CN104531827A - 细胞质量评价的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞工程技术领域，特别是关于细胞质量的评价方法。本发明提出一种细胞质量评价的方法，包括如下步骤：A，获取对象细胞的形态特性的有用信息的步骤；B，获取对象细胞的透明带弹性模量的步骤；C，获取对象细胞反馈的生物电信号的步骤；D，根据上述步骤而对象细胞进行综合评价的步骤。采用本发明上述技术方案所述的细胞质量评价的方法，可以有效地高通量高效率的对细胞质量进行可靠评价。

Description

细胞质量评价的方法

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，特别是关于细胞质量的评价方法，具体而言是基于所检测到的细胞的形态、弹性模量、膜电位而进行综合评价来获得细胞质量评价体系的方法。

背景技术

随着人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology , ART)的发展，体外受精（in vitro fertilization , IVF）、胚胎移植及其衍生技术的应用使得受孕及妊娠率得以提高，但同时多胚胎妊娠率及其带来的各类并发症也显著提高。为了避免多胚胎妊娠和多胚胎，中国卫生部规定：年龄≤35岁的妇女，在IVF第一周期不得移植超过2个胚胎；对于多胚胎妊娠必须实施减胎术，避免双胎，严禁三胎和三胎以上的妊娠分娩。因此，如何选择高质量的卵细胞进行IVF以及选择最具活力的胚胎进行移植已成为ART中的研究热点和挑战。

同时，在生物细胞注射实验中，被注射后的细胞大都是被置于同一个培养皿，如果细胞被注射后凋亡，该细胞凋亡过程中释放的物质会影响培养皿里的其它细胞，导致其它细胞的凋亡或基因表达失败，极大降低实验效率。在以高通量、高效率为目的显微注射机器人研究背景下，任何能提高细胞存活率的研究都有意义，都有可能对生物医学研究起到巨大的推动作用。进行细胞质量评估，剔除质量差的细胞，有利于提高整体的细胞存活率，推动生物医学的研究。

由此可见，对细胞质量进行科学评估是十分有意义的。目前已提出了许多细胞质量的评价方法，如形态学、细胞力学特性、膜电位、体外发育（培养）、荧光代谢探针、染色体筛查法等。

其中,形态学评估是目前应用最广泛的胚胎质量评价方法,主要包括以下几个方面。一、卵母细胞的质量；二、原核期合子的质量；三、卵裂期质量；四、囊胚形态学。形态学评估是基于微小物体光学摄影技术来采集细胞形态而进行细胞质量评价的方法，虽然形态学的评估方法用于胚胎活性筛选取得了一定的成效和进展，但是此单一用形态特征评估方法无法保证细胞质量评价的精确性。

 另外，在原核期透明带硬度随着受精而变化，并且杨氏模量伴随着胚胎的发育逐渐减少。对扩张囊胚(expanded blastocysts, EPBs)的质量的评估表明，EPBs的质量也可以通过弹性参数来评价。此外，观察表明各个阶段中在体内生长的胚胎的透明带明显比在体外生长的硬。初步的研究结果还表明，裸露在体外的成熟卵细胞在氯化锶的孤雌激活下没有表现出透明带的硬化，表明卵母细胞的成熟程度和随之而来的活化可由透明带弹性的增加来评价。以上分析表明，对细胞的力学特性——弹性模量的研究是细胞质量研究的另一重要方向。

以及，由于生物电是机体活动的基本属性，对细胞生物电学特性的研究，有助于了解生命活动的机制和产生规律。卵细胞的膜电位是卵母细胞成熟和受精的电生理学标志，检测卵母细胞膜电位是判断卵母细胞功能正常与否的重要指标。卵细胞在自然受精过程中由于胞内钙离子持续波动从而产生卵膜电位的变化。在单精子显微注射实验和动物核移植实验中，电刺激的方法能使卵母细胞膜通透性瞬间增加，从而使外源钙离子进入卵母细胞内或通过激活IP3系统诱导胞内钙库钙离子的释放，造成胞内钙离子浓度增加，使卵母细胞激活，提高胚胎的发育率。

代谢组学通过定向检测胚胎培养基中的相关因子，及其中间产物表达谱分析等预测胚胎的发育潜能,但是无直接的研究证明其代谢组学与临床妊娠率及出生率相关。现有的细胞质量评价方法有一定的成效，但是其中一些方法在实验过程中对细胞有一定的损伤性，并且单一研究细胞某一方面而获得细胞质量的评价体系有一定局限性，严谨性不够。

由以上可知，形态特征、力特性和电特性是细胞同时存在的重要特性，将三个特性综合起来研究动物细胞（尤其卵细胞）的发育机制是非常重要的。而现有的方法及装置系统大多单独对某一方面进行研究，然后再借助其他实验手段来分析结果，对细胞无法实时测量。

发明内容

基于本申请案的发明人已经发现细胞单一的指标的细胞质量评价手段并不能完全的描述细胞的质量。因此，本发明提出一种有助于高通量高效率的分析细胞质量的评价方法。

本发明的技术方案是在显微注射机器人研究背景下，获取细胞的形态特性，并对细胞采用复合力-电加载测量，实时监测细胞形态、力、电三个特性，并采用神经网络的方法获得细胞质量的评价体系。

本发明具体采用如下技术方案实现：

一种细胞质量评价的方法，包括如下步骤：

A，获取对象细胞的形态特性的有用信息的步骤；

B，获取对象细胞的透明带弹性模量的步骤；

C，获取对象细胞反馈的生物电信号的步骤；

D，根据上述步骤而对象细胞进行综合评价的步骤。

采用本发明上述技术方案所述的细胞质量评价的方法，可以有效地高通量高效率的对细胞质量进行可靠评价。

附图说明

图1是实施本发明的一个设备系统。

具体实施方式

现结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明。

本发明提出一种细胞质量评价的方法，包括如下步骤：

A，获取对象细胞的形态特性的有用信息的步骤；具体包括：

A1，通过微小物体光学摄影系统来获取对象细胞的形态学图像；

A2，通过图像处理系统来获取上述形态学图像的形态特性的有用特征参数信息，例如包括对象细胞（如胚胎细胞）的形体几何的参数信息、颜色的参数信息、明暗程度的参数信息、分裂球大小的均匀性（一致性）的参数信息、细胞质颗粒化的参数信息以及分裂球的碎片化程度的参数信息等，其中形体几何的参数信息一般采用8个参数，分别是：面积S、周长C、长度L、宽度w、方向角、宽长比、轴交比和形状指数。

B，获取对象细胞的透明带弹性模量的步骤；具体包括：

B1，通过力记载测量系统对对象细胞进行探压；

B2，通力记载测量系统实时测量上述被探压的对象细胞的压电信号；

B3，根据上述压电信号计算获得细胞的压力，进而计算得到对象细胞的透明带弹性模量。

C，获取对象细胞反馈的生物电信号的步骤；具体包括：

C1，通过电加载测量系统对对象细胞加载电刺激；

C2，通过电加载测量系统实时测量上述被电刺激的对象细胞反馈的生物电信号。

D，根据上述步骤而对象细胞进行综合评价的步骤；具体包括：

D1，建立一个对象细胞的有用特征参数信息、透明带弹性模量信息、生物电信号信息联合指标的数据库；

D2，通过神经网络的方法，确定对象细胞的一个或多个质量标准评价体系。神经网络的方法是模拟人脑思维方式的数学模型，它具有很好地对信息进行学习、联想、和模式分类的能力，因此我们在几种人工智能方法中选择有导师学习的神经网络作为专家模型的建模方法。另外，为符合自动化注射系统实时控制的要求，可以优选有较快收敛速度的ＲＢＦ神经网络。网络输入信号分别为细胞的形态学参数如：不同时期细胞直径(含透明带)、卵黄直径、卵裂球的轴长比等；细胞的力学特性如：不同时期细胞透明带的弹性模量；不同时期细胞的电学特性也是训练的指导信号；并在训练时注意变量间的权重设定。

作为本发明细胞质量评价的方法的实行的硬件设备系统可以有多种选择，如采用独立的微小物体光学摄影系统装置、力记载测量系统装置、电加载测量系统装置、装载有图像处理系统软件和分析计算系统软件的计算机联合组成一个总的系统装置，也可采用如图1所示的一种设备系统来实现。

参阅图1所示，该用于细胞质量评价的设备系统包括主要用于实现步骤B和步骤C的细胞复合力-电加载测量的装置10、主要用于实现步骤A的微小物体光学摄影装置20、及装载有图像处理系统软件和相应分析计算系统软件的计算机30。

其中，该细胞复合力-电加载测量的装置10已经在先提出申请并公开，具体可以参阅中国专利公开号103966091A的内容，于此不再赘述。步骤B中，在该细胞复合力-电加载测量的装置10的操作臂的移动下对对象细胞（如卵母细胞）的透明带施加一定的压力，采用PVDF压电薄膜为力敏感元件，设计简支梁力测试机构，将微小细胞探压力信号——微牛级的力转换为伏特级的电压输出。从而可以测得透明带的力与位移的关系，从而获得透明带的弹性模量。该装置的探针是采用被拉针器拉成微米级的毛细玻璃管作为注射探针，在显微镜的观察下，利用高精度直流电机位移控制平台控制探针的移动，来对细胞施加注射力。视该测量系统为准静态系统，即设定电机控制的注射针刚接触细胞时为坐标原点，电机运动的位移即为细胞变形量L。细胞所受的弹力F可以通过PVDF压电薄膜传感器以及调理电路获得。从而由细胞所受的弹力F及细胞变形量L可以获得细胞的力学特性即透明带的弹性模量。

步骤C中是采用微电极技术获取细胞的膜电位的方法。在该细胞复合力-电加载测量的装置10的操作臂带动该电极探针相对于该细胞放置平台位移运动，对细胞加载电刺激，从而获得其反馈的生物电信号。

该微小物体光学摄影装置20主要由光学显微镜、图像采集卡和摄像头组成，主要完成图像的获取、图像数据的传输和管理，并通过计算机30在用户界面实时显示图像，或采集图像到系统内存中为后续的图像处理工作和操作臂运动控制做好准备。

该计算机30内装载的用于执行步骤A2的图像处理系统软件可以有多种选择，如MATLAB 中的图像处理包、机器视觉算法软件包Halcon 及OpenCV 开源代码库等。其中MATLAB 和Halcon 是成本较高的商业化处理工具，而OpenCV 对所有应用都免费，大大降低了开发成本。因此，本系统优选选择OpenCV 开源代码库进行相关图像处理，应用此软件进行图像处理涉及到加载图像、显示图像、图像分割、边缘检测和目标定位等操作。此外，该计算机30还装有一些采集分析计算的必要软件，以对步骤B、C、D的实现提供必要基础，通过必要软件来将该细胞复合力-电加载测量的装置10采集的数据进一步数据加工和分析计算等。

尽管结合优选实施方案具体展示和介绍了本发明，但所属领域的技术人员应该明白，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围内，在形式上和细节上可以对本发明做出各种变化，均为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.细胞质量评价的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A，获取对象细胞的形态特性的有用特征参数信息的步骤；

B，获取对象细胞的透明带弹性模量的步骤；

C，获取对象细胞反馈的生物电信号的步骤；

D，根据上述步骤而对象细胞进行综合评价的步骤。

2.根据权利要求1所述的细胞质量评价的方法，其特征在于，所述步骤A具体包括：

A1，通过微小物体光学摄影系统来获取对象细胞的形态学图像；

A2，通过图像处理系统来获取上述形态学图像的形态特性的有用特征参数信息。

3.根据权利要求1所述的细胞质量评价的方法，其特征在于，所述步骤B具体包括：

B1，通过力记载测量系统对对象细胞进行探压；

B2，通力记载测量系统实时测量上述被探压的对象细胞的电信号；

B3，根据上述电信号计算获得细胞的压力，进而计算得到对象细胞的透明带弹性模量。

4.根据权利要求1所述的细胞质量评价的方法，其特征在于，所述步骤C具体包括：

C1，通过电加载测量系统对对象细胞加载弹压位置信息；

C2，通过电加载测量系统实时测量上述被电刺激的对象细胞反馈的生物电信号。

5.根据权利要求1所述的细胞质量评价的方法，其特征在于，所述步骤D具体包括：

D1，建立一个对象细胞的有用特征参数信息、透明带弹性模量信息、生物电信号信息联合指标的数据库；

D2，通过神经网络的方法，确定对象细胞的一个或多个质量标准评价体系。