JP2002233355A - 培地濃縮物技術 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、培地処方組成物を高濃度で溶解で
きる(１０ｘから１００ｘ)安定、適合性成分にサブグル
ープ化する方法に関するものである。サブグループを含
む成分の濃縮溶液は、培地処方組成物を製造するのに使
用できる。 【解決手段】 濃縮培養培地処方組成物(２から１０ｘ)
または１ｘ細胞培養培地は本発明の方法に従って、充分
量の濃縮サブグループ溶液を、充分量の希釈剤(水、緩
衝液等)と混合することにより製造できる。本発明はさ
らに、溶液中で、二価金属カチオンとグルタミンの複合
化または混合による安定化にもまた関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】発明の分野 本発明は細胞培地の分野に関し、具体的には濃縮した適
合性処方組成物に選択的にサブグループ化した培地成分
に関する。上記濃縮処方組成物は安定で、細胞培地を製
造するのに使用することができる。

【０００２】発明の背景 細胞培地は、制御された人工的試験管内環境の中で細胞
を維持および成長させるのに必要な栄養物を提供する。
細胞培地の特徴および組成は、個々の細胞の必要条件に
よって変化し得る。重要なパラメーターは浸透圧モル濃
度、pＨ、および栄養処方を含む。

【０００３】培地処方組成物は、動物、植物および細菌
細胞を含む多数の細胞型を成長させるのに使用されてき
た。培地で成長した細胞は利用できる栄養物を異化し、
モノクローナル抗体、ホルモン、成長因子等のような有
用な生物学的物質を産生する。上記物質は治療学的用途
を有し、組換えＤＮＡ技術の出現で細胞はこれらの物質
を大量に産生するように操作することができる。すなわ
ち、試験管内で細胞が成長する能力は、細胞生理学の研
究にだけ重要ではなく、それ以外の手段では費用効率的
な方法により得ることができない有用な物質の製造に必
要である。

【０００４】

【従来の技術】細胞培地処方組成物は文献で綿密に証明
されており、多数の培地は市販されている。細胞培地の
典型的な栄養物は、アミノ酸、塩、ビタミン、微量金
属、糖、脂肪および核酸を含む。しばしば、特に複合培
地組成物では、安定性の問題は毒性物質および／または
必須栄養物の低い有効濃度を生じ、それにより培地の機
能的な有効期間が限定される。例えば、グルタミンは試
験管内で哺乳類の細胞の培養で使用されるほとんど全て
の培地の構成成分である。グルタミンは、ピロリドンカ
ルボン酸およびアンモニアに自然に分解する。崩壊速度
はpＨおよびイオン条件により影響されるが、細胞培地
では、これらの分解物質の形成は避けることができない
（トリッシュ等、エクスペリメンタル・セル・リサー
チ、第２８巻、第３６０−３６４頁(１９６２年)）。

【０００５】ワング等（イン・ビトロ、第１４巻(８)、
第７１５−７２２頁(１９７８年)）は、過酸化水素のよ
うな光産物は細胞にとって致命的で、ダルベッコの修正
イーグルの培地（ＤＭＥＭ）で産生されることを示し
た。リボフラビンおよびトリプトファンまたはチロシン
は光照射期間に過酸化水素を形成するのに必要な成分で
ある。ほとんどの哺乳類の培地はリボフラビン、チロシ
ンおよびトリプトファンを含むので、毒性光産物はほと
んどの細胞培地で産生され得る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】これらの問題を避ける
ために、研究者は「必要に応じた」方式で培地を作り、
培地の長期間貯蔵を避けている。典型的には乾燥粉末型
である市販の培地はスクラッチ、すなわち各栄養物をそ
れぞれ加えて培地を作る好便な別法として役立ち、また
液体培地に関する幾つかの安定性問題を避ける。しかし
ながら、製造者により供給されたこれらの慣用処方組成
物を除いて、限定された市販培地しか入手できない。

【０００７】乾燥粉末培地処方組成物はある種の培地の
貯蔵寿命をのばすことができるが、乾燥粉末培地、特に
大規模適用に関する多くの問題がある。大きい培地体積
の製造には乾燥粉末培地の貯蔵設備が必要であり、栄養
物成分を混合および計量するのに必要な専門的な培地室
はいうまでもない。乾燥粉末培地の腐食性のため、混合
タンクは定期的に取り替えなければならない。

【０００８】生物学的物質の製造の費用を低くする必要
がある。液体細胞培地を安定化させる能率的で費用効率
的な方法および１倍培地組成物を製造する好便な方法の
発達は細胞培地技術の分野において重要な発達になる。

【０００９】

【課題を解決するための手段】発明の要約 本発明は、培地処方組成物を安定で適合性成分にサブグ
ループ化する方法に関し、その成分はサブグループによ
り異なるが、例えば水、酸、アルカリまたはアルコール
を含む溶液中高濃度(１０倍−１００倍)でその後可溶化
することができる。任意の培地形成体は本発明の６種の
サブグループの１種またはそれ以上に分割することがで
きる。具体的なサブグループは酸可溶性サブグループ、
グルタミン含有サブグループ、アルカリ可溶性サブグル
ープ、アルコール可溶性サブグループ、弱酸−塩基可溶
性サブグループおよび補足剤含有サブグループを含む。

【００１０】本発明によると、通常の技術者が、細胞培
地の成分を各成分の物理的および化学的特性（物理化学
的特性）に基づいた本発明のサブグループの１種に分割
することができる。培地の成分は典型的にはアミノ酸、
塩、ビタミン、微量金属、糖、脂肪、核酸等を含む。こ
れらの成分は異なった溶解性および安定性特徴を有す
る。これらの特徴に基づいて、分類構成が培地成分の適
合性サブグループ化を可能にさせた。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明はすなわち、適合性培地成
分をサブグループ化する方法に関する。この方法でサブ
グループ化した培地成分は安定で、高濃度においても可
溶性である。サブグループを含む成分の上記濃縮溶液は
その後、細胞の成長または維持に適した希釈培地処方組
成物を製造するのに使用することができる。濃縮培地処
方組成物（２−１０倍）または１倍細胞培地は、十分な
量の濃縮サブグループ溶液と十分な量の希釈剤（水、緩
衝液等）を混合して本発明により製造することができ
る。すなわち本発明は、（ａ）細胞培地の適合性成分を
１またはそれ以上のサブグループに分割し、上記サブグ
ループは（i）酸可溶性サブグループ、（ii）弱酸−塩
基可溶性サブグループ、（iii）グルタミン含有サブグ
ループ、（iv）アルコール可溶性サブグループ、（v）
アルカリ可溶性サブグループ、および（vi）補足剤含有
サブグループを含み、（ｂ）担体に適合性成分の各サブ
グループを溶解して、それぞれの担体中にサブグループ
を含む濃縮溶液を得て、（ｃ）段階（ｂ）で得られた各
サブグループの十分量を希釈剤の十分量と混合して細胞
培地を製造することを含む細胞培地を製造する方法を対
象とする。

【００１２】さらに、本発明は、（ａ）ＲＰＭＩ−１６
４０培地の成分を（i）酸可溶性サブグループ、（ii）
弱酸−塩基可溶性サブグループ、および（iii）グルタ
ミン含有サブグループに分割し、（ｂ）担体に適合性成
分の各サブグループを溶解して、それぞれの担体中にサ
ブグループを含む濃縮溶液を得て、（ｃ）段階（ｂ）で
得られた各サブグループの十分量を希釈剤の十分量と混
合してＲＰＭＩ−１６４０培地を製造することを含むＲ
ＰＭＩ−１６４０培地を製造する方法を具体的に対象と
する。

【００１３】本方法はまた、ＤＭＥＭ培地を作るのに使
用することができる。すなわち、ＤＭＥＭ培地の成分
は、酸可溶性サブグループ、弱酸−塩基可溶性サブグル
ープおよびグルタミン含有サブグループに分割すること
ができ、それらは後に混合および希釈して１倍製剤を得
る。

【００１４】本発明はさらに、溶液中グルタミンと二価
金属カチオンと複合または混合することによるグルタミ
ンの安定化に関する。すなわち、本発明はグルタミンと
グルタミンを安定化させるのに有効な量の二価カチオン
を含む要素の組成物を対象とする。

【００１５】意外にも、本発明は劇的に費用が少ない培
地の製造法を提供する。費用の減少は次の要因による。
本発明の培地濃縮物は１倍培地に必要な大きな撹拌タン
クが必要ではないので、ずっと小規模な製造設備で製造
することができる。さらに、本発明の培地濃縮物は、在
庫品、貯蔵および労働費用を減少する「ちょうど間に合
う」製造技術を使用して、必要に応じて行う方式で製造
することができる。培地の製造および積み出しに必要な
時間は６−８週間からわずか１日に減少することができ
る。さらに、本発明の培地濃縮物は、各サブグループ化
した成分が容易に溶解するので、ボールミル機を使用し
ないで製造することができる。さらに、本発明の培地サ
ブグループは室温で貯蔵することができ、冷蔵の必要が
ない。さらに、本発明は、先行技術により製造された多
数のバッチのための多数の品質対照試験と比較して、１
種だけ品質対照試験が必要である多量の１倍培地（100,
000リットルまたはそれ以上）を製造するのに使用する
ことができる。重要なことには、本発明の培地濃縮物
は、サブグループ化した成分がより安定であるため、バ
ッチ間で一定している。すなわち、本発明は培地製剤の
技術において大きく進歩している。

【００１６】図面の詳細な説明 第１図は、溶液中のＬ−グルタミン安定化を示す。Ｌ−
グルタミンと二価カチオンの様々な比率を試験し、Ｌ−
グルタミンの安定性を決定した。第２図は、濃縮したサ
ブグループの十分量と水の十分量との連続した混合によ
り、１倍培地組成物としたＲＰＭＩ−１６４０培地のモ
ニターした経時的pＨおよび浸透圧モル濃度を示す。第
３図は、Ｌ−グルタミンおよびグルコースのモニターし
た経時レベルを示す。試料は、濃縮したサブグループと
水との連続混合の間に混合室から取られた。第４図は、
濃縮したサブグループを含む大きい容器からなるキット
を示す。濃縮したサブグループは混合および希釈するこ
とができ、培地総量10,000リットルを得る。

【００１７】好ましい態様の記載 後に続く記載では、細胞培地の分野で通常使用する多く
の用語が広範囲に利用される。明細書および請求の範囲
の明確で矛盾のない理解および上記用語に与えられるべ
き範囲を提供するために、次の定義が提供される。

【００１８】成分 「成分」という語は、化学的または
生物学的源の何れかの任意の化合物を意味し、それは細
胞の成長または増殖を維持または促進するために細胞培
地で使用することができる。「成分」、「栄養物」および
「成分」という語は互いに交換して使用することがで
き、上記化合物を全て意味するということになる。細胞
培地で使用する典型的な成分は、アミノ酸、塩、金属、
糖、脂肪、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、蛋白質
等を含む。試験管内で細胞の成長を促進または維持する
他の成分は、個々の必要に応じて先行技術により選択す
ることができる。

【００１９】細胞培養 「細胞培養」により人工的、試
験管内環境で維持、培養または成長した細胞または組織
を意味する。

【００２０】培養容器 細胞の成長のための無菌環境を
提供する様々な大きさのガラス、プラスチックまたは金
属の容器を「培養容器」と称する。

【００２１】細胞培地 「細胞培地」または「培地」ま
たは「培地処方組成物」は、細胞を培養または成長する
ための栄養溶液を意味する。上記培地を構成する成分
は、培養される細胞の型により変化し得ることができ
る。栄養組成物に加えて、浸透圧モル濃度およびｐＨが
培地の重要なパラメーターと考えられる。

【００２２】適合性成分 細胞培地に使用される各成分
は、独特の物理的および化学的特徴を有する。溶液で維
持し、「安定した」組合わせを形成することができるこ
れらの培地栄養物は、「適合性成分」を意味する。「適
合性成分」は、成分が実質的に毒性化合物に崩壊または
分解しないかまたは、細胞培養により利用または異化す
ることができない化合物に崩壊または分解しない場合、
「安定」であると言える。崩壊が検出されない場合また
は、１倍細胞培地製剤での同じ成分の分解と比較して低
速度で崩壊がおこる場合もまた、成分は「安定である」
と考慮される。例えば、１倍培地製剤のグルタミンはピ
ロリドンカルボン酸およびアンモニアに崩壊することが
知られている。二価カチオンと混合したグルタミンは、
経時的に検出される分解がほとんどまたはないので「適
合性成分」と考えられる。

【００２３】安定性測定に加えて培地成分の適合性は、
溶液の成分の「溶解性」により決定される。「溶解性」
または「可溶性」という語は、他の成分と溶液を形成す
る成分の能力を意味する。すなわち成分は、測定または
検出できる沈殿物を形成しないで溶液中に維持すること
ができる場合適合する。すなわち、本書に記載されるよ
うな「適合性成分」の語は、個々の培地成分の混合を意
味し、その成分は濃縮または１倍処方組成物の一方とし
て溶液に混合される場合、「安定」であり、「可溶性」
である。

【００２４】１倍処方組成物 細胞培地は多数の成分か
らなり、これらの成分は培地から培地に及ぶ。「１倍製
剤」は、細胞培地で見られるある種または全ての成分を
含む任意の水溶液を意味するということである。例え
ば、「１倍処方組成物」は細胞培地またはその培地の成
分の任意のサブグループを意味する。１倍溶液の成分の
濃縮物は、細胞を維持または成長するのに使用する細胞
培養処方組成物で見られるその成分の濃度とほぼ同じで
ある。細胞を成長させるのに使用する細胞培地は定義に
よると１倍処方組成物である。多数の成分が存在する
（適合性成分のサブグループ中）場合、１倍処方組成物
の各成分は、細胞培地のこれらの成分の濃度とほぼ等し
い濃度を有する。例えば、ＲＰＭＩ １６４０培地はと
りわけＬ−アルギニン０.２ｇ／ｌ、Ｌ−アスパラギン
０.０５ｇ／ｌおよびＬ−アスパラギン酸０.０２ｇ／ｌ
を含む。これらのアミノ酸の「１倍製剤」は本発明によ
る適合性成分であり、溶液にこれらの成分とほぼ同じ濃
度を含む。すなわち、「１倍処方組成物」の意味する場
合、溶液中の各成分が記載された細胞培地で見られるの
と同じまたはほぼ同じ濃度を有することを意図する。１
倍処方組成物の培地成分の濃度は通常の技術に既知であ
り、「血清なしの動物細胞培養の培地、補足剤および基
質の製造方法」、アラン、アール、リス、ニューヨーク
（１９８４年）を参照、それはその全体を本書に包含さ
せる。しかしながら、浸透圧モル濃度および／またはp
Ｈは、特に成分がわずかしか１倍処方組成物に含まれて
いない場合、培地と比較して１倍処方組成物で異なる。

【００２５】１０倍処方組成物 「１０倍処方組成物」
は、その溶液の各成分が細胞培地の同じ成分より約１０
倍濃縮した溶液を意味する。例えば、ＲＰＭＩ １６４
０培地はとりわけＬ−グルタミン０.３ｇ／ｌを含む。
定義では、「１０倍処方組成物」はグルタミン約３.０
ｇ／ｌを含む。「１０倍処方組成物」は１倍培地で見ら
れる約１０倍の濃度で多数の付加的な成分を含むことが
できる。明らかなように、「２５倍製剤」、「５０倍製
剤」および「１００倍製剤」は、１倍細胞培地と比較し
てそれぞれ約２５、５０または１００倍濃度で成分を含
む溶液を示す。再び、培地処方組成物および濃縮処方組
成物の浸透圧モル濃度およびpＨは変化し得る。

【００２６】Ａ．培地濃縮物技術 本発明の培地濃縮物技術は培地成分を、個々のサブグル
ープにより異なるが、水、水性酸、アルコールまたは水
性アルカリのような担体の適当な量に溶解することによ
り濃縮処方組成物（１０倍−１００倍）にその後可溶化
することができる安定で適合性成分にサブグループ化す
ることに基づく。上記溶液を本書では「担体」と称す
る。適当な条件下、これらのサブグループを再構成（混
合）し、２倍から１０倍のような濃縮した（１倍以上）
細胞培地処方組成物を製造するかまたは、直接１倍細胞
培地処方組成物を再構成することができる。本発明の濃
縮物培地技術は適合性成分、上記サブグループの液体濃
縮物の製造、およびこれらの濃縮サブグループの十分量
と希釈剤の十分量とを混合して所望の培地処方組成物を
製造することに関する。

【００２７】細胞培地処方組成物は、アミノ酸、塩、ビ
タミン、微量金属、糖、脂肪、核酸等からなる。これら
の各成分は異なった溶解性および安定性特性を有する。
例えば、アミノ酸（グルタミンを除く）は可溶性で、酸
性条件下（pＨ約１.０）非常に安定であるが、ビタミン
（チアミンおよびアスコルビン酸を除く）は希酸または
アルカリ性条件下（pＨ４.０以上）可溶化する。培地成
分の物理的特性に基づいて、安定液体濃縮物を製造する
のに使用することができる任意の培地処方組成物をサブ
グループ化することを可能にする分類方式が開発され
た。

【００２８】本発明は、任意の細胞培地からの適合性成
分を分割することができる６種のサブグループを定義す
る。既定の細胞培地の成分は本発明により定義された少
なくとも１種のサブグループに分離することができる。
適合性培地成分を含む各サブグループは液体担体に溶解
または乾燥型で維持する。液体担体の型および分類した
成分を溶液に溶解するのに使用する方法は、サブグルー
プにより変化し、わずかな日常的な試験で通常の技術者
により決定することができる。

【００２９】好ましくは、サブグループ化した成分を含
む溶液は、１倍培地処方組成物の同じ成分の濃度より濃
縮している。分類された成分は好ましくは２５倍濃縮
（２５倍製剤）であり、さらに好ましくは５０倍濃縮
（５０倍製剤）である。高濃縮処方組成物は、成分が可
溶性で安定のままであることが提供される。

【００３０】いったん培地成分が６種のサブグループの
１またはそれ以上に分割し、分離濃縮溶液として製造す
るならば、各濃縮物の適当な（十分な）量を希釈剤と混
合して１倍培地製剤を製造する。典型的に、使用した希
釈剤は水であるが、緩衝液、生理食塩水溶液を含む他の
溶液または個々の培地成分を含む他の水溶液は、本発明
により使用することができる。

【００３１】本発明の培地は典型的に、細胞培地の不要
な汚染を防止するために滅菌する。滅菌は例えば、濃縮
成分を混合した後に無菌培養培地を製造する殺菌により
遂行することができる。別法としては、各濃縮サブグル
ープを滅菌して無菌溶液として貯蔵することができる。
これらの無菌濃縮物はその後、無菌希釈剤と混合して濃
縮１倍無菌培地処方組成物を製造することができる。

【００３２】多数の通常使用される滅菌技術の１種は、
本発明の濃縮サブグループまたは培地製剤を滅菌するの
に使用することができる。滅菌技術は滅菌する溶液の特
性により変化し得る。本発明による典型的な滅菌技術
は、熱および／または濾過滅菌を含む。他の滅菌の型は
通常の技術の１種で容易に明らかである。

【００３３】Ｂ．培地の型 細胞培地の任意の型を本発明により作ることができる。
培地処方組成物は文献でよく知られおり、そのうち多く
は市販されている。新規培地処方組成物および修正され
た既知培地処方組成物は本発明により製造することがで
きる。すなわち、培地成分は本発明で定義したように適
合性サブグループに分割することができる。これらの成
分のサブグループはその後溶液状態で濃縮され、所望な
らば滅菌することができる。

【００３４】本発明により製造することができる細胞培
地の例は、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ／
Ｆ１２、ＩＭＤＭ、ＭＥＭ、Ｍ１９９、マッコイ５Ａお
よびＦ１２栄養素混合物（ギブコ／ブリル、カタログお
よびレファレンス・ガイド(１９９０年)）を含むが、こ
れに限定されるものではない。

【００３５】すなわち本発明は、適合性成分の１または
それ以上の濃縮溶液を作る方法を提供し、その成分の十
分な量が希釈剤の十分な量と組合わせて混合される場
合、細胞培地を製造することができる。

【００３６】細胞培地に使用される任意の成分は、本発
明の６種のサブグループを１またはそれ以上に分割する
ことができる。本書に記載され、各サブグループにより
含まれる成分のリストは全てを含むものではないが、当
業者は、成分の物理化学的特性を知っているので、どの
サブグループがその成分と適合する他の成分を含むかを
容易に決定することができる。別法としては、新規成分
の特性が知られていない場合、日常の試験を好ましいサ
ブグループに決定するのに使用することができる。例え
ば、本発明により定義されるような特定の培地成分を含
む各サブグループは、新規成分を補足することができ
る。新規成分は、結果として生ずる濃縮溶液が可溶性で
安定である場合、特定のサブグループに適合する。試験
培地製造と培地濃縮物技術によって作られない対照培地
と比較することにより、当業者が好ましいサブグループ
をさらに決定することができる。細胞の成長特徴、毒性
物質の形成および培地の貯蔵寿命は適合性成分の指標と
して使用することができる。

【００３７】独特の物理化学的特性を有する特定の成分
は、場合により、任意のサブグループの成分と適合する
ことができないことがある。この場合には、別個のサブ
グループとしてこの成分を維持する必要があり得る。上
記成分は、十分な量の濃縮サブグループを希釈剤と混合
する場合に所望の１倍培地（本成分を含む）が製造され
るように、適当な濃度で希釈剤に加えることができる。
別法としては、不適合性成分を別個の濃縮溶液として加
えることができる。すなわち、本発明は、本発明で定義
される以外の付加的なサブグループの開発を考慮してい
るが、そのサブグループは本書で定義された任意のサブ
グループと適合することができない付加的な成分を安定
化および可溶化するものである。

【００３８】いくつかの成分を１種以上のサブグループ
に含ませることができることは、以下に記載した各サブ
グループを示す成分のリストから明らかである。特定の
成分が２種またはそれ以上のサブグループに適合するこ
とを示す場合、その成分の総量が最終培地製剤と一致す
る限り、その成分は様々な濃度でこれらのサブグループ
の１種またはそれ以上に含むことができる。唯一の限定
は、加えた成分の量が特定のサブグループにおいて他の
成分の溶解性または安定性に悪影響しないことである。
異なった培地を製造するのに必要なサブグループの数お
よび型は、成分の複雑性および／または成分の物理化学
的特性により変化し得る。１種以上のサブグループへの
成分の重複は、こうして任意の培地を製造する万能分類
方式を通常の当業者に提供する。

【００３９】Ｃ．酸可溶性サブグループ 酸可溶性サブグループに置いた培地成分は全てのアミノ
酸(グルタミンを除く)、チアミン、アスコルビン酸、鉄
（III）化合物、鉄（II）化合物、プリン、グルタチオ
ンおよび一塩基性リン酸ナトリウムを含む。これらの成
分は酸性（pＨ約０−１.０）で可溶性で、これらの条件
下非常に安定である。

【００４０】Ｄおよび／またはＬ−アミノ酸は両方とも
本発明の酸可溶性サブグループに含むことができる。典
型的に、培地はＬ−アミノ酸を含む。所望の培地製剤が
必要とする場合、グルタミンを除いて任意の組合わせの
１種またはそれ以上のアミノ酸を酸可溶性サブグループ
に含むことができる。グルタミンは具体的に、グルタミ
ン含有サブグループに含まれる。すなわち、本発明の酸
可溶性サブグループに含むことができるアミノ酸は、所
望の培地の必要条件により異なるが、グリシン、アラニ
ン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオ
ニン、システイン、シスチン、メチオニン、アスパラギ
ン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニ
ン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、ヒドロキ
シプロリン、ヒスチジンおよびトリプトファンを含む。
アミノ酸誘導体は、その誘導体が本サブグループの他の
成分および特有な細胞培養の維持または増殖に適合する
ならば酸可溶性グループに含むことができる。

【００４１】本発明の酸可溶性サブグループに含むこと
ができる他の成分は、チアミン（ビタミンＢ_１）、アス
コルビン酸（ビタミンＣ）、プリン類（グアニンおよび
アデニン）およびグルタチオンを含む。上記化合物の誘
導体はよく知られており、その誘導体が本サブグループ
に含まれる他の成分および特定の細胞培養の維持または
増殖にもはや適合しない程には、物理化学的特性を変化
しないならば、酸可溶性グループに含むことができる。

【００４２】鉄（III）および鉄（II）化合物は、培地
製剤が必要な場合、同様に本サブグループに置くことが
できる。本サブグループに含まれる他の成分の存在下で
安定で可溶性である上記鉄（III）および鉄（II）化合
物は、当業者によって容易に決定することができる。上
記鉄（III）化合物の例は、Ｆe（ＮＯ_３）_３、ＦeＳＯ
_４およびＦeＣl_３を含むが、これに限定されるものでは
ない。

【００４３】所望の培地処方組成物の成分である任意の
一塩基リン酸塩は、酸可溶性サブグループの中に含むこ
とができる。典型的なリン酸塩の例は、ＮaＨ_２ＰＯ_４
およびＫＨ_２ＰＯ_４のような一塩基リン酸塩を含むが、
これに限定されるものではない。

【００４４】本発明の酸可溶性サブグループは、特定の
培地の必要に応じて、上記記載の適合性成分の様々な組
合わせを含むことができる。すなわち、本発明の分類構
成により、所望の培地で見られ酸性溶液に適合する成分
が選択される。いったん本方法で分割すると、典型的に
乾燥粉末型（脱水）のこれらの成分は、pＨ約０−１.０
の酸性溶液で溶解する。生じた溶液は濃厚であるのが好
ましい（１０倍−１００倍）。すなわち、酸性溶液中の
成分は、１倍培地処方組成物で見られる同じ成分よりも
濃縮されている。

【００４５】明らかなように、濃縮酸可溶性サブグルー
プは、同じ培地の製造ごとに組成、浸透圧モル濃度およ
びpＨがわずかに変化し得る。さらに、酸可溶性サブグ
ループは１つの培地と次のものとでは異なる。このこと
は他のサブグループでも同様である。本発明は、酸可溶
性培地成分を含む安定な製品を製造する手段を提供す
る。上記製品は成分の乾燥粉末混合物として維持するこ
とができるが、好ましくは濃縮溶液として維持する。典
型的に、酸可溶性サブグループを含む濃縮溶液は多数の
よく知られた技術の１種により滅菌される。

【００４６】Ｄ．グルタミン含有サブグループ グルタミンは液体培地で不安定な成分と考えられている
（トリッシュ、ジー・エル、エクスペリメンタル・セル
・リサーチ、第２８巻、第３６０−３６４頁(１９６２
年)、オズターク、エス・エス等、バイオテクノロジカ
ル・プログレス、第６巻、第１２１−１２８頁(１９９
０年)）。溶液中では、グルタミンはカルボン酸および
アンモニアに分解する。本発明による培地濃縮技術の出
現がグルタミンの安定化の製造を提供する。すなわち、
グルタミンを含む細胞培地は他のサブグループに加えて
グルタミン含有サブグループを製造することにより作る
ことができる。

【００４７】本発明によると、グルタミン（ＤおよびＬ
型両方）は、１種またはそれ以上の二価カチオンの添加
により溶液中で安定化することができる。Ｃa^＋２、Ｍg
^＋２、Ｍn^＋２、Ｚ^＋２およびＣu^＋２のような任意の二
価カチオンをグルタミンを安定化するのに使用すること
ができる。ＭgＣl_２、ＣaＣl_２、Ｃa(ＮＯ_３)_２および
ＭgＳＯ_４を含む（しかし、これに限定されるものでは
ない）容易に入手できる多くの塩は、これらの二価カチ
オンを供給することができる。すなわち、任意の適合性
カルシウム塩、マグネシウム塩および／またはマンガン
塩は、このサブグループに含むことができる。上記塩は
ほとんどの任意培地の典型的な成分である。それ故、培
地製剤の二価塩は、グルタミンを安定化させる本サブグ
ループに含ませるべきである。二価カチオンが一般的に
所望の培地の成分ではない場合には、成長するべき細胞
の成長または維持に悪影響しない二価カチオンをグルタ
ミン含有サブグループのグルタミンを安定化するために
加える。

【００４８】しかしながら、本発明のグルタミン含有サ
ブグループに関する唯一の限定は、塩化カリウムのよう
なカリウム塩を本グループに含むことができないことで
ある。ナトリウムおよびマグネシウムイオンがカリウム
イオンの溶解性を減少させる。さらに、Ｃa^２＋がリン
酸イオンと不溶性複合体を形成して溶液からＣa^２＋を
除去するため、リン酸の金属塩は、本グループに置くこ
とができない。

【００４９】特定の培地の必要に応じたグルタミンの量
が、グルタミンを安定化させる二価カチオンの十分な量
と混合される。このサブグループのグルタミンと二価カ
チオンの比率は、好ましくは約２：１（重量／重量）で
あるが、２：１−２.９：１の範囲でもある。上記溶液
のpＨもまたグルタミンを安定化させるのに重要であ
る。好ましいpＨは４.０−６.０の範囲である。グルタ
ミン−二価カチオン溶液の最も好ましいpＨは約５.５で
ある。塩基性pＨはグルタミンの安定性を低下させる傾
向にあり、必要ならば、pＨをグルタミン含有サブグル
ープと適合する酸、例えばＨＣlで調節することができ
る。

【００５０】グルタミンと二価カチオンの比率が約２：
１である場合、グルタミンは安定した可溶性複合体を形
成する。この複合体は、グルタミンのピロリドンカルボ
ン酸およびアンモニアへの分解に有利に働かない。すな
わち、グルタミン金属複合体は安定な可溶性液体型で本
必須栄養物を提供する方法を提供する。

【００５１】グルタミン含有サブグループに含まれる成
分は、グルタミン、カルシウム塩および／またはマグネ
シウム塩を含むことができる。Ｄ−パントテン酸カルシ
ウムおよび塩化ナトリウムもまたグルタミン含有サブグ
ループに含むことができる。

【００５２】明らかなように、本発明により製造される
各培地は、好ましい浸透圧モル濃度範囲を有することが
できる。浸透圧モル濃度は培地の最終pＨのように、各
サブグループの成分の可溶化に使用する酸／塩基の量で
変化する。当業者は、培地処方組成物を製造するのに必
要な各濃縮サブグループの最終pＨおよび体積を考慮に
いれることにより所望の培地の好ましい最終浸透圧モル
濃度を得るのに必要な塩、例えば塩化ナトリウムの量を
容易に決定することができる。上記パラメーター（各サ
ブグループのpＨおよび総塩含量）は、日常的な試験に
より容易に決定することができる。例えば、成分を含む
サブグループのpＨは、よく知られた技術により測定す
ることができる。これらの濃縮サブグループの適当な容
積を混合することにより製造される１倍培地製剤の浸透
圧モル濃度は、培地の最終浸透圧モル濃度を調節するた
めに、もし必要ならば必要な塩化ナトリウムの量を決定
することを当業者に可能にする。塩化ナトリウムのこの
量をグルタミン含有サブグループに加えて、好ましい最
終浸透圧モル濃度を達成することができる。ほとんどの
１倍培地製剤は最終浸透圧モル濃度およびpＨの広範囲
必要条件を有し、それ故サブグループのpＨおよび塩濃
度のわずかな変化は重大ではない。

【００５３】Ｅ．弱酸および塩基可溶性サブグループ 弱酸−弱塩基可溶性サブグループ（本書では弱酸−塩基
可溶性サブグループと記載）の培地成分は、糖、デオキ
シリボース、リボース、ヌクレオチド、水溶性ビタミン
（チアミン、アスコルビン酸およびパントテン酸カルシ
ウムを除く）、リボフラビン、塩、例えば塩化カリウム
および塩化ナトリウム、微量金属、脂質、酢酸塩、リン
酸塩、ＨＥＰＥＳ、フェノールレッド、ピルビン酸塩お
よび緩衝液を含む。

【００５４】弱酸−塩基サブグループのpＨは、約４.０
−９.０の範囲である。二塩基性リン酸ナトリウムおよ
び一塩基性リン酸ナトリウムもまたここで分類すること
ができる。二塩基性および一塩基性リン酸ナトリウムの
組合わせは、本濃縮サブグループの緩衝系を提供する。
本サブグループの溶液のpＨの調節は、水酸化カリウム
ではなく、適当な場合、水酸化ナトリウムまたは塩酸の
添加により作るのが好ましい。

【００５５】本サブグループで見られる成分は、全ての
他のサブグループのように培地成分により決定する。す
なわち、上記成分の任意の組合わせは、弱酸−塩基可溶
性グループに含むことができる。

【００５６】本サブグループに含まれる糖は、培地成分
として使用することができ、上記成分の１種またはそれ
以上を組合わせて適合する任意の糖を含む。上記糖化合
物はグルコース、ガラクトース、マルトース、マンノー
ス等およびそれらの誘導体を含む。

【００５７】本サブグループの糖はまた、脂質が本サブ
グループに含まれる場合、脂質を可溶化するための媒体
として役立つ。脂質は糖または塩分子上に乾燥保存した
後、溶液に可溶化することができる。簡潔に述べると、
脂質をエタノールの少量で可溶化し、その後糖／塩の乾
燥粉末にゆっくり滴下する。混合物は３時間乾燥し、そ
の後ボールミル処理する。糖−脂質または塩−脂質組成
物は、その後弱酸−塩基サブグループの他の成分を含む
濃縮物として製造することができる。

【００５８】リノレイン酸、リポ酸、コレステロール、
カルシフェロール、ビタミンＡ、２−メルカプトエタノ
ール、ツイーン８０、メナジオンおよびビタミンＥを含
む任意の脂質および／または脂肪可溶性成分（しかし、
これに限定されるものではない）は、塩または糖上に乾
燥保存し、こうして本サブグループに含むことができ
る。

【００５９】任意のデオキシリボース、リボースまたは
ヌクレオチドは、本発明による弱酸および塩基可溶性サ
ブグループに含むことができる。これらの化合物および
それらの誘導体はよく知られている。例としてアデノシ
ンおよびアデノシン三リン酸を含む。この場合も、唯一
の限定は、成分が本サブグループで見られる他の成分と
適合しなければならないことである。

【００６０】弱酸−塩基サブグループのビタミンは、チ
アミン、アスコルビン酸およびパントテン酸カルシウム
を除く全ての水溶性ビタミンおよびそれらの誘導体であ
る。弱酸−塩基可溶性グループに含むことができる上記
水溶性ビタミンは葉酸、ビオチン、ピリドキシン、ニコ
チン酸、リボフラビン等を含む。

【００６１】培地処方組成物で使用する微量金属もまた
本サブグループに含まれる。微量金属の例は、ＣuＳＯ
_４、Ｎa_２ＳeＯ_３、ＺnＳＯ_４およびＣoＣl_２を含む。
他の金属の微量もまた本グループに含むことができる。
適当な微量金属の選択および使用する量は、通常の当業
者により容易に決定することができる。

【００６２】塩化カリウム、二塩基性リン酸ナトリウ
ム、酢酸ナトリウム、フェノールレッド、塩化ナトリウ
ム、ＨＥＰＥＳおよびピルビン酸ナトリウムもまた弱酸
−塩基サブグループの適合性成分である。任意の上記化
合物の誘導体もまた、上記誘導体が適合性である限り、
本グループで使用することができる。

【００６３】リボフラビンもまた本グループに置くこと
ができる。リボフラビンは光増感剤であり、ヒスチジ
ン、メチオニン、チロシンおよびトリプトファンとの相
互作用を経て過酸化水素の生成の原因となる主要な栄養
物である（グリフィン、エフ・エム等、カンサー・リサ
ーチ、第９１巻、第２２４１−２２４８頁(１９８１
年)、ワング、アール・ジェイ等、イン・ビトロ、第１
４巻、第７１５−７２２頁(１９７８年)）。アミノ酸か
らリボフラビンを分離することにより、安定な濃縮サブ
グループをもたらす。

【００６４】リボフラビンを含む液体培地サブグループ
に安定性を加える成分はピルビン酸塩である。ピルビン
酸塩は、過酸化水素と相互作用して酢酸、二酸化炭素お
よび水を生成する（ウエイル、エル、ゴードン、ダブリ
ュー・ジーおよびブチャート、エイ・アール、アーカイ
ブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィ
ジックス、第３３巻、第９０−１０９頁(１９５１
年)）。過酸化水素は培養細胞、細胞膜蛋白質、脂質お
よび酵素に有害であるため、その増強を制御することが
特定の培地において重大である。すなわち、所望の培地
がピルビン酸塩を必要ではない場合でも、ピルビン酸塩
の添加は弱酸−塩基可溶性サブグループの安定性および
本サブグループから製造した培地の貯蔵寿命を増加する
のに役立つ。

【００６５】Ｆ．アルコール可溶性サブグループ コレステロール、ステロイド、ツイーン８０、脂溶性ビ
タミンまたは他の疎水性成分を含む培地製剤は、アルコ
ール可溶性グループに濃縮することができる。アルコー
ル可溶性グループに含むことができる他の疎水性化合物
は当業者によく知られている。

【００６６】これらの成分の任意の組合わせは、エタノ
ールまたはプロピレングリコールの少量で可溶化するこ
とができる。いったん可溶化すると、これらの成分はそ
の後、よく知られた技術により微小流動物化し、小さい
脂質ベシクルを形成する（リゲイト等、バイオ・ファー
ム、第２巻（９）、第２８−３３頁(１９８９年)）。簡
潔には、微小流動機（モデル１１０微小流動機）がせん
断、乱流、およびキャビテイション力を組合わせること
により乳剤を製造する。微小流動機を経る各回路は、乳
化剤の平均小滴径を減少して非常に安定である半微量粒
子を最後に製造する。水溶性成分はまた、これらのベシ
クル内に捕獲して、その後培地に送達することができ
る。

【００６７】ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫを含む脂溶性
ビタミンおよびそれらの誘導体もまた、本サブグループ
に含むことができる。コルチゾール、プロゲステロン、
エストロゲン、テストステロン等を含むステロイドおよ
びそれらの誘導体もまたアルコール可溶性サブグループ
に含むことができる。

【００６８】培地処方組成物の脂肪酸および脂質は、本
サブグループに分割することができる。リノレイン酸、
オレイン酸、アラキドン酸等のような任意の脂肪酸は、
この分類に分けられる。もちろん、任意の脂質もまた含
むことができる。脂質の例は、レシチン、スフィンゴミ
エリンおよびリン脂質である。脂質（油）は、微小流動
物化が脂質ベシクルを製造するのに脂質（油）を必要と
するため、通常本発明のサブグループの必要な成分であ
る。培地製剤が脂質を必要とするが、本発明の疎水性成
分ではない場合には、上記脂質は弱酸−塩基可溶性グル
ープに含むことができるため、アルコール可溶性サブグ
ループを製造することは必要ではない。弱酸−塩基可溶
性サブグループでは、脂質は糖および／または塩上で乾
燥保存する。

【００６９】本発明のアルコール可溶性グループに含ま
れ得る他の培地成分は、ツイン８０および２−メルカプ
トエタノールを含み得る。

【００７０】Ｇ．アルカリ−可溶性サブグループ 溶解するためにアルカリ環境（pＨ＝９.０）を必要とす
る培地成分のために、アルカリ可溶性サブグループが用
いられる。このサブグループはアルカリpＨにおいて安
定で可溶性のピリミジン類およびプリン類を含む。これ
らの成分は、ＮaＯＨに溶解したとき、水性環境に可溶
性のナトリウム塩を形成する。

【００７１】アルカリサブグループとして適合するピリ
ミジン類およびその誘導体は、ウラシルおよびチミンを
含む。キサンチンおよびヒポキサンチンもまた本発明の
アルカリ可溶性サブグループに含まれ得るプリン類の例
である。アルカリ環境中で安定で可溶性の他の成分は、
当分野の技術者に既知であるかまたは容易に決定し得
る。

【００７２】Ｈ．補足物含有サブグループ 前述のように、一般的な培地組成はアミノ酸類、塩類、
ビタミン類、微量金属類、糖類、脂質類および核酸類を
含む。しかしながら、培地はしばしば蛋白、抗生物質ま
たは組成が確定しないブロス／血清により補われる。こ
のような補足物が特定の培地にとって必要な場合、補足
物は直接（例えば血清）使用し得、または濃縮物（イン
シュリン、トランスフェリンおよび成長因子のような蛋
白溶液）にすることができる。補足物含有サブグループ
は、次に、目的とする培地組成物を製造するために、他
の濃縮物サブグループを組み合わせ得る。

【００７３】最終培地組成物に含まれるが、前述のサブ
グループの１つの適合成分としては分類されていない種
々の成分を、１個あるいはそれ以上の個別の補足物とし
て加え得る。したがって、本発明は、上記のサブグルー
プと適合しない１個またはそれ以上の補足物含有サブグ
ループの製造も目的とする。この補足物サブグループに
含まれるこのような成分は、血清（胎児、馬、牛等）、
イーストレイト限外濾液、トリプトースリン酸ブロス、
蛋白濃縮物（インシュリン、トランスフェリン、成長因
子類、ホルモン類、アルブミン等）、抗生物質（ゲンタ
マイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォ
テリシンＢ等）、全卵限外濾過物、結合因子（フィブロ
ネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、ラミニン等）
およびＮaＨＣＯ_３液体濃縮物（例えば、２５×）を含
む。最終培地製剤に応じて、通常の当分野の技術者は、
適合する補足物を適当に選択し得る。

【００７４】Ｉ．キット 本発明の適合成分であるサブグループは、キットの製造
に理想的に適合する。このようなキットは、１個または
それ以上のバイアル、試験管、びん、ドラムカンの様な
容器手段を近接区域に収容する区画形成となる運搬手段
としてを含み得る。それぞれの上記容器手段は上記の適
合成分の個々のサブグループの１つを含む。このような
サブグループは、水和物または脱水物が可能であるが、
一般的には濃縮液体溶液である。このような溶液は、本
発明によると無菌であり得る。

【００７５】第１の容器手段は、例えば酸可溶性サブグ
ループとして適合される培地成分の任意の組み合わせを
含み得る。弱酸塩基可溶性グループに含まれる適合成分
またはそれの任意の組み合わせを第２の容器手段に含ま
れ得る。第３および第４の容器手段は、それぞれアルカ
リ可溶性サブグループおよびアルコール可溶性サブグル
ープに含まれる成分の任意の組み合わせを含み得る。第
５の容器手段は、二価カチオンがグルタミンの安定化の
ために含まれる限りグルタミン含有サブグループを含み
得る。第６の容器手段は、補足物含有サブグループに挙
げた成分を含み得る。本発明で定義したサブグループで
適合しない他の成分は、１個またはそれ以上の別の容器
手段に含ませて適合しない成分の混合を回避し得る。

【００７６】細胞培養培地を作るためのキットを含む容
器手段を含むサブグループの数および型は、製造される
べき培地の型に応じて変化し得る。一般的には、キット
は特定の培地を製造するのに必要なサブグループを含む
各容器手段を含む。しかしながら、異なった培地組成物
を作るための種々のサブグループの異なった量を混合す
ることにより、異なった培地を製造できるようにするた
めに付加的なサブグループを含む容器手段が本発明のキ
ットに含まれ得る。

【００７７】Ｊ．培養培地を製造するための濃縮サブグ
ループの混合 本発明の培地濃縮物技術は、これらの成分を上記に定義
したサブグループに分けることにより、１個またはそれ
以上の適合成分の濃縮溶液を製造する手段を提供する。
濃縮溶液として製造された(１×以上)これらのサブグル
ープは、目的とする培養培地を製造するために希釈剤と
組み合わせ得る。必要な濃縮溶液の量および希釈剤の量
は、各々のサブグループの濃度、サブグループの数およ
び最終培地製剤の濃度に応じて変化し得る。通常の当分
野の技術者は、目的とする培地を製造するに充分な希釈
剤の量および充分な濃縮溶液の量を容易に決定できる。

【００７８】得られた培養培地のpＨは、酸または塩基
の添加により調整可能である。しかしながら、この培地
は、特にもし各々のサブグループ濃縮物のpＨを、製造
された培地のpＨが望む範囲内であるように調整してい
れば調整を必要としない。一般的に、望ましい浸透圧は
計算することができ、望む浸透圧の最終倍地を製造する
ために濃縮溶液の塩の濃度の調整を行うことができる。

【００７９】Ｋ．用途 本発明は、培養培地を製造するために、容易に十分な量
の希釈剤と混合できる濃縮物を提供する。これらの濃縮
サブグループの混合はバッチまたは連続法で行うことが
できる。バッチシステムでは、一定量の培地を製造する
ために、サブグループ濃縮物の適当量を希釈剤と混合で
きる。連続システムでは、各々のサブグループ濃縮物の
充分量を連続的に充分量の希釈剤と混合チャンバー中で
混合し、一方培養培地は断続的に取出される。連続シス
テムの明らかな利点は、１個の反応装置（混合チャンバ
ー）が、多数の培養容器または発酵タンク用の培地を製
造するために使用できることである。加えて、この方法
での培地の連続製造は、閉鎖無菌システムで遂行でき
る。

【００８０】本発明にしたがって、いかなる培地および
いかなる量でも適当な培地濃縮物が製造できる。従っ
て、このような濃縮物を商業的に製造し、供給し、また
は研究室内研究で作り、使用することができる。製造し
た濃縮物を得た消費者は、経済的により有効な方法で培
地を製造できる。例えば、混合タンクの寿命は、ある種
の腐食性乾燥粉末が培地製造に必要でないため、増加す
る。また、目的とする培地の製造に必要な人数を少なく
できる。

【００８１】以上に、本発明を十分述べてあるが、説明
のみを目的とし、明示しない限り本発明を限定しない目
的で本明細書に包含されている実施例により、さらに明
確に理解できるであろう。

【００８２】

【実施例】実施例I 二価カチオンによるグルタミンの安定化 Ｌ−グルタミンをpＨ５.５で、種々の量の硝酸カルシウ
ムおよび硫酸マグネシウムと溶液中で混合した。図１は
Ｌ−グルタミンと二価カチオンの割合が２.５：１より
著しく上のとき、有意にグルタミンの安定性が減少する
ことを示す。Ｌ−グルタミンは、Ｏ−フタルジアルデヒ
ドでプレカラム誘導体化により分析し、次に高速液体ク
ロマトグラフィーを用いて検出した（ラジェンドラ・ダ
ブリュー、ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラ
フィー、１０巻(５号)９４１−９５５頁(１９８７
年)）。

【００８３】グルタミンと二価カチオンの比が２.５：
１のとき、グルタミンは２４週間安定のままである。グ
ルタミンを含む細胞培養培地はまた二価カチオンも含む
が、培養培地中に存在する他のアミノ酸と二価カチオン
の相互関係により、グルタミンは１×培地製剤では安定
ではなく、４℃でゆっくり減少し、３週間後には６５−
７０％が残っているだけである。（シグマ・セル・カル
チャー・リージェンツ・カタログ(１９９１年)２０２
頁）。

【００８４】実施例II ＲＰＭＩ−１６４０培地の製造 ＲＰＭＩ−１６４０培地は培養において一般的に哺乳類
細胞成育に使用されている培地である。この培地のpHは
約７で、浸透圧は２６５から３００の範囲が可能であ
る。

【００８５】ＲＰＭＩ−１６４０はＬ−グルタミンを含
むアミノ酸、種々の塩類、ビタミン類、糖等を含む。こ
の培地に検出される成分はギブコ／ビーアールエル・カ
タログ・アンド・リファレンス・ガイド１１８頁、１９
９０年に記載されている。

【００８６】ＲＰＭＩ−１６４０培地の成分を種々の適
合サブグループに分割した。一度乾燥適合成分粉末を混
合し、各々のサブグループの濃縮溶液を製造した。各々
の製造濃縮サブグループの適当量を、次に１×ＲＰＭＩ
−１６４０培地製剤の製造に使用した。

【００８７】表１は酸可溶性サブグループに分割される
ＲＰＭＩ−１６４０培地の成分を示す。この濃度は１×
製剤１リットル溶液に対応する。酸可溶性サブグループ
の１００×処方組成物を製造するために、表１に示した
各々の成分を酸可溶性成分の乾燥粉末混合物(ＤＰＭ)を
製造するために配合した。例えば、０.２ｇのＬ−アル
ギニン、０.０５ｇのＬ−アスパラギン、０.０２ｇのＬ
−アスパラギン酸等は総量０.６９ｇの乾燥粉末混合物
を製造するために添加した。

【表１】

【００８８】表２に示すように、酸可溶性適合成分を
８.８mlの水に混合し、次に最終pＨが０.８５になるよ
うにＨＣlを加えた。５Ｎ ＨＣl約１.２mlを必要とし
た。得られた溶液はＲＰＭＩ−１６４０培地のための酸
可溶性サブグループの１００×製剤である。

【００８９】１６４０培地組成に基づいて、２つの付加
サブグループを製造した：グルタミン含有サブグループ
および弱酸塩基可溶性サブグループである。表３はＲＰ
ＭＩ−１６４０培地のためのグルタミン含有サブグルー
プの乾燥粉末混合物を作るために付加された成分を示
す。最終pＨ約５.５の２０mlの５０×濃縮物を製造する
ために総量６.４ｇの成分の混合物を約１７.５mlの水に
混合した。

【００９０】表４は３.２５ｇの弱酸塩基可溶性成分の
ための乾燥粉末混合物(ＤＰＭ)を作るのに必要な成分の
量を示す。pＨ約８.３の２０mlの溶液を製造するために
約１９.５mlの水を弱酸塩基成分に添加した。このサブ
グループのすべての成分は水可溶性であり、それゆえ塩
または糖による粉末化作用は必要ではない。

【００９１】上記酸可溶性サブグループ、グルタミン含
有サブグループおよび弱酸塩基可溶性サブグループの再
構成は、１×ＲＰＭＩ−１６４０培地処方組成物を製造
するために表２に示すように遂行した。ＮaＨＣＯ_３は
別の補足物として添加した。この培地の浸透圧は濾過滅
菌の前は２７６ｍＯｍであった。別法として、ＮaＨＣ
Ｏ_３の乾燥粉末再構成培地に添加するのではなく、Ｎa
ＨＣＯ_３の濃縮溶液を使用できる。

【表２】ＲＰＭＩ−１６４０サブグループの製造法 １．弱酸塩基可溶性サブグループ(５０×濃縮) １リットル作るのに充分な量 １９.５ml 水３.２５ｇ ＤＰＭ ２０.０ml 全量 最終pＨ＝８.２８ 特別な注意：ＤＰＭは成分の凝固を避けるためにゆっく
り水に添加する。溶解するまで適度にかきまぜる(約１
５−２０分)。 ２．酸可溶性成分(１００×濃縮) １リットル作るのに充分な量 ８.８ml 水 ０.６９ｇ ＤＰＭ１.２０ml ５Ｎ ＨＣl １０.０ml 全量 最終pＨ＝０.８５ 特別な注意：５Ｎ ＨＣlをゆっくりかきまぜている溶液
に添加する。 ３．グルタミン含有サブグループ(５０×濃縮) １リットル作るのに充分な量 １７.５ml 水６.４ｇ ＤＰＭ ２０.０ml 全量 最終pＨ＝５.５０ 特別な注意：これは吸熱反応である。溶液の温度は成分
の添加で約３℃下がるであろう。適度なかきまぜを10−
15分または全ての成分が溶解するまで行う。 １×ＲＰＭＩ−１６４０培地組成物の製造方法： １．下記の量のサブグループ濃縮物を水に添加する： Ａ．９５０ml 水 pＨ ５.９８ Ｂ． ２０ml グルタミン含有サブグループ pＨ ５.６１ Ｃ． ２０ml 弱酸塩基可溶性サブグループ pＨ ８.２０ Ｄ． １０ml 酸可溶性サブグループ pＨ ４.９１ Ｅ． ２.０ｇ ＮaＨＣＯ_３ pＨ ７.００ 濾過前の浸透圧：２７６ mOSm

【表３】

【表４】

【００９２】実施例III 連続供給混合チャンバーを使用したＲＰＭＩ−１６４０
培地濃縮サブグループの再構成 再構成実験は１５lのバイオスピンバイオリアクターを
用いてＲＰＭＩ−１６４０培地濃縮サブグループを使用
して行った。サブグループ当たり５０×の培地サブグル
ープ３種および２５×ＮaＨＣＯ_３サブグループ２つを
断続的にバイオリアクターに２５０ml／時間の速度で注
入した。脱イオン化蒸留水を１２.５l／時間の速度でリ
アクターに注入した。灌流濃縮物は、断続的に混合チャ
ンバーに添加した。完全な１×培地組成物がバイオスピ
ンバイオリアクターから１時間当たり１２.５lの速度で
取出された。培地のpHは内部的または外部的の両方で追
跡した。培地パラメーター(pＨ、浸透圧、アミノ酸類、
グルコース、グルタミン)は灌流中連続して測定した。
実験の結果は、ＲＰＭＩ−１６４０濃縮サブグループが
バイオスピンバイオリアクター中で再構成され、得られ
た１×培地処方組成物パラメーターはＲＰＭＩ−１６４
０処方組成物と有意な相関性を示すことを示唆する(図
２、３および表５)。

【表５】

【００９３】実施例IV ＤＭＥＭ培地の製造 ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ修飾イーグル培地(ギブコ／
ビーアルエル・カタログ・アンド・リファレンス・ガイ
ド９６頁、１９９０年、ダルベッコ・アールら、ビロロ
ジー、８巻３９６頁(１９５９年)；およびスミス・ジェ
ー・ディーら、ビロロジー、１２巻、１８５頁(１９６
０年)をこの培地の成分を酸可溶性サブグループ、グル
タミン含有サブグループおよび弱酸塩基可溶性サブグル
ープに分割することにより製造した。ＤＭＥＭ培地の成
分は表６、７、８および９に示した濃縮サブグループと
して分割し製造した。実施例IIに記載したのと同様の方
法を使用した。

【００９４】表９はまたＤＭＥＭ１×処方組成物を作る
ためのＤＭＥＭサブグループの混合および希釈に使用し
た方法を示す。ＮaＯＨは最終pＨを７.３に調整するた
めに添加した。ＮaＨＣＯ_３は緩衝剤として添加した。

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】 ＤＭＥＭサブグループの製造法 １． 高グルコースＤＭＥＭ グルタミン含有サブグループ １８.１ml Ｈ_２Ｏ ６.３ｇ ＤＰＭ ２０.０ml 総量 pＨ５.５０ ５０×濃縮 ２． 高グルコースＤＭＥＭ 弱酸塩基可溶性含有サブグループ １７.０ml Ｈ_２Ｏ ５.４ｇ ＤＰＭ ０.７ml ０.１Ｎ ＮaＯＨ ２０.０ml 総量 pＨ６.６０ ５０×濃縮 ３． 高グルコースＤＭＥＭ 酸可溶性含有サブグループ １８.５ml Ｈ_２Ｏ １.１ｇ ＤＰＭ １.５ml ５Ｎ ＨＣl ２０.０ml 総量 pＨ０.８０ ５０×濃縮 １×ＤＭＥＭ培地組成の製造法 ９００.０ml Ｈ_２Ｏ ２０.０ml グルタミン含有サブグループ ２０.０ml 弱酸塩基サブグループ ２０.０ml 酸可溶性サブグループ ３.７ｇ ＮaＨＣＯ_３ ＡＤＤ pＨを７.３０にするための５Ｎ ＮaＯＨ ＡＤＤ 量を１０００.０mlにするためのＨ_２Ｏ １０００.０ml 総量 pＨ７.３０ １×製剤

【００９５】浸透圧は３１５−３４０mOsm。浸透性は各
々のサブグループの成分の溶解性のために使用する酸／
塩基の量により変わるであろう。もし浸透圧が上記の望
む限界より高いとき、ＮaＣl濃度の調整が振盪圧を下げ
得るであろう。

【００９６】実施例V ハム１２培地の製造 ハムＦ−１２培地(ハム・アール・ジー、プロシーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス、５３巻２８８頁(１９６５年))は培地を酸可溶性
サブグループ、グルタミン含有サブグループおよび弱酸
／塩基サブグループに分割することにより製造される。
それぞれのサブグループの成分は、表１０、１１および
１２に述べる。実施例IIに述べてあるのと同様の方法を
用いて培地濃縮物を製造し得る。

【表１０】

【表１１】ハムＦ−１２培地のためのグルタミン含有サ
ブグループ

【表１２】

【００９７】実施例VI ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地の製造 ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地(ギブコ／ビーアルーエル・カ
タログ・アンド・リファレンス・ガイド、９７頁(１９
９０年))は、この培地の成分を、酸可溶性サブグルー
プ、グルタミン含有サブグループ、および弱酸／塩基サ
ブグループに分割することにより製造する。それぞれの
サブグループの組成は、表１３、１４および１５にのべ
る。実施例IIに記載のと同様の方法を培地濃縮物製造に
用い得る。

【表１３】

【表１４】

【表１５】ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地のためのグルタミン
含有サブグループ

【００９８】実施例VII ＩＭＤＭ培地の製造 ＩＭＤＭ培地(ダルベッコ・アールおよびフリーマン・
ジー、ビロロジー、８巻３９６頁(１９５９年)；スミス
・ジェー・ディーら、ビロロジー、１２巻１８５頁(１
９６０)；ティッシュー・カルチャー・スタンダーズ・
コミッティー、イン・ビトロ、６巻２９３頁；イン・ビ
トロ、９巻６頁(１９７０年)；イスコーブ・エヌ・エヌ
およびメルチャーズ・エフ、ジャーナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メディスン、１４７巻９２３頁)は、培
地を酸可溶性サブグループ、グルタミン含有サブグルー
プおよび酸／塩基サブグループに分割することにより製
造する。それぞれのサブグループの成分は、表１６、１
７および１８に述べる。実施例IIに述べたのと同様の方
法で培地濃縮物を製造し得る。

【表１６】

【表１７】

【表１８】ＩＭＤＭ培地のためのグルタミン含有サブグ
ループ

【００９９】培地および発酵技術および／または関連分
野の人に明白な本発明を実施するための上記の例の修飾
は、以下の請求の範囲の中に含まれる。

【０１００】本明細書中の全ての刊行物および特許出願
は、本発明に適合する分野の技術者の技術レベルを表示
している。全ての刊行物および特許出願は、あたかも各
々個々の刊行物または特許出願の内容が具体的かつ個々
に引用して包含されるべく示されていると同様に本明細
書に包含される。

【０１０１】しかしながら、上記の発明は、明白な理解
のための説明および例としていくつかの態様を述べた
が、ある種の変化および修飾が添付の請求の範囲内で行
われるであろうということは明白である。

【０１０２】

【発明の効果】本発明は劇的に費用が少ない培地の製造
法を提供する。本発明の培地濃縮物は、サブグループ化
した成分がより安定であるため、バッチ間で一定してい
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 第１図は、溶液中のＬ−グルタミン安定化を
示す。Ｌ−グルタミンと二価カチオンの様々な比率を試
験し、Ｌ−グルタミンの安定性を決定した。

【図２】 第２図は、濃縮したサブグループの十分量と
水の十分量との連続した混合により、１倍培地組成物と
したＲＰＭＩ−１６４０培地のモニターした経時的pＨ
および浸透圧モル濃度を示す。

【図３】 第３図は、Ｌ−グルタミンおよびグルコース
のモニターした経時レベルを示す。試料は、濃縮したサ
ブグループと水との連続混合の間に混合室から取られ
た。

【図４】 第４図は、濃縮したサブグループを含む大き
い容器からなるキットを示す。濃縮したサブグループは
混合および希釈することができ、培地総量10,000リット
ルを得る。

フロントページの続き (72)発明者 デイビッド・ダブリュ・ジェイム アメリカ合衆国14072 ニューヨーク、グ ランド・アイランド、カーター・クリー ク・ドライブ907番 Ｆターム(参考） 4B065 AA90X BB02 BB12

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 グルタミンおよびグルタミンを安定化さ
   せるに有効な量の２価カチオンを含む組成物。
2. 【請求項２】 グルタミンおよび２価カチオンが溶液中
   にある、請求項１記載の組成物。
3. 【請求項３】 グルタミンと２価カチオンの比が約２：
   １である、請求項１または２記載の組成物。
4. 【請求項４】 ２価カチオンがカルシウム塩、マグネシ
   ウム塩またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜３
   のいずれか記載の組成物。
5. 【請求項５】 溶液が無菌である、請求項２記載の組成
   物。
6. 【請求項６】 グルタミンの溶液を１つまたはそれ以上
   の２価カチオンと混合することを特徴とする、溶液中に
   おけるグルタミンの安定化方法。
7. 【請求項７】 ２価カチオンがカルシウムおよびマグネ
   シウムから成る群より選ばれたものである、請求項６記
   載の方法。
8. 【請求項８】 ２価カチオンが塩の一部として供給され
   る、請求項６または７記載の方法。
9. 【請求項９】 塩がＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、Ｃａ（Ｎ
   Ｏ_３）_２またはＭｇＳＯ_４である、請求項８記載の方
   法。
10. 【請求項１０】 グルタミンと２価カチオンの比が２：
    １〜２．９：１の範囲にある、請求項６〜９のいずれか
    記載の方法。