PT105484A

PT105484A - Um método de ambientómica funcional para engenharia de meio de cultura celular

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Publication number: PT105484A
Application number: PT105484A
Authority: PT
Inventors: Rui Manuel Freitas Oliveira; Joao Miguel Lopes Dias; Ana Raquel Santos Ferreira
Original assignee: Univ Nova De Lisboa
Priority date: 2011-01-14
Filing date: 2011-01-14
Publication date: 2012-07-16
Also published as: US20140017706A1; BR112013018075A2; EP2663632A1; CA2824734A1; WO2012095819A1; JP2014503220A; CN103459584A; WO2012095819A4

Abstract

ESTA INVENÇÃO REFERE-SE A UM NOVO MÉTODO PARA A OPTIMIZAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DE UM MEIO PARA A CULTURA DE CÉLULAS. ESTE NOVO MÉTODO COMPREENDE DUAS FASES PRINCIPAIS. NA PRIMEIRA FASE, CONSTRÓI-SE UM MAPA DE AMBIENTÓMICA FUNCIONAL ATRAVÉS DO RASTREIO CONJUNTO DE FUNÇÕES CELULARES E DE FACTORES DO MEIO ATRAVÉS DA REALIZAÇÃO DE UM PROTOCOLO DE CULTURA CELULAR ESPECÍFICO E DE UM PROTOCOLO DE TESTES DE EXOMETABOLOMA. O MAPA DE AMBIENTÓMICA FUNCIONAL CONSISTE NUMA MATRIZ DE DADOS DE VALORES DE INTENSIDADE DE FUNÇÕES CELULARES ELEMENTARES EM RELAÇÃO A FACTORES DO MEIO. NA SEGUNDA FASE, SÃO DESENVOLVIDAS FORMULAÇÕES OPTIMIZADAS DO MEIO DE CULTURA CELULAR PARA OU AUMENTAR OU INIBIR FUNÇÕES CELULARES ELEMENTARES ALVO A PARTIR DE COLUNAS DO MAPA DE AMBIENTÓMICA FUNCIONAL. A PRINCIPAL VANTAGEM DESTE MÉTODO É A DE PERMITIR ENGENHARIA METABÓLICA ATRAVÉS DA MANIPULAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA, EM QUE SE OPTIMIZA UM NÚMERO ARBITRARIAMENTE ELEVADO DE FUNÇÕES CELULARES ATRAVÉS DA MANIPULAÇÃO DE FACTORES DO MEIO, EM CONTRASTE COM MÉTODOS ANTERIORES, OS QUAIS SÃO EMINENTEMENTE EMPÍRICOS, NÃO SÃO ORIENTADOS PARA AS FUNÇÕES CELULARES, E NECESSITAM DE UM NÚMERO DE EXPERIÊNCIAS MUITO SUPERIOR. ALÉM DISSO, ESTE NOVO MÉTODO BASEIA-SE EM TESTES DE EXOMETABOLOMA E NÃO NECESSITA DE TESTES GENÓMICOS OU PROTEÓMICOS INTRACELULARES ONEROSOS.

Description

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Em termos de factores do meio, é aqui considerado que a formulação do meio de cultura é definida pelos valores de N factores do meio:

Formulação do meio de cultura = {FACj}, j = l,...,N, sendo FACj o valor do factor do meio j. Os referidos factores do meio podem ser propriedades fisico-quimicas (por exemplo, osmolalidade ou força iónica), concentração ou velocidade de libertação de espécies moleculares conhecidas ou não conhecidas, ou concentração ou velocidade de libertação de misturas com composição conhecida ou desconhecida.

Tal como para as funções celulares elementares, é aqui considerado que a referida estrutura biológica alvo pode ser descrita por K funções celulares elementares:

Estrutura biológica alvo = {ei}, i = l,...,K,

Podem ser obtidas através da aplicação de algoritmos bioinformáticos disponíveis no domínio público [17], tais como análise de modos elementares de fluxo ou análise de vias extremas, à rede bioquímica da estrutura biológica alvo. 0 Exemplo 1 ilustra como as funções celulares elementares são obtidas para a estripes Pichia pastoris X33 .

Uma vez conhecida a estrutura geral, é aplicado um método compreendendo quatro passos, tal como se segue (ver Figura 2) .

Passo 1 - Conjunto de culturas celulares 7 invenção é esquematizado na Figura 1. Enquanto o genoma das células-alvo define a sua gama de modos elementares de fluxo, é o ambiente das células, ou seja, são os factores do meio que determinam a intensidade relativa dos modos elementares de fluxo para suportar o fenótipo da célula. Assim, o objectivo do método é numa primeira fase identificar como os factores do meio controlam a intensidade relativa dos modos elementares de fluxo, ou seja, a análise ambientómica funcional. Isto é conseguido através da execução de um protocolo experimental, em que se realiza um conjunto de experiências de cultura celular, em que se introduzem perturbações à linha de base dos factores do meio e em que se adquire e analisam dados de resposta exometabolómicos. Os dados assim adquiridos são processados na forma de um mapa de ambientómica funcional de funções celulares elementares em relação a factores do meio. Numa segunda fase, a partir do mapa de ambientómica funcional, desenvolvem-se formulações de meio optimizadas que ou intensificam ou reprimem funções celulares elementares alvo de modo a implementar um fenótipo desejado.

Tal método apresenta vários benefícios em relação aos métodos correntemente utilizados: - Permite modificar o metabolismo das células através do ajuste simultâneo de vários objectivos metabólicos. É menos empírico e assim pode ser mais facilmente generalizado ou extrapolado para diferentes espécies de células que partilham um dado grupo de genes, Uma vez que a função dos genes tende a ser conservada entre diferentes espécies também a função de variáveis ambientais tende a ser conservada entre diferentes espécies. 19 são classificadas de acordo com a sua correlação ou sensibilidade em relação aos valores dos factores do meio.

Noutra implementação preferível, o mapa de ambientómica funcional é determinado através de um sistema de elevado débito automatizado, em que se interligam dispositivos de cultura, dispositivos de análise do exometaboloma e algoritmos computacionais num dispositivo físico para produzir mapas de ambientómica funcional com elevado débito.

Com o método da presente invenção, os modos elementares de fluxos do produto aumentam entre 60 e 100%.

Outro aspecto da presente invenção é a utilização do método descrito acima para a optimização da composição de meios de cultura celular de linhas celulares de Plantae ou Animali ou outros organismos eucarióticos unicelulares ou pluricelulares, tais como Leveduras e Fungos, preferentemente para a optimização da composição de meio de cultura celular de organismos procarióticos e para a optimização da composição de meio de cultura celular de células estaminais.

Outros aspectos da presente invenção são identificadores de biomarcadores e sistemas de desenho de fármacos compreendendo o método descrito acima.

Na área de identificadores de biomarcadores, o processo de ambientómica funcional aqui descrito permite mapear moléculas do meio extracelular a funções intracelulares. Algumas dessas moléculas são moléculas secretadas ou 10

Passo 1.1 - Executar pelo menos N+l (número de factores do meio mais uma) experiências de culturas celulares com variação da composição do meio de cultura utilizando balões agitados, "T-flasks" ou reactores, mas preferentemente utilizando um equipamento de cultura de elevado débito tais como microplacas. A composição do meio rastreada em cada experiência é definida de modo a gerar dados experimentais adequados para a realização da regressão linear da intensidade da função celular elementar contra valores de factores do meio. O Exemplo 2 ilustra este procedimento para o caso de 11 factores do meio utilizando o método de desenho D-óptimo para identificação de função linear, em que são definidas 24 experiências independentes, que consistem em combinações a dois níveis de valores de factores do meio. Além disso, tais formulações do meio podem incluir substratos marcados, tais como substratos-C13 para fins analíticos, nomeadamente para facilitar o rastreio de funções celulares elementares.

Passo 1.2 - Adquirir dados iniciais e finais do exometaboloma para cada cultura celular realizada utilizando preferentemente técnicas analíticas rápidas e de elevado débito tais como 1H-RMN, 13C-RMN ou outra técnica de RMN, ou cromatografia acoplada a espectrometria de massa tais como GC-MS ou LC-MS ou técnicas de espectrometria de massa isoladamente. Esta análise pode ser complementada com métodos analíticos de metabolitos específicos mais tradicionais tais como kits enzimáticos ou cromatografia líquida de elevada eficiência (HPLC).

Passo 1.3 - Realizar um rastreio preliminar de funções celulares activas por regressão linear de valores de intensidades de funções celulares elementares em relação a - 0 desenho do método é assim baseado em conhecimento, o qual pode ser aumentado ao longo do tempo sem ser necessário repetir condições exploradas anteriormente. - Uma vez construída uma base de conhecimento suficiente, os desenhos de meios requerem um número de experiências muito menor. Teoricamente, se a base de conhecimento for suficientemente precisa, é necessário um único passo de desenho para optimizar o metabolismo das células alvo. Tal como apresentado nos exemplos 4 e 5, um único passo de desenho pode resultar em melhorias na gama de 60%-100% em produtividade.

Descrição Detalhada da Invenção

Aqui de seguida, descreve-se em detalhe o melhor modo de levar a cabo a presente invenção.

Uma característica distintiva do método da presente invenção é que os factores do meio e as funções celulares elementares são submetidas a um rastreio conjunto através de um protocolo experimental particular para extrair dados, os quais são então processados na forma de um mapa de

Ambientómica Funcional. Antes de se executar o protocolo experimental, é obrigatório definir com clareza a estrutura biológica para a qual o meio será desenhado, aqui referida como "estrutura biológica alvo". Pode ser uma célula inteira, um organelo, ou um conjunto coerente de reacções metabólicas que representam uma dada função celular. A referida estrutura biológica alvo é representada por q reacções metabólicas e os respectivos genes e proteínas caso sejam conhecidos. Uma vez claramente definida esta estrutura, são então estabelecidos o conjunto subjacente de trabalho de N factores do meio e K funções celulares elementares. 29

Exp, 1 1 1 -1 -1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 Exp, 2 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 Exp, 3 1 -1 1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 Exp, 4 1 1 -1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 Exp, 5 1 1 1 1 1 -1 -1 -1 1 1 1 Exp, 6 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 1 -1 -1 Exp, 7 -1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Exp, 8 1 1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 Exp, 9 1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 1 1 -1 Exp, 10 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 -1 1 -1 -1 Exp, 11 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 -1 1 Exp, 12 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 1 -1 1 Exp, 13 -1 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 Exp, 14 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 1 -1 1 Exp, 15 1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 Exp, 16 1 1 1 -1 1 -1 -1 1 -1 -1 -1 Exp, 17 1 -1 1 -1 -1 1 -1 -1 1 -1 1 Exp, 18 -1 1 1 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 Exp, 19 -1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 Exp, 20 -1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 1 -1 Exp, 21 -1 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 1 1 Exp, 22 -1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 1 -1 Exp, 23 1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 Exp, 24 Exp, 251 Exp, 261 1 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 (1) experiências controlo 11 valores de factores do meio. Estes valores de intensidade são obtidos a partir dos dados inicial e final de exometaboloma. Primeiro calcula-se a velocidade de alteração da quantidade de metabolito por unidade de massa celular ou por unidade de número de células, v, depois, para todas as funções celulares elementares K, determinar o valor máximo potencial de intensidade ei através da aplicação da seguinte fórmula: λι = v e±, i=l,.„, K (2)

Depois, realizar a regressão linear de λ± em relação aos valores dos factores do meio e classificar as funções celulares elementares de acordo com a correlação mais elevada com factores do meio ou com a variância máxima capturada de v.

Passo 1.4 - Executar pelo menos K+l experiências de cultura celular com alteração da composição do meio de cultura de um modo similar ao passo 1.1. Mas a estratégia é agora fazer o rastreio de combinações de valores baixos e elevados de intensidade de função celular elementar. Idealmente, deverão ser realizadas 2ΛΚ experiências para fazer o rastreio de todas as combinações possíveis. Na prática, nem todas as funções celulares elementares podem ser rastreadas uma vez que o seu número aumenta facilmente até uma ordem de grandeza de milhões. No entanto, no passo 1.3 anterior, é obtida uma pré-selecção das funções celulares elementares com maior contribuição para o fenótipo celular, o que raramente excede 20.

Passo 2 - Mapa de Ambientómica Funcional

Para a totalidade das experiências realizadas no passo 1, determinar um subconjunto de funções celulares elementares 20 excretadas pelas próprias células para o meio. Quando existir uma ligação especifica entre molécula excretada/secretada e determinada função biológica, essa molécula poderá constituir um marcador da dita função. Assim a presente tecnologia permite identificar biomarcadores de funções celulares.

Na área de sistemas de desenho de fármacos, sendo um fármaco um composto que é adicionado ao meio extracelular e assim, do ponto de vista da tecnologia de ambientómica funcional, é como se tratasse de um factor de meio. Um fármaco pode interagir com outros fármacos ou com os restantes factores de meio. A presente técnica de ambientómica funcional permite compreender como a dosagem do fármaco afecta as funções celulares da mesma forma como o permite para outros factores de meio. Permite ainda compreender a interacção entre o fármaco e os outros factores de meio.

Breve descrição das figuras A Figura 1 representa a abordagem conceptual do método da presente invenção, nomeadamente para engenharia de meios de cultura orientada para a função, em que λ representam os factores do meio e e representam os genes. A Figura 2 é uma representação esquemática dos passos principais do método da presente invenção, em que no passo 1 A - representa o conjunto de culturas celulares e B -representa a análise exometabolómica inicial e final; o 39 41. van Os, J., Rutten, B.P.F. & Poulton, R. Gene-Environment Interactions in Schizophrenia: Review of

Epidemiological Findings and Future Directions. Schizophrenia Bulletin 34, 1066-1082 (2008)

As seguintes reivindicações apresentam adicionalmente uma implementação preferida da presente invenção.

Lisboa, 1 de Junho de 2011 30

Cada meio com composições especificadas nas tabelas II e III foi formulado de acordo com o seguinte procedimento experimental. Suplementou-se 40 mL de solução BSM diluída (ver Tabela II) com glicerol (concentração de 20 g/L) e autoclavou-se a 121°C durante 30 minutos. O pH de BSM é aproximadamente 1,5 e deve ser ajustado ao pH de trabalho de 5,0 através da adição de 25% de hidróxido de amónia após a autoclavagem. O hidróxido de amónia também serve como fonte de azoto. A solução mãe de sais vestigiais PTM1 foi primeiramente esterilizada por filtração com um filtro de tamanho de poro de 0,22 nm e depois adicionada à solução BSM autoclavada numa razão de 1:200 (v/v) PTM1:BSM.

Os criotubos contendo as células foram armazenados a -80°C, O pré-inóculo foi preparado com 1 mL de uma reserva de células e 40 mL de meio com a composição de base (Tabela II) e depois foi incubado a 30°C e 150 rpm num incubador com agitação Innova 4300. Quando o pré-inóculo atingiu o crescimento exponencial, aproximadamente após 26 h de tempo de incubação, utilizou-se 2 mL para inocular todos os 26 "T-flasks" em paralelo.

Cada um dos 26 "T-flasks" foi incubado durante 110 horas a 30 °C e 150 rpm num incubador com agitação Innova 4300. Recolheram-se amostras a intervalos de 24 horas. Cada amostra foi analisada para os seguintes compostos: - Determinou-se a concentração de biomassa por densidade óptica a 600 nm (D0600) e pelo método do peso de células húmidas (centrifugação a 15000 rpm seguindo-se da pesagem e secagem). - Determinou-se a concentração de produto através de uma análise ELISA ("Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay"). 12 entre a totalidade do conjunto de funções celulares elementares que está intimamente ligado à composição do meio e determinar os seus pesos relativos para o fenótipo celular observado por análise de regressão em relação aos valores do meio que satisfazem os seguintes critérios: a. Maximizar a variância capturada dos dados do exometaboloma e/ou a velocidade de alteração dos dados do exometaboloma e/ou outra informação derivada dos dados do exometaboloma. b. Maximizar a correlação entre valores de funções celulares elementares e valores de factores do meio ou transformações dos seus valores. c. Minimizar o número de funções celulares elementares necessárias para capturar um dado valor de variância, ou seja, minimizar a redundância. 0 resultado deste passo é a discriminação do subconjunto de funções celulares elementares que está intimamente ligado com a composição do meio. A informação pode ser finalmente organizada num vector de dados NxK, denominado mapa de ambientómica funcional (MAF):

Mapa de Ambientómica Funcional = {J±,j}, i=l,...,N

As linhas representam factores do meio, as colunas representam o universo de funções celulares elementares e Ii,j a "intensidade" relativa de regulação para uma intensificação ou uma inibição de funções celulares elementares por factores do meio.

Conseguir estes passos requer o rastreio de um número elevado de formulações do meio, o que é oneroso. No 21 passo 2 representa o mapa de ambientómica funcional, apresentando-se no eixo dos xx as funções celulares elementares de um universo de genes e no eixo dos yy os factores do meio; no passo 3 ocorre a formulação do meio de cultura optimizado e no passo 4 ocorre a validação final, através da obtenção de triplicados de culturas celulares em formulações de meios de cultura optimizados. A Figura 3 exemplifica a aplicação do protocolo de cultura celular da presente invenção a uma estirpe recombinante Pichia pastoris X33. Proporciona os resultados da concentração de biomassa, concentração de produto e concentração de amónia, após 110 horas de tempo de incubação, para 26 experiências de cultura. A Figura 4 apresenta um mapa de Ambientómica Funcional de baixa resolução para uma estirpe recombinante Pichia pastoris X33.

Exemplos

Aqui de seguida, a presente invenção é descrita em maior detalhe e especificamente com referência aos exemplos, com os quais no entanto não se pretende limitar a presente invenção.

Exemplo 1 - Funções celulares elementares para a levedura Pichia pastoris X33

Aqui, descrevem-se os passos para a obtenção do conjunto de trabalho de funções celulares elementares para a levedura recombinante Pichia pastoris X33.

Primeiro, construiu-se uma rede metabólica a partir de fontes da literatura, nomeadamente a base de dados KEGG 31 - A concentração no sobrenadante de glicerol e diversos ácidos orgânicos (ácido málico, ácido succínico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido fumárico) foi determinada por cromatografia liquida de elevada eficiência (HPLC). - A concentração de amónia foi medida utilizando um eléctrodo (Thermo Electron Corporation, Orion 9512).

As Figuras 3a-c apresentam a concentração de biomassa, a concentração de produto e a concentração de amónia no final das 26 experiências. As concentrações de glicerol e dos ácidos orgânicos são apresentadas na Tabela IV. Os compostos ácidos orgânicos apresentaram concentrações residuais. 0 glicerol foi completamente consumido em todos os casos.

Tabela IV - Dados de exometaboloma (concentrações de glicerol e ácidos orgânicos) determinados por HPLC às 110 horas.

Glicerol (g/L) Ácido Málico (g/L) Ácido Succínico (g/L) Ácido Láctico (g/L) Ácido Fórmico (g/L) Ácido Fumárico (g/L) Exp, 1 0,12 0,28 0,46 0,12 0,34 0,08 Exp, 8 0, 01 0,15 0, 11 0,10 0,11 0,07 Exp, 10 0,03 0,11 0,08 0,06 0,09 0,08 Exp, 20 0,01 0,07 0,12 0,10 0,12 0,13 Exp, 25 0, 07 0,24 0,26 0, 11 0,09 0, 11 Exp, 26 0, 01 0, 19 0, 09 0,09 0,15 0,07

Exemplo 3 - Mapa de Ambientómica funcional de Pichia pastoris X33

Aqui exemplifica-se como os dados experimentais recolhidos no exemplo 2 podem ser processados na forma de um mapa de Ambientómica funcional para a levedura Pichia pastoris X33. 13 entanto, uma vez realizado, a impressão digital da célula em termos de propriedades ambiente-função será estabelecida. Além disso, os mapas de ambientómica funcional são conservados do mesmo modo que a função dos genes é conservada. Como tal, espera-se que os padrões identificados para uma dada função no interior de diferentes genótipos apresentem semelhanças cruciais que reflectem a ligação determinística entre genes e ambiente. 0 Exemplo 3 ilustra a construção de uma mapa de Ambientómica Funcional para a levedura P. pastoris X33.

Passo 3- Formulação de meio de cultura optimizado

No desenho de meio de cultura, idealmente seria possível afinar a funcionalidade celular de acordo com as necessidades do utilizador. Combinando a informação da funcionalidade desejada com aquela dos Mapas de Ambientómica Funcional, é possível deduzir regras a priori relativamente a como afinar a composição do meio em relação a alguma formulação de base de modo a implementar a funcionalidade desejada. No limite, se a informação no mapa de Ambientómica funcional for suficientemente precisa, um único passo de desenho resulta numa formulação de MC quase óptima. Mais especificamente, o procedimento é como se segue:

Cada coluna da matriz MAF contém a informação de como os valores dos factores de meio de base deveriam ser ajustados de modo a intensificar ou reprimir uma determinada função celular elementar. Mais especificamente, os novos valores de factores do meio deveriam ser alterados de acordo com a seguinte fórmula: FACj opt (0) (3) 22 [30] e os artigos Chung et al, [31] e Çelik et al, [32]. Os genes associados a cada reacção são na maioria dos casos conhecidos e podem ser encontrados em Chung et al, [31]. A rede metabólica foi ainda simplificada reunindo numa única reacção as vias anabólicas. A rede metabólica resultante tem 99 reacções (logo, 99 fluxos), 89 metabolitos intracelulares e 9 metabolitos extracelulares. O conjunto completo de reacções metabólica é apresentado na Tabela 1.

Tabela 1 - Lista de reacções metabólicas de uma estirpes recombinante Pichia pastoris X33 que expressa uma proteína de fórmula empírica CHlf 965No,27iOo, 535So,oo6

Reacções de assimilação RI 1 ATP + 1 GlyOH 1 ADP + 1 GAP + 1 NADH2 R2 2 ATP + 1 H3PO4 + 2 H20 -» 2 ADP + 3 Pi R3 2 ATP + 4 NADH2 + 1 H2S04 2 ADP + 1 PPi + 3 H20 + 1 H2S Glicólise/Gliconeogénese R4 1 G6P <-4- 1 F6P R5 1 ATP + 1 F6P -» 1 ADP + 2 GAP R6 1 h2o + 2 GAP -» 1 F6P + 1 Pi R7 1 ADP + 1 Pi + 1 GAP <-» 1 ATP + 1 PEP + 1 H 2o + 1 nadh2 R8 1 ADP + 1 PEP -» 1 Pyr + 1 ATP Via das Pentoses Fosfato R9 1 G6P + 1 H20 -» 1 R5P + 2 NADH2 + 1 C02 RlO 1 R5P <-> 1 X5P Rll 1 R5P + 1 X5P 1 E4P + 1 F6P R12 1 E4P + 1 X5P <-> 1 GAP + 1 F6P RI 3 1 ATP + 1 R5P -> 1 AMP* + 1 PRPP Reacções anapleróticas RI 4 1 Pyr + 1 H20 + 1 C02 + 1 ATP —> 1 OA + 1 ADP + 1 Pi RI 5 1 Mal -> 1 Pyr + 1 C02 + 1 NADH2 RI 6 1 OA + 1 ATP <-> 1 PEP + 1 ADP + 1 C02 Ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) RI 7 1 OA + 1 AcCoA + 1 H20 -» 1 Cit RI 8 1 Cit 1 ICit R19 1 ICit <-» 1 aKG + 1 NADH2 + 1 C02 R20 1 ADP + 1 Pi + 1 aKG -> 1 ATP + 1 NADH2 + 1 C02 + 1 Succ R21 1 Succ —» 1 Fum + 1 NADH2 32

Primeiramente, a velocidade de alteração de cada composto é calculada através da seguinte fórmula: ..t Q) ‘ xk t av^batch sendo ci(0) a concentração inicial, c í(tbatch) 9- concentração final, Xav a concentração celular média, tbatch a duração da experiência em descontínuo. Note-se que o índice inferior denota a experiência enquanto que o índice superior denota o composto.

Depois, realiza-se uma análise de regressão estatística de v em relação aos valores dos factores do meio utilizando o seguinte modelo linear: v = Z^e; (3a) i=i

Finalmente, organiza-se os dados na forma de um mapa de Ambientómica funcional colocando os valores de intensidade na forma de uma matriz NxK:

Mapa de Ambientómica funcional = 0 resultado final deste procedimento é apresentado na Tabela V e representado na Figura 4.

Tabela V - Mapa de Ambientómica funcional para Pichia pastoris X33. Apenas são apresentadas as funções celulares elementares mais significativas. São removidos todos os valores de intensidade 1% abaixo do desvio padrão. A Figura 4 apresenta uma representação gráfica destes dados. 14 sendo FACj(0) o valor de linha de base do factor de meio j, FACj°pt o valor optimizado do factor de meio j, I±,j o valor da intensidade da linha j e coluna i do mapa de Ambientómica funcional e η1 o factor de intensificação desejado da função celular elementar i (parâmetro do desenho). Formulações de suplementação de meio especificas para uma função celular podem ser deduzidas a partir das colunas do mapa de ambientómica funcional. Alternativamente, podem ser obtidas formulações de meio optimizadas globalmente através da aplicação de factores de intensificação a várias funções celulares elementares em simultâneo.

Passo 4 - Passo de validação final A formulação do meio de cultura optimizado de novo é rastreada em experiências de cultura adicionais tal como descrito nos passos 1. No entanto, o número de experiências é muito inferior, tipicamente triplicados de uma dada formulação optimizada do meio.

No final do passo 4, esperam-se ganhos de produtividade e/ou qualidade do produto ou de ganhos de desempenho globais da cultura muito para além da formulação do meio de base. 0 aumento na produtividade é obviamente dependente de cada caso. Os Exemplos 4 e 5 mostram como se podem obter aumentos de produtividade na gama de 6 0-10 0% para uma estirpe recombinante de P. pastoris X33.

Resumo da invenção O objecto da presente invenção é um método para determinação de uma composição de meio de cultura óptima compreendendo os seguintes passos: 23 23 R22 R23 R24 R25 R26 R27 R28 R29 R30 R31 R32 R33 R34 R35 R36 R37 R38 R39 R40 R41 R42 R43 R44 R45 R46 R47 R48 R49 R50 R51 R52 1 Fum + 1 H20 <-» 1 Mal 1 Mal f> 1 OA + 1 NADH2

Via do glioxilato 1 ICit —> 1 Glx + 1 Succ 1 AcCoA + 1 Glx + 1 H20 -» 1 Mal

Via do metabolismo C3/C4 1 Pyr -» 1 AcCoA + 1 C02 + 1 NADH2

Biossintese de proteínas 1 Asp + 1 Ser + 1 ATP + 1 H20 + 1 H2S -> 1 Cys + 1 ADP + 1 Pi + 1 Pyr + 1 NH3 + 1 C02 + 1 NADH2 1 Glu + 1 Gin + 1 Asp + 4 ATP + 1 C02 + 2 H20 + 1 NADH2 -> 1 Arg + 1 aKG + 3 ADP + 1 AMP* + 3 Pi + 1 PPi + 1 Fum 2 Glu + 1 AcCoA -» 1 Lys + 1 aKG + 1 C02

2 Pyr + 1 AcCoA + 1 Glu -» 1 Leu + 2 C02 + 1 aKG 1 PRPP + 1 ATP + 3 H20 + 1 Gin -» 1 His + 1 AICAR + 2 NADH2 + 2

PPi + 1 Pi + 1 aKG 1 Glu + 1 ATP + 1 NH3 -» 1 Gin + 1 ADP + 1 Pi 1 aKG + 1 NADH2 + 1 NH3 -> 1 Glu + 1 H20

1 Glu + 1 OA —» 1 Asp + 1 aKG

1 Asp + 1 Gin + 1 ATP + 1 H20 -» 1 Asn + 1 Glu + 1 AMP* + 1 PPi 1 Glu + 1 Pyr -» 1 Ala + 1 aKG 1 E4P + 2 PEP + 1 NADH2 + 1 ATP -» 1 Chor + 1 ADP + 4 Pi 1 Chor + 1 PRPP + 1 Gin + 1 Ser -» 1 Trp + 1 GAP + 1 Glu + 1 C02 + 1 H20 + 1 Pyr + 2 Pi 1 Chor + 1 Glu -» 1 Tyr + 1 NADH2 + 1 aKG + 1 C02 1 Chor + 1 Ala -» 1 Tyr + 1 NADH2 + 1 Pyr + 1 C02 1 Chor + 1 Glu -» 1 Phe + 1 aKG + 1 H20 + 1 C02 1 Chor + 1 Ala -» 1 Phe + 1 Pyr + 1 H20 + 1 C02

1 Glu + 2 Pyr + 1 NADH2 -> 1 Vai + 1 H20 + 1 C02 + 1 aKG 1 Glu + 1 GAP + 2 H20 -» 1 Ser + 1 aKG + 1 Pi + 2 NADH2

1 Gly + 1 MnTHF + 1 H20 -> 1 Ser + 1 THF 1 Asp + 2 ATP + 2 NADH2 + 1 H20 -» Thr + 2 ADP + 2 Pi 1 Asp + 1 ATP + 2 NADH2 + 1 H2S + 1 MnTHF + 3 NADH2 -> 1 Met + 1 ADP + 1 Pi + 1 THF + 1 H20 1 Ser + 1 THF -» 1 Gly + 1 MnTHF + 1 H20 1 Glx + 1 Ala —> 1 Gly + 1 Pyr 1 Glu + 1 ATP + 2 NADH2 -» 1 Pro + 1 ADP + 1 Pi + 1 H20 1 Glu + 1 Pyr + 1 Thr + 1 NADH2 -» 1 aKG + 1 ILeu + 1 H20 + 1 C02 + 1 NH3 0,1245 Ala + 0,0437 Arg + 0,0277 Asn + 0,0808 Asp + 0,0019 Cys + 0,0285 Gin + 0,0819 Glu + 0,0787 Gly + 0,0179 His + 0,0524 ILeu + 0,0803 Leu + 0,0776 Lys + 0,0138 Met + 0,0364 Phe + 0,0448 Pro + 0,0502 Ser + 0,0518 Thr + 0,0076 Trp + 0,0277 Tyr + 0,0719 Vai +

4,3 ATP +4,3 H20 => 1 Prot + 4,3 Pi + 4,3 ADP 33 33 elO el2 e5 e9 e3 CuS04, 5H20 0,06 0,13 0,09 CD O O 1 -0, 05 Nal 0,04 0,18 -0,16 0,00 0, 04 MnS04,H20 -0,16 0,21 0,00 -0,03 0, 00 Na2Mo04, 2H20 0,07 0,04 0,05 -0,03 -0, 01 H3BO3 0,01 -0,15 0,02 CM O O 1 -0, 02 CoCl2, 6H20 -0,02 -0,21 0,06 CM O O 1 0, 01 ZnCl2 CM O O 1 0,15 0,11 O \—1 O 1 0, 00 FeS04, 7H20 -0, 76 0,01 0,19 -0,32 -0, 02 Biotina O O 1 0,06 0,25 0 0 1 -0, 05 h2so4 -0,20 0,06 0,24 0,05 0, 00 BSM* 0,43 -0,24 -0,30 0,27 -0, 02

Exemplo 4 - Formulação optimizada do meio de cultura para intensificar a função elementar do produto num factor de intensificação de 60%

Aqui apresenta-se o modo como se podem obter formulações optimizadas de meio de cultura com uma produtividade especifica de produto muito superior àquela da formulação de meio de base utilizando a informação contida no mapa de Ambientómica funcional.

Primeiro, realizam-se ajustes iterativos dos factores do meio, utilizando as fórmulas (3a) e (3b) de modo que a produtividade especifica alvo de vproduto=0, 16 μq / q peso seco / dia o que corresponde a uma melhoria de 60% em relação à experiência com os valores de base. κ ν=ΣΑΛ oa> j= 1 (3b) l=ÍXxFACi 1=1 15 a) definir a estrutura biológica para a qual será desenhado o meio de cultura; b) estabelecer o conjunto de trabalho de N factores do meio e K funções celulares elementares da estrutura biológica previamente definida, c) construir um Mapa de Ambientómica funcional de K funções elementares K em relação a N factores do meio da estrutura biológica alvo através de - execução de uma primeira série de experiências de cultura compreendendo um número de culturas igual ou superior ao número de factores do meio mais um (N+l), em que cada cultura é realizada numa composição de meio de cultura diferente, em que se rastreiam combinações de níveis baixos e elevados de factores do meio; aquisição de dados iniciais de finais de biomassa, produto e exometaboloma para cada uma das experiências de cultura realizada; determinação de um subconjunto de funções celulares elementares activas que apresentam elevados coeficientes de correlação com valores de factores do meio por análise de regressão de dados de exometaboloma ou de dados derivados de exometaboloma em relação a dados de composição do meio; - execução de uma segunda série de experiências de cultura compreendendo um número de culturas igual ou superior ao número de funções celulares activas mais um, em que cada cultura é levada a cabo numa diferente composição de meio de cultura, em que são rastreadas combinações de níveis de intensidade baixos ou elevados de funções celulares elementares; - construção de um mapa de ambientómica funcional a partir dos dados recolhidos em passos anteriores por análise de regressão linear utilizando o seguinte modelo linear, R53 R54 R55 R56 R57 R58 R59 R60 R61 R62 R63 R64 R65 R66 R67 R68 R69 R70 R71 R72 R73 R74 R75 R76 R77 R78 R79 R80 R81

Biossíntese de lípidos

9 AcCoA + 8 ATP + 1 GAP +17 NADH2 + 1 H20 -A 8 ADP + 9 Pi + 1 MAG

18 AcCoA +16 ATP + 1 GAP +34 NADH2 + 1 H20 -A 16 ADP + 17 Pi + 1 DAG

2 7 AcCoA + 24 ATP + 1 GAP + 51 NADH2 + 1 H20 -A- 2 4 ADP + 25 Pi + 1 TAG 18 AcCoA + 18 ATP + 23 NADH2 + 10 02 A 18 ADP + 6 PPi + 6 Pi + 1 Zym + 7 H20 + 9 C02

1 Met + 1 Zym + 2 02 + 1 NADH2 -A 1 Asp + 1 Erg + 2 H20 + 1 H2S 1 Ser + 18 AcCoA + 16 ATP + 1 GAP + 1 CTP + 37 NADH2 => 16 ADP + 1

PPi + 16 Pi + 1 CMP* + 1 PDS 1 PDS -A 1 PDE + 1 C02 + 3 NADH2 1 PDE + 3 Met + 6 H20 -A 3 Asp + 3 H2S + 1 PDC + 6 NADH2 1 G6P +18 AcCoA +16 ATP + 1 GAP + 1 CTP +34 NADH2 + 1 H20 -A 16

ADP + 1 PPi + 17 Pi + 1 CMP* + 1 PDMI 0,0548 MAG + 0,0548 DAG + 0,0548 TAG + 0,1233 PDC + 0,0411 PDS + 0,0959 PDE + 0,1507 Erg + 0,3151 Zym + 0,1096 PDMI -A 1 Lip Biossíntese de hidratos de carbono 1 F6P + H20 => 1 Pi + 1 Man 1 G6P + 1 UTP + 1 H20 => 1 Glc + 1 PPi + 1 UDP 1 Glc => 1 Gal

1 Gin + 1 AcCoA + 1 F6P + 1 UTP => 1 Glu + 1 PPi + 1 GlcNAc + 1 UDP

1 PEP + 1 CTP + 1 GlcNAc + 3 H20 + 1 ATP => 1 PPi + 2 Pi + 1 NeuAc + 1 CMP* + 1 ADP 0,1554 NeuAc + 0,1554 GlcNAc + 0,3250 Man + 0,2088 Glc + 0,1554 Gal —^ 1 Carb

Biossíntese de nucleótidos

1 Asp + 2 Gin + 1 Gly + 5 ATP + 1 PRPP + 1 FTHF + 1 C02 + 3 H20 -A

2 Glu + 1 THF + 5 ADP + 5 Pi + 1 PPi + 1 Fum + 1 AICAR 1 AICAR + 1 FTHF -A 1 THF + 1 IMP + 1 H20

1 IMP + 1 Asp + 1 GTP -A 1 AMP + 1 Fum + 1 Pi + 1 GDP 1 IMP + 1 Gin + ATP + 2 H20 -A 1 GMP + 1 Glu + 1 PPi + AMP* + 1 NADH2 1 IMP + 1 NH3 + ATP + 1 H20 -A 1 GMP + 1 PPi + AMP* 1 PRPP + 1 Asp + 1 Gin + 2 ATP + 1 H20 -A 1 UMP + 1 Glu + 1 NADH2

+ 1 PPi + 2 Pi + 2 ADP 1 NH3 + 1 UMP -A 1 CMP + H20 1 CMP + 1 NADH2 -A 1 dCMP + H20 1 GMP + 1 NADH2 -A 1 dGMP + H20 1 AMP + 1 NADH2 -A 1 d AMP + H20 1 UMP + MnTHF + 2 NADH2 -A dTMP + THF + H20

0,2329 AMP + 0,3059 UMP + 0,2329 GMP + 0,2283 CMP + 0,4 ATP + 0,4 H20 -A 1 RNA + 0,4 Pi + 0,4 ADP

0,2000 dCMP + 0,3000 dTMP + 0,3000 d AMP + 0,2000 dGMP + 0,4 ATP + 0,4 H20 -A 1 DNA + 0,4 Pi + 0,4 ADP 34

Este procedimento resultou na seguinte composição de meio de cultura optimizada

Formulação optimizada

CuS04.5H20, 7, 25 g/L, Nal, 0,106 g/L, MnS04.H20, 1,152 g/L,

Na2Mo04.2H20, 0,036 g/L, H3BO3, 0,013 g/L, CoCl2.6H20, 0,25 g/L, ZnCl2, 25,2 g/L, FeS04.7H20, 5,34 g/L, Biotina, 0,038 g/L, H2S04, 1,989 mL/L, diluição de BSM, 0,84:1 (v/v)

As experiências de cultura em "T-flasks" foram executadas ou utilizando a formulação de meio de base (experiência controlo especificada na Tabela II) ou a formulação de meio optimizada. O protocolo aplicado foi aquele descrito no exemplo 2. As produtividades específicas finais medidas foram as seguintes:

Formulação de base: 0,10 μg / g peso seco / dia Formulação optimizada: 0,17 μg / g peso seco / dia Obteve-se um factor de intensificação de 62,3% em relação à formulação de base.

Exemplo 5 - Formulação optimizada do meio de cultura para intensificar a função elementar do produto num factor de intensificação de 100%

Realizou-se um procedimento similar ao do exemplo 4, mas tendo como objectivo um valor de produtividade específica de produto ainda mais elevada de vproduto=0,20 μg / g peso seco / dia o que corresponde a uma melhoria de 100% em relação à experiência com os valores de base. A formulação de meio optimizado obtida foi a seguinte:

Formulação optimizada 16 κ

j=í (3a)

N

(3b) e organizaçao dos dados na forma de um mapa de Ambientómica funcional, em que os valores de intensidades são colocados na forma de um vector de dados NxK:

Mapa de Ambientómica Funcional = d) optimização da composição do meio de cultura utilizando mapas de ambientómica funcional através de: - formulação de composições de meio especificas para uma função celular elementar utilizando a matriz de dados de ambientómica funcional, em que variações nos valores de factores do meio A(FAC;) resulta em variações do peso relativo de funções celulares elementares de acordo com a fórmula

(4) - formular composições de meio de cultura para intensificar ou reprimir uma única função celular elementar j utilizando a fórmula (4) aplicada à ja coluna do vector de dados de ambientómica funcional; - formular composições de meio de cultura para modificar o metabolismo celular através da intensificação ou da repressão de conjuntos cruciais de funções celulares elementares utilizando a fórmula (4) aplicada a múltiplas colunas do vector de dados de ambientómica funcional em simultâneo.

Numa implementação preferível: 25 R82 0,9471 RNA + 0,0529 DNA ->· 1 Nuc Síntese de biomassa

R83 0,5716 Prot + 0,0359 Nuc + 0,3855 Sug + 0,0073 Lip -» 1 X

Biossíntese do produto R84 Aminoácidos +4,3 ATP +4,3 H20 => Produto + 4,3 Pi + 4,3 ADP Fosforilação Oxidativa (razão P/O = 2) R85 2 ADP + 2 Pi + 1 NADH2 + 0,5 02 2 ATP + 3 H20

Biossíntese e Interconversão de unidades de um carbono R86 1 MnTHF + 1 H20 -> 1 FTHF + 1 NADH2

Rg7 1 FTHF + 1 AICAR + 1 OA + 1 NH3 + 1 ATP + 1 GTP + 1 NADH2 -> 1 THF + 2 Pi + 1 GDP + 1 Fum + 1 AMP* + 1 ADP + 1 H20 R88 1 MnTHF + 2 H20 -» 1 THF + 1 NADH2 + 1 For R89 1 THF + 1 Gly -> 1 MnTHF + 1 C02 + 1 NH3 + 1 NADH2 R90 1 For -> 1 nadh2 + 1 C02 Interconversão de Energia R91 1 PPi + 1 h2o -> 2 Pi R92 1 ATP + 1 AMP* —> 2 ADP R93 1 ATP + 1 CMP* -> 1 CDP + 1 ADP R94 1 ATP + 1 CDP —> 1 CTP + 1 ADP R95 1 ATP + 1 GMP* -> 1 GDP + 1 ADP R96 1 ATP + 1 GDP ->· 1 GTP + 1 ADP R97 1 ATP + 1 UMP* 1 UDP + 1 ADP R98 1 ATP + 1 UDP -» 1 UTP + 1 ADP R99 1 ATP + 1 h2o —> 1 ADP + 1 Pi 0 programa informático de código livre METATOOL 5,0 [33] foi utilizado para calcular os modos elementares de fluxos da rede metabólica especificada na Tabela 1. 0 número total de modos elementares de fluxo foi de 3368. Nas linhas abaixo especificam-se cinco modos elementares de fluxo obtidos com METATOOL 5,0 [30] . Note-se que a dimensão de cada vector do modo elementar de fluxo é 99 e que os valores nele incluídos representam o peso de uma dada reacção metabólica para aquele modo elementar de fluxo particular. Os modos elementares 9 e 10 correspondem à síntese de biomassa, os modos elementares 3 e 12 correspondem à síntese de produto e o modo elementar 5 corresponde ao catabolismo. Verificou-se que estes modos 35

CuS04.5H20, 12,0 g/L, Nal, 0,16 g/L, MnS04.H20, 6,00 g/L,

Na2Mo04.2H20, 0,40 g/L, H3BO3, 0,001 g/L, CoC12.6H20, 0,25 g/L, ZnCl2, 40,0 g/L, FeS04.7H20, 3,25 g/L, Biotina, 0,4 g/L, H2S04, 10,0 mL/L, diluição de BSM, 0,25:1 (v/v)

As experiências de cultura em "T-flasks" foram executadas ou utilizando a formulação de meio de base ou a formulação de meio optimizada de um modo semelhante àquele utilizado no exemplo 4. As produtividades especificas finais medidas foram as seguintes:

Formulação de base: 0,10 μg / g peso seco / dia Formulação optimizada: 0,22 μg / g peso seco / dia Obteve-se um factor de intensificação de 104,7% em relação à formulação de base.

Referências 1. Dong, J., et al., Evaluation and optimization of hepatocyte culture media factors by design of experiments (DoE) methodology. Cytotechnology, 2008. 57(3): p. 251-261. 2. Mandenius, C.F. e A. Brundin, Bioprocess Optimization Using Design-of-Experiments Methodology. Biotechnology Progress, 2008. 24(6): p. 1191-1203. 3. Hunter, D.J., Gene-environment interactions in human diseases. Nature Reviews Genetics, 2005. 6(4): p. 287-298. 4. Cunha, A.E., et al., Methanol induction optimization for scFv antibody fragment production in Pichia pastoris. Biotechnology and Bioengineering, 2004. 86(4): p. 458-467. 5. Deshpande, R.R., C. Wittmann, e E. Heinzle, Microplates with integrated oxygen sensing for médium optimization in animal cell culture. Cytotechnology, 2004. 46(1): p. 1-8. 6. Chang, K.H. e P.W. Zandstra, Quantitative screening of embryonic stem cell differentiation: Endoderm formation as 17 - a estrutura biológica alvo pode ser um tecido celular, uma célula inteira, um organelo, ou um conjunto coerente de reacções metabólicas que representam uma dada função celular; - os factores do meio são propriedades fisico-quimicas, concentrações e/ou velocidades de libertação de nutrientes essenciais e/ou de micronutrientes e/ou de moléculas funcionais, - as propriedades físico-químicas são temperatura, pressão, pH, força iónica e/ou osmolalidade.

Noutra implementação preferível, a formulação do meio de cultura é determinada pelos valores dos N factores do meio utilizando a seguinte fórmula:

Formulação do meio de cultura = {FAC j}, j = l,...,N, sendo FACj o valor do factor do meio j; e a estrutura biológica alvo é determinada pelas K funções celulares elementares utilizando a seguinte fórmula:

Estrutura biológica alvo = {ei}, i = l,...,K,

Noutra implementação preferível as funções celulares elementares são obtidas a partir de uma rede bioquímica da referida estrutura biológica alvo, em que a rede bioquímica é subdividida em K sub-redes funcionais compreendendo um subconjunto de transformações bioquímicas, em que tais sub-redes são obtidas manualmente e/ou automaticamente aplicando algoritmos de modos elementares de fluxo ou algoritmos de vias extremas ou outros algoritmos de análise de núcleo ou outros algoritmos de análise convexa de 26 elementares de fluxo eram os mais importantes em passos posteriores do método da presente invenção e é esta a razão pela qual os especificamos aqui: [7,22 0,13 0,03 -0, 46 6,19 7,59 3,95 3,49 0,00 -0, 15 -0,01 -0,14 0,16 1,19 0,20 0,00 0,51 0,51 0,51 0,00 0,00 0,20 0,00 0,00 0,00 1,62 0,00 0,08 0, 14 0, 15 0,03 0,82 2,46 0,65 0, 05 0,30 0,13 0,01 0, 05 0,00 0,00 0,07 0,13 0,32 0,00 0,19 0,04 0,20 0,00 0,08 0,10 1, 85 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0,01 0,01 0,00 0,00 0,02 0, 41 0, 45 0,19 0,39 0,19 1,25 0,05 0,05 0,03 0,03 0,00 0,06 0,03 0,00 0,00 0,00 0,00 0, 11 0,01 0,12 3,24 0,00 10,11 0, 14 0,03 0,02 0,00 0,02 1, 48 0,36 0,20 0,20 0,00 0,06 0,00 0,84 0,00] t [9,00 0,00 0,15 0,00 1,94 2,18 6,50 5,36 0, 00 -0,25 0,16 -0, 41 0,08 2,07 0,00 0,00 1, 12 1, 12 1, 12 0,00 0,00 0,25 0,25 0,00 0,00 1,67 0, 11 0,25 0, 15 0,40 0,00 0,67 6,05 1,20 0,06 0,34 0,57 0,08 0,25 0,00 0,23 0,00 0,25 1,69 0,00 0,57 0,04 0,70 0,00 0,25 0, 17 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 5, 12 13,91 0,00 0,00 0,65 0,00 0,65 0, 46 0,40 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00] t [1,08 0,00 0,00 -3,23 0,00 1,08 0,00 14, 00 3,23 2, 15 1,08 1,08 0,00 14, 00 0,00 14, 00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 7,54 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00] t [47,58 0,82 0,19 -4, 48 0,00 9,66 25, 76 22, 76 1,50 0,00 0,43 -0,43 1, 07 7, 78 1,28 0,00 3,34 3,34 3,34 0,00 0,00 1,28 ©9 36 a model. Biotechnology and Bioengineering, 2004. 88(3): p. 287-298. 7. Montgomery D.C., 2005, Design and Analysis of Experiments, John Wiley & Sons Inc, 6a edição 8. Ghosalkar, A., V. Sahai, e A. Srivastava, Optimization of chemically defined médium for recombinant Pichia pastoris for biomass production. Bioresource Technology, 2008. 99(16): p. 7906-7910. 9. K ell, D.B., et al., Metabolic footprinting and Systems biology: The médium is the message. Nature Reviews Microbiology, 2005. 3(7): p. 557-565. 10. Schuster, S. e H. Claus, On Elementary Flux Modes in Biochemical Reaction Systems at Steady State. Journal of Biological Systems, 1994. 2(2): p. 165-182. 11. Schuster, S., T. Dandekar, e D.A. Fell, Detection of elementary flux modes in biochemical networks: a promising tool for pathway analysis and metabolic engineering. Trends in Biotechnology, 1999. 17(2): p. 53-60. 12. Schuster, S., D.A. Fell, e T. Dandekar, A general definition of metabolic pathways useful for systematic organization and analysis of complex metabolic networks. Nature Biotechnology, 2000. 18(3): p. 326-332. 13. Klamt, S. e J. Stelling, Two approaches for metabolic pathway analysis? Trends in Biotechnology, 2003. 21(2): p. 64-69. 14. Palsson, B.O., N.D. Price, e J.A. Papin, Development of network-based pathway definitions: the need to analyze real metabolic networks. Trends in Biotechnology, 2003. 21(5): p. 195-198. 15. Papin, J.A., et al., Comparison of network-based pathway analysis methods. Trends in Biotechnology, 2004. 22(8): p. 400-405. 27 27 0,00 0, 00 0, 00 10,56 0, 02 0,53 0,94 0,97 0,22 5, 16 16,07 4, 23 0,33 2,28 0, 87 0, 09 0,00 0,33 0, 00 0,44 0,87 2,07 0,00 1,26 0,25 1,31 0, 00 0,54 0,63 12, 08 0,01 0,01 0,01 0,07 0, 02 0, 04 0, 03 0, 02 0,02 0, 15 2,65 2,97 1,27 2,53 1,27 8, 15 0,35 0,35 0, 18 0,00 0, 18 0, 40 0,17 0,01 0,01 0,01 0, 01 0, 72 0, 04 0, 76 21,14 0, 00 69,30 0,93 0,22 0,12 0,00 0, 12 9,67 2,32 1,32 1,32 0, 00 0, 40 0,00 5, 50 46,69]; [37,03 0, 00 0,60 -1,50 0,00 1,50 26,37 21, 74 1,50 0,00 1,16 -1,16 0,34 9, 42 1, 03 0,00 4, 54 4, 54 4, 54 0,00 0,00 1,03 0,00 0, 00 0, 00 6, 76 0,43 1,03 0,60 1,63 0,00 2,74 24, 57 4, 88 0,26 3,34 2,31 0,34 0,00 1, 03 0, 00 0,94 1,03 6,85 0,00 2,31 0,17 2, 83 0,00 1,03 0,68 0, 00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0, 00 0, 00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0, 00 0, 00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 20, 80 59,99 0,00 0,00 2,65 0,00 2,65 1,88 1,63 0,00 0,00 0,00 0, 00 0,00 0,00 13,34];

Exemplo 2 - Conjunto de 24 experiências de cultura para o rastreio de N=ll factores de meio para a levedura Plchia pastoris X33

Aqui descreve-se o modo como são levadas a cabo as experiências de rastreio para a estirpe Pichia pastoris X33 . para o meio tem [34], um um nivel

Seleccionaram-se onze factores de meio (N=ll) rastreio (listados na Tabela II). Cada factor de um valor de base tomado das normas da Invitrogen nivel -1 (10 vezes inferior ao valor de base) e +1, coincidente com o valor de base.

Realizou-se um conjunto de 24=2x(N+l) culturas celulares mais 2 experiências de controlo em "T-flasks" de 250 mL com diferentes composições de meio. As combinações dos valores 18 núcleos da rede metabólica da referida estrutura biológica alvo.

Noutra realização preferível, as funções celulares elementares são obtidas a partir da reconstrução à escala genómica da rede bioquímica da referida estrutura biológica alvo, em que o conjunto de trabalho das K funções elementares pode ser previamente reduzido utilizando dados de transcriptoma e/ou dados de proteoma e/ou dados de endometaboloma e/ou dados termodinâmicos caso estes dados estejam disponíveis.

Noutra implementação preferível, o mapa de ambientómica funcional é determinado por experiências de cultura em série e/ou em paralelo levadas a cabo em balões agitados, "T-flasks", reactores, microplacas, microbiorreactores ou "microarrays" fenotipicos. Preferentemente o mapa de ambientómica funcional é determinado por análises de exometaboloma, compreendendo, a análise do sobrenadante por uma técnica de RMN, tal como 1H-RMN ou 13C-RMN, por técnicas cromatográficas, tais como cromatografia liquida (LC) ou cromatografia gasosa (GC) , técnicas de espectrometria de massa (MS) ou cromatografia acoplada a espectrometria de massa, tais como GC-MS ou LC-MS.

Noutra implementação preferível, identifica-se um conjunto reduzido de funções celulares elementares activas por análise de regressão linear ou não linear, em que a variância ou a covariância dos dados de exometaboloma ou dos dados derivados do exometaboloma é maximizada, em que a correlação entre os dados de exometaboloma ou dos dados derivados do exometaboloma e os valores dos factores do meio é maximizada, em que as funções celulares elementares 37 16. Wagner, C., Nullspace approach to determine the elementary modes of Chemical reaction systems. Journal of Physical Chemistry B, 2004. 108(7): p. 2425-2431. 17. http://pinguin.biologie.uni-jena.de/bioinformatik/networks/metatool/metatool5.0/metatoo 15.0.html 18. http://www.brenda-enzymes.org/ 19. http://www.pichiagenome.org 20. Martinez, V., et al., Virai vectors for the treatment of alcoholism: Use of metabolic flux analysis for cell cultivation and vector production. Metabolic Engineering, 2010. 12(2): p. 129-137.

21. W0200900 7641 - CULTURE MÉDIUM FOR ΗΑΕΜΟΡΗILUS

INFLUENZAE ΤΥΡΕ B

22. W02008134220 - CULTURE MEDIA FOR DEVELOPMENTAL CELLS

CONTAINING ELEVATED CONCENTRATIONS OF LIPOIC ACID

23. W02009CA01342 20090922 - CULTURE MÉDIUM FOR MYOBLASTS, PRECURSORS THEREOF AND DERIVATIVES THEREOF 24. W02008035110 - Stem Cell Culture Médium and Method

25. W02004101808 - GENOMIC AND PROTEOMIC APPROACHES FOR THE DEVELOPMENT OF CELL CULTURE MÉDIUM 26. US2008248515 - Optimizing culture médium for CD34<+> hematopoietic cell expansion

27. US2009061516 - ANIMAL CELL CULTURE MEDIA COMPRISING NON ANIMAL OR PLANT DERIVED NUTRIENTS

28. MX2 009004974 - RATIONALLY DESIGNED MEDIA FOR CELL

CULTURE

29. W02008009642 - CELL CULTURE MEDIA

30. WO2009149719 - THE USE OF EXTRACT OF SELENIUM ENRICHED YEAST (Se-YE) IN MAMMALIAN CELL CULTURE MEDIA FORMULATIONS 31. Chung, B.K.S., et al., Genome-scale metabolic reconstruction and in silico analysis of methylotrophic 28 dos factores de meio a serem testados em cada experiência são listadas na Tabela III. Estas foram obtidas através de um desenho D-óptimo para identificação de função linear utilizando 24 experiências independentes.

Tabela II - Lista de factores do meio, respectivos valores de base e valores superior (+) e inferior (-) para experiências de cultura celular. A formulação final do meio compreende misturas de 1:200 (v/v) do PTM1 e soluções diluídas de BSM.

Factores do meio Unidades Linha de base Nível -1 Nível +1 Solução PTM11 Faci CuS04, 5H20 g/L 6,00 0,6 6,00 Fac2 Nal g/L 0,08 0,008 0,08 Fac3 MnS04, H20 g/L 3,00 0,3 3, 00 Fac4 Na2Mo04, 2H20 g/L 0,20 0,02 0,20 Fac5 H3BO3 g/L 0, 02 0, 002 0,02 Fac6 CoCl2, 6H20 g/L 0,50 0,05 0,50 Fac7 ZnCl2 g/L 20, 00 2 20, 00 Fac8 FeS04, 7H20 g/L 65, 00 6,5 65, 00 Fac9 Biotina g/L 0,20 0,02 0,20 Fac10 h2so4 mL/L 5, 00 0,5 5, 00 Solução BSM2 Facn Factor de diluição BSM v/V 1:1 0,5:1 1:1 (1) Suplementos de sais "Pichia Trace Metals" (PTM1) (ver [34])

(2) A composição da solução "Basal Salts Médium" é: H3P04 85%, 26,70 mL/L, CaS04,2H20 0,93 g/L, K2S04 18,20 g/L, MgS04,7H20 14,90 g/L, KOH 4,13 g/L

Tabela III: Desenho experimental D-óptimo para identificação de função linear para 11 factores (colunas) e 24 experiências (linhas), Os níveis +1 e -1 são especificados na Tabela I.

Facl Fac2 Fac3 Fac4 Fac5 Fac6 Fac7 Fac8 Fac9 FaclO Facll 38 yeast Pichia pastoris for strain improvement. Microbial Cell Factories, 2010. 9. 32. Celik, E., P. Calik, e S.G. Oliver, Metabolic Flux Analysis for Recombinant Protein Production by Pichia pastoris Using Dual Carbon Sources: Effects of Methanol Feeding Rate. Biotechnology and Bioengineering, 2010. 105(2): p. 317-329. 33. von Kamp, A. e S. Schuster, Metatool 5.0: fast and flexible elementary modes analysis. Bioinformatics, 2006. 22(15): p. 1930-1931. 34. Pichia fermentation process guidelines, Invitrogen life Sciences, www.invitogen.com/pichia 35. Schuster, S. e H. Claus, On Elementary Flux Modes in Biochemical Reaction Systems at Steady State. Journal of Biological Systems, 1994. 2(2): p. 165-182. 36. Schilling, C.H. e B.O. Palsson, Assessment of the metabolic capabilities of Haemophilus influenzae Rd through a genome-scale pathway analysis. Journal of Theoretical Biology, 2000. 203(3): p. 249-283. 37. Shlomi, T., et al., A genome-scale computational study of the interplay between transcriptional regulation and metabolism. Molecular Systems Biology, 2007. 3. 38. Stelling, J., et al., Metabolic network structure determines key aspects of functionality and regulation. Nature, 2002. 420(6912): p. 190-193. 39. Trinh, C.T., et al., Design, construction and performance of the most efficient biomass producing E-coli bacterium. Metabolic Engineering, 2006. 8(6): p. 628-638. 40. Forster, J., A.K. Gombert, e J. Nielsen, A functional genomics approach using metabolomics and in silico pathway analysis. Biotechnology and Bioengineering, 2002. 79(7): p. 703-712.

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para a determinação da composição óptima de um meio de cultura celular caracterizado por compreender os seguintes passos: a) seleccionar a estrutura biológica alvo; b) definir o conjunto de trabalho dos N factores do meio e das K funções celulares elementares da estrutura biológica previamente seleccionada; c) construir um Mapa de Ambientómica Funcional dos K funções celulares elementares contra os N factores do meio da estrutura biológica alvo; d) optimização da composição do meio de cultura utilizando mapas de ambientómica funcional.

2. Processo de acordo com a reivindicação anterior caracterizado por a construção do mapa no passo c) compreender os seguintes passos: - realização de uma primeira série de experiências de cultura compreendendo um número de culturas igual ou superior ao número de factores do meio mais um (N+l), em que cada cultura é realizada numa composição de meio de cultura diferente, em que se rastreiam combinações de níveis baixos e elevados de factores do meio; - aquisição de dados iniciais de finais de biomassa, produto e exometaboloma para cada uma das experiências de cultura realizada; - determinação de um subconjunto de funções celulares elementares activas que apresentam elevados coeficientes de correlação com valores de factores do meio por análise de regressão de dados de 2 exometaboloma ou de dados derivados de exometaboloma em relação a dados de composição do meio; - realização de uma segunda série de experiências de cultura compreendendo um número de culturas igual ou superior ao número de funções celulares activas mais um, em gue cada cultura é levada a cabo numa diferente composição de meio de cultura, em que são rastreadas combinações de níveis de intensidade baixos ou elevados de funções celulares elementares; construção do mapa de ambientómica funcional a partir dos dados recolhidos em passos anteriores por análise de regressão linear utilizando o seguinte modelo linear, V = Z1;e; (3a> 7=1 N (3b), /=1 forma de um mapa de que os valores de forma de um vector de e organização dos dados na Ambientómica funcional, em intensidades são colocados na dados NxK: Mapa de Ambientómica Funcional = {Ji(j}.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a optimização da composição do meio de cultura no passo d) compreender os seguintes passos: - formulação de composições de meio específicas para uma função celular elementar utilizando a matriz de dados de ambientómica funcional, em que variações nos valores de factores do meio á(FAQ) resultam em 3 variações do peso relativo de funções celulares elementares de acordo com a fórmula A(i) = txA(fAC/) (4) - formulação de composições de meio de cultura para intensificar ou reprimir uma única função celular elementar j utilizando a fórmula (4) aplicada à ja coluna do vector de dados de ambientómica funcional; - formulação de composições de meio de cultura para modificar o metabolismo celular através da intensificação ou da repressão de conjuntos cruciais de funções celulares elementares utilizando a fórmula (4) aplicada a múltiplas colunas do vector de dados de ambientómica funcional em simultâneo.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a estrutura biológica alvo ser um tecido celular, uma célula inteira, um organelo, ou um conjunto coerente de reacções metabólicas que representam uma dada função celular.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado por os factores do meio serem propriedades fisico-quimicas, concentrações e/ou velocidades de libertação de nutrientes essenciais e/ou micronutrientes e/ou moléculas funcionais.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 e 5, caracterizado por as propriedades fisico-quimicas serem a temperatura, a pressão, o pH, a força iónica e/ou a osmolalidade. 4

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por a formulação do meio de cultura ser determinada pelos valores de N factores do meio utilizando a seguinte fórmula: Formulação do meio de cultura = {FACj}, j = l,...,N, sendo FACj o valor do factor de maio j.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por a estrutura biológica alvo ser determinada por K funções celulares elementares utilizando a seguinte fórmula: Estrutura biológica alvo = {ei}, i=l,...,K.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por as funções celulares elementares serem obtidas a partir de uma rede bioquímica da referida estrutura biológica alvo em que a rede bioquímica é subdividida em K sub-redes funcionais compreendendo um subconjunto de transformações bioquímicas, em que tais sub-redes são obtidas manualmente e/ou automaticamente.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por as funções celulares elementares serem obtidas a partir da reconstrução à escala genómica da rede bioquímica da referida estrutura biológica alvo, em que o conjunto de trabalho das K funções elementares pode ser previamente reduzido utilizando dados de transcriptoma e/ou dados de proteoma e/ou dados de endometaboloma e/ou dados termodinâmicos. 5

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o mapa de ambientómica funcional ser determinado por experiências de cultura em série e/ou em paralelo levadas a cabo em balões agitados, "T-flasks", reactores, microplacas, microbiorreactores ou "microarrays" fenotipicos.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o mapa de ambientómica funcional ser determinado por análises de exometaboloma, compreendendo, a análise do sobrenadante por uma técnica de RMN, tal como 1H-RMN ou 13C-RMN, por técnicas cromatográficas, tais como cromatografia líquida (LC) ou cromatografia gasosa (GC), técnicas de espectrometria de massa (MS) ou cromatografia acoplada a espectrometria de massa, tais como GC-MS ou LC-MS.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se identificar um conjunto reduzido de funções celulares elementares activas por análise de regressão linear ou não linear, em que a variância ou a covariância dos dados de exometaboloma ou dos dados derivados do exometaboloma é maximizada, em que a correlação entre os dados de exometaboloma ou dos dados derivados do exometaboloma e os valores dos factores do meio é maximizada, em que as funções celulares elementares são classificadas de acordo com a sua correlação ou sensibilidade em relação aos valores dos factores do meio.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o mapa de 6 ambientómica funcional ser determinado através de um sistema de elevado débito automatizado, em que se interligam dispositivos de cultura, dispositivos de análise do exometaboloma e algoritmos computacionais num dispositivo físico para produzir mapas de ambientómica funcional com elevado débito.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por o modo elementar de fluxo do produto aumentar entre 60 e 100%.

16. A utilização do processo descrito nas reivindicações anteriores caracterizado por ser usado para a optimização da composição do meio de cultura de linhas celulares de Plantae e Animali ou de outros organismos eucarióticos unicelulares ou multicelulares tais como Leveduras e Fungos.

17. A utilização do processo descrito nas reivindicações 1-15 caracterizado por ser usado para a optimização da composição do meio de cultura celular para um organismo procariótico.

18. A utilização do processo descrito nas reivindicações 1-15 caracterizado por ser usado para a optimização da composição do meio de cultura celular para células estaminais.

19. Identificadores de biomarcadores caracterizados por compreenderem o processo descrito nas reivindicações 1-15. 7

20. Sistema de desenho de fármacos caracterizado por compreender o processo descrito nas reivindicações 1-15.

21. Formulações de meio de cultura quimicamente definido para cultivo da levedura Pichia pastoris, caracterizadas por serem obtidas pelo processo descrito nas reivindicações 1-15 e compreendem: a) uma solução aquosa de sais vestigiais composta por CuS04.5H20, 12,0 g/L, Nal, 0,16 g/L, MnS04.H20, 6, 00 g/L, Na2Mo04.2H20, 0, 40 g/L, H3B03, 0, 001 g/L, CoC12.6H20, 0,25 g/L, ZnCl2, 40,0 g/L, FeS04.7H20, 3,25 g/L, Biotina, 0,4 g/L, H2S04, 10,0 mL/L; e b) misturas da solução a) com uma solução aquosa basal complementar composta por H3P04 85%, 26,70 ml/L, CaS04.2H20 0,93 g/L, K2S04 18,20 g/L, MgS04.7H20 14, 90 g/L, KOH 4,13 g/L, ou outras soluções basais complementares. Lisboa, 1 de Junho de 2011