WO2018126530A1 - 环境pH的生物力学测试方法 - Google Patents

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WO2018126530A1
WO2018126530A1 PCT/CN2017/076027 CN2017076027W WO2018126530A1 WO 2018126530 A1 WO2018126530 A1 WO 2018126530A1 CN 2017076027 W CN2017076027 W CN 2017076027W WO 2018126530 A1 WO2018126530 A1 WO 2018126530A1
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冯原
黄珑
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苏州大学张家港工业技术研究院
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    • G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
    • G01Q60/00—Particular types of SPM [Scanning Probe Microscopy] or microscopes; Essential components thereof
    • G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes

Abstract

一种环境pH的生物力学测试方法，包括以下步骤：选取不同的pH环境、不同培养时间下的细胞或组织样本，通过AFM测试仪测量其力学特性，建立细胞或组织的力学特性与pH环境的映射关系；通过AFM测试仪进行挤压测试，得到挤压力学特性曲线；观察挤压力学特性曲线，选取相应的弹性模量计算方法来计算弹性模量E；建立并拟合E＝E(pH，t)的函数或表格；依据E(pH，t)的函数或表格建立基于测量E值的pH与生长时间映射关系；选取所需要检测pH环境中的细胞或组织，测定细胞或组织的弹性模量E，从映射关系中，找到相应的环境pH值与所培养的时间信息。

Description

环境pH的生物力学测试方法
本申请要求了申请日为2017年1月9日，申请号为201710012626.8，发明名称为“环境pH的生物力学测试方法的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及一种环境pH值的测试方法，尤其涉及一种环境pH的生物力学测试方法。
背景技术
生物生长环境的pH值对生物的生长发育与代谢具有重要影响。目前针对生物生长环境pH的检测方法主要包括磁共振成像方法，荧光染色方法，基于纳米微粒的纳米探针方法等。虽然这些方法可以在当前时刻对生物生长环境的pH进行测量，但是难以对生长的环境pH历史轨迹进行追踪和标示。
磁共振成像方法主要针对活体生物组织进行极化的H13CO3 -注射，通过对比H13CO3和CO3 -的信号强度，对细胞组织的生长环境进行pH值的关联和测量。此方法对设备要求较高，需要大型磁共振设备，同时对注射的极化材料有较高要求。
荧光染色法，通过在生物生长环境中加入对pH敏感的荧光材料，通过颜色与pH的关联对环境pH进行检测。虽然此方法是最为广泛应用的技术，但依然需要对环境加入额外材料介质，同时仅能对测试时刻的pH进行评估。
纳米探针方法，通过施加纳米颗粒进行检测pH，主要限制为纳米颗粒对细胞组织的毒理难以确认，同时颗粒对生长环境可能造成影响。
现有技术的主要缺点：1.需要额外的试剂或材料添加入细胞组织的环境中。2.对试剂与材料的制备要求和成本较高。3.可对当前生长环境的pH进行测量，难以对前序生长的pH历史进行追踪。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种环境pH的生物力学测试方法，该方法能够摆脱额外材料与试剂的依赖与添加，对当前和前序pH历史进行 追踪，降低对测试设备的要求，成本低。
本发明提出的一种环境pH的生物力学测试方法，包括以下步骤：
(1)选取不同的pH环境、不同培养时间下的细胞或组织样本，通过AFM测试仪测量其力学特性，建立细胞或组织的力学特性与pH环境的映射关系；
(1.1)测量细胞或组织样本的高度特征，对形态进行测量，通过AFM测试仪进行挤压测试，得到挤压力学特性曲线；
(1.2)观察挤压力学特性曲线，选取相应的弹性模量计算方法来计算弹性模量E；
如未观察到较大的挤压粘连情况，可选用普通的Hertz模型进行模量计算，计算公式为：
Figure PCTCN2017076027-appb-000001
其中，F是测量的挤压力，D是挤压进给位移，α为AFM测试探针的针尖半开角度，V是泊松比；
如果观察到较大的粘连情况，可用DMT模型进行模量计算，计算公式为：
Figure PCTCN2017076027-appb-000002
其中Ftip是AFM测试探针在下压过程中的受力最大值，Fadh是样本与AFM测试探针在回针过程中的粘连力最大值，R是探针尖的弧度半径，d是挤压进给位移，V是泊松比；
或者是采用有限元方法结合逆向算法对测试的细胞或组织样本进行弹性模量计算；
(2)建立并拟合E＝E(pH，t)的函数关系，对于pH与时间点间隔较大较为离散的情况，建立E与pH，t的对应表格；
(3)依据E(pH，t)的函数或表格建立基于测量E值的pH与生长时间映射关系；
(4)选取所需要检测pH环境中的细胞或组织，测定细胞或组织的弹性模量E，从步骤(3)建立的映射关系中，找到相应的环境pH值与所培养的时间 信息。
进一步的，步骤(1)中选取的细胞或组织的pH环境至少有两种。
进一步的，步骤(1)中选取的细胞或组织的培养时间至少有三种。
进一步的，步骤(1)中选取不同的pH环境、不同培养时间下的细胞或组织样本的数量均为20到30个。
进一步的，步骤(1.1)中选取2％到8％的应变量进行挤压测试。
进一步的，步骤(1.1)中AFM测试仪的探针弹性系数为0.01-10N/m。
进一步的，步骤(1.1)中挤压测试的下压深度为应变量与测量样本的平均厚度乘积数值。
进一步的，步骤(1.1)中在AFM显微镜的视野范围内选取可容纳至少一个样本细胞或对象的区域进行挤压测试。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
一、摆脱额外材料与试剂的依赖与添加，对细胞组织生长环境不进行干扰。
二.、对当前和前序pH历史可进行相应追踪。
三、利用通用AFM测试仪，对测试设备要求低，成本低。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为本发明实施例中探针下压与恢复的行程示意图；
图2为本发明实施例中力学测试曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例：以自然环境中常见的曲霉为例，介绍用力学特性对pH进行测定。
步骤1：样本制备。
分别在酸性(pH＝1.5)和中性环境(pH＝6.5)中制备黑曲霉。制备马铃薯葡萄 糖琼脂(PDA)用于培养基。采用200g/L的土豆粉，20g/L的葡萄糖，20g/L的琼脂，和1L水。液态PDA制备不用琼脂。采用1mol/L盐酸和1mol/L的NaOH对培养基溶液pH进行调制。
将黑曲霉的孢子放置在在不同pH值的摇瓶PDA中进行培养，环境温度28℃，摇瓶转动速度为170r/min。用于AFM挤压测试的样本从瓶中取出一滴，置于硅片上。分别对曲霉培养3、5、7天。
步骤2：AFM测试
选用常见的商用AFM测试仪(Dimension Icon，Bruker)开展测量。用铝膜覆盖的硅针头(Tap 150AI-G，Budget Sensors，Innovative Solutions Bulgaria Ltd.，Sofia，Bulgaria)对样本进行挤压测试，探针弹性系数5N/m，下压深度100nm至300nm之间。
在AFM显微镜的视野范围内选取50x50μm2的区域进行测量。探针下压位置选取观察到的孢子或菌丝的中间部位。力学测试曲线可分为下压和恢复两个阶段。下压阶段AFM探针接近孢子或菌丝的表面，恢复阶段AFM探针远离孢子或菌丝的表面。
步骤3：弹性模量计算
在对曲霉的测试中，观察到曲霉的力学测试曲线有较大的粘连特征，因此计算弹性模量(E)采用DMT(Derjaguin–Muller–Toporov)方法，公式为：
Figure PCTCN2017076027-appb-000003
其中Ftip是AFM测试探针在下压过程中的受力最大值，Fadh是样本与AFM测试探针在回针过程中的粘连力最大值，R是探针尖的弧度半径，d是挤压进给位移，V是泊松比。
步骤4：数据分析与pH关联映射建立
分别选取pH＝1.5与pH＝6.5环境中培养了3、5、7天的曲霉孢子进行测试，样本数量分别为30、28、30个和30、30、30个。对于曲霉菌丝在pH＝1.5和pH＝6.5在3、5、7天培养期的样本分别选取30、30、30个和20、30、30个。测量的弹性模量如下表所示：
Figure PCTCN2017076027-appb-000004
通过上述表格，可以发现在酸性环境中，菌丝与孢子随培养时间的增长模量增大，不同pH值的模量对应区别明显。因此，在测定菌丝与孢子弹性模量后，可对应找到相应的环境pH值与所培养的时间信息。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

  1. 一种环境pH的生物力学测试方法，其特征在于：包括以下步骤：
    (1)选取不同的pH环境、不同培养时间下的细胞或组织样本，通过AFM测试仪测量其力学特性，建立细胞或组织的力学特性与pH环境的映射关系；
    (1.1)测量细胞或组织样本的高度特征，对形态进行测量，通过AFM测试仪进行挤压测试，得到挤压力学特性曲线；
    (1.2)观察挤压力学特性曲线，选取相应的弹性模量计算方法来计算弹性模量E；
    如未观察到较大的挤压粘连情况，可选用普通的Hertz模型进行模量计算，计算公式为：
    Figure PCTCN2017076027-appb-100001
    其中，F是测量的挤压力，D是挤压进给位移，α为AFM测试探针的针尖半开角度，V是泊松比；
    如果观察到较大的粘连情况，可用DMT模型进行模量计算，计算公式为：
    Figure PCTCN2017076027-appb-100002
    其中Ftip是AFM测试探针在下压过程中的受力最大值，Fadh是样本与AFM测试探针在回针过程中的粘连力最大值，R是探针尖的弧度半径，d是挤压进给位移，V是泊松比；
    或者是采用有限元方法结合逆向算法对测试的细胞或组织样本进行弹性模量计算；
    (2)建立并拟合E＝E(pH，t)的函数关系，对于pH与时间点间隔较大较为离散的情况，建立E与pH，t的对应表格；
    (3)依据E(pH，t)的函数或表格建立基于测量E值的pH与生长时间映射关系；
    (4)选取所需要检测pH环境中的细胞或组织，测定细胞或组织的弹性模量E，从步骤(3)建立的映射关系中，找到相应的环境pH值与所培养的时间信息。
  2. 根据权利要求1所述的环境pH的生物力学测试方法，其特征在于：步骤(1)中选取的细胞或组织的pH环境至少有两种。
  3. 根据权利要求1所述的环境pH的生物力学测试方法，其特征在于：步骤(1)中选取的细胞或组织的培养时间至少有三种。
  4. 根据权利要求1所述的环境pH的生物力学测试方法，其特征在于：步骤(1)中选取不同的pH环境、不同培养时间下的细胞或组织样本的数量均为20到30个。
  5. 根据权利要求1所述的环境pH的生物力学测试方法，其特征在于：步骤(1.1)中选取2％到8％的应变量进行挤压测试。
  6. 根据权利要求1所述的环境pH的生物力学测试方法，其特征在于：步骤(1.1)中AFM测试仪的探针弹性系数为0.01-10 N/m。
  7. 根据权利要求1所述的环境pH的生物力学测试方法，其特征在于：步骤(1.1)中挤压测试的下压深度为应变量与测量样本的平均厚度乘积数值。
  8. 根据权利要求1所述的环境pH的生物力学测试方法，其特征在于：步骤(1.1)中在AFM显微镜的视野范围内选取可容纳至少一个样本细胞或对象的区域进行挤压测试。
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