分である。それ故、培地製剤の二価塩は、グルタミンを安定化させる本サブグ ループに含ませるべきである。二価カチオンが一般的に所望の培地の成分てはな い場合には、成長するべき細胞の成長または維持に悪影響しない二価カチオンが グルタミン含有サブグループのグルタミンを安定化するために加える。

しかしながら、本発明のグルタミン含有サブグループに関する唯一の限定は、塩 化カリウムのようなカリウム塩を本グループに含むことができないことである。

ナトリウムおよびマグネシウムイオンがカリウムイオンの溶解性を減少させる。

さらに、Ｃａ”がリン酸イオンと不溶性複合体を形成して溶液からＣａ２−を除 去するため、リン酸の金属塩は、本グループに！くことができない。

特定の培地の必要に応じたグルタミンの量が、グルタミンを安定化させる二価カ チオンの十分な量と混合される。このサブグループのグルタミンと二価カチオン の比率は、好ましくは約２＝１（重量／重量）が、２　：１−２．９　＋　１の 範囲でもある。上記溶液のｐＨもまたグルタミンを安定化させるのに重要である 。好ましいｐＨは４．０−６．０の範囲である。グルタミンー二価カチオン溶液 の最も好ましいｐＨは約５．５である。塩基性ｐＨはグルタミンの安定性を低下 させる傾向にあり、必要ならば、ｐＨをグルタミン含有サブグループと適合する 酸、例えばＨＣＩで調節することができる。

グルタミンと二価カチオンの比率が約２：１である場合、グルタミンは安定した 可溶性複合体を形成する。この複合体は、グルタミンのピロリドンカルボン酸お よびアンモニアへの分解に有利に働かない。すなわち、グルタミン全１＠複合体 は安定な可溶性液体型で本必須栄養物を提供する方法を提供する。

グルタミン含有サブグループに含まれる成分は、グルタミン、カルシウム塩およ び／またはマグネシウム塩を含むことができる。Ｄ−パントテン酸カルシウムお よび塩化ナトリウムもまたグルタミン含有サブグループに含むことができる。

明らかなように、本発明により製造される各培地は、好ましい浸透圧モル濃度範 囲を有することができる。浸透圧モル濃度は培地の最終ｐＨのように、各サブグ ループの成分の可溶化に使用する酸／塩基の量で変化する。当業者は、培地処方 組成物を製造するのに必要な各濃縮サブグループの最終ｐＨおよび体積を考慮に いれることにより所望の培地の好ましい最終浸透圧モル濃度を得るのに必要な塩 、例えば塩化ナトリウムの量を容易に決定することができる。上記パラメーター （各サブグループの［）Ｈおよび総塩含量）は、日常的な試験により容易に決定 することができる。例えば、成分を含むサブグループのｐＨは、よく知られた技 術により測定する二とができる。これらの濃縮サブグループの適当な容積を混合 する二色により製造される１倍培地製剤の浸透圧モル濃度は、培地の最終浸透圧 モル濃度を調節するために、もし必要ならば必要な塩化ナトリウムの量を決定す ることを当業者に可能にする。塩化ナトリウムのこの量をグルタミン含有サブグ ループに加えて、好ましい最終浸透圧モル１度を達成することができる。はとん どの１倍培地製剤は最終浸透圧モル濃度およびｐＨの広範囲必要条件を有し、そ れ故サブグループのｐＨおよび塩１度のわずかな変化は重大ではない。

Ｅ　弱酸および塩基可溶性サブグループ弱酸−弱塩基可溶性サブグループ（本書 では弱酸−塩基可溶性サブグループと記載）の培地成分は、策、デオキシリボー ス、リポース、ヌクレオチド、水溶性ビタミン（チアミン、アスコルビン酸およ びパントテン酸カルシウムを除く）、リボフラビン、塩、例えば塩化カリウムお よび塩化ナトリウム、微量金属、脂質、酢酸塩、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、フェノ ールレッド、ピルビン酸塩および緩衝液を含む。

弱酸−塩基サブグループのｐＨは、約４．０−９０の範囲である。二塩基性リン 酸ナトリウムおよび一塩基性リン酸ナトリウムもまたこ二で分類することができ る。二塩基性および一塩基性リン酸ナトリウムの組合わせは、本濃縮サブグルー プの緩衝系を提供する。本サブグループの溶液のｐＨの調節は、水酸化カリウム ではなく、適当な場合、水酸化ナトリウムまたは塩酸の添加により作るのが好ま しい。

本サブグループで見られる成分は、全ての他のサブグループのように培地成分に より決定する。すなわち、上記成分の任意の組合わせは、弱酸−塩基可溶性グル ープに含むことができる。

本サブグループに含まれる糖は、培地成分として使用することができ、上記成分 の１種またはそれ以上を組合わせて適合する任意の糖を含む。上記糖化合物はグ ルコース、ガラクトース、マルトース、マンノース等およびそれらの誘導体を含 む。

本サブグループの糖はまた、脂質が本サブグループに含まれる場合、脂質を可溶 化するための媒体として役立つ。脂質は糖または塩分子上に乾燥保存した後、溶 液に可溶化することができる。簡潔に述べると、脂質をエタノールの少量で可溶 化し、その後糖／塩の乾燥粉末にゆっくり滴下する。混合物は３時間乾燥し、そ の後ボールミル処理する。糖−脂質または塩−脂質組成物は、その後弱酸−塩基 サブグループの他の成分を含む濃縮物として製造することができる。

リルイン酸、リポ酸、コレステロール、カルシフェロール、ビタミンＡ、　２＝ メルカプトエタノール、ツイーン８０、メナジオンおよびビタミンＥを含む任意 の脂質および／または脂肪可溶性成分（しがし、これに限定されるものではない ）は、塩または部上に乾燥保存し、こうして本サブグループに含むことができる 。

任意のデオキシリボース、リポースまたはヌクレオチドは、本発明による弱酸お よび塩基可溶性サブグループに含むことができる。これらの化合物およびそれら の誘導体はよく知られている。例としてアデノシンおよびアデノシン三リン酸を 含む。この場合も、唯一の限定は、成分が本サブグループで見られる他の成分と 適合しなければならないことである。

弱酸−塩基サブグループのビタミンは、チアミン、アスコルビン酸およびパント テン酸カルシウムを除く全ての水溶性ビタミンおよびそれらの誘導体である。

弱酸−塩基可溶性グループに含むことができる上記水溶性ビタミンは葉酸、ビオ チン、ピリドキシン、ニコチン酸、リボフラビン等を含む。

培地処方組成物で使用する微量金属もまた本サブグループに含まれる。微量金属 の例は、Ｃｕ５Ｏａ、Ｎａ２ＳｅＯ３、Ｚ　ｎ　Ｓ　Ｏ４およびＣＯＣｌ２を含 む。他の金属の微量もまた本グループに含むことができる。適当な微量金属の選 択および使用する量は、通常の当業者により容易に決定することができる。

塩化カリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、フェノールレ。

ド、塩化ナトリウム、ＨＥＰＥＳおよびピルヒン酸ナトリウムもまた弱酸−塩基 サブグループの適合性成分である。任意の上記化合物の誘導体もまた、上記誘導 体が適合性である限り、本グループで使用することができる。

リボフラビンもまた本グループに置くことができる。リボフラビンは光増感剤で あり、ヒスチジン、メチオニン、チロシンおよびトリプトファンとの相互作用を 経て過酸化水素の生成の原因となる主要な栄養物である（グリフイン、エフ・エ ム等、カンサー・リサーチ、第９１巻、第２２４１−２２４８頁（１９８１年） 、ワンプ、アール・ンエイ等、イン・ビトロ、第１４巻、第７１．５−７２２頁 （１９７８年））、アミノ酸からりボフラヒンを分離することにより、安定なａ 縮すブグループをもたらす。

リボフラビンを含む液体培地升ブグループに安定性を加える成分はピルビン酸塩 である。ピルビン酸塩は、過酸化水素と相互作用して酢酸、二酸化炭素および水 を生成する（ウニイル、エル、ゴートン、ダブリュー・シーおよびブチヤード、 エイ・アール、アーカイブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィ ジックス、第３３巻、第９０−１０９頁（１９５１年））。過酸化水素は培！細 胞、細胞膜蛋白質、脂質および酵素に有害であるため、その増強を制御すること が特定の培地において重大である。すなわち、所望の培地がピルビン酸塩を必要 ではない場合でも、ピルビン酸塩の添加は弱酸−塩基可溶性サブグループの安定 性および本サブグループから製造した培地の貯蔵寿命を増加するのに役立つ。

Ｆ　アルコール可溶性サブグループ コレステロール、ステロイド、ツイーン８０、脂溶性ビタミンまたは他の疎水性 成分を含む培地製剤は、アルコール可溶性グループに濃縮することができる。

アルコール可溶性グループに含むことができる他の疎水性化合物は当業者によく 知られている。

これらの成分の任意の組合わせは、エタノールまたはプロピレングリコールの少 量で可溶化することができる。いったん可溶化すると、これらの成分はその後、 よく知られた技術により微小流動物化し、小さい脂質ベンクルを形成する（リヶ イト等、バイオ・ファーム、第２巻（９）、第２８−３３頁（１９８９年））。

簡潔には、微小流動機（モデル１１０微小流動機）がぜん断、乱流、およびキャ ビテインヨン力を組合わせることにより乳剤を製造する。微小流動機を経る各回 路は、乳化剤の平均小滴径を減少して非常に安定である半微量粒子を最後に製造 する。水溶性成分はまた、これらのベシクル内に捕獲して、その後培地に送達す ることができる。

ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫを含む脂溶性ビタミンおよびそれらの誘導体もまた 、本サブグループに含むことができる。コルチゾール、プロゲステロン、ニスト ロケン、テストステロン等を含むステロイドおよびそれらの誘導体もまたアルコ ール可溶性サブグループに含むことができる。

培地処方組成物の脂肪酸および脂質は、本サブグループに分割することができる 。リルイン酸、オレイン酸、アラキドン酸等のような任意の脂肪酸は、この分類 に分けられる。もちろん、任意の脂質もまた含むことができる。脂質の例は、レ ンチン、スフィンゴミエリンおよびリン脂質である。脂質（油）は、微小流動物 化が脂質ベシクルを製造するのに脂質（油）を必要とするため、通常本発明のサ ブグループの必要な成分である。培地製剤が脂質を必要とするが、本発明の疎水 性成分ではない場合には、上記脂質は弱酸−塩基可溶性グループに含むことがで きるため、アルコール可溶性サブグループを製造することは必要ではない。弱酸 −塩基可溶性サブグループでは、脂質は糖および／または壇上で乾燥保存する。

本発明のアルコール可溶性グループｌ：含まれ得る他の培地成分は、ツィシ８０ および２−メルカプトエタノールを含み得る。

Ｇ、アルカリ−可溶性サブグループ 溶解するためにアルカリ環境（ｐＨ＝９．０）を必要とする培地成分のために、 アルカリ可溶性サブグループが用いられる。このサブグループはアルカリｐＨに おいて安定で可溶性のピリミジン類およびプリン類を含む。これらの成分は、Ｎ ａＯＨ１：溶解したとき、水性環境に可溶性のナトリウム塩を形成する。

アルカリサブグループとして適合するピリミジン類およびその誘導体は、ウラシ ルおよびチミンを含む。キサンチンおよびヒポキサンチンもまた本発明のアルカ リ可溶性サブグループに含まれ得るプリン類の例である。アルカリ環境中で安定 で可溶性の他の成分は、当分野の技術者に既知であるかまたは容易に決定し得る 。

Ｈ２補足物含有サブグループ 前述のように、一般的な培地組成はアミノ酸類、塩類、ビタミン類、微量金属類 、ｍ類、脂質類および核酸類を含む。しかしながら、培地はしばしば蛋白、抗生 物質または組成が確定しないブロス／血清により補われる。このような補足物が 特定の培地にとって必要な場合、補足物は直接（例えば血清）使用し得、または 濃縮物（インシュリン、トランスフェリンおよび成長因子のような蛋白溶液）に することができる。補足物含有サブグループは、次に、目的とする培地組成物を 製造するために、他のＳ縮物サブグループを組み合わせ得る。

最終培地組成物に含まれるが、前述のサブグループの１つの適合成分としては分 類されていない種々の成分を、１個あるいはそれ以上の個別の補足物として加え 得る。したがって、本発明は、上記のサブグループと適合しない１個またはそれ 以上の補足物含有サブグループの製造も目的とする。この補足物サブグループに 含まれるこのような成分は、血清（胎児、馬、牛等）、イーストレイト限外濾液 、トリプトースリン酸ブロス、蛋白濃縮物（インシュリン、トランスフェリン、 成長因子類、ホルモン類、アルブミン等）、抗生物Ｎ（ゲンタマイシン、ペニシ リン、ストレプトマイノン、アンフォテリノンＢ等）、全卵限外濾過物、結合因 子（フィブ０：クチン、ビトロネクチン、コラーゲン、ラミニン等）およびＮａ ＨＣＯ，液体Ｓ縮物（例えば、２５×）を含む。最終培地製剤に応じて、通常の 当分野の技術者は、適合する補足物を適当に選択し得る。

■　キット 本発明の適合成分であるサブグループは、キットの製造に理想的に適合する。

このようなキットは、１個またはそれ以上のバイアル、試験管、びん、ドラムカ ンの様な容器手段を近接区域に収容する区画形成となる運搬手段としてを含み得 る。それぞれの上記容器手段は上記の適合成分の個々のサブグループの１つを含 む。このようなサブグループは、水和物または脱水物が可能であるが、一般的に は濃縮液体溶液である。このような溶液は、本発明によると無菌であり得る。

第１の容器手段は、例えば酸可溶性サブグループとして適合される培地成分の任 意の組み合わせを含み得る。弱酸塩基可溶性グループに含まれる適合成分または それの任意の組み合わせを第２の容器手段に含まれ得る。第３および第４の容器 手段は、それぞれアルカリ可溶性サブグループおよびアルコール可溶性サブグル ープに含まれる成分の任意の組み合わせを含み得る。第５の容器手段は、二価カ チオンがグルタミンの安定化のために含まれる限りグルタミン含有サブグループ を含み得る。第６の容器手段は、補足物含有サブグループに挙げた成分を含み得 る。本発明で定義したサブグループで適合しない他の成分は、１個またはそれ以 上の別の容器手段に含ませて適合しない成分の混合を回避し得る。

細胞培養培地を作るためのキットを含む容器手段を含むサブグループの数および 型は、製造されるべき培地の型に応じて変化し得る。一般的には、キットは特定 の培地を製造するのに必要なサブグループを含む各容器手段を含む。しかしなが ら、異なった培地組成物を作るための種々のサブグループの異なった量を混合す ることにより、異なった培地を製造できるようにするために付加的なサブグルー プを含む容器手段が本発明のキットに含まれ得る。

Ｊ　培養培地を製造するためのＪｉＩサブグループの混合本発明の培地濃縮物技 術は、これらの成分を上記に定義し、たサブグループに分けることにより、１個 またはそれ以上の適合成分の濃縮溶液を製造する手段を提供する。濃縮溶液とし て製造された（１×以上）これらのサブグループは、目的とする培養培地を製造 するために希釈剤と組み合わせ得る。必要な濃縮溶液の量および希釈剤の量は、 各々のサブグループの１度、サブグループの数および最終培地製剤の濃度に応じ て変化し得る。通常の当分野の技術者は、目的とする培地を製造するに充分な希 釈剤の量および充分な濃縮溶液の量を容易に決定できる。

得られた培養培地のｐＨは、酸または塩基の添加により調整可能である。しかし ながら、この培地は、特にもし各々のサブグループ濃縮物のｐＨを、製造された 培地のｐＨが望む範囲内であるように調整していれば調整を必要としない。一般 的に、望ましい浸透圧は計算することができ、望む浸透圧の最終借地を製造する ために濃縮溶液の塩の濃度の調整を行うことができる。

Ｋ、用途 本発明は、培養培地を製造するために、容易に十分な量の希釈剤ど混合できる濃 縮物を提供する。これらの濃縮サブグループの混合はバッチまたは連続法で行う ことができる。バッチシステムでは、一定量の培地を製造するために、サブグル ープ濃縮物の適当量を希釈剤と混合できる。連続システムでは、各々のサブグル ープ濃縮物の充分量を連続的に充分量の希釈剤と混合チャンバー中で混合し、一 方培養培地は断続的に取出される。連続システムの明らかな利点は、１個の反応 装ｆｌ（混合チャンバー）が、多数の培養容器または発酵タンク用の培地を製造 するために使用できることである。加えて、この方法での培地の連続製造は１、 閉鎖無菌システムで遂行できる。

本発明にしたがって、いかなる培地およびいかなる量でも適当な培地濃縮物が製 造できる。従って、このような濃縮物を商業的に製造し、供給し、または研究室 内研究で作り、使用することができる。製造したｓｗｉ物を得た消費者は、経済 的により有効な方法で培地を製造できる。例えば、混合タンクの寿命は、ある種 の腐食性乾燥粉末が培地製造に必要でないため、増加する。また、目的とする培 地の製造に必要なに数を少なくてきる。

以上に、本発明を十分述べであるが、説明のみを目的とし、明示しない限り本発 明を限定しない目的で本明細書に包含されている実施例により、さらに明確に理 解できるであろう。

実施例■ 二価カチオンによるグルタミンの安定化Ｌ−グルタミンをｐＨ５，５で、種々の 量の硝酸カルシウムおよび硫酸マグネシウムと溶液中で混合した。図１はＬ−グ ルタミンと二価カチオンの割合が２５１より著しく上のとき、有意にグルタミン の安定性が減少することを示す。Ｌ〜グルタミンは、○−フタルジアルデヒドで プレカラム誘導体化により分析し、次に高速液体クロマトグラフィーを用いて検 出した（ラシエンドラ・ダブリュー、ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグ ラフィー、１０巻（５号）９４１−９５５頁（１９８７年））。

グルタミンと二価カチオンの比が２５：ｌのとき、グルタミンは２４週間安定の ままである。グルタミンを含む細胞培養培地はまた二価カチオンも含むが、培養 培地中に存在する他のアミノ酸と二個カチオンの相互関係により、グルタミンは ｌ×培地製剤では安定ではなく、４℃でゆっくり減少し、３週ｌ５ｌｊ後には６ ５−７０％が残っているだけである５　（シグマ・セル・カルチャー・リージエ ンッ・カタログ（１９９１年）２０２頁）。

実施例■ ＲＰＭＩ−１６４０培地の製造 ＲＰＭＩ−１６４０培地は培養において一般的に晴乳履細胞成育に使用されてい る培地である。この培地のｐＨは約７で、浸透圧は２６５から３００の範囲が可 能である。

ＲＰＭＩ−１６４０はＬ−グルタミンを含むアミノ酸、種々の塩類、ビタミン類 、糖等を含む。この培地に検出される成分はギブコ／ピーアールエル・カタログ ・アンド・リファレンス・ガイド１１８頁、１９９０年に記載されている。

ＲＰＭＩ−１６４０培地の成分を種々の適合サブグループに分割した。一度乾燥 適合成分粉末を混合し、各々のサブグループの１縮溶液を製造した。各々の製造 濃縮サブグループの適当量を、次にＩＸＲＰＭＩ−１６４０培地製剤の製造に使 用した。

表１は酸可溶性サブグループに分割されるＲＰＭＩ−１６４０培地の成分を示す 。この濃度は１×製剤１リツトル溶液に対応する。酸可溶性サブグループの１０ ０Ｘ処方組成物を製造するために、表１に示した各々の成分を酸可溶性成分の乾 燥粉末混合物（ＤＰＭ）を製造するために配合した。例えば、０．２ｇのし一ア ルギニン、０．０５ｇのし一アスパラギン、００２ｇのＬ−アスパラギン酸等は 総量０．６９ｇの乾燥粉末混合物を製造するために添加した。

表１ ＲＰＭＩ−１６４０培地のための 酸可溶性サブグループ 表２に示すように、酸可溶性適合成分を８．８ｍｌの水に混合し、次に最終ｐＨ が０．８５になるようにＨＣｌを加えた。５Ｎ　ＨＣＩ約１２ｍｌを必要とした 。得られた溶液はＲＰ〜ｆｒ−１６４０培地のための酸可溶性サブグループの１ ００Ｘ製剤である。

１６４０培地組成に基づいて、２つの付加サブグループを製造した　グルタミン 含有サブグループおよび弱酸塩基可溶性サブグループである。表３はＲＰＭＩ− １６４０培地のためのグルタミン含有サブグループの乾燥粉末混合物を作るため に付加された成分を示す。最終ｐＨ約５５の２０ｍ１の５０×濃縮物を製造する ために総量６，４ｇの成分の混合物を約１７．５ｍｌの水に混合した。

表４は３．２５ｇの弱酸塩基可溶性成分のための乾燥粉末混合物（ＤＰＭ）を作 るのに必要な成分の量を示す。ｐＨ約８３の２０ｍ１の溶液を製造するために約 １９．５ｍｌの水を弱酸塩基成分に添加した。このサブグループのすべての成分 は水可溶性であり、それゆえ塩または糖による粉末化作用は必要ではない。

上記酸可溶性サブグループ、グルタミン含有サブグループおよび弱酸塩基可溶性 サブグループの再構成は、ｌｘＲＰＭＩ−１６４０培地処方組成物を製造するた めに表２に示すように遂行した。ＮａＨＣＯ３は別の補足物として添加した。こ の培地の浸透圧は濾過滅菌の前は２７６ｍ０ｍであった。別法として、ＮａＨＣ Ｏ３の乾燥粉末再構成培地に添加するのではなく、ＮａＨＣＯ３の濃縮溶液を使 用できる。

表２ ＲＰＭＩ−１６４０サブグループの製造法１、弱酸塩基可溶性サブグループ（５ ０Ｘ１ｌｌ縮）■リンドル作るのに充分な量 ２０．０ｍｌ　全量　最終ｐＨ＝８．２８特別な注意：ＤＰＭは成分の凝固を避 けるためにゆっくり水に添加する。溶解するまで適度にかきまぜる（約１５−２ ０分）。

２、酸可溶性成分（１００Ｘ濃縮） １リットル作るのに充分な量 ８．８１１１水 ０．６９ｇ　ＤＰＭ １．２０ｍ１　５Ｎ　ＨＣｌ １０．０ｍｌ　全量　最終ｐＨ＝０．８５特別な注意：５ＮＨＣ１をゆっくりか きまぜている溶液に添加する。

３、グルタミン含有サブグループ（５０×濃縮）１リットル作るのに充分な量 ２０．０ｇ＋１　全量　最終１）Ｈ＝５．５０特別な注意　これは吸熱反応であ る。溶液の温度は成分の添加で約３℃下がるであろう。適度なかきまぜを１０− １５分または全ての成分が溶解するまで行う。

ＩＸＲＰＭＩ−１６４０培地組成物の１！８！遣方法・１、下記の量のサブグル ープ濃縮物を水に添加する・Ａ、９５０Ｉｌｌ　水　ｐＨ５，９８ Ｂ、　２０ｍ１　グルタミン含有サブグループ　ｐＨ５，６１Ｃ，２０ｍ１　弱 酸塩基可溶性サブグループ　ｐＨ８，２０Ｄ、　１０ｍ１　酸可溶性サブグルー プ　ｐＨ４，９１Ｅ、　２．ＯｇＮａＨＣＯａ　ｐＨ７，００濾過前の浸透圧゛ ２７６国ＯＳ履 表４ ＲＰＭＩ−１６４０培地のための 弱酸塩基可溶性サブグループ 実施例■ 連続供給混合チャンバーを使用したＲＰＭＩ−１６４０培地濃縮サブグループの 再構成 再構成実験は１５１のバイオスピンバイオリアクターを用いてＲＰＭＩ−１６４ ０培地濃縮サブグループを使用して行った。サブグループ当たり５０×の培地サ ブグループ３種および２５ｘＮａＨＣＯ３サブグループ２つを断続的にバイオリ アクターに２５０１１１１／時間の速度で注入した。脱イオン化蒸留水を１２． ５１／時間の速度でリアクターに注入した。潅流濃縮物は、断続的に混合チャン バーに添加した。完全な１×培地組成物がバイオスピンバイオリアクターから１ 時間当たり１２５１の速度で取出された。培地のｐｆｌは内部的または外部的の 両方で追跡した。培地パラメーター（ｐＨ，浸透圧、アミノ酸類、グルコース、 グルタミン）は潅流中連続して測定した。実験の結果は、ＲＰＭＩ−１，６４０ 濃縮サブグループがバイオスピンバイオリアクター中で再構成され、得られた１ ×培地処方組成物パラメーターはＲＰＭＩ−１６４０処方組成物と有意な相関性 を示すことを示唆する（図２．３および表５）。

実施例■ ＤＭＥＭ培地の製造 ＤＭＥＭ培地（ダルベンコ修飾イーグル培地（ギブコ／ビーアルエルルアンド・ リファレンス・ガイド９６頁、１９９０年、タルべ・ノコ・アールら、ピロロジ ー、８巻３９６頁（１９，１９年）；およびスミス・ジエー・ディーら、ピロロ ジー、１２巻、１８５頁（１９６０年）をこの培地の成分を酸可溶性サブグルー プ、グルタミン含有サブグループおよび弱酸塩基可溶性サブグループ；こ分割１ することにより製造した。ＤＭＥＭ培地の成分（よ表６、７、８および９（こ示 した濃縮サブグループとして分割し製造した。実施例■に記載したのと同様の方 法を使用した。

表９はまたＤＭＥＭＩＸ処方組成物を作るためのＤＭＥＭサブグループの混合お よび希釈に使用した方法を示す。ＮａＯＨｌよ最終ｐＨを７．３１：調整するた め（二添加した。ＮａＨＣＯ３は緩衝剤として添加した。

表９ ＤＭＥＭサブグループの製造法 １、　高グルコースＤＭＥＭ グルタミン含有サブグループ １８．１謬Ｉ　Ｈ２Ｏ ３，３ｇ　ＤＰＭ ２０．０ｆｆｉｌ　総量　ｐＨ５，５０５０ｘ濃縮２、　高グルコースＤＭＥＭ 弱酸塩基可溶性含有サブグループ １７、０１１１１　８２０ ５．４ｇ　ＤＰＭ Ｏ１７ｍｌ　Ｏ，ＩＮ　ＮａＯＨ ２０，０１１１総量　ｐＨ６，６０５０Ｘ濃縮３、　高グルコースＤＭＥＭ 酸可溶性含有サブグループ １８．５ｍｌ　Ｈ２Ｏ １１ｇ　ＤＰＭ ＩＸＤＭＥＭ培地組成の製造法 ９００、０１１　Ｈ２Ｏ ２０，０１１１グルタミン含有サブグループ２Ｑ、Ｑｍｌ　弱酸塩基サブグルー プ ２０．０１１　酸可溶性サブグループ ３．７ｇ　ＮａＨＣＯ２ ＡＤＤ　ｐＨを７．３０にするための５Ｎ　Ｎａ０ＨＡＤＤ　量を１００００１ １１１にするためのＨ２゜１０００、ｆ）１１１　総量　ｐＨ７，３０ＬＸ製剤 浸透圧は３１５−３４　ＱｍＯｓｌｏ　＆透性１ま各々のサブク゛ル−プの成分 の溶解性のために使用する酸／塩基の量により変わるであろう。もし浸透圧力（ 上言己の望む限実施例Ｖ ハム１２培地の製造 ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、５３巻２８８頁（１９６５年））（マ培 地を０．１１および１２に述へる。実施例■に述べであるのと同様の方法を用１ ．＝て培地濃縮物を製造し得る。

表１０ ハムＦ−１２培地のための酸可溶性サブグループ表１１ 表１２ ハムＦ−１２培地のための弱酸／塩基サブグループ実施例■ ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地の製造 ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ギブコンビ−アル−エル・カタログ・アンド・ｌＪ７ アレンス・ガイド、９７頁（１９９０年））は、この培地の成分を、酸可溶性サ ブグループ、グルタミン含有サブグループ、および弱酸／塩基サブグループに分 割することにより製造する。それぞれのサブグループの組成は、表１３．１４お よび１５にのべる。実施例Ｈに記載のと同様の方法を培地濃縮物製造に用い得る 。

表１３ ＤＭＥＭ／Ｆ〜１２培地のための酸可溶性サブグループ表１４ ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地のための弱酸／塩基サブグループ表１５ ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地のためのグルタミン含有サブグループ実施例■ ＩＭＤＭ培地の製造 ＩＭＤＭ培地（ダルベフコ・アールおよびフリーマン・シー、ピロロジー、８巻 ３９６頁（１９５９年）ニスミス・ジェー・ディーら、ピロロシー、１２巻１８ ５頁（１９６０）：ティン／ニー・カルチャー・スタンダーズ・コミッティー、 イン・ビトロ、６巻２９３頁。イン・ビトロ、９巻６頁（１９７０年）、イスコ ープ・エフ・エフおよびメルチャーズ・エフ、ジャーナル・オブ・エクスベリメ ンタル・メディスン、１４７巻９２３頁）は、培地を酸可溶性サブグループ、グ ルタミン含有サブグループおよび酸／塩基サブグループに分割することにより製 造する。

それぞれのサブグループの成分は、表１６．１７および１８に述べる。実施例■ に述べたのと同様の方法で培地濃縮物を製造し得る。

表１６ ＩＭＤＭ培地のための酸可溶性サブグループ表１７ ＩＭＤＭ培地のための弱酸／塩基サブグループ表１８ ＩＭＤＭ培地のためのグルタミン含有サブグループ培地および発酵技術および／ または関連分野の人に明白な本発明を実施するための上記の例の修飾は、以下の 請求の範囲の中に含まれる。

本明細書中の全ての刊行物および特許出願は、本発明に適合する分野の技術者の 技術レベルを表示している。全ての刊行物および特許出願は、あたかも各々個々 の刊行物または特許出願の内容が具体的かつ個々に引用して包含されるべく示さ れていると同様に本明細書に包含される。

しかしながら、上記の発明は、明白な理解のための説明および例としていくつか の嬰様を述べたが、ある種の変化および修飾が添付の請求の範囲内で行われるで あろうということは明白である。

残留し一グルタミン％ 期間（時間） ＦＩＧ、　２ 期間（時間） ＦＩＧ、３

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）細胞培養培地の成分を１個あるいはそれ以上の適合サブグループに分 割し、上記適合サブグループは： ｉ．酸可溶性サブグループ ｉｉ．弱酸塩基可溶性サブグループ ｉｉｉ．グルタミン含有サブグループ ｉｖ．アルコール可溶性サブグループ ｖ．アルカリ可溶性サブグループ、およびｖｉ．補足物含有サブグループ； を含み、 （ｂ）上記細胞培養培地を得るために工程（ａ）で得られたそれぞれのサブグル ープの充分量を充分量の希釈剤と共に混合することを含む細胞培養培地の製造法 。
2. ２．（ａ）細胞培養培地の成分を１画あるいはそれ以上の適合サブグループに分 割し、上記適合サブグループは： ｉ．酸可溶性サブグループ ｉｉ．弱酸塩基可溶性サブグループ ｉｉｉ．グルタミン含有サブグループ ｉｖ．アルコール可溶性サブグループ ｖ．アルカリ可溶性サブグループ、およびｖｉ．補足物含有サブグループ； を含み、 （ｂ）上記サブグループを担体に溶解し、各々のサブグループをぞれぞれの担体 中に含む濃縮溶液を得、 （ｃ）上記細胞培養培地を得るために工程（ｂ）で得られたそれぞれのサブグル ープの充分量を充分量の希釈剤と共に混合することを含む細胞培養培地の製造法 。
3. ３．細胞培養培地が１０ｘ処方組成物である、請求項１または２記載の方法。
4. ４．細胞培養培地が１ｘ処方組成物である、請求項１または２記載の方法。
5. ５．細胞培養培地がＲＰＭＩ−１６４０である、請求項１または２記載の方法。
6. ６．細胞培養培地がＤＭＥＭ培地である、請求項１または２記載の方法。
7. ７．上記混合がバッチシステムで行われる、請求項２記載の方法。
8. ８．上記混合が連続システムで行われる、請求項２記載の方法。
9. ９．工程（ｂ）で得られた濃縮溶液が１０ｘより大である、請求項２記載の方法 。
10. １０．工程（ｂ）で得られた濃縮溶液が約５０ｘである、請求項２記載の方法。
11. １１．工程（ｂ）で得られた濃縮溶液が約１００ｘである、請求項２記載の方法 。
12. １２．酸可溶性サブグループが、ｐＨ約１で安定かつ可溶な成分を含む、請求項 １または２記載の方法。
13. １３．上記サブグループが、チアミン、アスコルビン酸、、第一鉄塩、第二鉄塩 、リン酸およびグルタミン以外のアミノ酸からなる群から選択される１個または それ以上の成分を含む、請求項１２記載の方法。
14. １４．弱酸塩基可溶性サブグループが、ｐＨ約４から９で安定かつ可溶な成分を 含む、請求項１または２記載の方法。
15. １５．酸塩基可溶性サブグループが、砂糖、デオキシリボース、リボース、ヌク レオチド、微量元素、脂質、フェノールレッド、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰ ＥＳ、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＣ１、ＫＣ１、酢酸ナトリウムおよびチアミン以外 の水溶性ビタミン、アスコルビン酸またはＤ−パントテン酸Ｃａからなる群から 選択される１個またはそれ以上の成分を含む、請求項１４記載の方法。
16. １６．グルタミン酸含有サブグループが、グルタミンおよび少なくとも１種の、 グルタミンを安定化させる量の二価カチオンを含む、請求項１または２記載の方 法。
17. １７．上記二価カチオンがカルシウム、マグネシウムまたはマンガン、またはそ れらの組み合わせである、請求項１６記載の方法。
18. １８．上記サブグループがさらに塩化ナトリウム、またはＤ−パントテン酸Ｃａ またはそれらの組み合わせを含む、請求項１６記載の方法。
19. １９．アルコール可溶性サブグループがコレステロール、リノール酸、リポ酸、 脂溶性ビタミン、メナジオン、２−メルカプトエタノール、脂質、および脂肪酸 からなる群から選択された１個またはそれ以上の成分を含む、請求項１または２ 記載の方法。
20. ２０．アルカリ可溶性サブグループが１個またはそれ以上のｐＨ約９．０で可溶 性かつ安定な成分を含む、請求項１または２記載の方法。
21. ２１．上記アルカリ可溶性サブグループが、ウラシル、キサンチンおよびヒポキ サンチンからなる群から選択された１個またはそれ以上の成分を含む、請求項２ ０記載の方法。
22. ２２．細胞培養培地を得るために、充分量の水性希釈剤を、ｉ．酸可溶性サブグ ループ ｉｉ．弱酸塩基可溶性サブグループ ｉｉｉ．グルタミン含有サブグループ ｉｖ．アルコール可溶性サブグループ ｖ．アルカリ可溶性サブグループ、およびｖｉ．補足物含有サブグループ を含む担体に溶解された成分の少なくとも１種のサブグループの充分量と混合す ることからなる、細胞培養培地製造法。
23. ２３．上記混合がバッチシステムで行われる、請求項２２記載の方法。
24. ２４．上記混合が連携システムで行われる、請求項２２記載の方法。
25. ２５．ＲＰＭＩ−１６４０培地を製造するために（ａ）ＲＰＭＩ−１６４０培地 の成分をサブグループに分割し、上記サブグループは ｉ、酸可溶性サブグループ ｉｉ．弱酸塩基可溶性サブグループ ｉｉｉ．グルタミン含有サブグループ：を含み、 （ｂ）上記適合成分のサブグループを担体に溶解し、各々のサブグループのぞれ ぞれの担体中の濃縮溶液を得： （ｃ）工程（ｂ）で得られたそれぞれのサブグループの充分量を充分量の希釈剤 と共に混合する ことを含むＲＰＭＩ−１６４０培地の製造法。
26. ２６．ＤＭＥＭ培地を製造するために （ａ）ＤＭＥＭ培地の成分をサブグループに分割し、上記サブグループはｉ．酸 可溶性サブグループ ｉｉ．弱酸塩基可溶性サブグループ ｉｉｉ．グルタミン含有サブグループ：を含み、 （ｂ）上記適合成分のサブグループを担体に溶解し、各々のサブグループのぞれ ぞれの担体中の濃縮溶液を得、 （ｃ）工程（ｂ）で得られたそれぞれのサブグループの充分量を充分量の希釈剤 と共に混合する ことを含むＤＭＥＭ培地の製造法。
27. ２７．キットが、近接区域に１個またはそれ以上の容器を収容するように区画形 成されている運搬体を含み、 （ａ）第１の容器手段は酸可溶性サブグループの適合成分を含む；（ｂ）第２の 容器手段は弱酸塩基可溶性サブグループの適合成分を含む；（ｃ）第３の容器手 段はグルタミン含有サブグループの適合成分を含む；（ｄ）第４の容器手段はア ルカリ可溶性サブグループの適合成分を含む；（ｅ）第５の容器手段はアルコー ル可溶性サブグループの適合成分を含む；および（ｆ）第６の容器手段は補足物 含有サブグループの適合成分を含む；細胞培養培地を作るためのキット。
28. ２８．細胞培養培地がＲＰＭＩ−１６４０である、請求項２７記載のキット。
29. ２９．細胞培養培地がＤＭＥＭ培地である、請求項２７記載のキット。
30. ３０．少なくとも１個の上記容器手段中の成分が溶液である、請求項２７記載の キット。
31. ３１．上記溶液が上記適合成分の濃縮溶液である、請求項３０記載のキット。
32. ３２．上記濃縮溶液が約２５ｘである、請求項３１記載のキット。
33. ３３．上記濃縮溶液が約５０ｘである、請求項３１記載のキット。
34. ３４．上記濃縮溶液が無菌である、請求項３１記載のキット。
35. ３５．グルタミンおよびグルタミンを安定化させる量の２価カチオンを含む合成 物。
36. ３６．グルタミンおよび２価カチオンが溶液である、請求項３５記載の合成物。
37. ３７．グルタミンと２価カチオンの比が約２：１である、請求項３６記載の合成 物。
38. ３８．上記２価カチオンがカルシウム塩、マグネシウム塩またはそれらの組み合 わせを含む、請求項３６記載の合成物。
39. ３９．上記溶液が無菌である、請求項３６記載の合成物。
40. ４０．キットが、近接区域に： （ａ）第１の容器手段は酸可溶性サブグループの適合成分を含む；（ｂ）第２の 容器手段は弱酸塩基可溶性サブグループの適合成分を含む；（ｃ）第３の容器手 段はグルタミン含有サブグループの適合成分を含む；を収容するように区画形成 されている運搬体を含む、ＲＰＭＩ−１６４０培地を作るためのキット。
41. ４１．キットが、近接区域に： （ａ）第１の容器手段は酸可溶性サブグループの適合成分を含む：（ｂ）第２の 容器手段は弱酸塩基可溶性サブグループの適合成分を含む；（ｃ）第３の容器手 段はグルタミン含有サブグループの適合成分を含む；を収容するように区画形成 されている運搬体を含む、ＤＭＥＭ培地を作るためのキット。