CN104411817A

CN104411817A - 方法和设备

Info

Publication number: CN104411817A
Application number: CN201380032956.3A
Authority: CN
Inventors: 索伦·伯斯戈德; 梅特·莱格德斯曼德; 英吉·埃雷波·阿格霍姆
Original assignee: Unisense Fertilitech AS
Current assignee: Unisense Fertilitech AS
Priority date: 2012-06-25
Filing date: 2013-06-25
Publication date: 2015-03-11
Also published as: IN2014DN10790A; WO2014001312A1; AU2013283424A1; EP2864475A1; US20150169842A1

Abstract

描述了确定胚胎例如体外孵育的人胚胎的发育潜能的方法，以及用于实施此类方法的设备。某些实施例中，方法包括获得与观察期期间胚胎的发育相关的多个形态动力学特征，例如与胚胎的时间或形态发育相关的特征。通过以预定的方式组合获得的这些特征的值与相应的参考值之间的差来确定连续变量的值。可以例如从所获得的至少一个具有已知发育潜能的参考胚胎的多个特征的值来确定参考值。然后基于所确定的连续变量的值来确立胚胎的发育潜能。

Description

方法和设备

技术领域

本发明涉及确定胚胎发育潜能的方法和设备。

背景技术

不育症影响全世界8千多万的人。据估计所有夫妻中有10％经历原发性或继发性不育。辅助生殖治疗(ART)是一种可选的医学治疗，其可为用其他方式无法怀孕的夫妻提供妊娠的机会。辅助生殖治疗的过程是将卵(卵母细胞)从女性的卵巢中取出，然后在实验室里用精子受精。然后将该过程中产生的胚胎放置于子宫内以进行可能的着床。为了避免多次妊娠和多胞胎生育，仅转移少数几个胚胎(一般少于4个，理想情况是只有1个)。因此选择要转移的胚胎是任何ART中关键的一步，ART结果数据的回顾性分析对于确定改善的胚胎选择标准非常重要。

可用已知的着床数据(KID)来构建、评价和验证胚胎选择模型，其中阳性KID胚胎是已知后续已着床的胚胎，阴性KID胚胎是已知后续未着床的胚胎。

如果胚胎达到了胚泡阶段，也可通过观察来构建、评价和验证胚胎选择模型。

目前的选择程序很大程度是基于用标准的立体显微镜在胚胎发育的不同的时间点对胚胎进行形态学评价，尤其是在转移的时候进行评价。但是，普遍认识到对于改进已知的评价程序存在着需求。

现有的一种方法是使用“早期卵裂”至2-细胞阶段(即，在授精/注射之后25-27h之前)作为质量指标/选择标准。这种方法中，受精之后目视观察胚胎25-27小时以确定第一次细胞分裂是否已完成。

几项研究已表明了与细胞分裂相关的时间确定在确定胚胎质量中的重要性。2001年，例如，Lundin等人报道了早期的第一次卵裂作为人IVF中胚胎质量的重要指标(Lundin等,2001)，Meseguer等报道了几个胚胎形态学参数对于后续胚胎着床的重要性(Meseguer等,2011)。

在Lemmen et al.,2008中使用了缩时(time-lapse)系统来研究在从受精卵至卵裂状态的胚胎的早期发育期间各事件的发生时间及其协调。受精后原核的早期消失和第一次卵裂的开始与收获卵母细胞后第2天数量更多的卵裂球相关。此外，第一次卵裂后核同步出现与妊娠成功相关。

近年来，缩时设备被越来越广泛地应用于孵育和监测体外发育过程中的胚胎。缩时设备是一种在孵育过程中以时间间隔(例如如果需要的话频率可以达每5分钟一次)拍照(显微镜图像)的装置。与较早期的方式相比，这使得能够容易地确定发育过程中各细胞事件的更精确的发生时间，例如细胞分裂的发生时间。这些增加的对胚胎发育的了解使得有可能改善对胚胎的选择(即鉴别具有最大的发育潜能/成功着床可能性的胚胎的过程)。可在例如以下文献中找到这种方式的一些例子：WO 2012/163363 A1(Unisense Fertilitech)、WO2013/004239 A1(Unisense Fertilitech)、WO 2011/025736 A1(Leland Stanford Junior大学理事会)、US 7,963,906B2(Leland Stanford Junior大学理事会)，以及Wong等。

然而，虽然早期卵裂的发生时间和其他的发生时间可以有助于提供胚胎发育的质量指标，但是仍然需要用于更好地确定胚胎诸如体外孵育的人胚胎的发育潜能(活力/质量)的方法和设备。

发明概述

用于从缩时显微镜成像确定胚胎质量的现有的技术一般是基于对给定胚胎发育事件的发生时间(诸如某一细胞分裂阶段的发生时间)与先前被观察到与高质量胚胎相关的预定范围的发生时间(例如，基于对阳性KID和阴性KID胚胎的发生时间的分析)的比较。如果某一胚胎的胚胎发育事件的发生时间落在被认为与高质量胚胎相关的预定范围的发生时间内，那么该胚胎可被认为是高质量的胚胎。相反，如果该胚胎发育事件的发生时间落在被认为与高质量胚胎相关的预定范围的发生时间之外，那么该胚胎可被认为是低质量的胚胎。

在这方面，对高质量胚胎(即，具有相对高的发育潜能的胚胎)和低质量胚胎(即，具有相对低的发育潜能的胚胎)的鉴定基于二元模型。虽然这种二元模型简单且稳定，但是本发明是基于这些模型仅提供相对粗糙的胚胎筛选这一认识完成的。例如，现有的二元模型不能区分落在“高质量”范围内的不同的胚胎，此外，这些模型不易被修改以引入另外的变量或考虑患者特征(诸如年龄)的变化。

开发了根据本发明某些实施方式的方法，以促进基于胚胎发育过程中提取的形态学参数和/或动力学参数来选择待被转移用于着床的最优的体外受精胚胎。因此，根据某些实施方式，用考虑了与胚胎发育相关的多个变量的连续模型来确定胚胎发育潜能。这可以通过获得与体外胚胎发育相关的多个特征的值来实现，例如使用缩时显微镜成像。然后可将所述多个不同特征的值与参考值比较，例如通过确定与所确定的阳性KID胚胎的相应平均值的差，然后组合在一起以产生一个或多个连续变量。然后可基于这些(一个或多个)连续变量的值来确定胚胎的发育潜能。

发明内容

根据一个方面，本发明提供一种确定胚胎发育潜能的方法，该方法包括：获得与观察期期间胚胎发育相关的多个特征的值；通过以预定的方式组合所获得的值与所述多个特征的相应参考值之间的差来确定连续变量的值；以及，基于所确定的连续变量的值确定胚胎的发育潜能。

根据另一个方面，本发明提供一种确定胚胎发育潜能的设备，该设备包括：数据输入元件，所述数据输入元件被配置用于获得与观察期期间胚胎发育相关的多个特征的值；以及处理器元件，所述处理器元件用于通过以预定的方式组合所获得的值与所述多个特征的相应参考值之间的差来确定连续变量的值并基于所确定的连续变量的值确定胚胎的发育潜能。

附图简述

为了更好地理解本发明并说明本发明如何实施，现在以示例的方式参考附图，附图中：

图1示意性示出了如本文对于卵裂模式所用的一些系统命名，相对于所获得的图像显示了卵裂时间(t2至t5)、细胞周期持续时间(cc1至cc3)、以及同步时间(synchrony)(s2和s3)。

图2示意性示出了从初始受精(时间t＝0)和在卵裂时间t2-t8的不同胚胎发育事件时胚胎外观，以及如本文所用的时间术语的一些相关方面。

图3示意性示出了根据本发明实施方式的确定胚胎发育潜能的设备。

图4示意性对阳性KID胚胎(以加号(+)表示)和阴性KID胚胎(以减号(-)表示)群体的卵裂时间t2相对于卵裂时间t5进行绘图。

图5示意性绘制了来自五个不同诊所的胚胎群体的卵裂时间t5的直方图。

图6是一个流程图，示意性表示了一种根据本发明的某些实施方式确定胚胎发育潜能的方法。

图7A、8A、9A和10A示意性对阳性KID胚胎(以加号(+)表示)和阴性KID胚胎(以减号(-)表示)群体根据本发明实施方式确定的不同对的参数进行绘图。

图7B、8B、9B和10B是图7B、8B、9B和10B的左下角的放大图。

图11示意性对根据本发明实施方式确定的四个模型的阳性KID胚胎和相应的模型预测在一定范围的数据百分位数的发生率进行绘图。

具体实施方式

除非另有定义，本文所用的科技术语具有本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义。Singleton等,微生物和分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and MolecularBiology),20Ed.,John Wiley and Sons,New York(1994),和Hale&Marham,The Harper Collins生物学词典(The Harper Collins Dictionary of Biology),Harper Perennial,NY(1991)为本领域技术人员提供了本公开中所用的很多术语的一般词典。

本公开内容不受本文公开的示例性方法和材料的限制，任何与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料均可用于实施或测试本公开内容的实施方式。

当提供一个数值范围时，可以理解，也具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间数值，直至下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。在某个描述的范围中的任何描述的数值或中间数值和该描述的范围中的任何其他描述的数值或中间数值之间的每个较小的范围均涵盖在本公开内容中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或不包括在该范围中，上限和下限中的一个、零个或俩个包括在该较小范围中的每个范围也涵盖在本公开内容中，以所描述的范围中任何具体排除的限值为度。当描述的范围包括上限和下限中的一个或两个时，排除了那些包括的上限或下限的一个或两个的范围也包括在本公开内容中。

必须指出，如本文和所附权利要求书所用，单数形式“a/an(一)”和“该”(或“这”、“那”、“其”)包括复数指代，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提到“an embryo(一个胚胎)”时包括多个这种候选胚胎，等等。

本文讨论的出版物仅仅是因为它们的公开日期早于本申请的申请日。本文任何内容都不应理解为承认这些出版物构成了本文所附权利要求书的现有技术。

本文引用的所有专利和非专利文献也通过引用以其整体纳入本文。

本发明的一些示例性实施方式涉及一种确定胚胎发育潜能的方法，该方法包括：获得与观察期期间胚胎发育相关的多个特征的值；通过以预定的方式组合获得的值与所述多个特征的相应参考值之间的差来确定连续变量的值；以及，基于所确定的连续变量的值确定胚胎的发育潜能。

根据一些示例性实施方式，由从至少一个具有已知发育潜能的参考胚胎获得的多个特征的值确定参考值。

根据一些示例性实施方式，组合获得的值与参考值之间的差的步骤考虑了与参考值中的每一个相关的加权值。

根据一些示例性实施方式，加权值是通过由具有已知发育潜能的多个参考胚胎获得的多个特征的值统计确定的。

根据一些示例性实施方式，加权值是通过由多个参考胚胎获得的值的方差来确定的。

根据一些示例性实施方式，所述多个特征与胚胎的形态学发育相关。

根据一些示例性实施方式，连续变量代表胚胎的形态学发育中的规律性的量度。

根据一些示例性实施方式，所述多个特征与胚胎的时间(temporal)发育相关。

根据一些示例性实施方式，连续变量代表胚胎的时间发育中的规律性的量度。

根据一些示例性实施方式，所述多个特征包括胚胎的多个细胞周期持续时间cci。

根据一些示例性实施方式，所述多个特征包括胚胎的后续细胞分裂之间的多个时间差Δtj。

本发明的一些示例性实施方式还包括：获得与观察期期间胚胎发育相关的另外的多个特征的值；通过以另外的预定的方式组合获得的值与所述另外的多个特征的相应参考值之间的差来确定另外的连续变量的值；以及，还基于所确定的另外的连续变量的值确定胚胎的发育潜能。

根据一些示例性实施方式，用缩时显微镜获得数值。

本发明的一些示例性实施方式涉及一种确定胚胎发育潜能的设备，该设备包括：数据输入元件，所述数据输入元件被配置成获得与观察期期间胚胎发育相关的多个特征的值；以及处理器元件，所述处理器元件用于通过以预定的方式组合获得的值与所述多个特征的相应参考值之间的差来确定连续变量的值，并基于所确定的连续变量的值确定胚胎的发育潜能。

本发明的一些示例性实施方式涉及非暂时性(non-transitory)计算机程序产品，该产品带有用于执行根据本发明其他示例性实施方式的方法的机器可读性指令。

本发明的一些示例性实施方式涉及一种设备，该设备加载有机器可读指令，并且可操作以执行所述机器可读指令，该机器可读性指令用于执行根据本发明其他示例性实施方式的方法。

本文可根据以下定义使用各种术语(除非上下文要求其他含义)。

卵裂时间被定义为第一个观察到新形成的分裂球被汇合的细胞膜完全分隔开的时间点，因此卵裂时间是分裂球分裂完成的时间。在本发明上下文中，各卵裂时间经常被表示为胞浆内精子注射(ICSI)显微注射之后的小时数，即受精(配子成功融合形成新的有机体受精卵)时间。因此卵裂时间如下：

●t2:分裂为2分裂球胚胎的时间

●t3:分裂为3分裂球胚胎的时间

●t4:分裂为4分裂球胚胎的时间

●t5:分裂为5分裂球胚胎的时间

●t6:分裂为6分裂球胚胎的时间

●t7:分裂为7分裂球胚胎的时间

●t8:分裂为8分裂球胚胎的时间

●tn:分裂为n分裂球胚胎的时间

第一个细胞周期持续时间cc1是受精至卵裂时间t2(提供第一对子细胞，即最早出现的第二代细胞)之间的时间段。第二个细胞周期持续时间cc2是卵裂时间t2(提供第一对子细胞)和卵裂时间t3(提供第一对孙代细胞，即最早出现的第三代细胞)之间的时间段。第三个细胞周期持续时间cc3是卵裂时间t3(提供第一对孙代细胞)和卵裂时间t5(提供第一对曾孙代细胞，即最早出现的第四代细胞)之间的时间段。第四个细胞周期持续时间cc4是卵裂时间t5(提供第一对曾孙代细胞)和卵裂时间t9(提供第一对玄孙代细胞，即最早出现的第五代细胞)之间的时间段。

这些细胞周期持续时间因此是基于新的每一代分裂球分裂的最快速度。但是，还有与较慢的分裂球的分裂相关的其他细胞周期持续时间。

例如，除细胞周期持续时间cc2之外，还有细胞周期持续时间cc2b，其对应于卵裂时间t2(提供第一对子细胞)和卵裂时间t4(提供第二对孙代细胞)之间的时间段。在这方面，为命名的简单起见，细胞周期持续时间cc2也可称为细胞周期持续时间cc2a。

此外，除细胞周期持续时间cc3之外，还有细胞周期持续时间cc3b，其对应于卵裂时间t3(提供第一对孙代细胞)和卵裂时间t6(提供第二对曾孙代细胞)之间的时间段。还有细胞周期持续时间cc3c，其对应于卵裂时间t4(提供第二对孙代细胞)和卵裂时间t7(提供第三对曾孙代细胞)之间的时间段。还有细胞周期持续时间cc3d，其对应于卵裂时间t4(提供第二对孙代细胞)和卵裂时间t8(提供第四对曾孙代细胞)之间的时间段。在这方面，为命名的一致性起见，细胞周期持续时间cc3也可称为细胞周期持续时间cc3a。

因此，细胞周期的持续时间定义如下：

●cc1＝t2:第一个细胞周期

●cc2(也称为cc2a)＝t3-t2:第二个细胞周期，作为2分裂球胚胎的持续时间段。

●cc2b＝t4-t2:两个分裂球的第二个细胞周期，作为2分裂球胚胎和3分裂球胚胎的持续时间段。

●cc3(也称为cc3a)＝t5-t3:第三个细胞周期，作为3分裂球胚胎和4分裂球胚胎的持续时间段。

●cc2_3＝t5-t2:第二个和第三个细胞周期，作为2分裂球胚胎、3分裂球胚胎和4分裂球胚胎的持续时间段(即cc2+cc3)。

●cc4＝t9-t5:第四个细胞周期，作为5分裂球胚胎、6分裂球胚胎、7分裂球胚胎和8分裂球胚胎的持续时间段。

同步时间定义如下：

●s2＝t4-t3:从2分裂球胚胎至4分裂球胚胎的分裂同步化。

●s3＝t8-t5:从4分裂球胚胎至8分裂球胚胎的分裂同步化。

●s3a＝t6-t5；s3b＝t7-t6；s3c＝t8-t7:从4分裂球胚胎至8分裂球胚胎的发育中涉及的各细胞分裂的持续时间。

●cc3b,cc3c,cc3d＝t6-t3；t7-t4；和t8-t4分别为:较慢分裂球的第三个细胞周期，分别作为3分裂球胚胎、4分裂球胚胎、和5分裂球胚胎的持续时间段；作为4分裂球胚胎、5分裂球胚胎和6分裂球胚胎的持续时间段，和作为4分裂球胚胎、5分裂球胚胎、6分裂球胚胎和7分裂球胚胎的持续时间段。

图1和2示意性示出了本文所用术语的某些方面，这些术语是关于一些胚胎发育事件诸如上文所讨论的那些事件的发生时间和持续时间。图1显示了各个发育阶段的胚胎的多个图像，并且指示与各个发育事件诸如t2、t3、t4、t5、cc1、cc2(本文也可称为cc2a)、cc3(本文也可称为cc3a)、s2和s3相关的各个发生时间。图2从左到右示意性示出了经历了1分裂球阶段、2分裂球阶段、3分裂球阶段、4分裂球阶段、5分裂球阶段、6分裂球阶段、7分裂球阶段和8分裂球阶段的胚胎发育。沿着底轴示意性标出了时间t2至t8，在这些时间点完成了相应的细胞分裂阶段。图2还示意性指示了细胞周期持续时间cc1、cc2a、cc2b、cc3a、cc3b、cc3c和cc3d以及同步时间S2和S3。

卵裂时段被定义为从第一次观察到细胞膜凹进(表示细胞质分裂的开始)到细胞质的细胞分裂完成从而分裂球被汇合的细胞膜完全分开的时间段。也称为胞质分裂持续时间。

受精和卵裂是胚胎的主要形态学事件，至少到8分裂球阶段。卵裂时间、细胞周期、分裂同步化和卵裂时段是可以从这些主要形态学事件中定义的胚胎形态学参数的例子，这些胚胎形态学参数中的每一个被定义为两个形态学事件之间的(例如以小时计)持续时间段。

归一化的胚胎形态学参数被定义为两个胚胎形态学参数的比率，例如cc2除以cc3(cc2/cc3)，或cc2/cc2_3或cc3/t5或s2/cc2。

可组合多个细胞周期的持续时间(例如CC1,CC2,CC3和CC4)以形成共同的归一化参数：

其中CCi例如选自CC1至CC4。本发明一个实施方式中，CC_归一的值高表示胚胎质量差，因为一个或多个变量CCi远离中位值，即，使用的并非是CCi的绝对值，而是变量的相互关系。可基于整个群体或群体的一部分(例如具有已知着床和阳性着床的胚胎)来计算中位值。使用对数值替代的另一个等同变量(lCC_归一)，也可用于评价胚胎质量。

类似地，也可组合细胞分裂的同步时间Si(例如S2,S3和S4)以形成共同的归一化参数：

本发明一个实施方式中，S_归一的值高表示胚胎质量差，因为一个或多个同步时间较长。使用对数值替代的另一个等同变量(lS_归一)，也可用于评价胚胎质量。

根据孵育的持续时间，可基于第1、2、3或4个细胞周期来计算变量CC_归一和S_归一。

可使用以下离散(二元)变量

·MN2:在2分裂球阶段观察到的多核现象；其可以取“真”值或“假”值。

·MN2val:2细胞阶段时多核细胞的数目(0,1,2)。

·MN4:在4分裂球阶段观察到的多核现象；其可以取“真”值或“假”值。

·MN4val:4细胞阶段时多核细胞的数目(0,1,2,3,4)。

·EV2:2分裂球胚胎中分裂球的均一性；其可以取“真”值(即均一)或“假”(即不均一)值。

WO 2013/004239 A1(Unisense Fertilitech)，其题目为“通过反复定制和协作而优化的适应性胚胎选择标准(Adaptive embryo selection criteria optimized through iterative customizationand collaboration)”，涉及的问题是改变在不同孵育条件下例如在不同诊所中的胚胎培养物群体之间的胚胎质量标准。该申请通过引用而全部纳入本文中。然而，质量参数如CC_归一、lCC_归一、S_归一和lS_归一可有助于确保质量模型能够在不同孵育条件下培养的不同的胚胎群体之间直接适用，因为它们是基于对操作条件差异不敏感的变量。这方面的另一个例子是基于相对时间段(例如cc2/cc3)的质量参数，除以该变量的中心估计值(例如平均值或中位值，例如cc2/cc2_中位值)的变量，或使用靶区间，其中根据中心估计值来定标(scale)中心，根据变异估计值(例如方差、标准差、百分数)来定标边界。

胚胎质量是胚胎在转移后成功在子宫内着床并发育的能力的量度。高质量的胚胎比低质量胚胎在转移后成功在子宫内着床并发育的可能性要高。然而，即使是高质量胚胎也不能保证一定能着床，因为实际的转移和女性的接受度影响到最终的结果。

活力和质量在本文中可互换使用。胚胎质量(或活力)测量是一个意在反映胚胎的质量(或活力)的参数，从而具有某些质量参数值(例如高值或低值，取决于该参数是如何定义的)的胚胎具有高质量(或活力)的可能性高，具有低质量(或活力)的可能性低。而具有质量(或)活力参数的某些其他值的胚胎具有高质量(或活力)的可能性低，具有低质量(或活力)的可能性高。

本文所定义的术语“发育潜能”是指胚胎发育到胚泡阶段、着床、导致妊娠、和/或产下活的婴儿的可能性。某些实施方式中，发育潜能可能是胚胎质量的一个决定因素。发育潜能可等同胚胎质量。胚胎质量(或胚胎的发育潜能)可基于对发育中的胚胎和其命运的观察结果中能够获得的信息。阳性发育潜能(或良好的(或高)胚胎质量)的结果是胚胎发育到胚泡阶段、产生成功着床、转移后胚胎在子宫中的发育、导致妊娠、和/或产下活的婴儿(优选至少产生成功着床)。阴性发育潜能(或低胚胎质量)的结果是胚胎在发育到胚泡阶段之前就停滞、无着床、和流产。优选在确定胚胎质量时使用非侵入性方法如形态学特征。

良好(或高)质量的胚胎比低质量胚胎在转移后成功在子宫内着床和/或发育的可能性要高。然而，即使是高质量胚胎也不能保证一定能着床，因为实际的转移和女性的接受度高度影响最终结果。

如上所述，根据一些实施方式，由与观察期期间胚胎的发育相关的多个特征确定连续变量的值。然后可用该变量的值确定胚胎的发育潜能。

某些情况下，术语“胚胎”用于描述在子宫内着床后的受精的卵母细胞，直至受精后8周(在该阶段胚胎变为胎儿)。根据这一定义，受精的卵母细胞通常称为前-胚胎或受精卵，直至着床发生。然而，本文所用术语“胚胎”具有更广的定义，包括了胚前阶段。本文所用术语“胚胎”涵盖了从卵母细胞受精至桑椹胚、胚泡阶段、孵化和着床的所有发育阶段。

胚胎是大致球形的，由被类似于明胶的壳(被称为透明带的无细胞基质)包围的一个或多个细胞(分裂球)组成。透明带行使多种功能直至胚胎孵化，而且是胚胎评价的良好标志。透明带是球形和透明的，应当与细胞碎片清楚地区分开来。

当卵母细胞通过精子细胞(精子)的融合或注射而受精时形成了胚胎。术语胚胎传统上还用于孵化(即透明带破裂)和后续的着床之后。对人而言，受精的卵母细胞传统上在前8个星期称为受精卵或胚胎。那之后(即8个星期之后和当所有主要的器官都已经形成的时候)称为胎儿。但是受精卵、胚胎和胎儿之间的差别一般并未被明确地界定。本文中术语胚胎和受精卵可互换使用。

根据本发明的方法评价的胚胎可以是之前冷冻的，例如受精后(例如在1-细胞阶段)立即冷冻保存然后融化的胚胎。或者，胚胎可以是新鲜制备的，例如胚胎可以是例如用IVF或ICSI技术从卵母细胞新鲜制备的。

受精是精子细胞被卵母细胞识别并接受的时间点。在卵母细胞减数分裂周期已经暂停在第二次减数分裂中期后精子细胞引发了卵的活化。这导致第二极体的产生和挤出。精子和卵子融合后几个小时，DNA合成开始。雄性和雌性原核(PN)出现。PN移动到卵的中心，膜破裂，PN消失(淡出)。两个基因组的这种组合称为配子配合。此后，细胞分裂开始。

原核消失的时间可称为t2PN。与原核(PN)相关的术语“淡出”和“消失”在本文可互换使用。

胚胎发育期间，分裂球数量呈几何级增加(1-2-4-8-16-等)。同步细胞分裂在人胚胎中一般保持至8细胞期。在这之后，细胞分裂变为异步的，最后各个细胞拥有自己的细胞周期。在不育治疗期间产生的人胚胎可以在8-分裂球阶段之前转移到接受者。在某些情况下，人胚胎也在转移之前培养到胚泡阶段。当有很多质量良好的胚胎可用或者需要延长时间的孵育以等待着床前遗传诊断(PGD)的结果时尤其优选这样做。但是随着孵育技术的改进，有延长孵育的倾向。

因此，术语胚胎在下文中用于指代以下各阶段：受精的卵母细胞、受精卵、2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞、致密化(compaction)、桑椹胚、胚泡、扩张的胚泡和孵化的胚泡，以及其间的所有阶段(例如3-细胞或5-细胞)。

本发明实施方式的一些示例性实施可使用胚泡相关的参数。

胚泡的质量标准是胚胎质量标准的例子。胚泡质量标准可能例如与胚胎从致密化即初步致密化到孵化的胚泡的发育有关。致密化是这样一个过程，其中具有紧密连接的分裂球和桥粒之间的接触加强，导致细胞间隙减少，细胞轮廓变模糊。致密化之前，可逐个地追踪胚胎分裂球，在致密化之前，胚胎的发育遵循清晰的、基本同步的细胞分裂路径，所述细胞分裂可用肉眼观察到并且能够容易地加以注解。致密化之后，胚胎发育的特征是从桑椹胚到胚泡的几乎连续的发育，其中很难分辨出单个的分裂球，但是可根据已经建立的技术例如目视来表征许多的阶段并对其加以注解(鉴别)以提供胚泡相关参数。一些示例性实施方案中可用到以下胚泡相关参数：

致密化开始(SC)描述观察到2个或更多个分裂球之间的致密化的第一时间。因此，SC标志致密化过程的起始。

桑椹胚(M)被定义为观察到任何分裂球之间均不存在质膜的第一时间。当致密化过程完成时，形成致密化的任何分裂球之间看不到质膜，胚胎可以被定义为桑椹胚。更常见地，在S3之后、接近第四个同步期(S4)的开始或者就在第四个同步期开始时看到桑椹胚。在致密化起始之前，很少有胚胎分裂为16个细胞或更多的细胞。

滋养外胚层的最初分化(IDT)被定义为在桑椹胚阶段期间识别到清楚的滋养外胚层细胞的第一时间。它描述滋养外胚层细胞分化的开始。分裂球逐渐变得扁平和细长，在外部环境和桑椹胚的内部细胞部分之间形成了屏障。

胚泡形成的开始(SB)被定义为可观察到充有液体的腔即胚泡腔的第一时间。它也被称为“腔化的开始”。它描述胚胎的桑椹胚阶段和胚泡阶段之间的过渡期的开始。胚胎往往停留在这个过渡阶段一段时间，然后才进入实际的胚泡阶段。腔化的开始通常在滋养外胚层细胞分化后立即出现。桑椹胚与外部环境接触的外层开始积极地泵送盐和水进入细胞间隙，结果是空腔(胚泡腔)开始形成。

胚泡(B)被定义为当液体填充的腔最终形成的时候，即，在胚泡开始扩大之前空腔不再显著增加的时候。

内细胞团的初始分化(IDICM)被定义为可识别出内细胞团的第一时间。IDICM描述内细胞团发育的开始。偏心布置的细胞簇由间隙连接相连，其中细胞间的边界似乎不能被明确界定。

胚泡扩张的开始(EB)被定义为胚胎已填满卵周隙并开始移动/扩展透明带的第一时间。EB描述了胚胎扩张的开始。由于胚泡扩张，可看见透明带变得更薄。

孵化中的胚泡(HB)被定义为滋养外胚层细胞逃脱/穿透了透明带的第一时间。

完全孵化的胚泡(FH)被定义为当孵化完成且透明带脱落时。

与胚泡发育相关的各个发生时间可定义如下：

tM＝从授精至形成桑椹胚的时间(小时)

tSB＝从授精至胚泡形成开始的时间(小时)

tB＝从授精至形成胚泡的时间(小时)

tEB＝从授精至形成扩张的胚泡的时间(小时)

tHB＝从授精至孵化中的胚泡的时间(小时)

图3示意性示出了根据本发明某些实施方式的设备2，其用于确定胚胎8的发育潜能。设备2包括连接到胚胎成像系统6的通用计算机4。胚胎成像系统6可以是一般常规的，其被配置成按照已建立的技术获得胚胎8在各个发育阶段的图像。应当理解的是，一般而言胚胎成像系统6典型地被配置为在监测阶段中获得多个胚胎的图像，而不是仅仅单个胚胎的图像。例如，典型的研究可包括分析若干个胚胎，例如72个胚胎。胚胎成像系统可以被配置成记录每个胚胎的图像(可能利用在多个焦点平面拍摄的图像)，每次一个胚胎，然后移动去对下一个胚胎成像。一旦所有的胚胎均已经成像(这可能要花例如5分钟)，可以重复对单个胚胎成像的循环以提供下一时间点各个胚胎的各个图像。

通用计算机4适于(被编程以)执行从对从胚胎成像系统6获得的图像的分析确定胚胎发育潜能的方法，如下文进一步的描述。

因此，根据本发明一个实施方式，计算机系统4被配置成执行胚胎图像数据的处理。计算机4包括中央处理单元(CPU)24，只读存储器(ROM)26，随机存取存储器(RAM)28，硬盘驱动器30，硬件接口46，显示驱动器32，显示器34，和用户输入/输出(IO)电路36，以及键盘38和鼠标40。这些设备通过公共总线42相连。计算机4还包括图形卡44，其通过公共总线42连接。图形卡包括图形处理单元(GPU)和紧密耦合到GPU的随机存取存储器(GPU存储器)。胚胎成像系统6根据常规技术的技巧通过硬件接口46与计算机4通信耦联。

CPU24可执行ROM26、RAM28或硬盘驱动器30内存储的程序指令，以进行对可能存储在RAM28或硬盘驱动器30内的胚胎图像数据的处理。RAM28和硬盘驱动器30统称为系统内存。在一些实施方案中，根据本发明实施方式的处理可以基于计算机4直接从成像系统6获得的胚胎图像。在其它实施方案中，根据本发明实施方式的处理可以基于之前获得并存储在计算机4的存储器例如HDD30的RAM28中的胚胎图像(即，胚胎成像系统6本身不是本发明实施方式的必要元件)。计算机4的各方面可以在很大程度上是常规的，除了CPU被配置为运行一个程序，该程序可以例如存储在RAM28、ROM26或HDD30中，以如本文所述根据本发明的某些实施方式执行处理。

根据某些示例性实施方式，用胚胎成像系统6按时监测胚胎8以获得相关的信息(即，与具体胚胎发育事件相关的发生时间)。胚胎优选监测每小时至少一次，例如每小时至少两次，如每小时至少3次，如每小时至少四次，如每小时至少6次，如每小时至少12次。优选当胚胎置于用于培养胚胎的孵化器中时进行监测。优选通过对胚胎的图像采集例如本文关于缩时方法所讨论的图像采集来进行这种监测。

可例如通过目视检查胚胎8的图像和/或通过诸如在题为“确定细胞群体的变化(Determination of a change in a cell population)”的WO2007/042044 A1(Unisense Fertilitech)中详述的自动方法来(从如本文所述的发育事件的发生时间中)确定选择标准。另外，确定选择标准的其它方法可以通过采用展望(例如采用使用FertiMorph软件(ImageHouse MedicallCopenhagen，丹麦))来确定细胞质膜的位置来进行。所描述的方法可以单独使用或与如上所述的胚胎图像的目视检查和/或与自动化方法组合使用。

如上所述，可优选用缩时显微镜来实施根据本发明实施例的方法的某些实施方案和/或测值。用缩时显微镜来测值的合适系统描述于WO2007/042044 A1(通过引用纳入本文)。得到的不同的图像可用于量化在一系列图像的连续帧之间发生的改变的量。

本发明可应用于差分图像数据(difference image data)的分析，其中由于细胞运动而产生的细胞边界(即细胞膜)的位置变化引起从差分图像获得的一系列参数的短暂升高(参见WO2007/042044A1)。这些参数包括(但不限于)平均绝对强度或方差的升高。这样的参数的一个例子绘制于图1，显示了与各种发育事件的发生相关的“尖峰”。因此，可通过差分图像中的所有像素的标准差或WO 2007/042044中列出的“分裂球活动”的任何其他衍生参数的暂时性变化——增加或减少——来检测细胞分裂和它们的持续时间以及相关的细胞重新排布。然而，选择标准也可以应用到与胚胎相关的对缩时图像和其他时间分辨数据(例如代谢物的排泄或摄取、物理或化学外观的改变、衍射、散射、吸收等)的目视观测和分析。

在一般意义上，本文描述的按照本发明某些实施方式的各种方法，是基于从与各胚胎发育事件相关的发生时间(例如分裂时间和/或细胞周期持续时间)来确定胚胎的发育潜能。在这方面，获得各发生时间的具体方式不是很重要。实际上，可根据任何常规技术，例如使用以常规的缩时胚胎成像系统6(如图3中示意性示出的)获得的图像，来获得这些发生时间。例如，根据一种方式，当有关胚胎发育事件(例如某一细胞分裂)发生时，使用者可以查看正在发育的胚胎的缩时图像并记录。通常，使用者可“播放”包含胚胎的缩时图像的视频序列，并在观察到相关的细胞分裂发生时“暂停”回放(或只是在正在进行的回放期间“点击”)。然后可将“暂停”或“点击”的时间记录为对应于相关的发育事件的发生时间。这可称为手动识别发生时间。对于给定的事件的某一发生时间的识别，有时被称为注释该事件。因此，对于确定了发生时间(例如利用手动识别技术)的胚胎发育事件，有时可称为注释的事件。

如上所述，已知的是，在尝试找到用于预测哪些胚胎具有良好发育潜能的模型时，要考虑与胚胎发育相关的某些变量。作为这种方式的一个例子，可考虑对应于卵裂时间t2和t5(如上文定义)的变量。

图4基于从五个不同的诊所获得的KID数据示意性地对一群阳性KID胚胎(显示为加号(+))和阴性KID胚胎(显示为减号(-))的卵裂时间t5对卵裂时间t2作图。然而，从该图很难估测参数t5和t2的最佳组合，因为阳性KID观测值(加号)和阴性KID观测值(减号)在很大程度上重叠。

本发明的发明人发现，与使用单纯的卵裂时间来评估胚胎相关的另一个问题是，在不同的孵育条件下可产生卵裂时间的变化。图5示意性地表示了该问题，该图绘制了来自五个不同诊所(图中标记为1至5)的数据中看到的卵裂时间t5的值的直方图。不同的诊所具有不同的孵育条件，例如温度、氧的存在，等等，它们可以导致更快或更慢的形态动力学胚胎发育。例如，从图5中可明显看出，诊所1的孵育条件通常比诊所4的孵育条件产生更低的t5值。这可能意味着，对一个诊所中孵育的胚胎所确定的胚胎发育事件的最佳值可能与对在不同诊所中孵育的胚胎的相同胚胎发育事件所确定的最佳值不同。这使得很难建立一个模型用于确定能够适用于来自不同诊所的胚胎(即经受不同的孵育条件的胚胎)的胚胎发育潜能。

为了有助于减少上文提到的一些问题的影响，本发明某些实施方式提供了从多个与胚胎发育事件相关的发生时间导出可称之为聚合变量(aggregated variables)的变量。可根据常规技术来确定这些发生时间本身。然后用一个或多个这种聚合变量来提供胚胎发育潜能的指标。

图6是一个流程图，示意性示出了根据本发明一个实施方式确定胚胎(本文称为研究胚胎)发育潜能的方法。例如，该方法可以通过在图3中示出的通用计算机来实现。具体而言，该方法可以由处理单元如CPU24来实施，该处理单元运行程序使计算机执行所述方法。在一般意义上，根据图6中示意性示出的方法的本发明实施方式旨在从与研究胚胎的发育相关的多个特征来产生连续变量的值。

在步骤S1，获得与观察期期间研究胚胎的发育相关的多个特征。这些特征可以从根本上基于用常规的缩时胚胎成像来确定的卵裂时间。一个或多个特征可基于原核的淡出/消失(tPN淡出(或tPNf))的发生时间。

在该例子中，所述特征包括针对一个序列的细胞周期的一系列细胞周期持续时间cci。例如，多个特征可包括一系列值：cc2a(＝t3-t2)；cc2b(＝t4-t2)；cc3a(＝t5-t3),cc3b(＝t6-t3),cc3c(＝t7-t4),cc3d(＝t8-t4)。也就是说，对于这个例子，所述序列包括从cc2a至cc3d的所有细胞周期的持续时间(即直至8-分裂球胚胎的所有细胞周期持续时间，cc1除外)。如果对于给定的胚胎存在没有测量到的特定细胞周期持续时间(例如由于测量不充分或由于到指示时间结束(t末尾(tEnd))时卵裂事件还没有发生，所以不能合适地确定相关卵裂事件的发生时间)，所述序列中可略去所述缺失的(一个或多个)细胞周期。这些特征可以通过执行所述方法的设备的数据输入单元而获得。因此，例如，数据输入单元可以包括配置为从存储器或从胚胎成像系统读出数据的计算机元件。数据可以包括所述特征的已经确定的值，或者可以包含信息，诸如细胞裂解时间或显微镜图像，从这些信息可得到所述特征。可例如基于先前的数据手动注释来确定细胞裂解时间。

在步骤S2中，获得在阳性KID胚胎群体中所观察到的与步骤S1中获得的研究胚胎的那些特征相对应的特征的平均值和方差值。这些可以是例如从存储器或执行该方法的设备的其他存储装置读取。平均值和方差值可以通过对后续成功着床的胚胎的图像进行回顾性分析来获得。对于给定的研究胚胎，获得其平均值和方差值的胚胎可称为参考胚胎。某些情况下，参考胚胎可包括预期与研究胚胎在同一诊所的胚胎，例如以有助于将与不同的孵育条件相关的诊所间变异考虑进来。也就是说，步骤S2还可包括基于研究胚胎的风险(Risks)来选择获得平均值和方差值的参考胚胎的合适分组。平均值和方差值可根据常规的统计学分析技术来确定，例如可能包括舍弃离群数据等。应理解术语“平均值”在本文中用其广义，指在样品群体中见到的参数的典型/代表性/指示性的值。在这方面，平均值可例如对应于参考群体(阳性KID群体)的相关特征的平均数、众数或中位值。

步骤S3中，确定研究胚胎的各特征的值和与阳性KID胚胎群体相关的相应特征平均值的差。

步骤S4中，通过用各自的方差值加权的方式来组合/集合所确定的各特征的差，从而确定研究胚胎的质量参数(对应于连续变量)。因此，在一个具体实例中，质量参数(GIV)定义为：

其中cci是对研究胚胎所观察到的一系列细胞周期持续时间，cci_m是在参考组的胚胎(例如来自35岁以下患者的阳性KID群体)中观察到的对应系列的平均细胞周期持续时间，cci_v是与参考群体相关的相应方差值。参数n是构成所述系列的细胞周期持续时间cci的数目。作为组合过程的一部分，用方差值将差(cci-cci_m)归一化。这意味着，样品群体中显示出相对高变异的特定细胞周期(i的值)的差相对于样品群体中显示出相对低变异的细胞周期的差，对GIV值的贡献要少。在组合过程中将差(cci-cci_m)平方，意味着对于某给定的差不管是正的还是负的(即，不管cci比cci_m长还是短)，其对GIV的贡献都是一样的。

一般而言当研究胚胎展现出规律性的卵裂模式时GIV低，当胚胎展现出无规律性的卵裂模式时GIV高。

在此实例中，基于特定序列的细胞周期持续时间cci＝cc2a；cc2b；cc3a；cc3b；cc3c和cc3d的特定质量参数在本文中可称为第一总无规律性变量(first generalized irregularity variable)GIV1。

步骤S5中，基于质量参数(本实例中GIV1)确定研究胚胎的发育潜能。下文中进一步一般性地讨论了该过程。

步骤S6中，输出对于所述胚胎确定的发育潜能的指示，例如在显示器上显示给医师。

因此，图6示意性示出了根据本发明实施方式确定胚胎发育潜能的过程。可以理解，可以使用类似方法来使用与研究胚胎的发育相关的不同特征和/或通过以不同的方式组合这些特征来产生不同的质量参数，从而确定胚胎的发育潜能。

例如，当如上文所述的第一总无规律性变量GIV1基于细胞周期cc2a、cc2b、cc3a、cc3b、cc3c和cc3d的持续时间(或至少是测量的/不缺失的那些细胞周期的持续时间)时，另外的总无规律性变量可基于其他细胞周期的持续时间。例如，可定义如下变化形式：

GIV2(第二总无规律性变量)：类似于GIV1，但是还包括cc1，即，可用与GIV1类似的方式计算GIV2，但是基于cci＝cc1、cc2a、cc2b、cc3a、cc3b、cc3c和cc3d。

GIV3(第三总无规律性变量):仅包括第二代细胞周期(cc2a和cc2b)，即，可用与GIV1类似的方式计算GIV3，但是基于cci＝cc2a和cc2b。

GIV4(第四总无规律性变量):仅包括第二和第三代的最短的细胞周期(cc2a和cc3a)，即可用与GIV1类似的方式计算GIV4，但是基于cci＝cc2a和cc3a。

虽然上文例示的总无规律性变量是基于相对于细胞卵裂次数而定义的细胞周期持续时间，但可理解其他总无规律性变量可基于与其他胚胎发育事件相关的其他发生时间(和/或(多个)发生时间之间的持续时间)。例如，可用相对于原核淡出时间(tPNf)来定义的发生时间建立根据本发明一些实施方式使用的总无规律性变量。其中一个例子，可称为GIV5，可如下定义：

GIV5(第五总无规律性变量):包括(t3-tPNf)和cc3a。

每一个情况下，如果胚胎缺失了构成总规律性变量的任何特征(例如由于某些特征没有正确测量或在孵育时间结束之前还没有发生)，则在变量计算中可略去该相应特征(n的值相应减少)。

其他变量可从除细胞周期持续时间之外的、与研究胚胎的发育相关的特征来确定。

例如，上文所述实施图6方法的一种变化形式可以如下：

步骤S1中，与研究胚胎的发育相关的特征可以改为包括后续(subsequent)细胞分裂(或形态学阶段)之间的一系列时间差Δtj。例如，多个特征可包括一系列值：Δt1(＝t2)；Δt2(＝t3-t2)；Δt3(＝t4-t3)；Δt4(＝t5-t4),Δt5(＝t6-t5),Δt6(＝t7-t6),Δt7(＝t8-t7)-，即，后续细胞分裂(直至八分裂球阶段)之间的时间差。也就是说，在该实例中，所述序列包括从单细胞至八分裂球胚胎的后续细胞分裂之间的所有时间，或至少被认为被适当测量(即没有缺失)的所有这些时间。

步骤S2中，获得在阳性KID胚胎群体中所观察到的特征的平均值和方差值，所述特征是步骤S1中获得的研究胚胎的那些特征。

步骤S4中，通过用各自的方差值加权的方式来组合/集合所确定的各特征的差，从而确定研究胚胎的质量参数(对应于连续变量)。因此在一个具体实例中，质量参数(GTV)定义为：

其中Δtj是对于研究胚胎所观察到的后续细胞分裂的一系列时间差。Δtj_m是在参考组的胚胎(例如来自35岁以下患者的阳性KID群体)中观察到的对应系列的平均值，Δtj_v是与参考群体相关的相应方差值。参数k是构成所述一系列Δtj的值的数目。作为组合过程的一部分，用方差值Δtj_v将差(Δtj-Δtj_m)归一化。这意味着，样品群体中显示出相对高变异的特定细胞分裂(j的值)的差相对于样品群体中显示出相对低变异的细胞分裂的差，对GIV的值的贡献要少。在该实例中，每个时间差对GIV的贡献取决于特定的后续细胞分裂对的时间差比阳性KID群体的平均值快还是慢(即，时间差是正的还是负的)。

该特定的质量参数GTV在本文中可称为第三总时间变量GTV3。一般而言，当研究胚胎显示出较快的发育时，GTV3低；当胚胎显示出较慢的发育时，GTV3高。

基于特定序列Δt1(＝t2)；Δt2(＝t3-t2)；Δt3(＝t4-t3)；Δt4(＝t5-t4),Δt5(＝t6-t5),Δt6(＝t7-t6),Δt7(＝t8-t7)的特定质量参数，如在本实例中的特定质量参数，在本文中可称为第三总时间变量GIV3。

步骤S5中，基于质量参数GTV3确定研究胚胎的发育潜能。下文中进一步一般性地讨论了该过程。

步骤S6中，输出所确定的发育潜能的指示，例如在显示器上显示给医师。

也可以理解，可使用类似方法用与研究胚胎的发育相关的不同特征来确定胚胎的发育潜能。

例如，虽然如上文所述的第三总时间变量GTV3是基于从单细胞至八分裂球胚胎的后续细胞分裂之间的所有时间，但是其他的总无规律性变量可基于其他序列的时间差。例如，可定义以下变化形式：

GTV1(第一总时间变量):类似于GTV3，但是仅使用所观察到的最多至8分裂球状态的最后两次细胞分裂之间的时间差。即，Δti＝(t8-t7)，如果t7和t8注释了；或者Δti＝(t7-t6)，如果t8缺失，t6和t7注释了；或者Δti＝(t6-t5)，如果t8和t7缺失，t5和t6注释了；或者Δti＝(t5-t4)，如果t8、t7和t6缺失，t4和t5注释了；或者Δti＝(t4-t3)，如果t5至t8缺失，t3和t4注释了；或者Δti＝(t3-t2)，如果t4至t8缺失，t2和t3注释了；Δti＝t2，如果t3至t8缺失，t2注释了。每种情况下，参数k为1。

GTV2(第二总时间变量):类似于GTV1，但是当有时间缺失时，一对分裂时间中的后一个分裂时间(卵裂时间)用t末尾(孵育时间的末尾)替代。即，Δti＝(t8-t7)，如果t7和t8注释了；或者Δti＝(t末尾-t7)，如果t8缺失，t7注释了；或者Δti＝(t末尾-t6)，如果t7和t8缺失，t6注释了；或者Δti＝(t末尾-t5)，如果t6至t8缺失，t5注释了；或者Δti＝(t末尾-t4)，如果t5至t8缺失，t4注释了；或者Δti＝(t末尾-t3)，如果t4至t8缺失，t3注释了；或者Δti＝(t末尾-t2)，如果t3至t8缺失，t2注释了。可基于不用上述替代的Δti计算参考群体的平均值和方差值。对于GTV2，参数k总是1。

GTV3(第三总时间变量):如上所述，该质量参数使用没有从直至8分裂球阶段的数据缺失的所有连续分裂之间的时间。即，Δti＝((t8-t7),(t7-t6),(t6-t5),(t5-t4),(t4-t3),(t3-t2),t2)。如果对于特定胚胎，从该序列中缺失了某Δti，则从计算中略去该Δti。参数k是对于特定胚胎的计算中使用的Δti数目。

GTV4(第四总时间变量):类似于GTV3，但使用所有连续的分裂，只是如果最后的分裂时间缺失，则用孵育末尾时间替代。Δti＝((t8-t7),(t7-t6),(t6-t5),(t5-t4),(t4-t3),(t3-t2),t2)。如果某ti缺失，则用t末尾来替代。可基于不用上述替代的Δti计算参考群体的平均值和方差值。k是对于该特定胚胎的计算中使用的Δti数目。

GTV5(第五总时间变量):类似于GTV3，但是使用完整细胞周期的时间。即，Δti＝((t8-t4),(t4-t2),t2)。如果缺失了某Δti，则略去它。k是对于某特定胚胎的计算中使用的Δti数目。

GTV6(第六总时间变量):类似于GTV5，但使用所有完整的细胞周期，只是如果最后的分裂时间缺失，则用t末尾替代。Δti＝((t8-t4),(t4-t2),t2)。如果某ti缺失，则用t末尾来替代。基于不用上述替代的Δti计算平均值和方差值。k是对于该特定胚胎的计算中使用的Δti数目。

GTV7(第七总时间变量):类似于GTV2，但是仅使用从授精至最后注释的发生时间之间的时间段。即，Δti＝t8，如果t8注释了；Δti＝t7，如果t8缺失，t7注释了；Δti＝t6，如果t7和t8缺失，t6注释了；以此类推。对于GTV7，参数k总是1。

GTV8(第八总时间变量):类似于GTV3，但是如果t8注释了则使用t8，如果t8缺失则使用t末尾。对于GTV8，参数k总是1。

GTV9(第九总时间变量):类似于GTV2，但是使用直至胚泡阶段的胚胎阶段，用于在授精后第5天评价。Δti＝(tB-tSB)，如果tSB和tB均注释了；或者Δti＝(t末尾-tSB)，如果tB缺失，tSB注释了；或者Δti＝(t末尾-tM)，如果tSB和tB缺失，tM注释了；或者Δti＝(tM-t8)，如果tM至tB缺失，t8注释了；或者Δti＝(t末尾-t7)，如果t8至tB缺失，t7注释了；或者Δti＝(t末尾-t6)，如果t7至tB缺失，t6注释了；或者Δti＝(t末尾-t5)，如果t6至tB缺失，t5注释了；或者Δti＝(t末尾-t4)，如果t5至tB缺失，t4注释了；或者Δti＝(t末尾-t3)，如果t4至tB缺失，t3注释了；或者Δti＝(t末尾-t2)，如果t3至tB缺失，t2注释了。可基于不用上述替代的Δti计算平均值和方差值。对于GTV9，参数k总是1。

GTV10(第十总时间变量):类似于GTV4，但是使用直至胚泡阶段的所有阶段。用于在授精后第5天进行评价。Δti＝((tB-tSB),(tSB-tM),(tM-t8),(t8-t7),(t7-t6),(t6-t5),(t5-t4),(t4-t3),(t3-t2),t2)。如果某个发生时间缺失，则用t末尾来替代。基于不用上述替代的Δti计算平均值和方差值。对于GTV10，参数k是对于该特定胚胎的计算中使用的Δti数目。

胚胎的发育潜能(质量)可基于一个变量值或多个变量值。例如，参考以上具体实例，可基于包括总无规律性变量(GIV1-4)之一和总时间变量(GTV1至GTV8)之一的一对变量来确定胚胎的发育潜能。

除了用通过本文描述的方法获得的变量值来确定胚胎质量以外，还可考虑对胚胎进行的其他定量测量。这可包括与在线测量进行比较，所述在线测量例如分裂球的运动性、呼吸速率、氨基酸摄取等。分裂球运动性分析、呼吸速率和其他定量参数的组合数据集可改善对胚胎的选择并使胚胎学家能可靠地选择最好的胚胎用于转移。

因此，在一个实施方式中，根据本发明的方法可与其他测量组合以评价感兴趣的胚胎，还可用于选择合适的胚胎以转移给接受者。

这些其他的测量可(仅例举)选自呼吸速率、氨基酸摄取、运动性分析、分裂球运动性、形态学、分裂球大小、分裂球成粒、破碎、多核现象、分裂球的颜色、极体定向、成核、纺锤体的形成和完整性、以及很多其他定性的测量。呼吸测量可如PCT公开号WO 2004/056265A1(Unisense)中所述进行。

本发明实施方式还提供用于选择胚胎以供移植的方法，其中如上文所述监测胚胎以确定各胚胎的预测的发育潜能，并且其中基于各自的发育潜能选择一个或多个胚胎以移植。这种选择或鉴定方法可与其他测量组合以评价胚胎的质量。在胚胎的形态学评价中一些可能重要的标准是：(1)胚胎的形状，包括分裂球的数目和破碎程度；(2)透明带的存在和质量；(3)大小；(4)颜色和质地；(5)对与胚胎发育阶段有关的胚胎年龄的了解；和(6)分裂球膜的完整性。然后可用本领域技术人员所知的任何合适方法进行移植。

在一个优选实施方式中，在培养细胞群的过程中(例如细胞群在于培养基中的过程中)进行观察。本领域已知培养细胞群的方法。培养胚胎的一个例子描述在PCT公开号WO2004/056265 A1(Unisense)中。因此，可在本领域已知的任何常规条件下培养胚胎以提高胚胎的存活、生长和/或发育，例如可包括WO2004/056265 A1中教导的方法、装置和条件，WO2004/056265 A1通过引用纳入本文。

本发明还涉及数据载体，其包括可直接加载在数字处理装置的存储器中的计算机程序，还包括计算机代码部分，所述计算机代码部分构成了执行如上文所述的本发明方法的方式。

该数据载体可以是磁盘或光盘，或者是电子卡的形状例如EEPROM或闪存类型，并设计用于加载到现有的数字处理装置中。

实施例

从五个诊所根据各诊所常规的孵育和观察技术获得胚胎数据。获得所有胚胎的缩时图像，但只有转移的胚胎中着床情况已知(即，0％着床或100％着床)的胚胎通过详细的缩时分析来测量发育事件的准确发生时间(以受精后小时数计)，从而进行研究。根据诊所使用的标准程序来进行ICSI。这些标准程序是本领域技术人员知晓的。

本研究基于在第3天转移的1758个胚胎和第5天转移的288个胚胎的数据，这些胚胎是来自五个诊所的KID阳性或KID阴性胚胎。表1显示了数据是如何在五个诊所之间分布的。本分析中所用的所有胚胎均来自最多至第3天或第5天转移的胚胎，而且仅来自ICSI周期而没有进行活检。如果某些周期中一些胚胎在没有缩时的情况下孵育，则在分析中除去该周期。直至八细胞阶段的卵裂阶段(发生时间)用于估计各胚胎如上文所定义的各总无规律性变量和总时间变量。对于各胚胎，用获自与该胚胎相关的诊所的KID阳性群体的平均值和方差来确定各总无规律性变量和总时间变量。

	n(第3天)	n(第5天)
			诊所1	279	119
诊所2	271	50
			诊所3	158	20
诊所4	783	98
			诊所5	267	1

表1:来自各诊所的在授精后第3天或第5天转移的已知着床数据(KID)的胚胎的数目。

孵育

根据各诊所的常规技术孵育胚胎。

成像系统

根据常规技术给胚胎成像。常规成像系统的一个例子是EmbryoScope，其使用具有每张图像30毫秒的短照射时间的单一LED发出的低强度红色光(波长635nm)，以尽量减少胚胎暴露于光并避免有害的短波长光。

形态动力学参数的缩时评价

用外部计算机workstation(EV),(Unisense FertiliTech,Aarhus,丹麦)使用图像分析软件来进行对各胚胎所获得图像的回顾性分析，其中所有考虑的胚胎发育事件都和这些事件的相应发生时间(以ICSI显微注射或IVF处理后的小时数计)一起被注释。然后用EV来鉴定相关胚胎发育事件的发生时间。实施例中的相关事件是确定直至八细胞阶段的卵裂阶段的如上文所定义的GIV和GTV所需要的。事件的时间被定义为相关事件能被清晰观察到的第一个时间点/图像帧。所有事件均表示为ICSI显微注射或IVF处理后的小时数。

对转移的100％着床(即超声证实的胎囊数目与转移的胚胎数目相匹配)的胚胎进行了详细分析；也对0％着床(其中没有实现生化妊娠)的胚胎进行了详细分析。

实施例结果

表2A和2B示出了如上文所定义并按照本发明实施方式确定的多个总无规律性变量和总时间变量的一些统计学数据。表2A显示了授精后第3天转移的数据，表2B显示了授精后第5天转移的数据。可以看到，表2A和2B各分为两部分，上面部分显示了示例性的总无规律性变量GIV1至GIV5的数据，下面部分显示了示例性总时间变量(表2A是GTV1至GTV8，表2B是GTV1至GTV10)的数据。

表2A:对于第3天转移的胚胎，与KID阳性和KID阴性相关的不同变量的统计学。

表2B:对于第5天转移的胚胎，与KID阳性和KID阴性胚胎相关的不同变量的统计学。

表2A和2B中示出的统计学数据是基于来自几个诊所的胚胎的数据。在表中相应部分的上部示出的是KID阴性胚胎的结果，在表中相应部分的下部示出的是阳性KID胚胎的结果。N是用于产生相应统计学数据的胚胎总数目。最小值、25％四分位数、中位值、75％四分位数和最大值分别代表对应群体中对于对应变量观察到的最小值、第一个、第二个和第三个四分位数的值以及最大值。

从表2A和2B可以看出，KID阳性群体相对于KID阴性群体而言各变量的统计学值总体较低。

对于上文讨论的具体示例性变量，有五个总无规律性变量(GIV1至GIV5)和十个总时间变量(GTV1至GTV10)。本发明的一些实施方式集中在不同对的这些变量上，其中每一对变量包括选自GIV1至GIV5的一个总无规律性变量和选自GTV1至GTV10的一个总时间变量。因此，这些实例中有50个不同对的变量可供选择。对于与GIV1至GIV5和GTV1至GTV8相关的40个不同对的变量(即，GIV1至GIV5中的一个和GTV1至GTV8中的一个的40个不同组合)中的每一对，用标准统计技术并根据下式估算逻辑回归模型：

其中OD是成功胚胎着床的几率(pi/(pi-1))，pi是着床可能性，α₀是估算的模型截距，α_诊 _所代表估算的诊所对模型截距的影响，β_GIV是对于该模型特定GIV变量GIV_i(其中i＝1至5)的估算系数，β_GTV是对于该模型特定GTV变量GTV_i(其中对于第3天转移的胚胎，i＝1至8；对于第5天转移的胚胎，i＝1至10)的估算系数，ε是该模型的估算误差。

表4A显示了对与授精后第3天转移的各对(组合)GIV和GTV根据方程3估算的模型相关的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristics,ROC)确定的曲线下面积(AUC)。表4B显示了授精后第5天转移的相应值。对于一些组合，确定了(用标准统计学技术，诸如赤池信息量准则(Akaike information criterion，AIC)GTV变量的作用不显著。这些组合在表中有关的格中表示为剑号(例如，表4A中的(GTV_i,GIV_i)＝(GTV1,GIV1)和(GTV1,GIV2)，等等)。对GIV5这一列，只使用了来自一个诊所的数据。AUC 0.65可例如被认为是可接受的阈值。

表4A:用授精后第3天数据的不同类型的GIV和GTV组合估算的模型的ROC曲线的AUC。

表4B:用授精后第5天数据的不同类型的GIV和GTV组合估算的模型的ROC曲线的AUC。

表5A显示了对第3天转移的各对(组合)的GIV和GTV根据方程3估算的模型确定的赤池信息量准则AIC。表5B显示了授精后第5天转移的相应值。如上文提到的，经标准统计学技术确定，GTV变量的作用对于表中相关格中用剑号标识的组合是不显著的。对GIV5这一栏，只使用了来自一个诊所的数据。

表5A:用第3天转移的不同类型的GIV和GTV组合估算的模型的赤池信息量准则AIC。

表5B:用第5天转移的不同类型的GIV和GTV组合估算的模型的赤池信息量准则AIC。

从表4可看出，总变量的所有组合的模型均与大于或等于0.65的AUC值相关，表明所有模型均可用于对本研究中的胚胎分级。第3天转移的提供具有相对高AUC和相对低AIC的模型的GIV和GTV的4个示例组合是：选择的变量对1＝GTV6和GIV1(AUC＝0.69,AIC＝1787)；选择的变量对2＝GTV2和GIV2(AUC＝0.68AIC＝1786)；选择的变量对3＝GTV4和GIV2(AUC＝0.68AIC＝1784)；以及选择的变量对4＝GTV6和GIV2(AUC＝0.68AIC＝1785)。第5天转移的提供具有相对高AUC和相对低AIC的模型的GIV和GTV的两个示例组合是：选择的变量对5＝GTV10和GIV2(AUC＝0.70,AIC＝364)；选择的变量对6＝GTV10和GIV4(AUC＝0.70,AIC＝364)。

图7A示意性绘制了第3天转移的GTV6相对于GIV1(即，与构成本研究的KID胚胎群体的所选择的变量对1相关的变量)的图。阳性KID胚胎的数据表示为加号(+)，阴性KID胚胎的数据表示为减号(-)。图7B显示了一些与图7A中的数据相同的数据，但是比例尺放大了(见各轴上的标示)。

图8A和8B与图7A和7B类似，从图7A和7B即可以理解图8A和8B，但是图8A和8B对与上文所鉴定的选择的变量对2(即，第3天转移的GTV2相对于GIV2)相关的变量的数据作图。

图9A和9B与图7A和7B类似，从图7A和7B即可以理解图9A和9B，但是图9A和9B对与上文所鉴定的选择的变量对3(即，第3天转移的GTV4相对于GIV2)相关的变量的数据作图。

图10A和10B与图7A和7B类似，从图7A和7B即可以理解图10A和10B，但图10A和10B对与上文所鉴定的选择的变量对4(即，第3天转移的GTV6相对于GIV2)相关的变量的数据作图。

图7-10显示，对于每一个示例性的选择的变量对，在各图中与低GIV和GTV值相应的区域中，KID阳性胚胎的发生率比KID阴性胚胎的发生率要高。这表明各变量能够区分KID阳性和KID阴性事件。

可以理解，除了与GTV、GIV和诊所相关的影响(这些纳入了根据方程3的线性回归模型)之外，可能还有影响给定胚胎成功着床几率的其他因素。例如，在2细胞阶段和4细胞阶段是否出现了多核现象(MN2和MN4)，在2细胞阶段和4细胞阶段分裂球大小是否不均一(UE2和UE4)，在治疗时患者的年龄(年龄)和各参数对诊所的依赖程度。关于不均一性，如果最大的分裂球的特征性(例如，平均)直径例如比最小的分裂球的特征性(例如比特征性(例如平均))直径大25％以上，则可认为分裂球在2细胞阶段和/或4细胞阶段大小不均一。在经历了相同数目的分裂(例如，当胚胎在2细胞阶段和/或4细胞阶段时)的细胞中不均一性最容易被表征。这是因为在经历了不同数目分裂的细胞之间通常大小会不同。例如，在一个三细胞胚胎中，最慢的分裂球(即，下一次预期分裂的分裂球)在其之后分裂之前将会更大。

考虑到这一点，针对图7-10(基于第3天转移)中示出的选择的变量对并且还针对上面所鉴定的选择的变量对5和6(基于第5天转移)来估算另外的逻辑回归模型。对于这6个选择的变量对中的每一个，用标准统计学技术并根据下式估算逻辑回归模型：

其中OD是成功胚胎着床的几率(pi/(pi-1))，pi是着床可能性，α₀是估算的模型截距，α_诊 _所代表诊所对该模型截距的估算影响，MN2、MN4、UE2和UE4如果对胚胎是“真”则取值1，如果是“假”则取值0，α_MN2、α_MN4、α_UE2、α_UE4分别代表MN2、MN4、UE2和UE4(当为真时)对该模型截距的估算影响，β_年龄是对于该模型患者年龄的估算系数，β_{年龄,诊所}代表对于不同诊所患者年龄的影响的差，β_GIV是对于该模型特定GIV变量的估算系数，β_GIV,诊所代表对于不同诊所GIV的影响的差，β_GTV是对于该模型特定GTV变量的估算系数，β_GTV,诊所代表对于不同诊所GTV的影响的差，ε是该模型的估算误差。

如下文进一步讨论的，方程[4]中的多个要素可以被鉴定为对模型没有显著影响(即，ln(OD)对某要素没有强烈依赖)。在这方面，可从方程4代表的模型(“完整”模型)中除去一些要素以提供可以称为“简化的”模型。此外，本发明的发明人意识到，不同的项目可能对不同的模型有不同的显著性，例如，被确定为对区分第3天转移的KID阳性和KID阴性胚胎具有统计学显著性的某项目可能会被确定为对区分第5天转移的KID阳性和KID阴性胚胎不具有统计学显著性。因此，对于对应于选择的变量对1-4的四个不同的GIV和GTV组合，可如下表示第3天转移的简化模型：

ln(OD)＝α₀+α_诊所+α_MN2MN2+α_MN4MN4+β_年龄年龄_i+β_GIVGIV_i+β_GTVGTV_i

+β_{年龄诊所} 年龄_i+ε [5a]

并且对于对应于选择的变量对5和6的两个不同的GIV和GTV组合，可如下表示第5天转移的简化模型：

ln(OD)＝α₀+α_诊所+α_MN4MN4+β_年龄年龄_i+β_GIVGIV_i+β_GTVGTV_i+ε [5b]

因此，示于方程5a(第3天转移)和5b(第5天转移)的从“完整”模型中除去以提供“简化”模型的要素是那些与不均一性(UE2,UE4)和不同诊所对GIV和GTV的影响(β_GIV,诊所,β_GTV,诊所)有关的要素。此外，对于第5天转移，将与2细胞阶段(MN2)的多核性和诊所对年龄的依赖性(β_年龄诊所年龄)相关的要素从“完整”模型中除去以提供“简化”模型(方程5b)。

表6示出了与由方程4和5a定义的模型相关的、针对第3天转移的第一个选择的变量对GTV6和GIV1确定的变量值。对于该选择的变量对，简化模型的ROC的AUC是0.70。表中的最上一行显示了对完整模型确定的AIC。

表6与由针对第3天转移的变量对GTV6和GIV1的方程4和5a定义的模型相关的变量的值。

表6中第一(最左边)列列出了各变量，第二列列出了由基于方程5a的逻辑回归建模(针对第3天转移的简化模型)确定的变量的相应参数估算值，第三列表征了完整模型(方程4)中变量的统计学确定的显著性。第四(最右边)列列出了对应于完整模型(方程4)但是除去了相关变量的一个模型确定的AIC。根据传统的统计学技术，将与从完整模型中去除某一变量相关的AIC减少作为该变量不是该完整模型的重要参数的指示。如果确定为没有显著性，则第三列中示出的显著性表征为"ns"，显著性增加则星号("*")的数目增加。在这方面，根据由传统统计学技术确定的p-值来表征显著性。本文中将小于0.001的p值归类为三个星号("***")，等于或大于0.001并小于0.01的p-值本文中归类为两个星号("***")，等于或大于0.01并小于0.05的p值归类为一个星号("**")，等于或大于0.05并小于0.1的p值归类为一个点(".")。

表7与表6类似，从表6即可以理解表7，但是表7与第3天转移的第二个选择的变量对GTV2和GIV2有关。此处简化模型的ROC的AUC为0.71。

表7与由针对第3天转移的GTV2和GIV2的方程4和5a定义的模型相关的变量的值。

表8与表6类似，从表6即可以理解表8，但是表8与第3天转移的第三个选择的变量对GTV4和GIV2有关。此处简化模型的ROC的AUC为0.71。

表8与由针对第3天转移的变量对GTV4和GIV2的方程4和5a定义的模型相关的变量的值。

表9与表6类似，从表6即可以理解表9，但是表9与第3天转移的第四个选择的变量对GTV6和GIV2有关。此处简化模型的ROC的AUC为0.71。

表9与由针对第3天转移的GTV6和GIV2的方程4和5a定义的模型相关的变量的值。

表10与表6类似，从表6即可以理解表10，但是表10与第五天转移的第五个选择的变量对GTV10和GIV2(因此基于方程5b的简化模型)有关。此处简化模型的ROC的AUC为0.73。

表10与由针对第5天转移的GTV10和GIV2的方程4和5b定义的模型相关的变量的值。

表11与表6类似，从表6即可以理解表11，但是表11与第五天转移的第六个选择的变量对GTV10和GIV4有关。此处简化模型的ROC的AUC为0.73。

表11与由针对第5天转移的GTV10和GIV4的与方程4和5b定义的模型相关的变量的值。

从表6-11的每一个表可看出，对于每一个选择的变量对，在所有情况下，没有与诊所的相互作用和各个总变量(GIV_i和GTV_i)相关的变量的完整模型确定的AIC都比完整模型确定的AIC要低。根据标准统计学技术，将其看作是各模型在GIV和GTV方面不显著依赖诊所的特性的指示。类似地，从表6-11中与UE2和UE4相关的AIC值可看出，它们对这些模型也没有统计学显著性。对于此处示出的第5天转移的例子(表10和11)，与2细胞阶段的多核性(MN2)和诊所对年龄的依赖性(β_{年龄,诊所}年龄)相关的值也没有统计学显著性。这支持了在方程5a和5b代表的简化模型中这些不同的变量没有贡献。在试图建立用于评价胚胎质量的模型的情况下，如果某给定模型的相同方面可以应用于在不同的诊所孵育的胚胎，则通常是有利的。

因此，根据本发明实施方式的方法可提供利用诸如上面所定义的那些衍生自胚胎缩时成像的变量来鉴定特定发育事件的发生时间从而预测成功胚胎着床几率的模型。而且，本文示出的六个示例性简化模型的ROC曲线的AUC均在0.70至0.73左右，表明所有六个模型都可被认为是“良好的”模型。

基于方程5a代表的简化模型，确定第3天转移的特定胚胎的绝对着床成功几率应考虑患者年龄和诊所。基于方程5b代表的简化模型(第5天转移)，确定特定胚胎的绝对着床成功几率应考虑患者年龄。但是，可以理解，一般而言评价胚胎发育潜能的任务主要是与对来自在某给定诊所治疗的给定患者的一群胚胎分级相关。也就是说，通常是希望确定一群胚胎中哪个胚胎具有最高的几率，而不需要确定这些几率是多少(即，感兴趣的发育潜能可以是评价一个样品中哪个是最好的胚胎，而不管这个胚胎实际有多好)。在这方面，图5的简化模型中对于某给定患者是常数的要素可以忽略，目的是确定使来自同一患者的不同胚胎能够在一个生育治疗周期中互相比较的质量参数。

在这方面，意在预测实际着床成功几率的方程5a和5b的简化模型可被进一步简化，以提供给出可称为模型分数的方程，该方程允许同一个生育治疗周期中的不同胚胎能够相互之间比较。因此，对于第3天转移，该模型分数可被定义为：

模型分数_i＝α₀+α_MN2MN2+α_MN4MN4+β_GIVGIV_i+β_GTVGTV_i [6a]

对于第5天转移，可被定义为：

模型分数_i＝α₀+α_MN4MN4+β_GIVGIV_i+β_GTVGTV_i [6b]

方程6a对应于方程5a，但是除去了对于给定患者是常数的参数(即，与年龄和诊所相关的参数，即α_诊所、β_年龄年龄和β_{年龄,诊所}年龄)。类似地，方程6b对应于方程5b，但是除去了对于给定患者是常数的参数。

模型分数越高，胚胎越好。原则上，截距参数α₀也可作为常数除去，但是本发明的发明人意识到，如果没有截距参数，如以上方程6a和6b所限定的模型分数经常给出负值，这可能被看作是当根据哪个胚胎分数最高来对来自不同胚胎的分数分级时，考虑起来不太直观。

因此，方程6a(第3天转移)和方程6b(第5天转移)所定义的模型分数以和方程5a和5b的相应简化模型相同的方式对给定生育治疗周期的一群胚胎进行分级。但是，依靠方程6a或6b的模型分数而不是方程5a和5b提供的对几率的实际预测的一个好处是其使用评价胚胎的人所掌握的仅来自于缩时电影的信息而不需要任何患者或诊所的具体信息。

基于方程6a和6b的模型分数，上文鉴定的六个示例性总变量对提供了以下方程，这些方程可用于对胚胎分级(这些通过根据需要将表6-11中示出的参数代入到方程6a或6b中来确定)：

模型1分数_i＝2.32-0.36MN2-0.37MN4-1.17GIV1_i-0.70GTV6_i [7]

模型2分数_i＝2.43-0.39MN2-0.36MN4-1.69GIV2_i-0.06GTV2_i [8]

模型3分数_i＝2.38-0.37MN2-0.37MN4-1.49GIV2_i-0.47GTV4_i [9]

模型4分数_i＝2.51-0.36MN2-0.37MN4-1.53GIV2_i-0.64CTV6_i [10]

模型5分数_i＝1.86-1.22MN4-1.02GIV2_i-2.13GTV10_i [11]

模型6分数_i＝2.83-1.31MN4-0.57GIV4_i-2.44GTV10_i [12]

可以理解，这些只是根据本发明一些实施方式确定胚胎模型分数的一些示例性方式。其他例子可基于上文讨论的示例性GTV和GIV参数的不同组合，或实际上是通过将与胚胎的形态动力学发育相关的多种其他特征以考虑这些特征的参考值的方式组合而获得的其他参数。因此，可以理解，以上实施例中使用的具体特征(即，基于上文示出的示例性GIV和GTV特征的选择的变量对)只是很多可能的实施例中的一些，根据本发明其他实施方式，可使用其他特征。具体而言，虽然上文的一些实施例集中在直至八分裂球阶段的胚胎发育相关的发育事件，但从其他实施例可以理解，其他实施方式可以除此之外还基于更晚阶段的发育事件或备选地基于更晚阶段的发育事件。例如，根据本发明一些其他实施方式，可以用与上文的描述相应的方式使用与胚泡事件的发生时间相关的特征(即胚泡相关变量)，例如基于上文讨论的GTV9和GTV10变量。

图11针对四个第3天转移的简化模型(由方程5a定义)中的每一个(基于上述的四个选择的变量对中的每一个)，示意性绘制了构成本研究的KID胚胎根据相应模型(模型预测)分级的发生率，以10个百分位阶表示增加的胚胎发育潜能(预期的着床成功可能性增加)。也显示了相应胚胎的实际发生率数据(KID阳性)。可以看出，对于所有的模型，预测值和实际发生率之间有良好的相关性，是各模型预测胚胎的发育潜能的能力的量度。

虽然以上实施例集中在与着床成功相关的KID阳性和KID阴性数据上，但是根据本发明一些实施方式，评价胚胎的质量/发育潜能可能包括确定达到不同的发育事件的潜能。例如确定胚胎的发育潜能/质量可能包括确定胚胎发育到胚泡阶段的可能性，着床的可能性，导致妊娠的可能性，和/或产生活产婴儿的可能性。

因此，根据本文描述的一些原则，可用KID数据群来产生模型，这些模型用于由一个或多个连续变量来确定胚胎质量变量/发育潜能(例如，着床可能性和/发育成胚泡的可能性)，所述连续变量是通过组合与观察期期间胚胎发育相关的多个特征的值与相应的参考值之间的差而获得的。然后可通过观察研究胚胎中的一些或所有的相关发育事件来确定所述一个或多个连续变量的值，然后用该模型由与其相关的(一个或多个)连续变量来预测研究胚胎的发育潜能。

因此，已经描述了确定胚胎例如体外孵育的人胚胎的发育潜能的方法，以及执行所述方法的设备。一些实施例中，方法包括获得与观察期期间胚胎的发育相关的多个形态动力学特征的值，例如与胚胎的时间发育或形态发育相关的特征的值。通过以预定的方式组合这些特征的所获得的值和相应参考值之间的差来确定连续变量的值。参考值，例如，可从所获得的至少一个具有已知发育潜能的参考胚胎的多个特征的值来确定。然后基于所确定的连续变量的值来确定胚胎的发育潜能。

以上说明书中提及的所有出版物均通过引用引入本文。

在不背离本发明的范围和精神的前提下，本发明所述方法和体系的各种修改和变动对本领域技术人员是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方式描述了本发明，但应理解要求保护的发明不应该不当地限制于这些具体的实施方式。实际上，对胚胎学、生物化学和生物技术或相关领域的技术人员而言显而易见的是，对所描述的实施本发明的方式的各种修改意在涵盖在以下权利要求书的范围内。

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Claims

1.一种确定胚胎发育潜能的方法，该方法包括：

获得与观察期期间所述胚胎的发育相关的多个特征的值；

通过以预定的方式组合所获得的值与所述多个特征的相应参考值之间的差来确定连续变量的值；以及

基于所确定的连续变量的值确定所述胚胎的发育潜能。

2.权利要求1的方法，其中所述参考值是从所获得的至少一个具有已知发育潜能的参考胚胎的多个特征的值确定的。

3.权利要求1或2的方法，其中组合所获得的值与所述参考值之间的差的步骤考虑与所述参考值中的每一个相关的加权值。

4.权利要求3的方法，其中所述加权值是从所获得的多个具有已知发育潜能的参考胚胎的多个特征的值统计确定的。

5.权利要求4的方法，其中所述加权值是从所获得的多个参考胚胎的值的方差来确定的。

6.任一在前权利要求的方法，其中所述多个特征与胚胎的形态学发育相关。

7.权利要求6的方法，其中所述连续变量代表胚胎的形态学发育中的规律性的量度。

8.任一在前权利要求的方法，其中所述多个特征与胚胎的时间发育相关。

9.权利要求8的方法，其中所述连续变量代表胚胎的时间发育中的规律性的量度。

10.任一在前权利要求的方法，其中所述多个特征包括胚胎的多个细胞周期持续时间cci。

11.任一在前权利要求的方法，其中所述多个特征包括胚胎的后续细胞分裂之间的多个时间差Δtj。

12.任一在前权利要求的方法，还包括：

获得与观察期期间所述胚胎的发育相关的另外的多个特征的值；

通过以另外预定的方式组合所获得的值与所述另外的多个特征的相应参考值之间的差来确定另外的连续变量的值；以及

也基于所确定的另外的连续变量的值确定所述胚胎的发育潜能。

13.任一在前权利要求的方法，其中通过缩时显微镜获得所述值。

14.一种确定胚胎发育潜能的设备，该设备包括：

数据输入元件，所述数据输入元件被配置成获得与观察期期间胚胎的发育相关的多个特征的值；以及

处理器元件，所述处理器元件用于通过以预定的方式组合所获得的值与所述多个特征的相应参考值之间的差来确定连续变量的值，并基于所确定的连续变量的值确定胚胎的发育潜能。

15.一种非暂时性计算机程序产品，其带有用于执行权利要求1-13中任一项所述的方法的机器可读指令。

16.一种设备，其加载有用于执行权利要求1-13中任一项所述的方法的机器可读指令，并且可操作以执行所述机器可读指令。