CN103459584A - 用于细胞培养基工程化的功能环境学方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于最优化细胞培养基的组成的新方法。该新方法包括两个主要阶段。在第一阶段中，通过执行特定细胞培养方案和外代谢物组测定方案，联合筛选细胞功能和介质因子（medium factor）来建立功能环境学图谱。所述功能环境学图谱由基本细胞功能的强度值相对于介质因子的数据阵列组成。在第二阶段，由所述功能环境学图谱的列（columns）开发最优化的细胞培养基制剂，所述培养基制剂增强或抑制靶标基本细胞功能。该方法的主要优势在于使得能够通过培养基组成操纵进行代谢工程化，其中通过介质因子的操纵来最优化任意高数量的细胞功能，这与主要根据经验而非细胞功能导向的并且需要多得多的实验次数的先前的方法相反。此外，该新方法基于有成本效益的外代谢物组测定且不需要花费巨大的细胞内基因组或蛋白质组学测定。

Description

用于细胞培养基工程化的功能环境学方法

发明领域

本发明涉及用于最优化细胞培养基的组成的方法。描述了用于测定介质因子的最佳值的方法，从而按照用户需要增强或抑制靶标基本细胞功能。所述方法包括通过执行细胞培养实验和优选外代谢物组（exometabolome）的高通量分析法构建功能环境学图谱，随后基于介质因子的所述功能进行介质因子值调整。

发明背景

细胞生长制剂在水溶液中包含数百种单独的成分。它们通常由下述组成：营养物例如蛋白胨、氨基酸、肉类提取物和酵母提取物；矿物质和维生素、抑制剂和固化剂。这些成分中的某些对于细胞生长或生产率可能是至关重要的，其它成分在某种水平上可能是有毒性的，并且许多成分可在细胞内的相同或竞争性途径中参与复杂的相互作用。包含哺乳动物细胞生长所必需的生长因子的血清（胎小牛血清FCS和胎牛血清FBS)已被广泛用作用于动物细胞培养的培养基补充物。然而血清的使用正被渐渐停止，因为监管机构对使用动物来源的材料生产活性药物成分(API)施以了非常严格的限制。若干文献(例如WO2008009642、WO2009149719、US2009061516)公开了能够支持动物细胞的体外培养的无血清细胞培养基制剂。

通过统计学实验设计（design-of-experiments）(DoE)支持的密集实验（Intensive experimentation）是用于确定细胞培养基的最佳组成的现有标准方法。然而该方法耗时且昂贵。单个地或在平行实验中以小的组合的方式筛选培养基成分，这显著限制了发现许多培养基成分之间的复杂相互作用的能力。已报导了众多关于使用DoE对通过反应器或摇瓶实验支持的细菌、真菌、哺乳动物细胞和干细胞培养进行培养基最优化的研究([2]、[5]、[6]、[8])。最常见的DoE法是利用两个浓度水平的所谓的缩减因子设计（reduced factorial design），其允许在有限次数的实验中初步筛选5至10种介质因子([7]、[2])。例如，文献号US2008248515公开了使用2-水平因子设计和最速上升法（deepest ascent method）确定无血清真核细胞培养基补充物的最佳组成的方法。通过使用DoE，同时比较数种介质因子，测量它们的作用，并基于反应变量的测量对其进行排序。反应变量通常是代谢物的浓度、细胞和产物浓度。一旦确定了反应变量，就可使用统计性能参数例如方差分析(ANOVA)来评估所测量的作用的相关性。相关于它们的影响力对介质因子进行排序，随后选择最有效的因子，并在另外的实验中进一步进行测试[2]。最后，建立回归模型来确定介质因子的最佳水平[2]。

统计学DoE法的主要劣势是，由于其经验主义的性质，当用于许多具有潜在相互作用的介质因子时，其成本膨胀。为了加速对大量介质因子的筛选，最近基于微生物生物反应器技术开发了高成本的高通量培养基最优化设备，目标是使得能够并行筛选数千种营养物水平或其组合。减少工作量和加速培养基开发的另一个策略是将培养基成分分成浓缩的相容性制剂小组（如文献号NZ243160中公开的）。也提出了较少经验性因而更快速且更便宜的方法。文献号MX2009004974公开了用于细胞培养基设计的合理方法，其中基于培养的细胞的蛋白质含量、所表达的重组蛋白质的氨基酸组成和细胞维持需求来计算培养基中的氨基酸浓度。

如今存在可用于较少经验性和倾向（tendencially）机械性的培养基设计的更先进的系统生物学工具。Kell和同事显示出在外代谢物组(所有细胞外代谢物的浓度)与细胞内状态之间存在紧密联系[9]。他们显示出外代谢物组动力学提供了细胞代谢活性以及间接地基因组和蛋白组状态的信息性和准确的“足迹”。事实上，培养基不仅输送关键的营养物而且还输送参与基因表达调控的小分子和蛋白质(例如[3])。然而先前从未描述过使用外代谢物组来改善培养基的组成。

在文献号WO2004101808中，描述了用于使用基因组学和/或蛋白质组学来开发细胞培养基制剂的方法。其描述了用于配制细胞培养基的方法，包括检测细胞中的序列，所述序列是核酸序列（例如关于基因组的信息）或所表达的氨基酸序列（例如关于蛋白质组的信息），以及配制包含调节所检测的序列或其表达或调节受所检测的序列或其表达影响的细胞过程的分子的细胞培养基，其中不比较所述分子对不同细胞系或不同培养条件的影响。然而，这样的方法提出了3个主要的问题：i)寻找单个分子相互作用已被证明昂贵且困难，ii)在基因表达、蛋白质组与细胞表型之间存在公知的空缺，iii)基因表达或蛋白质组数据的系统性收集是困难且昂贵的。因此使用基因组学和/或蛋白质组学来进行系统性培养基设计在许多情况下可能是不可行的。

调节特定生物化学转化的备选方案是功能导向的工程化，其是本文中所探索的方法。可使用基元通量模式分析（elementary flux modesanalysis）或极端途径分析（extreme pathways analysis）[35]将细胞的代谢分解成基本细胞功能。基元通量模式代表代谢反应的独特且不可分解的亚网络，其以稳定的状态协调工作。基元模式的完整的组代表细胞实现其功能的所有可运行的模式。具体地，细胞的表型，如通过其通量组（fluxome）v定义的，可被表达为基元通量模式的贡献的权重和:

$v={\mathrm{\λ}}_1{e}_1+{\mathrm{\λ}}_2{e}_2+\·\·\·+{\mathrm{\λ}}_K{e}_K=\·\underset{i=1}{\overset{K}{\mathrm{\Σ}}}{\mathrm{\λ}}_i\×e_i---\left(1\right)$

λ_i表示基元通量模式e_i的权重因子，K表示基元通量模式的数目，dim(v)=dim(e_i)=q表示细胞的代谢反应的数目。基元通量模式的总体主要由细胞的基因组确定。从全基因组重构的代谢网络（genome widereconstructed metabolic networks）进行基元模式确定的实例可见于[36]-[38]。将细胞的代谢分解成为基元通量模式先前已被用于支持遗传工程化[39]和功能基因组学[40]。然而，基本功能导向的基质设计法（其为本文中所描述的方法）先前从未被尝试过。下文中描述的方法因而被称为功能环境学，因为其基于环境变量（即介质因子）对细胞功能的影响的系统性表征。虽然功能基因组学目前是细胞生物学研究中非常活跃的领域，其补充性的功能环境组学在精神健康障碍（mental health disorders）的情境中已被提及[41]但在细胞生物学情境中之前未曾被提及，也从未被用于细胞培养基设计。

发明概述

先前报导的细胞培养基最优化法明显地是经验性的。因为细胞培养基包含许多成分，需要优化大量的介质因子，这最终需要进行数目呈指数增加的实验。例如，具有潜在的相互作用的10种介质因子的2水平因子设计将需要2^10=1024个筛选实验。进行这样大量的实验的理由在于介质因子的生物化学功能及它们的相互作用通常是未知的。

这样，本发明描述了用于细胞培养基开发的方法，该方法主要集中于阐明介质因子的功能。本发明的方法中所采用的一般原理在图1中经图式阐述。靶细胞的基因组界定其基元通量模式的范围，然而，是细胞的环境（即介质因子）设定基元通量模式的相对强度以支持细胞的表型。因此，所述方法的目的在第一阶段中是鉴定介质因子如何控制基元通量模式的相对强度，即功能环境学分析。这是通过进行实验方案来实现的，其中进行一系列细胞培养实验，其中向基线介质因子中引入扰动，获得并分析了反应外代谢物组数据。将这样获得的数据加工成为基本细胞功能相对于介质因子的功能环境学图谱的形式。在第二阶段中，由所述功能环境学图谱，开发了增强或抑制靶基元细胞功能的最优化的培养基制剂，以强加所需表型。

此种方法相对于目前使用的方法提供了若干益处:

-其使得能够通过同时调整若干靶代谢目标来工程化细胞的代谢。

-其为较少经验性的，从而可更容易地被推广或外推至共有给定的一组基因的不同细胞种类。由于基因的功能在不同物种之间倾向于保守，环境变量的功能在不同物种之间也倾向于保守。

-培养基设计因此是基于可随着时间而增加的知识，而无需重复先前已探究的条件。

-一旦建立了充足的知识基础，培养基设计就需要少得多的实验。理论上，如果知识基础足够准确，则需要单步设计来最优化靶细胞的代谢。如实施例4和5中所示，单个设计步骤可引起60%至100%的范围内的蛋白质生产率的提高。

发明详述

在下文中，详细描述了用于进行本发明的最佳模式。

本发明的方法的独特特征在于通过特定的实验方案联合筛选介质因子和基本细胞功能以提取数据，随后将所述数据加工为功能环境学图谱的形式。在进行实验方案之前，必须明确阐述培养基将被设计成的生物学结构（在此称为“靶标生物学结构”）。其可以是全细胞、细胞器或表示给定的细胞功能的协同的一组生物化学反应。所述靶标生物学结构由q个生物化学反应和相关的基因和蛋白质表示（如果它们是已知的话）。一旦该结构被明确阐述，则建立作为基础的N个因子和K个基本细胞功能的工作组。

通过N个介质因子的值来定义培养基制剂:

培养基制剂={FAC_j},j=1,…,N,

FAC_j是介质因子j的值。所述介质因子可以是物理化学性质(例如温度、摩尔渗透压浓度或离子强度)、已知的或未知的分子种类的浓度或释放速率，或具有已知或未知组成的混合物的浓度或释放速率。

靶标生物学结构由q个生物化学反应来定义，其被转化成为K个基本细胞功能：

靶标生物学结构={e_i},i=1,…,K。

可通过应用公共域生物信息学算法[17]（例如基元通量模式分析或极端途径分析）来获得q个生物化学反应至K个基本细胞功能的转化。实验例1阐释了如何获得酵母巴斯德毕赤酵母X33的基本细胞功能。

一旦已知该一般结构，则如下应用包括4个步骤的方法（参见图2）：

步骤1-细胞培养物阵列

步骤1.1-在摇瓶、T形瓶或反应器中（优选在高通量培养设备例如微量滴定板、生物微反应器或表型微阵列中）以不同的培养基组成进行至少N+1(介质因子的数目+1)个细胞培养实验。定义每个实验中所筛选的培养基组成使得产生足够的实验数据用于相对于培养基因子值而对基本细胞功能权重因子进行线性回归。实施例2对于11种介质因子的情况阐释了这一过程，其使用D-最优设计法进行线性功能鉴定，其中定义了24个独立的实验，其由介质因子值的2-水平组合组成。此外，此类培养基制剂可包括被标记的底物例如¹³C-底物，用于分析目的，即促进筛选基本细胞功能和/或蛋白质抑制因子或激活因子，或干扰核糖核酸或者敲高（knock up）或敲低（knock down）基本细胞功能的其它功能性分子。

步骤1.2-优选使用快速高通量分析技术（例如1H-NMR、13C-NMR或其它NMR技术、或与质谱法联合的色谱法例如GC-MS或LC-MS或单独的质谱技术）获得每一个所进行的细胞培养的初始和终点外代谢物组数据，即大量代谢物的浓度，以及细胞浓度的数据。可用更为常规的代谢物特异性分析法例如酶促试剂盒或高效液相色谱(HPLC)来补充该分析。

步骤1.3-通过相对于介质因子而对基本细胞功能权重因子的线性回归来预筛选活性基本细胞功能。这类权重因子获自初始和终点外代谢物组数据。首先，根据公式（2）或任何其它近似方法测定代谢物的改变速率，以从性质的时间系列测量计算所述性质的改变速率，

$v=\frac{1}{C_X}\frac{{\mathrm{dC}}_{\mathrm{Mi}}}{\mathrm{dt}}\≈\frac{1}{C_X}\frac{{\mathrm{\ΔC}}_{\mathrm{Mi}}}{\mathrm{\Δt}},---\left(2\right)$

C_Mi是代谢物i的浓度，C_X是细胞浓度，t是培养时间。

然后，对于所有K个基本细胞功能，通过应用下列公式测定潜在的最大e_i权重因子值：

λ_i=v e_i,i=1,…,K                          (3)

然后，根据公式（4）进行λ_i相对于介质因子的线性回归

${\mathrm{\λ}}_i=\·\underset{j=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{I}_{j,i}\×{\mathrm{FAC}}_j---\left(4\right)$

I_j,i是表示培养基因子FAC_j对细胞功能e_i的活化的强度的回归参数。随后从低至高的λ_i对介质因子值的相关系数对基本细胞功能进行排序。备选地，根据从低至高的速率数据的可释方差（explainedvariance）v对基本细胞功能进行排序。随后选择一个亚组的K’（<<K）个具有最高的相关系数和最高的可释方差的细胞功能，用于在步骤1.4中进行进一步筛选。

步骤1.4-以与步骤1.1相似的方式利用不同的细胞培养基组成进行至少K’+1个细胞培养实验。但现在的策略为筛选基本细胞功能权重因子的低和高的值的组合。理想地，应当进行2^K个实验来筛选所有可能的组合。实际上，并非全部K个基本细胞功能均可被筛选，因为它们的数目可容易地增加至数百万的范围。然而，在先前的步骤1.3中，获得了K’个具有最高的对细胞表型的贡献和最高的与培养基组成的相关性的基本细胞功能的预选择，这很少超过K’=20。对于该第二轮实验，使用在先前的步骤中测定的强度值I_j,i，围绕基线配方修饰了培养基组成。这些强度值定义介质因子值的改变方向，以根据公式（5）上调或下调基本细胞功能:

Δ(λ_i)=·I_j,i×Δ(FAC_j).                       (5)

步骤2-功能环境图谱

对于步骤1中进行的实验的总体，将培养基组成数据组织在数据矩阵X={Fac_i,j}（M种培养基制剂的M×N矩阵，其中M≥N+K'+2）中，并将分别测量的通量数据组织在R={v_i}（所测量的通量的M X q矩阵）中。随后，在基本细胞功能的整个组中确定一个与介质因子紧密关联的基本细胞功能亚组，并通过相对于满足下列标准的培养基组成数据X={Fac_i,j}对R={v_i}进行回归分析，而确定所述亚组对于所观察到的细胞表型的权重因子R={v_i}:

a.使外代谢物组数据的捕获方差（captured variance）和/或外代谢物组datam的改变速率R={v_i}和/或获自外代谢物组数据的其它信息最大化。

b.使基本细胞功能权重因子与介质因子之间的关系或它们的值的转换最大化。

c.使用于捕获外代谢物组数据的给定的方差所需的基本细胞功能的数目和/或外代谢物组数据的改变速率R={v_i}和/或获自外代谢物组数据的其它信息最小化，即使冗余度最小化。

可通过根据下列公式使培养基组成数据X={Fac_i,j}与所测量的相应通量数据R={v_i}之间的协方差最大化来满足这些标准:

$\begin{array}{cc}\underset{I}{\mathrm{Maximize}}& \mathrm{cov}(X,R)\\ s.t.& \left\{\begin{array}{c}R=\mathrm{\&Lambda;}\&times;{\mathrm{EM}}^T\\ \mathrm{\&Lambda;}=X\&times;I^T\end{array}\right.\end{array}---\left(6\right)$

EM={e_i}是K个基本细胞功能的q×K矩阵，e_i(dim(e_i)=q),Λ={λ_i}（基本细胞功能(dim(λ_i)=M)的权向量λ_i的M×K矩阵）和I={I_i,j}（强度参数的K×N矩阵，其为解出公式(6)的自由度）。可使用数种方法来解公式(6)。一种有效的方法包括根据公式(7a-c)依次进行基本细胞功能分解

X=T·W^T+EF_X                         (7a)

R=Λ×EM^T+EF_R                       (7b)

Λ=T·B^T+EF_Λ                       (7c)

EF_i是最小化的剩余矩阵，W是载荷系数的矩阵，B是回归系数的矩阵。最后，强度矩阵I由下式给出

I=·B·W^T                           (8)

此过程的结果是对与培养基组成紧密关联的基本细胞功能的亚组的辨别。此信息最终可被组织在N×K数据阵列（称为功能环境学图谱(FEM)）中:

功能环境学图谱=I^T={I_j,i},j=1,…,N i=1,…,K

行表示介质因子，列表示基本细胞功能的总体，I_j,i表示基本细胞功能i被介质因子j上调或下调的相对“强度”。

完成这些步骤需要筛选大量培养基制剂，这是昂贵的。然而，一旦进行，便建立了关于环境-功能性质的细胞指纹。此外，功能环境学图谱以与基因功能保守的方式相同的方式保守。这样，预期对于不同基因型内给定的功能鉴定的模式显示反映基因与环境之间的决定性关联的关键的相似性。实施例3阐释了对酵母巴斯德毕赤酵母X33的功能环境学图谱的构建。

步骤3-最优化的培养基制剂

在培养基设计中，理想地应当能够按照用户需要精细地调节细胞功能性。通过结合所需的功能性与功能环境学图谱的信息，有可能推断出关于如何以增强所需功能性的方式相对于一些基线配方调节培养基组成的先验规则。这允许大幅减少用于培养基设计的实验次数。在限制内（In limit），如果功能环境学图谱中的信息足够准确，则单一设计步骤产生几乎最佳的培养基制剂。更具体地，程序如下：

FEM矩阵的每一列保有应如何调整基线介质因子的值以增强或抑制特定基本细胞功能的信息。更具体地，应当根据下列公式改变新的介质因子的值:

${\mathrm{FAC}}_j^{\mathrm{opt}}=(1+{\mathrm{\&eta;}}_i{I}_{\mathrm{ij}}){\mathrm{FAC}}_j^{\left(0\right)}---\left(9\right)$

表示介质因子j的基线值，

表示介质因子j的最优化的值，I_j,i表示功能环境学图谱的第j行和第i列的强度值，ηi表示基本细胞功能i(设计参数)的所需增强系数。可从功能环境学图谱的列推断出细胞功能特异性培养基补充配方。或者，可通过将增强系数同时用于若干基本细胞功能来获得全局性最优化的培养基制剂。

步骤4-最终的验证步骤

在如步骤1中所述的另外的培养实验中筛选了新优化的培养基制剂。然而实验次数现在少得多，通常将给定的最优化的培养基制剂一式三份。

在步骤4结束时，预期生产率和/或产物质量或总体培养性能增益远超基线培养基制剂。生产率的增加显然是取决于情形。实施例4、5和6显示对于重组巴斯德毕赤酵母X33菌株如何可获得在60%-100%的范围内的生产率增加。

发明概括

本发明的目的是用于确定最佳细胞培养基组成的方法，其包括下列步骤：

a)阐明培养基将被设计成的生物学结构;

b)建立前述生物学结构的N个介质因子和K个基本细胞功能的工作组；

c)通过如下步骤建立靶标生物学结构的K个基本细胞功能相对于N个介质因子的功能环境学图谱：

-进行第一轮培养实验，其包括数目等于或高于介质因子的数目+1(N+1)的培养，其中以不同的培养基组成进行每一个培养，其中筛选介质因子的低和高水平的组合;

-对于所进行的每一个培养实验，获得初始和终点生物质、产物和外代谢物组数据;

-通过外代谢物组数据或衍生的外代谢物组数据相对于培养基组成数据的回归分析确定显示与介质因子的高相关系数的K’个活性基本细胞功能的亚组;

-进行第二轮培养实验，其包括数目等于或高于活性细胞功能的数目+1(K’+1)的培养，其中以不同的培养基组成进行每一个培养，其中筛选基本细胞功能的低和高强度水平的组合;

-通过根据下列公式使培养基组成数据X={Fac_i,j}与所测量的相应通量数据R={v_i}之间的协方差最大化来由在先前的步骤中收集的数据建立功能环境学图谱:

$\begin{array}{cc}\underset{I}{\mathrm{Maximize}}& \mathrm{cov}(X,R)\\ s.t.& \left\{\begin{array}{c}R=\mathrm{\&Lambda;}\&times;{\mathrm{EM}}^T\\ \mathrm{\&Lambda;}=X\&times;I^T\end{array}\right.\end{array}---\left(6\right)$

并且以功能环境学图谱的形式组织数据，其中将强度值置入N×K数据阵列的形式中:

功能环境学图谱=I^T={I_j,i};

d)通过下列步骤，使用功能环境学图谱最优化培养基组成

-使用功能环境学数据矩阵配制基本细胞功能特异性培养基组成，其中根据下列公式，介质因子值的变化Δ(FAC_j)导致基本细胞功能的相对权重的变化Δ(λ_i)

Δ(λ_i)=·I_j,i×Δ(FAC_j)               (5)

-使用对功能环境学图谱的第i列应用的公式(5)配制细胞培养基组成以增强或抑制单个基本细胞功能;

-使用同时对功能环境学数据阵列图谱的多列应用的公式(5)来配制细胞培养基组成，以通过增强或抑制关键的基本细胞功能组来工程化细胞代谢。

在优选的实施方案中:

-所述靶标生物学结构可以是细胞组织、全细胞、细胞器或表示给定的细胞功能的一组协同的代谢反应;

-介质因子是必需营养物和/或微量营养物和/或功能性分子的物理化学性质、浓度和/或释放速率。

-所述物理化学性质是温度、压力、pH、离子强度和/或摩尔渗透压浓度。

在另一个优选的实施方案中，使用下列公式，通过N个介质因子的值确定培养基制剂：

培养基制剂={FAC_j},j=1,…,N,

FAC_j表示介质因子j的值;使用下列公式通过K个基本细胞功能确定靶标生物学结构:

靶标生物学结构={e_i},i=1,…,K。

在另一个优选的实施方案中，从所述靶标生物学结构的生物化学网络获得基本细胞功能，其中将所述生物化学网络细分为K个功能性亚网络，所述亚网络包含生物化学转化的亚组，其中通过应用所述靶标生物学结构的代谢网络的基元流量模式算法或极端途径算法或其它零空间分析算法（null space analysis algorithm）或其它零空间凸分析算法（null space convex analysis algorithm）手动地和/或自动地获得此类亚网络。

在另一个优选的实施方案中，从所述靶标生物学结构的生物化学网络的基因组规模的重构获得基本细胞功能，其中可使用转录组数据和/或蛋白质组数据和/或内代谢物组（endometabolome）数据和/或热动力学数据（如果这些数据是可获得的话）预减小K个基本细胞功能的工作组。

在另一个优选的实施方案中，通过在摇瓶、T形瓶、反应器、微量滴定板、生物微反应器或表型微阵列中进行的系列和/或平行培养实验来确定功能环境学图谱。优选地，通过外代谢物组测定来确定功能环境学图谱，所述测定包括通过下述来分析上清液：NMR技术例如1H-NMR或13C-NMR，通过色谱技术例如液相色谱(LC)或气相色谱(GC)、质谱技术(MS)或与质谱法联合的色谱法例如GC-MS或LC-MS。

在另一个优选的实施方案中，通过线性或非线性回归分析鉴定活性基本细胞功能的减小的组，其中使外代谢物组数据或衍生的外代谢物组数据的方差或协方差最大化，其中使外代谢物组数据或衍生的外代谢物组数据与介质因子的值之间的相关性最大化，其中根据它们与介质因子的值的相关性或对所述值的敏感性对基本细胞功能进行排序。

在另一个优选的实施方案中，通过高通量自动化系统确定功能环境学图谱，其中将培养装置、分析外代谢物组装置和计算机算法连接在物理设备中以产生高通量功能环境学图谱。

利用本发明的方法，产物基元流通模式增强60至100%。

本发明的另一个方面是上述方法用于最优化植物界或动物界细胞系或其它真核单细胞或多细胞生物体例如酵母和真菌的细胞培养基的组成、优选用于最优化原核生物的细胞培养基的组成以及用于最优化干细胞的细胞培养基的组成的用途。

本发明的另一个方面是基本细胞功能的生物标志物标识。使用本发明的方法发现与单个基本细胞功能强烈相关的由细胞排泄或分泌的以及在外代谢物组中检测到的培养基组分，可作为该基本细胞功能的生物标志物。

本发明的另一个方面是靶向基本细胞功能的药物设计系统，其包括上述方法。被发现与疾病状况相关性基本细胞功能强烈相关的化合物可构成用于治疗该疾病的药物候选物。

附图简述

图1表示本发明的方法的概念化方法，即用于功能定向的培养基工程化，其中λ_i表示受介质因子控制的基本功能权重因子，e_i表示由基因赋予的基本细胞功能。

图2是本发明的方法的主要步骤的图示，其中步骤1A-表示细胞培养物的组，B-表示初始和终点外代谢物组测定；步骤3表示功能环境学图谱，其中xx轴中表示基因总体的基本细胞功能组，yy轴中表示介质因子；步骤3表示最优化的细胞培养基的配方，步骤4表示在最优化的培养基制剂中、在一式三份的细胞培养中进行的最终验证。

图3示例了将本发明的细胞培养方案用于重组巴斯德毕赤酵母X33菌株的应用。其提供了在110小时的温育时间后，26个培养实验的生物质浓度、产物浓度和铵浓度的结果。

图4显示重组巴斯德毕赤酵母X33菌株的低分辨率功能环境学图谱。

实施例

在下文中，更详细地描述了本发明（特别是参考实施例），然而所述实施例不意在限定本发明。

实施例1–对于酵母巴斯德毕赤酵母X33的基本细胞功能

在本文中，描述了用于获得重组酵母巴斯德毕赤酵母X33菌株的基本细胞功能的工作组的步骤。

首先，根据文献来源即KEGG数据库[30]以及Chung等人[31]和

等人[32]的论文建立了代谢网络。与每一个反应相关的基因在大多数情况下是已知的，并且可见于Chung等人[31]中。通过将合成代谢途径一起组合在单个反应中来进一步简化所述代谢网络。所产生的代谢网络具有99个反应（从而为99个通量），89种细胞内代谢物和9种细胞外代谢物。代谢反应的完整的组列于表1中。

表1-表达实验式CH_1.965N_0.271O_0.535S_0.006的蛋白质的重组巴斯德毕赤酵母X33菌株的代谢反应的列表

将开放源生物信息学软件METATOOL5.0[33]用于计算表1中所述的代谢网络的基元通量模式。基元通量模式的总数为3368个。在下面的行中，是利用METATOOL.5.0[30]获得的指定的5个基元通量模式。注意，每一个基本流通模式向量的维是99并且其中的值表示该特定基元流通模式的给定的代谢反应的权重。基元模式9和10对应于生物质合成，基元模式3和12对应物产物合成，基元模式5对应于分解代谢。发现这些基元流通模式在本发明方法后面的步骤中是最重要的并且这是我们在此处详细说明的理由:

实施例2-用于筛选用于酵母巴斯德毕赤酵母X33的N=11种介质因子的24个培养实验的阵列

此处描述了对于酵母巴斯德毕赤酵母X33如何进行筛选实验。

选择了11种介质因子(N=11)用于筛选(表II中所列的)。每一种介质因子作为取自Invitrogen指南[34]的基线值、-1水平(为所述基线值的10倍更低)和+1水平（与基线值一致）

用不同的培养基组成在250mlT形瓶中进行了一系列24=2×(N+1)个细胞培养加上2个对照实验。在每一个实验中待测试的介质因子的值的组合列于表III中。使用24个单独的实验，通过线性功能鉴定的D-最佳设计获得了这些。

表II–用于细胞培养实验的介质因子、各自的基线值以及较高值（upper value）(+1)和较低值（lower value）(-1)的列表。最终培养基制剂分别包含1:200(v/v)的PTM1和稀释的BSM溶液的混合物。

(1)毕赤酵母痕量金属盐补充剂(PTM1)(参见[34])

(2)基底盐介质溶液组成是:H3PO485%,26.70ml/L,CaSO4.2H2O0.93g/L,K2SO418.20g/L,MgSO4.7H2O14.90g/L,KOH4.13g/L

表III:用于11种因子(列)和24个实验(行)的线性功能鉴定的D-最佳实验设计。表I中指定了+1和-1水平。

(1)对照实验

根据下列实验程序配制了具有表II和III中所示组成的每一种培养基。用甘油(20g/L的浓度)补充40ml经稀释的BSM溶液（参见表II），在121℃下高压灭菌30分钟。BSM的pH为约1.5，并且必须在高压灭菌后通过添加25%的氢氧化铵将其调整至5.0的工作pH。氢氧化铵也作为氮源。首先通过用0.22nm孔径的过滤器进行过滤来对PTM1痕量盐储液进行灭菌，然后将所述储液以1:200(v/v)PTM1:BSM的比率添加至经高压灭菌的BSM溶液。

将包含细胞的冻存管储存在-80℃。用1ml细胞储液和40ml具有基线组成（表II）的培养基制备预接种物，随后在4300振荡培养箱中在30℃和150rpm下进行温育。当预接种物达到指数生长时（在约26小时的温育时间后），将2mL的所述预接种物用于平行接种所有26个T形瓶。

将26个T形瓶的每一个在Innova4300振荡培养箱中于30℃和150rpm下温育110小时。以24小时的间隔采集样品。就下列化合物而言分析每一个样品

-通过600nm处的光密度(OD600)和湿细胞重量法（wet cellweight method）(以15000rpm离心，随后不干燥而称重)测定生物质浓度。

-通过酶联免疫吸附测定（ELISA)来测定产物浓度。

-通过高效液相色谱(HPLC)测定甘油和数种有机酸（苹果酸、琥珀酸、乳酸、甲酸、富马酸）在上清液中的浓度。

-使用电极(Thermo Electron Corporation,Orion9512)测量铵浓度。

图3a-c显示26个实验结束时的生物质浓度、产物浓度和铵浓度。甘油和有机酸浓度显示于表IV中。有机酸化合物显示了残留浓度。甘油在所有情况下被完全耗尽。

表IV-在第110小时通过HPLC测定的外代谢物组数据(甘油和有机酸浓度)

实施例3-巴斯德毕赤酵母X33的功能环境学图谱

此处示例了如何能够将实施例2中所收集的实验数据加工成为酵母巴斯德毕赤酵母X33的功能环境学图谱的形式。

首先，通过下列公式计算每一种化合物的变化速率:

$v_i^k=\&CenterDot;\frac{C_{\mathrm{Mi}}^k\left(t_{\mathrm{batch}}\right)-C_{\mathrm{Mi}}^k\left(0\right)}{C_X^{\mathrm{av}}{t}_{\mathrm{batch}}}---\left(10\right)$

C_Mi(0)为初始浓度，C_Mi(t_batch)为终点浓度，X_av为平均细胞浓度，t_batch为批次实验的持续时间。注意上标指数表示实验，而下标指数表示化合物。

随后使用下列线性模式进行v相对于介质因子的值的统计学回归分析:

$v=\&CenterDot;\underset{i=1}{\overset{K}{\mathrm{\&Sigma;}}}{\mathrm{\&lambda;}}_i\&times;e_i---\left(1\right)$

${\mathrm{\&lambda;}}_i=\&CenterDot;\underset{j=1}{\overset{N}{\mathrm{\&Sigma;}}}{I}_{j,i}\&times;{\mathrm{FAC}}_j---\left(4\right)$

最后通过将强度值置于N×K阵列的形式中来将所述数据组织为功能环境学图谱的形式:

功能环境学图谱={I_j,i}。

该过程的最终结果显示在表V中并且在图4中表示。

表V-巴斯德毕赤酵母X33的功能环境学图谱。仅显示了最显著的基本细胞功能。去除了所有低于标准偏差的1%的所有强度值。该数据的图象表示显示在图4中。

	e10	e12	e5	e9	e3
						CuSO4.5H2O	0.06	0.13	0.09	-0.06	-0.05
NaI	0.04	0.18	-0.16	0.00	0.04
						MnSO4.H2O	-0.16	0.21	0.00	-0.03	0.00
Na2MoO4.2H2O	0.07	0.04	0.05	-0.03	-0.01
						H3BO3	0.01	-0.15	0.02	-0.02	-0.02
CoCl2.6H2O	-0.02	-0.21	0.06	-0.02	0.01
						ZnCl2	-0.02	0.15	0.11	-0.10	0.00
FeSO4.7H2O	-0.76	0.01	0.19	-0.32	-0.02
						生物素	-0.04	0.06	0.25	-0.07	-0.05
H2SO4	-0.20	0.06	0.24	0.05	0.00
						BSM*	0.43	-0.24	-0.30	0.27	-0.02

实施例4-使产物基本功能增强60%的增强系数的最优化的培养基制剂

在此显示了如何可使用功能环境学图谱中包含的信息获得具有比基线培养基制剂的产物比生产率高得多的产物比生产率的最优化的培养基制剂。

首先，使用公式(6)进行了介质因子的值的反复调整，从而v_产物=0.16μg/g干细胞重量/天的靶比生产率对应于相对于基线实验的60%的提高。

${\mathrm{FAC}}_j^{\mathrm{opt}}=(1+{\mathrm{\&eta;}}_i{I}_{\mathrm{ij}}){\mathrm{FAC}}_j^{\left(0\right)}---\left(9\right)$

此方法产生下列最优化的培养基组成。

最优化的配方

CuSO₄.5H₂O,7.25g/L,NaI,0.106g/L,MnSO₄.H₂O,1.152g/L,Na₂MoO₄.2H₂O,0.036g/L,H₃BO₃,0.013g/L,CoCl₂.6H₂O,0.25g/L,ZnCl₂,25.2g/L,FeSO₄.7H₂O,5.34g/L,生物素,0.038g/L,H₂SO₄,1.989mL/L,稀释的BSM,0.84:1(v/v)

使用基线培养基制剂（表II中指定的对照实验）或最优化的培养基制剂进行T形瓶（T-flask）培养实验。所应用的方案是实施例2中所描述的方案。最终测量的比生产率如下：

基线配方:0.10μg/g干细胞重量/日

最优化的配方：0.17μg/g干细胞重量/日

相对于基线配方获得了62.3%的增强系数。

实施例5-使产物基本功能增强100%的增强系数的最优化的培养基制剂

进行了与实施例4类似的程序，但靶向v_产物=0.20μg/g干细胞重量/日的甚至更高的比生产率，其对应于相对于基线实验的100%的提高。所获得的最优化的培养基制剂如下：

最优化的配方

CuSO₄.5H₂O,12.0g/L,NaI,0.16g/L,MnSO₄.H₂O,6.00g/L,Na₂MoO₄.2H₂O,0.40g/L,H₃BO₃,0.001g/L,CoCl₂.6H₂O,0.25g/L,ZnCl₂,40.0g/L,FeSO₄.7H₂O,3.25g/L,生物素,0.4g/L,H₂SO₄,10.0mL/L,稀释的BSM,0.25:1(v/v)

以与实施例4类似的方式，使用基线培养基制剂或最优化的培养基制剂进行了T形瓶培养实验。最终测量的比生产率如下：

基线配方：0.10μg/g干细胞重量/日

最优化的配方：0.22μg/g干细胞重量/日

相对于基线配方获得了104.7%的增强系数。

实施例6-在50升的试验规模（pilot scale）生物反应器中通过酵母巴斯德毕赤酵母X33产生的重组蛋白质生产的增加

在本实施例中使用了与先前实施例中使用的相同的巴斯德毕赤酵母X33菌株。将该菌株培养在50升的试验反应器中。使用基线培养基制剂（表II中指定的）或实施例5的最优化的培养基制剂进行了两个50升的试验实验，所述最优化的培养基制剂包括：

CuSO₄.5H₂O,12.0g/L,NaI,0.16g/L,MnSO₄.H₂O,6.00g/L,Na₂MoO₄.2H₂O,0.40g/L,H₃BO₃,0.001g/L,CoCl₂.6H₂O,0.25g/L,ZnCl₂,40.0g/L,FeSO₄.7H₂O,3.25g/L,生物素,0.4g/L,H₂SO₄,10.0mL/L,稀释的BSM溶液,0.25:1(v/v)

对于所述最优化的配方，将稀释的0.25:1(v/v)BSM溶液在121℃下灭菌30分钟；随后添加具有实施例5的相同组成的PTM1痕量盐储备最优化的溶液。

对于基线配方，将未稀释的BSM溶液在121℃下灭菌30分钟；随后添加具有表II中指定的组成的PTM1痕量盐储液。

如下，对于基线和最优化的培养基制剂所有随后的步骤均相同。

用一个冻存管的巴斯德毕赤酵母细胞储液接种包含40ml的上述经灭菌的培养基的摇瓶，在30℃下温育3天，以150rpm搅拌；将10ml的该预接种物用于接种含有750ml的最优化的培养基的摇瓶。使该接种物在30℃下,150rpm,(OD600nm=2-6)下生长3天，并将其用于接种生物反应器。以15的经灭菌的培养基的起始体积接种所述反应器。以批次模式运行反应器约30小时，然后在甘油批次补料中培养100小时。将培养温度控制在30℃，通过添加25%的氢氧化铵将pH控制在5.0。在甘油批次补料中，通过闭环操纵甘油的给料速度而使溶解氧在低水平（5%的饱和度）保持恒定。在第90小时的培养时，两个实验的终产物产生如下：

用基线培养基制剂进行的50升试验实验：终蛋白质滴度为219.32mg/L，终蛋白质产率为0.27mg蛋白质/g湿细胞重量

用最优化的培养基制剂进行的50升试验实验：终蛋白质滴度为258.04mg/L，终蛋白质产率为0.38mg蛋白质/g湿细胞重量

相对于基线配方，用最优化的培养基制剂获得了终产物滴度的18%的增强系数以及终蛋白质产率的38%的增强系数。

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下列权利要求另外地提供了本发明的优选实施方案。

Claims (26)

1.用于确定最佳细胞培养基组成的方法，其特征在于下列步骤:

a)选择靶生物学结构;

b)建立K个基本细胞功能的组，其设置自主的和模块化的生物学功能，其将结果一起组合成为靶标生物学结构的功能；

c)建立N种介质因子的组，其决定靶标生物学结构的环境；

d)使用新鲜的和/或经消耗的培养基样品的上清液的外代谢物组的实验数据建立功能环境学图谱，其表示N种介质因子的每一个对K个基本细胞功能的每一个的活化或抑制的强度；

e)使用功能环境学图谱最优化定向为活化或抑制一个或多个基本细胞功能的细胞培养基的组成。

2.权利要求1的方法，其中步骤d)中的功能环境学图谱的构建包括下列步骤：

-进行第一轮培养实验，其包括数目等于或高于介质因子的数目+1(N+1)的培养，其中在不同的培养基组成中进行每一个培养，其中筛选了介质因子的低和高水平的组合;

-对于每一个所进行的培养实验，获得初始和终点生物质、产物和外代谢物组数据或部分外代谢物组数据；

-使用下列线性模型，通过外代谢物组数据或衍生的外代谢物组数据相对于培养基组成数据的回归分析确定其相对权重因子λ_j大于零的活性基本细胞功能的亚组，

$v=\&CenterDot;\underset{i=1}{\overset{K}{\mathrm{\&Sigma;}}}{\mathrm{\&lambda;}}_i\&times;e_i---\left(1\right)$

${\mathrm{\&lambda;}}_i=\&CenterDot;\underset{j=1}{\overset{N}{\mathrm{\&Sigma;}}}{I}_{j,i}\&times;{\mathrm{FAC}}_j---\left(4\right)$

v向量，其元素表示所测量的外代谢物组组分的改变速率;I_i,j是通过回归分析确定的介质因子i对基本细胞功能j的活化的强度参数；

-进行第二轮培养实验，其包括数目等于或高于活性细胞功能的数目+1的培养，其中在不同的培养基组成中进行每一个培养，其中使用先前测定的强度参数值I_i,j设置每一个培养基组成以筛选活性基本细胞功能的低和高的权重因子值，例如以鉴定被介质因子控制的活性细胞功能的亚组；

-使用公式(3a)和(3b)通过线性回归分析从在所有之前的步骤中收集的数据建立功能环境学图谱，并且以功能环境学图谱的形式组织所述数据，其中用第二轮实验的数据改善用第一轮实验测定的强度值I_i,j，随后将其置于N×K数据阵列的形式中:

功能环境学图谱={I_i,j}。

3.权利要求1的方法，其中步骤e)中的培养基组成的最优化包括下列步骤：

-使用功能环境学数据矩阵配制基本细胞功能特异性培养基组成，其中根据下列公式，介质因子值的变化Δ(FAC_j)引起基本细胞功能的相对权重的变化Δ(λ_i)

Δ(λ_i)=·I_j,i×Δ(FAC_j)              (5)

-使用应用于功能环境学数据阵列的第j列的公式(4)配制细胞培养基组成以增强或抑制单个基本细胞功能j；

-使用同时应用于功能环境学数据阵列的多列的公式(4)来配制细胞培养基组成，以通过增强或抑制关键的基本细胞功能组来工程化细胞代谢。

4.根据前述任一权利要求的方法，其中所述靶标生物学结构是细胞组织、全细胞、细胞器或表示给定的细胞功能的协同的生物化学转化组。

5.权利要求1-3中的任一项的方法，其中所述靶标生物学结构被遗传修饰，包括定向为活化或抑制基本细胞功能的遗传修饰。

6.权利要求1-3中任一项的方法，其中介质因子是必需营养物和/或微量营养物和/或生物功能性分子的固体和/或液体或/或气体混合物的物理化学性质，或所述化合物的释放速度或所述化合物的进料速度。

7.权利要求1-3和6中任一项的方法，其中所述物理化学性质包括温度和/或压力和/或pH和/或离子强度和/或浓度和/或活性和/或同渗重摩和/或摩尔渗透压浓度和/或相关性质。

8.权利要求1-3和6中任一项的方法，其中必需营养物和/或微量营养物和/或功能性分子包括无机和/或有机材料，包括盐和/或维生素和/或代谢辅因子和/或抗生素和/或碳水化合物材料和/或脂质材料和/或蛋白质性质材料和/或核苷酸材料和/或信号转导蛋白和/或酶活性的抑制分子和/或蛋白质的激活分子和/或基因转录调节因子和/或干扰核糖核酸和/或具有已知或未知组成的所述材料的复杂混合物，包括血清或者纯的或复杂的有机材料的水解产物。

9.根据前述任一权利要求的方法，其中使用下列公式通过N种介质因子的值确定培养基制剂:

培养基制剂={FAC_j},j=1,…,N,

FAC_j为介质因子j的值。

10.根据前述任一权利要求的方法，其中使用下列公式通过q个生物化学反应和K个基本细胞功能确定所述靶生物学结构:

靶标生物学结构={e_i},i=1,…,K,

e_i为q个元素的向量，其值表示基本细胞功能i的每一个生物化学反应的权重因子。

11.根据前述任一权利要求的方法，其中所述基本细胞功能获自所述靶标生物学结构的生物化学网络，其中所述生物化学网络被细分为K个包含生物化学转化的亚组的功能性亚网络，其中手动地和/或自动地获得此类亚网络。

12.根据前述任一权利要求的方法，其中基本细胞功能获自所述靶标生物学结构的生物化学网络的基因组规模重构，其中可使用转录组数据和/或蛋白质组数据和/或内代谢物组数据和/或热动力学数据来预减小K个基本细胞功能的工作组，如果可获得这些数据的话。

13.根据前述任一权利要求的方法，其中通过在摇瓶、T形瓶、反应器、微量滴定板、微量生物反应器或表型微阵列中进行的系列和/或平行培养实验来确定所述功能环境学图谱。

14.根据前述任一权利要求的方法，其中通过外代谢物组测定来确定所述功能环境学图谱，所述测定包括通过下述来分析新鲜的或经消耗的培养基样品的上清液：色谱技术例如液相色谱(LC)或气相色谱(GC)、NMR技术例如1H-NMR或13C-NMR、质谱技术(MS)或与质谱法联合的色谱法例如GC-MS或LC-MS或所述测量技术的组合。

15.根据前述任一权利要求的方法，其中通过线性或非线性回归分析来鉴定活性基本细胞功能的减小的组，其中使外代谢物组数据或衍生的外代谢物组数据的方差或协方差最大化，其中使外代谢物组数据或衍生的外代谢物组数据与介质因子的值之间的相关性最大化，其中根据它们与介质因子的值的相关性或对所述值的敏感性对基本细胞功能进行排序。

16.根据前述任一权利要求的方法，其中通过高通量自动化系统确定所述功能环境学图谱，其中将培养装置、分析外代谢物组装置和计算机算法连接在物理设备中以产生高通量功能环境学图谱。

17.根据前述任一权利要求的方法，其中与产物数量和/或产物质量相关的靶基本细胞功能i使其相对权重Δ(λ_i)增加60至100%。

18.一种用于培养酵母巴斯德毕赤酵母的化学上确定的培养基制剂，其特征在于使异源蛋白质表达功能增强60至100%，其是通过权利要求1-17中描述的方法获得的，其包含：

a)由CuSO₄.5H₂O,12.0g/L,NaI,0.16g/L,MnSO₄.H₂O,6.00g/L,Na₂MoO₄.2H₂O,0.40g/L,H₃BO₃,0.001g/L,CoCl₂.6H₂O,0.25g/L,ZnCl₂,40.0g/L,FeSO₄.7H₂O,3.25g/L,生物素,0.4g/L,H₂SO₄,10.0mL/L构成的痕量元素的水性溶液;和

b)溶液a)与由H₃PO₄85%,26.70ml/L,CaSO₄.2H₂O0.93g/L,K₂SO₄18.20g/L,MgSO₄.7H₂O14.90g/L,KOH4.13g/L构成的补充性基础水性溶液或其它补充性基础水性溶液的混合物。

19.权利要求1-17中描述的方法的用途，其用于在生物学生产过程中，例如在生物燃料生产中，或疫苗生产中，或药物生产中，或生物聚合物生产中或所述产物的前体的生产中增加下述的数量和/或质量：组织和/或细胞和/或病毒和/或细胞组分和/或蛋白质性质的材料和/或碳水化合物材料和/或核苷酸材料和/或脂质材料和/或初级代谢产物和/或次级代谢产物或所述产物的混合物。

20.权利要求1-17中描述的方法的用途，其用于最优化植物界或动物界细胞系或其它真核单细胞或多细胞生物体例如酵母和真菌的细胞培养基的组成。

21.权利要求1-17中描述的方法的用途，其用于最优化原核生物的细胞培养基的组成。

22.权利要求1-17中描述的方法用于最优化干细胞的细胞培养基的组成的用途。

23.权利要求1-17中描述的方法用于鉴定细胞功能的生物标志物的用途。

24.权利要求1-17中描述的方法的用途，其用于设计药物或用于最优化定向为修饰与疾病状况相关的细胞功能的药物混合物。

25.一种生物标志物标识，其包括权利要求1-17中描述的方法。

26.一种药物设计系统，其包括权利要求1-17中描述的方法。

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